1. RESUMO
Introdução: O uso de agentes antimicrobianos, tanto sistêmicos como locais, são coadjuvantes essenciais ao tratamento das doenças periodontais. A doxiciclina (DOX), uma tetraciclina semi sintética, é mais vantajosa que a tetraciclina por exibir maior absorção bucal, têm meia-vida mais prolongada e mostra uma melhor solubilidade lipídica, o que é importante para a sua ação antibacteriana. Mesmo com o bom desempenho da doxiciclina, necessita-se de um veículo que permita a liberação e disposição da mesma, no meio subgengival, por um período prolongado. Assim, o poli (L- Ácido Lático-co-Ácido Glicólico) (PLGA) representa um tipo de microparticulado polimérico que oferece uma abordagem alternativa para a liberação de drogas, devido à sua biocompatibilidade, não imunogenicidade, não toxicidade, biodegradabilidade, métodos de preparação simples e estabilidade físico-química. Embora outros estudos demonstrem a biocompatibilidade do PLGA e da farmacocinética da doxiciclina em ensaios in vivo e in vitro, não se sabe qual seria o comportamento biológico quando ambos estão associados e liberando o fármaco. Objetivo: Analisar a biocompatibilidade de microesferas de PLGA contendo DOX. Metodologia: Adotou-se os protocolos adaptados de Dawes et al. (2009) e Misra et al. (2009) para a produção das microesferas de PLGA. Realizou testes de viabilidade celular das células- tronco mesenquimais de tecido adiposo hMSC a fim de avaliar o metabolismo mitocondrial, adesão e proliferação celulares. Em seguida, fez-se a avaliação da morfologia celular por meio de microscopia confocal a laser. Resultados: O teste MTT mostrou que as células apresentam índice de viabilidade 2x maior em relação ao intervalo de tempo entre 1 a 3 dias, apresentando uma diferença de viabilidade quando comparadas com o grupo controle. Ademais, a análise por microscopia (teste pelo Kit Live/Dead®) também mostrou que as células permanecem viáveis após 3 dias de cultura e pouquíssimas células mortas foram identificadas.
Conclusão: O estudo aventou a possibilidade dessas microesferas serem utilizadas em aplicações periodontais e de serem uma alternativa de baixo custo que favorece sua utilização na saúde pública.
2. INTRODUÇÃO
A periodontite é uma inflamação infecciosa dos ligamentos e ossos que dão suporte aos dentes, de alta incidência, e o indivíduo que apresenta periodontite dificilmente consegue se alimentar corretamente, passando assim a modificar sua alimentação e causando uma redução na ingestão de nutrientes essenciais, facilitando ou potencializando ainda doenças sistêmicas, como doenças cardiovasculares,
diabetes melittus, doenças pulmonares e artrite reumatoide.¹,²
Dentre algumas novas técnicas de tratamento há o uso de agentes antimicrobianos, tanto sistêmicos como locais, e tem sido sugerido como coadjuvantes do tratamento mecânico.³ A utilização de sistemas de liberação controlada de drogas visa fornecer uma concentração adequada de antimicrobiano que penetre e permaneça no sítio periodontal por períodos de tempos longos.
A doxiciclina (DOX) é uma tetraciclina (antibiótico de amplo espectro)semi sintética, por ser capaz de inibir a metaloproteinase de matriz (MMP), destrói os constituintes do periodonto como colágeno, fibras elásticas, proteoglicanas e fibronectinas.4 É mais vantajosa que a tretaciclina por exibir maior absorção bucal, têm meia-vida mais prolongada e mostra uma melhor solubilidade lipídica, o que é importante para a sua ação antibacteriana.5
Mesmo com o bom desempenho da doxiciclina, necessita-se de um veículo que permita a liberação e disposição da mesma, no meio subgengival, por um período prolongado. Dentre os vários tipos de veículos, as micro/nanopartículas se destacam por oferecer estabilidade química, física e liberadora de fármacos.6O poli- ácido lático- co-ácido glicólico (PLGA) representa um tipo de nanopartícula polimérica que oferece uma abordagem alternativa para a liberação da droga, devido à sua biocompatibilidade, não imunogenicidade, não toxicidade, biodegradabilidade, métodos de preparação simples e estabilidade físico-química.7Ele permite a liberação local controlada da droga eficientemente a partir da hidrólise de sua estrutura química, a qual é clivada em ácido lático e ácido glicólico até piruvato, quando é assimilado pelo ciclo do ácido tricarboxílico, gerando como produtos finais dióxido de carbono e água.8
Moura et al. (2015) avaliaram o efeito da associação da administração local de nanoesferas de doxiciclinacom o debridamento periodontal no tratamento da periodontite crônica avançada, e os resultados sugeriram que as microesferas de PLGA são efetivas como sistema de liberação controlada local de DOX, e quando associadas ao debridamento periodontal, podem promover resultados superiores em relação à terapia mecânica isoladamente. Devido à sua lipofilicidade, a doxiciclina mostra uma excelente distribuição tecidual.9
Os polímeros bioabsorvíveis sintéticos podem estimular células isoladas para regenerar tecidos e liberar drogas, tais como analgésicos, anti-inflamatórios e antibióticos, o que tem motivado recentemente seu estudo como suportes para o
transplante de células, tanto in vitro como in vivo.10,11,15,16,17 Com o poli (ácido láctico) e o poli(ácido glicólico) estabelecidos como materiais de implante úteis e aceitáveis, era esperado que a mistura deles poderia ser copolimerizada em um esforço para aumentar a gama de propriedades do polímero e as taxas de absorção in vivo.18 No campo dos sistemas de liberação de fármacos, estudos que utilizam PLGA, o qual é polímero biodegradável já utilizado em produtos farmacêuticos, são conduzidos ativamente devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade.19,20
Embora outros estudos demonstrem a biocompatibilidade do PLGA e da farmacocinética da doxiciclina em ensaios in vivo e in vitro, não se sabe qual seria o comportamento biológico quando ambos estão associados e liberando o fármaco.
Assim, este trabalho se fundamenta em preencher esta lacuna in vitro.
3. OBJETIVO
Analisar a biocompatibilidade de microesferas de PLGA contendo doxiciclina.
4. METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO
a. Síntese do biomaterial: Obtenção das microesferas de PLGA contendo doxiciclina.
As microesferas de PLGA foram produzidas no Laboratório de Biomateriais (Labiomat) da Faculdade de Ciências Biológicas da Pontifícia Universidade Católica de São Paulo. Um protocolo adaptado de Dawes et al. (2009) 34 e Misra et al.(2009) foi adotado. O método descrito por TERUKINA et al (2016)26 de simples emulsão com evaporação de solvente foi utilizado.
A técnica de evaporação foi empregada para formular o PLGA carregado com DOX microesferas. Para esse método, DOX equivalente a 20% (p / p, em relação ao peso seco do polímero) foi dissolvido em 1 ml de tampão fosfato 0,1 mM, pH 4, para formar solução aquosa de DOX; separadamente, 100 mg de PLGA (82/18; MW1600 g / mol) dissolvidos em 4 ml de diclorometano (DCM) (Quimex, São Paulo,Brasil) foi utilizada como fase oleosa; 1 ml do DOX acima preparado solução aquosa foi adicionada à 4 ml de solução de DCM e emulsionada usando um misturador ULTRA- TURRAX (T25, IKA, Staufen, Alemanha) por 4 minutos a 17,5 x103 RPM. Em seguida, essa emulsão estável de A / O foi lentamente adicionada à 200 mL de um solução aquosa contendo 2% de álcool polivinílico (PVA) (Vetec Fine Chemistry Ltda, Rio de Janeiro, Brasil) com 4% de NaCl e emulsionado por 6 min a 17,5x 103 RPM para formar a emulsão A / O / A à temperatura ambiente.
3.2. Cultivo das células
Além disso, a remoção de solvente e o endurecimento das microesferas foram alcançado por agitação contínua em um agitador magnético durante a noite (Fisatom mod.752 A, São Paulo, Brasil). Posteriormente, as microesferas foram isoladas por centrifugação (3500 RPM / 3 minutos) e lavada com água destilada vários vezes para remover o PVA. As microesferas, assim produzidas, foram congeladas a -20ºC por 24 h. Finalmente, as microesferas foram liofilizadas em um freezer industrial (GT COM 6011; Fa. HofSonderanlagenbauGmbH, Lohra, Alemanha), executando ciclos de acordo com um protocolo genérico estabelecido para amostras. Depois, as microesferas foram inseridas em ponteiras plásticas adaptadas para este estudo.
A caracterização físico química deste material, foi realizada previamente pelo químico Dr. Daniel Komatsu, pesquisador assistente do laboratório de Biomateriais, e a aluna de mestrado Virgínia Nazato, o qual demonstrou apresentar uma característica morfológica esférica média em torno de 3 a 15µm(Figura 1).
Figura 1. Imagem de microscopia eletrônica de varredura das microesferas utilizadas neste trabalho.
Utilizamos células-tronco mesenquimais humanas obtidas de tecido adiposo de
lipoaspiração (hMSC) que foram mantidas em DMEM
(Dulbecco’sModifiedEagleMedium) suplementado com 10% de soro bovino fetal e antibióticos. As células já foram adquiridas pelo Banco de Células do Rio de Janeiro e se encontravam congeladas criogenicamente no laboratório de Biomateriais da PUC/SP.
b. Viabilidade Celular
O teste de viabilidade celular (método colorimétrico) foi realizado a fim de avaliar metabolismo mitocondrial, adesão e proliferação celulares.
Antes de cada ensaio, as amostras foram esterilizadas com radiação UV-C durante 1h e imersas em DMEM puro. Avaliamos, então, a viabilidade celular depois após 1 e 3 dias em cultura: as células foram encubadas por 2h com MTT (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), a 37ºC/5%CO2; o MTT convertido pela atividade mitocondrial foi obtido por lise celular a partir dimetilsulfóxido (DMSO) depois do período desejado. Por fim, a solução colorimétrica obtida foi lida por espectrofotômetro. Realizou-se uma cinética de diferentes volumes de microesferas na cultura. As microesferas de PLGA-DOX foram adicionadas ao meio de cultura antes dos ensaios nas seguintes concentrações 0,1, 1, 10, 50 e 100µg/mL.
Grupos controle negativo (C-N) e controle positivo contendo apenas as esferas de PLGA sem DOX (C-P) também foram realizadas com as demais concentrações.
c. Avaliação da morfologia celular
Foi realizado, por contato indireto ou direto, a citocompatibilidade das hMSC com as microesferas de PLGA contendo doxiciclina (DOX). Foi utilizado o kit Live/Dead (#L3224, LifeTechnologiesLtd.) para uma identificação acurada de células vivas ou mortas quando sob contato indireto ou direto. Os grupos C-N e C-P foram igualmente avaliados. Os ensaios de proliferação e morfologia foram conduzidos depois de 1 a 3 dias em cultura. As células foram fixadas em paraformaldeído 4% e marcadas com DAPI, para detecção nuclear, e Alexafluor 647 para identificação da actina do citoesqueleto. Assim, pode-se realizar a morfologia celular através de microscopia confocal a laser (CSLM) e as imagens obtidas foram contadas por software de imagem. As concentrações selecionadas como biocompatíveis de PLGA- DOX avaliadas inicialmente no ensaio de viabilidade são selecionadas para este ensaio. O microscópio Confocal a laser fica localizado na UFSCar-Sorocaba sob a responsabilidade do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Monitoramento Ambiental da UFSCar, no qual o laboratório de biomateriais possui estreita colaboração e permissão de uso.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O teste do MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium]} é um teste colorimétrico usado para avaliar a viabilidade celular a partir de espectrofotômetro. Desidrogenases mitocondriais, presentes apenas em células metabolicamente viáveis, clivam o anel de tetrazólio, transformando-se de um composto de coloração amarela em um composto de coloração azul escuro, chamado de formazan {E,Z- 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-1,3-diphenylformazan}, que são cristais insolúveis em soluções aquosas. Assim sendo, a produção de formazan reflete o estado funcional da cadeia respiratória. A concentração de cristais formados é diretamente proporcional à concentração de células viáveis em um experimento. A
densidade óptica (OD) resultante do Teste MTT é determinada em espectofotômetro.21
A citotoxicidade pode ser comparada entre diferentes biomateriais, como os derivados da quitosana, celulose, colágeno, látex ou ácido hialurônico.Os resultados são extraídos do contato direto de células cultivadas sobre superfície das películas, ou as células cultivadas e expostas ao meio de extração (ME) dos biomateriais testados. A viabilidade celular por MTT é expressa como uma percentagem de células vivas que metabolizaram o MTT e o transformaram em um pigmento na cor roxa identificado pelo espectrofotômetro, assim é feita um cálculo da percentagem de células viáveis do controle positivo com os demais grupos experimentais, no qual se estabelece uma relação de citotoxicidade 22,23
Esse teste foi o primeiro a ser realizado para a análise da biocompatibilidade das microesferas de PLGA com DOX. Ele demonstrou que as células são viáveis já que observou coloração azul escura em todas as amostras, o qual representa indicação de viabilidade celular. Além disso, na figura 2é possível observar o comparativo da viabilidade celular das populações celulares em contato direto com as amostras PLGA 0.1, PLGA 1, PLGA 10, PLGA 50, PLGA 100 e PLGA-DOX 0,1 PLGA-DOX 1, PLGA-DOX 10, PLGA-DOX 50 e PLGA-DOX 100 em relação ao grupo controle utilizando a técnica do MTT (a numeração indicativa em cada nome amostral é referente a sua respectiva concentração em µg/mL. Observa-se no gráfico que as amostras apresentaram índice de viabilidade 2x maior em relação ao intervalo de tempo entre 1 a 3 dias, apresentando uma diferença de viabilidade quando comparadas com o grupo controle (CTRL-N) no ensaio de MTT.
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
1 DIA 3 DIAS
CTRL-N PLGA 0.1 PLGA 1 PLGA 10 PLGA 50 PLGA 100 PLGA-DOX 0.1 PLGA-DOX 1 PLGA-DOX 10 PLGA-DOX 50 PLGA-DOX 100 CTRL-N PLGA 0.1 PLGA 1 PLGA 10 PLGA 50 PLGA 100 PLGA-DOX 0.1 PLGA-DOX 1 PLGA-DOX 10 PLGA-DOX 50 PLGA-DOX 100
Figura 2. Análise da viabilidade celular das microesferas de PLGA- DOX em diferentes concentrações após 48 horas do teste de MTT: as colunas representam a média ± desvio padrão. FONTE: Autoras.
Para avaliar a viabilidade celular por microscopia foi realizado o teste pelo Kit Live/Dead®; este ensaio se baseia em distinguir células vivas de células mortas por meio de coloração fluorescente. As células vivas são identificadas em verde e as mortas são as em vermelho.24
Cada fluoróforo possui um tempo de atividade na célula específico e sua análise é observada no microscópio confocal a laser em tempo real e com as células vivas.
São obtidas imagens as quais são analisadas, e se estabelece uma relação entre células vivas e mortas, de forma que é possível tirar conclusões quanto à interação do substrato e a cultura celular. As figuras 03 e 04 apresentam as imagens da viabilidade celular por meio do uso do ensaio Live/Dead® obtidas por microscópio confocal.
Figura 3. Micrografias de varredura confocal a laser das células mesenquimais cultivadas após 1 e 3 dias nas microesferas de PLGA nas concentrações de 0,1; 1;
10; 50 e 100µg/mL identificadas por P01, P1, P10, P50, P100, respectivamente. O
experimento feito com o kit live/dead® marca em verde as células vivas e em vermelho as células mortas. O grupo controle negativo (CN) demonstra a distribuição das células aderidas em lamínula de vidro e em meio de cultura completo. Nos grupos com os tratamentos de microesferas, todas as concentrações usadas foram diluídas no mesmo meio de cultura completo usado no CN e as células se encontram aderidas no mesmo tipo de lamínula. As setas indicam grupos de microesferas enquanto que as áreas circulares indicam regiões de associação das células com as mesmas.
Barras 50µm.
Figura 4. Micrografias de varredura confocal a laser das células mesenquimais cultivadas após 1 e 3 dias nas microesferas de PLGA contendo doxiciclina à 20%, sendo as concentrações de 0,1; 1; 10; 50 e 100µg/mL identificadas por PD01, PD1, PD10, PD50, PD100, respectivamente. O experimento feito com o kit live/dead®
marca em verde as células vivas e em vermelho as células mortas. As setas indicam grupos de microesferas contendo doxiciclinaenquanto que as áreas circulares indicam regiões de associação das células com as mesmas. A doxiciclina apresenta leve autofluorescência vermelha, o qual é identificada pelo leve sinal avermelhado identificado no mesmo comprimento de onda do laser para detectar as células mortas.
Barras 50µm
Através da análise qualitativa a partir do ensaio com o kit Live/Dead® foi possível observar que as células permanecem viáveis após 3 dias de cultura. Pouquíssimas
células mortas (vermelhas) foram identificadas.
6. CONCLUSÃO
De acordo com as análises que avaliaram a biocompatibilidade, constatou-se que há viabilidade celular das microesferas de poli-ácido lático-co-ácido glicólico (PLGA) contendo doxiciclina e, por isso, o presente estudo aventou a possibilidade futura dessas microesferas serem utilizadas em aplicações periodontaise de serem uma alternativa de tratamento de baixo custo que favorece sua utilização na saúde pública.
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