Técnica de
Observação de Células e Tecidos
Desenvolvimento da Microscopia
-Microscópio Óptico (luz)
-Microscópio Eletrônico (elétrons)
2 Microscópio óptico – utiliza feixes de luz
Desenvolvimento da Microscopia
Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.
Microscópio óptico
Desenvolvimento da Microscopia
Sistemas de lentes:
-condensador -objetiva -ocular
Microscópio óptico de campo claro
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
4 Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico confocal
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons
Desenvolvimento da Microscopia
→Alta resolução
→Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm)
→Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio
Microscópio eletrônico de transmissão:
Desenvolvimento da Microscopia
Estrutura e funcionamento
6 Microscópio eletrônico
de transmissão
Centro de Microscopia Eletrônica-IB/UNESP
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de transmissão
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
8 Preparação de material
para análise ao microscópio
As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.
Preparação de material para análise ao microscópio
Fixa Fixa Fixa
Fixaççççãoãoão – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado ão →Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.
Preparação de material para análise ao microscópio
Lavagem Lavagem Lavagem Lavagem
Preparação de material para análise ao microscópio
Desidrata Desidrata Desidrata
Desidrataççççãoãoãoão – Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%→80%→90%→100%).
10 Preparação de material para análise ao microscópio
Diafaniza DiafanizaDiafaniza
Diafanizaççççãoãoãoão ou ou ou clareamentoou clareamentoclareamentoclareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de impregna Meio de impregna Meio de impregna
Meio de impregnaççççãoãoão – Substituição do líquido ão (xilol) por parafina ou resina sintética.
A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras.
Preparação de material para análise ao microscópio
Suporte para o tecido impregnado com parafina
Preparação de material para análise ao microscópio
Suporte para tecido impregnado com resina sintética
12 Preparação de material para análise ao microscópio
Micr MicrMicr Micróóóótomotomotomotomo
Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicr
MicrMicróóóótomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes.
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicrMicr Micróóóótomotomotomotomo
Realizando cortes do material
Preparação de material para análise ao microscópio
Micr MicrMicr Micróóóótomotomotomotomo
...realizando cortes.
14 Preparação de material para análise ao microscópio
Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 ooooCCCC
Derreter e eliminar a parafina
Preparação de material para análise ao microscópio
Xilol Xilol Xilol Xilol
Retirada da parafina
S S S
Séééérie alcorie alcorie alcoórie alcoóóólica lica lica lica ---- Rehidratação.
Hidratação completa
Preparação de material para análise ao microscópio
Coloração
Preparação de material para análise ao microscópio
Hematoxilina/Eosina (HHHHEEEE))))
Coloração freqüentemente utilizada Colora
Colora Colora
Coloraçççãoçãoão – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.ão
→Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.
→Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.
Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...
Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...
Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.
16 Preparação de material para análise ao microscópio
Montagem de lâminas permanentes
Preparação de material para análise ao microscópio
Análise do Material
Preparação de material para análise ao microscópio
Técnicas de estudo
Cultivo de células Centrifugação fracionada Radioautografia
Histoquímica e citoquímica Imunocitoquímica
Hibridação
Preparação de material para análise ao microscópio
Resultados
