AVALIAÇÃO DO EFEITO REMINERALIZADOR DE DENTIFRÍCIOS COM COMPOSTOS BIOATIVOS ASSOCIADOS OU NÃO AO CHÁ VERDE (CAMMELIA
SINENSIS) NA DENTINA BOVINA ERODIDA
Niterói 2015
AVALIAÇÃO DO EFEITO REMINERALIZADOR DE DENTIFRÍCIOS COM COMPOSTOS BIOATIVOS ASSOCIADOS OU NÃO AO CHÁ VERDE (CAMMELIA
SINENSIS) NA DENTINA BOVINA ERODIDA
ALINE SILVEIRA DOS SANTOS MENEZES Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Orientador: Profa. Dra. Thereza Christina Lopes Coutinho
Niterói 2015
compostos bioativos associados ou não ao chá verde (Cammelia Sinensis) na dentina bovina erodida / Aline Silveira dos Santos Menezes; orientadora: Prof.ª Dr.ª Thereza Christina Lopes Coutinho - Niterói: [s.n.], 2015.
49 f. : il. Inclui e tabelas
Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2015.
Bibliografia: f. 36-41
1.Dentina 2.Erosão 3.Metaloproteinases da matriz I.Coutinho, Thereza Christina Lopes [orien.] II.Título
Prof(a). Dr(a). Thereza Christina Lopes Coutinho Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Prof(a). Dr(a). Gloria Fernanda Barbosa de Araújo Castro Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro
Decisão: _________________________Assinatura:_________________________
Prof(a). Dr(a). Monica Almeida Tostes
Instituição: Universidade Federal Fluminense
À meu marido, melhor amigo, companheiro de todas as
horas. Seu apoio e companheirismo diário foram
fundamentais para que eu pudesse chegar até aqui. Tenho
muito orgulho de ser sua esposa. Muito obrigada pela linda
família que você me ajudou a construir.
As minhas lindas filhas Beatriz e Manuela que são a razão
pela qual quero me tornar uma pessoa melhor a cada dia.
Amo vocês!
À minha mãe, minha mamãezinha querida, nenhuma
palavra que eu pudesse escrever seria capaz de expressar
minha gratidão e sua importância em minha vida. Capaz de
tudo por mim. Sem você não teria conseguido. Obrigada
por estar sempre ao meu lado, me ajudando, me apoiando
e abrindo meus olhos, melhorando sempre o meu modo de
ver o mundo.
À meu querido pai João Francisco, meus queridos sogros
Sandra e Eduardo, minhas queridas irmãs Andréia e
Adriana e meus adorados sobrinhos Fernando e Gabriela.
Família guerreira e batalhadora. Minha base, meu porto
seguro. Cada um de vocês teve seu papel especial nesta
minha jornada. Fazer parte desta família fez de mim uma
pessoa melhor e mais forte.
À minha orientadora, Profª. Drª. Thereza Christina Lopes
Coutinho, dedicação, profissionalismo, inteligência, amor
pelo que faz, dignidade, honradez, sensatez, honestidade e
sinceridade são apenas algumas de suas inúmeras
qualidades. Obrigado por todo apoio, incentivo e confiança
que dedicou a mim nesses últimos anos. Adorei ter
desfrutado da sua companhia. Não deve ter havido um
único dia ao seu lado que eu não tenha aprendido.
Conviver com você foi entender o significado da palavra
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará a seu tamanho original.”
Albert Einstein
À Profª Drª Monica Almeida Tostes, mestre, excelente
profissional, exemplo de competência e dedicação.
“Eu não
tenho ídolos. Tenho admiração por trabalho, dedicação e
competência”(Ayrton Senna
). Obrigada pelo apoio e
confiança dedicados a mim nesses últimos anos.
À Drª Viviane Cancio, profissional dedicada, sonhadora e
guerreira. Muitas pessoas irão entrar e sair da minha vida,
mas somente algumas ficarão marcadas no meu coração.
Nossa convivência foi curta, porém muito intensa.
Obrigado pelo seu incentivo.
Aos Professores do Curso de Graduação e Pós-Graduação
em Odontopediatria por todos os ensinamentos durante o
estágio que realizei na clínica.
Ao Sr. José Maria, técnico do Laboratório de Pesquisa de
Dentística, disciplinado, competente, integro. Mas, acima
de tudo, dono de um coração enorme. Sempre tão solícito,
dedicado e disposto a ajudar.
Às funcionárias do Departamento de especialização em
Dentística e Odontopediatria: Cris, Cleide e Damiana pelo
indispensável suporte durante todo o curso de Mestrado.
À Lorena Basílio Chaves, aluna de iniciação cientifica, por
toda ajuda e pelas experiências compartilhadas.
Ao Prof. Dr. Eduardo Moreira da Silva, por disponibilizar o
Labiom-R para que fosse possível a realização dos
experimentos e pelas excelentes ideias que engrandeceram
esse trabalho.
À Karla Avellar da PUC-Rio, pela paciência e dedicação para a
realização das excelentes imagens de microscopia eletrônica
que ilustraram esse trabalho.
ficarão para sempre na lista dos melhores da minha vida.
“
Fácil é ser colega, fazer companhia a alguém, dizer o que ele
deseja ouvir. Difícil é ser amigo para todas as horas e dizer
sempre a verdade quando for preciso.”(Carlos Drummond de
Andrade
). Obrigado pela amizade de vocês.
RESUMO
Menezes ASS. Avaliação do efeito remineralizador de dentifrícios com compostos bioativos associados ou não ao chá verde (Cammelia sinensis) na dentina bovina erodida [dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2015.
O objetivo deste estudo foi analisar in vitro, o efeito do chá verde (CV), um inibidor de metaloproteinases da matriz (MMP), associado a dentifrícios dessensibilizantes Colgate Sensitive Pro-Alívio (PA) e Sensodyne Repair & Protect
bovina erodida submetida à desafio erosivo e abrasivo com duração de 5 dias. Cento e dez blocos de dentina bovina foram avaliados por perfilometria e submetidos a um processo inicial de erosão por imersão em ácido cítrico a 0,1% (pH 2,5) durante 30 min. Depois de avaliação da rugosidade inicial (Ri), foram divididos aleatoriamente em 11 grupos (N = 10): ERO, CV+SO, SO, CV+RP, RP, CV+PA, PA, CV+DF, DF, CV+NP e NP e submetidos à desafio erosivo adicional (DE) (bebida cola, 4x / 90s / dia), além de abrasão (ABR) (280 rotações / min; carga 100g / 2x / dia) com suspensão diluída do creme dental (1:3 de saliva) imediatamente após o primeiro e último DE e remineralização em saliva artificial entre os ciclos e pernoite durante 5 dias. Ao termino dos 5 dias de ciclagem, as amostras foram avaliadas para análise da rugosidade final (Rf) e a mudança de perfil da superfície (% MPS) foi calculada. Todos os blocos também foram avaliados ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) por meio do software Image Tool ® para avaliação do número e diâmetro dos túbulos. Um bloco de cada grupo foi avaliado qualitativamente em MEV 3D e em perfilometria 3D. Os dados foram analisados no software SPSS v. 20 com os testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (P<0.05). Os resultados mostraram que, o uso do CV anterior à abrasão com dentifrícios sem flúor e dessensibilizantes teve um resultado significativamente melhor na Rf das amostras (p < 0,05) quando comparados aos mesmos grupos sem CV, com exceção dos grupos DF e NP, onde o CV não melhorou a sua proteção contra a erosão / abrasão. Todos os grupos com o uso prévio de CV apresentaram um valor significativamente melhor que o grupo ERO, que apenas conduziu a um valor inferior de Rf estatisticamente significativo (p = 0,000) com relação aos grupos sem CV. Quanto ao %MPS, o grupo DF levou à maior alteração de dentina estatisticamente significativa (46,24%) (p = 0,000) entre os grupos experimentais, seguido em ordem decrescente por SO (16,81%), PA (13,22%), ERO (5,67%), CV + PA (0,52%) e CV + RP e CV + SO que apresentaram valores negativos de %MPS (-2,93% e -4,77% respectivamente), o que demostrou uma recuperação de perfil superficial nestes grupos. Observou-se ao MEV que, o número de túbulos foi similar para todos os grupos (p>0.05), com maior diâmetro estatisticamente significativo (p<0.05) nos grupos SO (3.47), RP (3.36) e DF (3.23) quando comparados com os grupos com CV (1.77, 2.46 e 2.57, respectivamente), enquanto PA (3.28) não diferiu de CV+PA (2.72). A avaliação qualitativa ao MEV 3D
grupos com CV mostraram superfícies mais lisas, por outro lado, os grupos sem CV foram mais irregulares, semelhante à dentina erodida. Concluiu-se que, o uso prévio de CV potencializou a ação dos agentes bioativos presentes nos cremes dentais dessensibilizantes, com exceção da pasta NP sendo, portanto, uma opção viável nos casos de pacientes com lesões erosivas em dentina e hipersensibilidade dentinária.
Palavras-chave: erosão, abrasão, dentina, metaloproteinases da matriz, chá verde, dentifrícios, fluoreto.
ABSTRACT
Menezes ASS. Evaluation of the remineralization effect of toothpastes with bioactive compounds associated or not to green tea (Cammelia sinensis) on eroded bovine dentin [dissertation]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2015.
The aim of this study was to analyze in vitro, the protective effect of green tea (GT), a matrix metalloproteinases (MMP) inhibitor, associated with desensitizers toothpastes Colgate Sensitive Pro-Relief (PR) and Sensodyne Repair & Protect (RP) and a desensitizer paste Desensibilize Nano P (NP) compared to toothpastes with
slabs were evaluated by profilometry (baseline) and submitted to an initial erosion process by immersion in a 0.1% citric acid (pH 2.5) for 30 min. After initial profilometry (IP) evaluation, the samples were randomly divided into 11 groups (n = 10): ERO, GT + SO, SO, GT + RP, RP, GT + PR, PR, GT + FD, FD, GT + NP and NP, subjected to additional erosive challenge (EC) (cola drink, 4x / 90s / day), plus abrasion (ABR) (280 strokes / min; load 100g / 2x / day) with suspension of diluted toothpaste (1: 3 of saliva) immediately after the first and last EC and remineralization in artificial saliva between cycles and overnight for 5 days. At the end of the experiment, the samples were evaluated for final profilometry (FP) and surface profile change (%SPC) was calculated. All blocks were also evaluated by scanning electron microscope (SEM) through Image Tool ® software to assess the number and diameter of the tubules. One block of each group was assessed qualitatively by 3D SEM and 3D profilometer. Data were statistically analyzed in SPSS v. 20 software through Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests (P <0.05). The results showed that the use of GT previous to abrasion with toothpaste without fluoride and desensitizers toothpastes had a significantly better result in FP values (P <0.05) when compared to the same groups without GT, except for FD and NP groups, where the GT did not improve their protection against erosion / abrasion. All GT groups had a significantly better value than the ERO group that only led to a statistically significant lower FP value (p = 0.000) with respect to non-GT groups. As for the % SPC, the FD group led to statistically significantly greater dentin change (46.24%) (p = 0.000) among the experimental groups, followed in descending order by SO (16.81%), FD (13.22 %), ERO (5.67%), GT + PR (0.52%) and GT+RP and GT + SO that showed negative values of %SPC (-2.93% and -4.77%, respectively), which demonstrated a recovery of the surface profile in these groups. It was observed by SEM that the number of tubules was similar in all groups (P> 0.05), with greater diameter statistically significant (p <0.05) in the groups SO (3.47), RP (3.36) and FD (3.23) when compared with these groups with GT (1.77, 2.46 and 2.57, respectively), while PR (3.28) did not differ from GT + PR (2.72). Qualitative evaluation by 3D SEM showed better occlusion of the tubules when GT was previously used, regardless of the paste used. In 3D profilometer, it was observed that the groups with GT showed smoother surfaces, on the other hand, groups without GT were more irregular similar to eroded
of patients with erosive lesions in dentin and dentin hypersensitivity.
Keywords: erosion, abrasion, dentin, matrix metalloproteinases, green tea, toothpastes, fluoride.
1 - INTRODUÇÃO
A erosão dentária é considerada um processo progressivo e destrutivo, caracterizado pela perda do tecido duro dos dentes por ação de ácidos contidos em bebidas e/ou alimentos ou, ainda, provenientes do próprio organismo, que pode causar sensibilidade dentinária, dor e problemas estéticos (MAGALHÃES et al., 2009). Para Huysmans et al. (2011), a erosão é definida como uma desmineralização parcial do esmalte ou da dentina causada por ácidos intrínsecos e/ou extrínsecos, já o desgaste dentário erosivo é a perda acelerada de tecido duro dentário através do efeito combinado da erosão e da perda mecânica (abrasão e atrição) na superfície dentária.
Como a dentina apresenta uma concentração de 18-20% de material orgânico (90% colágeno tipo I), a presença de uma superfície dentinária rica em colágeno parece diminuir a difusão dos ácidos para o tecido, minimizando a ocorrência de erosão (GANSS et al., 2004; HARA et al., 2005). Porém, esta matriz orgânica pode ser degradada mecânica ou quimicamente, facilitando uma desmineralização posterior.
Assim, quando a dentina é exposta aos ácidos, os minerais presentes na dentina peritubular e intertubular são liberados promovendo o aumento do diâmetro dos túbulos dentinários e exposição da camada superficial da matriz de colágeno da dentina desmineralizada. Essa camada superficial de matriz de colágeno pode proteger a camada subjacente de dentina mineralizada contra forças mecânicas e de desgaste, desse modo, o processo de desmineralização da dentina diminui à medida que a quantidade de colágeno degradado aumenta, já que é atribuída à matriz de colágeno a capacidade de prevenir a difusão iônica através da dentina (KATO, 2011).
Desse modo, no processo erosivo em dentina, a queda do pH causa desmineralização da dentina expondo as fibrilas de colágeno. Ao mesmo tempo, a queda do pH ativa as metaloproteinases da matriz (MMPs) da dentina e/ou da saliva, as quais o pH, ao retornar ao nível neutro, degradam a matriz orgânica desmineralizada permitindo a progressão da perda dentinária, já tendo sido identificadas as MMPs 1, 2, 3, 8, 9 e 20, todas com potencial para degradar a matriz
dentinária em situações patológicas, uma vez que as mesmas tornam-se ativas quando o pH cai durante o metabolismo bacteriano (KATO, 2011).
Portanto, a aplicação de inibidores de MMPs poderia reduzir a perda dentinária durante os desafios erosivos subsequentes. A camada protetora composta de matriz orgânica desmineralizada dificultaria a difusão do ácido e reduziria a progressão da erosão em dentina (GANSS et al., 2004; KATO, 2011).
Partindo desse pressuposto, o uso de inibidores de MMPs passou a ser considerado eficaz no tratamento de distúrbios que ocorrem na cavidade oral, como por exemplo, a erosão dentária no que diz respeito a sua prevenção.
O chá verde (cammelia simensis) originário da China, tem se tornado popular mundialmente, por ter seu consumo amplamente associado ao emagrecimento e rejuvenescimento. Recentemente, vem sendo atribuído a ele, ação de prevenção de algumas patologias bucais, tais como erosão (KATO et al., 2009, 2010a,b; MAGALHÃES et al., 2009).
O polifenol epigallocatechin-3 gallate (EGCG), da família dos flavonoides e presente no chá verde, apresenta efeitos inibitórios sobre as MMPs (DEMEULE et al., 2000; GARBISA et al., 2001).
Os polifenóis têm recebido muita atenção da comunidade cientifica por seus numerosos efeitos biológicos, tais como: modulação da atividade de algumas enzimas, inibição da proliferação celular, bem como seu potencial como agente antibiótico, antialérgico e antinflamatório. (REF?)
Já com relação ao fluoreto (F), agente terapêutico bem estabelecido no que diz respeito à cárie dentária ao produzir equilíbrio favorável nos processos de des-remineralização, a sua ação na prevenção da erosão da dentina quando não associado a outros cátions potencialmente relevantes, parece ser dependente da manutenção da matriz orgânica desmineralizada (GANSS et al., 2010). DenBesten et al. (2002) mostraram que o F poderia alterar a atividade da MMP-20 no esmalte e, recentemente, Kato et al. (2014) confirmaram a hipótese que o F foi capaz de inibir ambas as MMP-2 e -9 de uma forma dose-resposta, atribuindo assim ao F uma possível ação de inibição das MMPs.
Alguns dentifrícios foram introduzidos no mercado apresentando flúor associado a agentes terapêuticos (agentes bioativos) como a tecnologia Pro-Argin™ e a Novamin® que prometem atuar no tratamento da hipersensibilidade dentinária,
através do mecanismo de formação de uma camada reparadora sobre a dentina exposta e dentro dos túbulos dentinários, reparando e protegendo esta dentina de desafios ácidos seguintes. Estudos indicam esses dentifrícios para prevenir a erosão ácida e reduzir a sensibilidade (FOWLER et al., 2006; NEWBY et al., 2006; ZERO et al., 2006; LUSSI et al., 2008; KATO et al., 2010c; JHAM, 2010; BURWELL et al., 2010; LA TORRE, GREENSPAN, 2010; WEST et al., 2011; EARL et al., 2011), no entanto, poucos são os estudos comparativos.
Atualmente, com os avanços no desenvolvimento da nanotecnologia de produtos para a remineralização do esmalte, surgiram também no mercado materiais à base de nano-hidroxiapatita. Contudo, a maior parte dos estudos é voltada para o uso deste produto na remineralização de lesões cariosas de esmalte, enquanto que o seu efeito na erosão dentária tem sido pouco investigado (HUANG et al., 2011). O nanofosfato de cálcio é organizado na forma cristalina de hidroxiapatita sendo recentemente desenvolvido como uma pasta. Os cristais de nanofosfato de cálcio são menores que 100 nm, com vista a melhorar a bioatividade do produto, resultando em um aumento na área de superfície e molhabilidade das nanopartículas de hidroxiapatita, segundo o fabricante. Os íons cálcio, fosfato e flúor são liberados e organizados em fluorapatita e fluoreto de cálcio (CaF2) na superfície desmineralizada dos dentes (CARVALHO et al., 2013).
Uma vez que os agentes remineralizantes presentes nos dentifrícios atuam aumentando a biodisponibilidade de ions para participar dos eventos de remineralização, o chá verde, por outro lado, através de seus efeitos inibitórios sobre as MMPs, atua impedindo a degradação da matriz orgânica desmineralizada. Torna-se interessante supor que essa matriz orgânica que não foi degradada possa ser passível de remineralização pela ação do flúor e/ou dos compostos bioativos presentes nos dentifrícios, o que certamente levaria a uma diminuição da perda dentinária.
Devido à escassez de pesquisas na literatura no que diz respeito à eficácia desses diferentes dentifrícios com compostos bioativos e a pasta de nanoparticula de hidroxiapatita associados a inibidores de MMPs na prevenção da progressão da erosão dentinária associada à abrasão, o objetivo deste estudo foi avaliar comparativamente, in vitro, o efeito do chá verde, um inibidor de metaloproteinases da matriz (MMP), associado ou não a dentifrícios contendo diferentes agentes
dessensibilizantes na prevenção da progressão da erosão dentária associada à abrasão em dentina bovina, sob ciclagem de pH. Foram utilizados como método de avaliação desse efeito, a medição perfilométrica superficial expresso em micrometros e o consequente percentual de mudança do perfil superficial da dentina (%MPS), assim como a avaliação ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), do diâmetro dos túbulos dentinários através de um software específico.
A hipótese nula testada foi a de que o uso do chá verde associado aos diferentes produtos testados não minimiza os efeitos erosivos provocados por uma bebida ácida associada à abrasão com relação à perfilometria ou com relação à porcentagem de mudança do perfil superficial da dentina, assim como no diâmetro dos túbulos dentinários.
2 - METODOLOGIA
2.1 Desenho do estudo
O estudo foi realizado in vitro, utilizando 110 blocos de dentina bovina previamente erodida, que foram submetidos à ciclagem erosiva, imersão em chá verde (CV) e tratamento abrasivo com os diferentes dentifrícios testados durante 5 dias e posteriormente avaliados, quantitativamente e qualitativamente, através da rugosidade superficial, perfilometria 3D e microscopia eletrônica de varredura para avaliação da superfície dentinária e condição dos túbulos após os tratamentos. 2.2 Obtenção dos dentes e preparo da amostra de dentina bovina
Foram utilizados 110 incisivos bovinos provenientes de frigorífico (Vangélio Mondelli, Bauru – SP) e armazenados em solução de timol a 0.1%, pH 7,0 até o momento do experimento.
Os dentes foram analisados em lupa estereoscópica (Olympus SZ61, aumento 20x) após polimento com escova Robinson e mistura de pedra-pomes extra-fina (Asfer) e água destilada em baixa rotação (Kavo do Brasil S.A.), lavados com água destilada e escolhidos obedecendo aos seguintes critérios: ausência de trincas ou defeitos macroscópicos ou qualquer outra alteração de esmalte.
As coroas foram fixadas na sua face lingual com cera pegajosa Kota (Kota Ind. e Com. Ltda., São Paulo, SP) em placas de acrílico cristal de 40 mm X 40 mm X 5 mm e do centro da face vestibular foi obtido 1 bloco de esmalte com dimensões de 4 X 4 mm, através do uso de dois discos diamantados dupla face - XL 12205, “High concentration” , 102 mm X 0,3 mm X 12,7 mm (Extec Corp., Enfield, CT, USA), com um espaçador de 4 mm entre eles, acoplado a um aparelho de corte de precisão Labcut 1010 (Extec Corp.), com velocidade de 300 rpm. No total foram confeccionados 110 blocos.
Cada bloco foi fixado com cera pegajosa Kota (Kota Ind. e Com. Ltda., São Paulo, SP) ao redor do mesmo, com o auxílio de um instrumento PKT (Duflex 55G, SS White Artigos Dentários Ltda, Rio de Janeiro, RJ) e uma lamparina (Jon, Ind. Bras., São Paulo, SP) no centro de um disco de acrílico de 30 mm de diâmetro por 8
mm de espessura, com a maior área plana do esmalte voltada para baixo, para a realização da planificação da dentina interna. O conjunto (disco/dente) foi adaptado a uma Politriz metalográfica (APL 4, Arotec, Cotia, SP), com um sistema de suporte que permite que o desgaste seja paralelo à base do disco de acrílico. A planificação da dentina interna foi realizada com uma lixa de silicone carbide de granulação #320 (Carbimet Paper Discs, ref. 30-5108-320, Buehler, Lake Bluff, IL, USA), com refrigeração a água deionizada.
A seguir, os blocos foram removidos dos discos de acrílico e limpos com xilol (Pharmácia Specifica Manipulação de Fórmulas, Bauru, SP), para remover todo o resíduo de cera. Os blocos foram novamente fixados nos discos de acrílico com a cera pegajosa, no centro do disco de acrílico desta vez com a face de esmalte exposta, para realização do desgaste do esmalte até a exposição da dentina. Para isso foi utilizada broca de diamante (KG Sorensen 4054, Cotia, SP, Brasil) acoplada à caneta de alta rotação irrigada com água deionizada durante 5 min até a exposição da dentina. A seguir foram utilizadas lixas de carbeto de silício #600 e #1200 (Extec Corp., USA) em baixa velocidade durante 30s e 60s respectivamente, na Politriz em baixa velocidade, até a dentina apresentar aspecto vítreo e os blocos ficassem com a espessura de 2 mm.
Para finalizar o polimento, foi utilizado um feltro (Polishing Cloth Buehler, ref. 40-7618) umedecido com uma suspensão de diamante de 1 μm (ref. 40-6530, Buehler), durante 6s. Ao final do polimento, os blocos foram lavados por 5 min com água deionizada em aparelho de ultrassom.
2.3 Avaliação da rugosidade superficial baseline
A rugosidade da superfície de dentina foi avaliada utilizando-se um Rugosímetro de bancada portátil digital SJ-201 (Mitutoyo, Tokyo, Japão) previamente calibrado com um dispositivo padrão. Foi utilizado o parâmetro vertical Ra que expressa quantitativamente a rugosidade superficial em micrometro (μm). A ponta apalpadora do rugosímetro percorreu uma distância de 0,25mm (cut-off) em cada medição. Foram realizadas duas medições em cada amostra, formando-se duas linhas perpendiculares. Os pontos iniciais de leitura foram demarcados com uma caneta permanente na base do disco de acrílico, para que todas as leituras
fossem realizadas no mesmo ponto. Foram obtidas as rugosidades média (Ra), total (Rt) e Ry calculadas pelo software disponível no rugosímetro. A rugosidade média corresponde à distância média de um perfil desde sua linha média, sobre o comprimento medido; a rugosidade total (Rt) é a distância vertical entre o pico mais elevado e o vale mais baixo no percurso de medição; Ry é a soma da máxima altura e da máxima profundidade de rugosidade (NOVASKI, 1994).
A média de rugosidade baseline (Rb) foi calculada a partir da média aritmética dos dois valores. A Rb foi realizada antes da imersão dos blocos no ácido cítrico a 0,1%, para possibilitar a confirmação da formação da lesão inicial de erosão.
2.4 Formação de lesão inicial de erosão e grupos experimentais
Após a avaliação da rugosidade baseline, os blocos foram submetidos ao processo de erosão inicial produzido pela imersão em ácido cítrico a 0,1% (pH 2.5) por 30 minutos, 30 mL/bloco. Em seguida, foram submetidos à nova análise de rugosidade superficial pós-erosão (Ri) para distribuição homogênea entre os grupos e tiveram as laterais protegidas com duas camadas de verniz ácido resistente (esmalte de unha; Colorama®) e o centro dos blocos foi protegido com fita adesiva expondo as áreas a serem pintadas. Após, essa fita foi removida para que o centro dos blocos recebesse os tratamentos experimentais. Os 110 blocos foram distribuídos aleatoriamente de forma homogênea entre os 11 grupos compostos por 10 blocos cada (N=10) (Quadro 1).
Quadro 1 – Divisão dos grupos experimentais
Grupo Tratamento
G1 – ERO
Apenas erosão (ERO);
G2 – CV+SO ERO + imersão em chá verde (CV) + abrasão (ABR) com dentifrício placebo Sensodyne® Original (sem flúor; GlaxoSmithKline, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil);
G3 – SO ERO + ABR com dentifrício placebo Sensodyne® Original
G4 – CV+RP Sensodyne® Repair & Protect (a base de fosfosilicato de cálcio eERO + imersão em CV durante 1 min + ABR com dentifrício
sódio – NovaMin®; GlaxoSmithKline, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) G5 – RP
ERO + ABR com dentifrício Sensodyne® Repair & Protect
G6 – CV+PA
ERO + imersão em CV durante 1 min + ABR com dentifrício
Colgate® Sensitive Pró-alívio (a base de Pro-Arginina®; Colgate
Palmolive, São Bernardo do Campo, SP, Brasil) G7 – PA ERO + ABR com dentifrício Colgate® Sensitive Pró-alívio G8 – CV+DF ERO + imersão em CV durante 1 min + ABR com dentifrício fluoretado Crest® – Cavity Protection (1.100 ppmF de NaF;
Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA)
G9 – DF ERO + ABR com dentifrício fluoretado Crest® – Cavity Protection
G10 – CV+NP
ERO + imersão em CV durante 1 min + ABR com dentifrício placebo
Sensodyne® Original (sem flúor; GlaxoSmithKline) + aplicação do Desensibilize Nano P (pasta de nanopartículas de fosfato de cálcio
– hidroxiapatita com 9000 ppmF de NaF, FGM, Joinville, SC, Brasil) G11 – NP ERO + ABR com dentifrício placebo Sensodyne® Original (sem
2.5 Ciclagem erosiva e tratamento abrasivo
Para promover erosão subsequente, os blocos foram submetidos a um regime de ciclagens de pH diário segundo metodologia de Magalhães et al. (2012). Eles foram ciclados diariamente 4 vezes consecutivas através desse regime. Uma ciclagem completa compreendeu as seguintes etapas: cada bloco foi imerso, individualmente, em 30mL de refrigerante Coca-Cola® (Companhia Fluminense de Refrigerantes, Porto Real, Rio de Janeiro, Brasil, pH 2,6) durante 90s à temperatura ambiente. Entre as ciclagens, os espécimes foram imersos em saliva artificial (0.67g/l NaCl; 0.1168g/l CaCl2; 8g/l CMC; 0.0408g/l MgCl2; 0.96g/l KCl; 1g/l C8H8O3; 24g/l C6H14O6; 964.938ml/l H2O; 0.274g/l KH2PO4; pH 6.8). Após o primeiro e último ciclo erosivo, os blocos dos grupos 2, 4, 6, 8 e 10 foram imersos durante 1 min em chá verde sob agitação, 20 mL/bloco. O chá verde (Yamamotoyama Midori Indústria de Chá Ltda, pH 7.0, São Miguel Arcanjo – SP) foi preparado conforme instruções do fabricante, sendo 1 sachê para cada 200mL de água quente. O chá ficou em infusão durante 1 min e esfriado a temperatura ambiente por 4 min. Após, os blocos de todos os grupos com exceção do grupo 1, foram submetidos ao tratamento abrasivo (ABR) com as respectivas soluções dos dentifrícios na proporção de 1:3 (1mg para 3 mL de saliva artificial) em máquina de escovação (MEV2, Odeme Biotechnology, Joaçaba, SC, Brasil) 2x/10s ao dia (280 oscilações/100g) com escova dental (Oral B® 30, Procter & Gamble, Brasil). Os blocos dos grupos 10 e 11 sofreram abrasão com dentifrício placebo e após, foi aplicada na superfície dos blocos a pasta Desensibilize Nano P conforme instruções do fabricante. O produto foi aplicado nos blocos com microbrush e com um disco de feltro adaptado em baixa rotação com velocidade baixa (Diamond Flex – FGM), o mesmo foi friccionado durante 10 segundos e deixado em repouso durante 5 min, sendo o excesso removido com cotonete. Após os respectivos tratamentos, os fragmentos dos demais grupos foram lavados com água destilada e secos com papel absorvente. Após estes procedimentos, os blocos foram imersos durante 2h em 35mL/bloco de saliva artificial até a próxima imersão em Coca-cola®. Ao final das 4 ciclagens diárias, os fragmentos foram imersos na saliva artificial até o dia seguinte. Esta foi trocada diariamente. A ciclagem de pH foi realizada durante 5 dias.
A Fig. 1 ilustra o fluxograma do experimento e o Quadro 2 (ANEXO A) a composição dos dentifrícios.
Fig. 1 – Fluxograma da fase laboratorial da pesquisa
2.6 Análise da rugosidade final
Após a realização das ciclagens, foi feita nova análise de rugosidade – rugosidade final (Rf) como descrito previamente. Os resultados obtidos nos perfis pós-erosão (Ri) e final (Rf), foram utilizados para o cálculo do percentual de mudança no perfil superficial (%MPS) das amostras de cada grupo, através da aplicação da seguinte fórmula:
% MPS = Rugosidade final (Rf) – Rugosidade pós-erosão (Ri) x 100 Rugosidade pós-erosão (Ri)
Dente bovino Remoção do esmalte Máquina de corte Aplicaçãocom microbrush durante 3min Perfilometria 3D digital Perfilometria superficial final (RPF) Microscópio eletrônico de varredura Grupos 10 e 11 Após 5 dias Imersão em 30mmi/bloco durante 90s Imersão em Chá verde sob agitaçã o durante 1min Máquina de escovação por 10s proporção de1:3 de saliva artificial Grupos
Pares ÍmparesGrupos
Planificação e Polimento esmalte Amostras planificadas e polidas Perfilometria superficial pós-erosão (Rb) Aplicaçã o do esmalte Ácido cítrico 0,1% por 30min (lesão inicial de erosão)
Os dados de rugosidade obtidos nas três fases do experimento estão dispostos no ANEXO B.
2.7 Análise topográfica em perfilômetro 3D
Um bloco de cada grupo com média de rugosidade mais próxima da média do grupo foi analisado através da análise topográfica em perfilômetro 3D (Form Talysurf 60, Taylor Hobson, Leicester, UK). A imagem da topografia obtida em cada grupo (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10 e G11) foi comparada qualitativamente. Em cada espécime, uma área de 1 mm2 (1x1mm) foi escaneada com uma resolução-z de 20nm empregando 4.000 steps na direção x e um espaço de 2µm na direção y. As imagens 3D reconstruídas foram comparadas com imagens de dentina hígida e com lesão erosiva inicial.
2.8 Análise ao microscópio eletrônico de varredura (MEV)
Após o experimento, os blocos foram avaliados ao MEV para análise quantitativa e qualitativa. Para tal, os mesmos foram secos em estufa a temperatura de 37ºC durante 24h. Todos os blocos foram avaliados ao MEV de baixo vácuo (Phenom® ProX, Phenom, Eindhoven, The Netherlands), com voltagem de aceleração de 25kV e magnificação de 5.500x, na escala de 10μm gerando 110 micrografias de 2.500μm2 de área total por bloco. As imagens foram realizadas do centro de cada amostra (Fig 2). As micrografias foram analisadas por um único examinador, através do software Image Tool® 3.0 (University of Texas Health Science Center in San Antonio, Copyright© 1995- 2002), que permite a delimitação e cálculo de áreas, perímetros, distâncias selecionadas e contagens de objetos, dentre inúmeras outras funções, a partir de medidas padronizadas, partindo de uma calibração informada pelo usuário. A calibração foi baseada na barra de escala de 10 μm da fotomicrografia (SIVIERO et al., 2006). A partir deste software foram então realizadas as contagens e medidas necessárias.
A análise quantitativa avaliou o número de túbulos de cada micrografia, bem como a área de todos os túbulos. Os dados obtidos estão dispostos no ANEXO C.
A análise qualitativa (descritiva) considerou a característica da superfície dentinária, dentina intertubular e peritubular e condição dos túbulos dentinários após os tratamentos comparados com bloco de dentina hígida e com lesão erosiva inicial. Para esta análise as amostras foram pulverizadas com ouro e avaliadas em MEV 3D (Jeol JSM-6510LV, Tokyo, Japan) com voltagem de aceleração de 25 kV em aumentos 2.500x e 8.000x.
Fig. 2 – Amostras avaliadas ao MEV. Micrografias foram realizadas na parte central de cada bloco.
2.9 Análise estatística dos dados
Os resultados obtidos foram tabulados e, posteriormente, foi efetuado o tratamento estatístico em relação à normalidade e homogeneidade dos dados no software SPSS for Windows v. 20 (IBM, New York, USA). Os dados relacionados ao perfil superficial pós-erosão e final foram analisados com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney foi utilizado para analisar as interações entre os grupos quanto aos fatores do experimento (erosão e erosão/abrasão) e diferentes composições dos dentifrícios experimentais com e sem a utilização prévia do chá verde. O nível de significância adotado foi de α=0.05.
Title: Comparative analysis in vitro of the effect of green tea associated with new desensitizing toothpastes on erosion progression/abrasion in bovine dentin
Short title: Effect of green tea and desensitizing toothpastes on erosion progression/abrasion in dentin
Authors: Aline S.S. Menezesa, Lorena B. Chavesb, Ana B. M. Fonsecac, Thereza C. L. Coutinhoa
aPediatric Dentistry Department, School of Dentistry, Fluminense Federal University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
bUndergraduate student, School of Dentistry, Fluminense Federal University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
cStatistics Department, Mathematics and Statistics Institute, Fluminense Federal University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
Keywords: Dentin, erosion – Dentin, abrasion – Matrix metalloproteinases – Green tea – Sodium fluoride – Arginine – Hydroxyapatite – NovaMin
Corresponding author: Dra. Thereza Christina Lopes Coutinho – Universidade Federal Fluminense / Faculdade de Odontologia - Rua Mário Santos Braga, nº 30 - Campus Valonguinho, Centro, Niterói, RJ, Brazil - CEP 24040-110 - Phone: 55 21 2629-9829 – e-mail: christina.coutinho@gmail.com
Abstract
The aim of this study was to analyze in vitro, the protective effect of green tea (GT), a matrix metalloproteinases (MMP) inhibitor, associated with desensitizers toothpastes Colgate Sensitive Pro-Relief (PR) and Sensodyne Repair & Protect (RP) and a desensitizer paste Desensibilize Nano P (NP) compared to toothpastes with fluoride (F) (Crest - FD) and without F (Sensodyne Original – SO), on the progression of early erosive lesions plus abrasion in dentin. One hundred and ten bovine dentin slabs were evaluated by profilometry (baseline) and submitted to an initial erosion process by immersion in a 0.1% citric acid (pH 2.5) for 30 min. After initial profilometry (IP) evaluation, the samples were randomly divided into 11 groups (n = 10): ERO, GT + SO, SO, GT + RP, RP, GT + PR, PR, GT + FD, FD, GT + NP and NP, subjected to additional erosive challenge (EC) (cola drink, 4x / 90s / day), plus
abrasion (ABR) (280 strokes / min; load 100g / 2x / day) with suspension of diluted toothpaste (1: 3 of saliva) immediately after the first and last EC and remineralization in artificial saliva between cycles and overnight for 5 days. At the end of the experiment, the samples were evaluated for final profilometry (FP) and surface profile change (%SPC) was calculated. All blocks were also evaluated by scanning electron microscope (SEM) through Image Tool ® software to assess the number and diameter of the tubules. One block of each group was assessed qualitatively by 3D SEM and 3D profilometer. Data were statistically analyzed in SPSS v. 20 software through Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests (P <0.05). The results showed that the use of GT previous to abrasion with toothpaste without fluoride and desensitizers toothpastes had a significantly better result in FP values (P <0.05) when compared to the same groups without GT, except for FD and NP groups, where the GT did not improve their protection against erosion / abrasion. All GT groups had a significantly better value than the ERO group that only led to a statistically significant lower FP value (p = 0.000) with respect to non-GT groups. As for the % SPC, the FD group led to statistically significantly greater dentin change (46.24%) (p = 0.000) among the experimental groups, followed in descending order by SO (16.81%), FD (13.22 %), ERO (5.67%), GT + PR (0.52%) and GT+RP and GT + SO that showed negative values of %SPC (-2.93% and -4.77%, respectively), which demonstrated a recovery of the surface profile in these groups. It was observed by SEM that the number of tubules was similar in all groups (P> 0.05), with greater diameter statistically significant (p <0.05) in the groups SO (3.47), RP (3.36) and FD (3.23) when compared with these groups with GT (1.77, 2.46 and 2.57, respectively), while PR (3.28) did not differ from GT + PR (2.72). Qualitative evaluation by 3D SEM showed better occlusion of the tubules when GT was previously used, regardless of the paste used. In 3D profilometer, it was observed that the groups with GT showed smoother surfaces, on the other hand, groups without GT were more irregular similar to eroded dentin. In conclusion, the previous use of GT enhanced the action of bioactive agents in desensitizing toothpastes, except for NP, and therefore is a viable option in cases of patients with erosive lesions in dentin and dentin hypersensitivity.
Introduction
Dental erosion is a progressive, destructive process characterized by loss of hard tissue of the teeth by the action of acids contained in beverages and / or food, or even from the body itself, which can cause dentin sensitivity, pain, and aesthetic problems [Magalhães et al.,
2009b]. To Huysmans et al. [2011], the erosive tooth wear is an accelerated loss of dental hard tissue through the combined effect of erosion and mechanical loss (abrasion and attrition) on the tooth surface. As dentin has a concentration of 18-20% of organic material (90% type I collagen), the presence of a dentin surface rich in collagen seems to decrease diffusion of acid into the tissue, minimizing the occurrence of erosion [Ganss et al., 2004; Hara et al, 2005]. However, this organic matrix can be mechanically or chemically degraded, facilitating a subsequent demineralization.
Thus, when the dentin is exposed to acids, minerals present in the intertubular and peritubular dentin are released promoting the increase of the diameter of dentinal tubules and exposure of the surface layer of the collagen matrix of demineralized dentin. This surface layer of the collagen matrix can protect the underlying layer of mineralized dentin from mechanical forces and wear, then the dentin demineralization process decreases as the amount of degraded collagen increases, as is attributed to the collagen matrix the ability to prevent ion diffusion through the dentin [Kato, 2011].
So, in the dentin erosion process, a decrease in pH causes demineralization of dentin exposing the collagen fibrils. At the same time, the fall of pH activate matrix metalloproteinases (MMPs) presented in dentin and / or saliva which when the pH returns to a neutral level degrade demineralized organic matrix allowing the progression of dentin loss. Thus, application of inhibitors of MMPs could reduce dentin loss during subsequent erosive challenges. The protective layer composed of demineralized organic matrix hinders the diffusion of acid and reduce the progression of erosion in dentin [Ganss et al., 2004; Kato, 2011].
Based on this assumption, the use of MMP inhibitors has been considered effective in the treatment of disorders of the oral cavity such as dental erosion as regards its prevention. Among these, it is being studied polyphenol epigallocatechin 3-gallate, green tea component (EGCG), which has inhibitory effects on MMPs, in an attempt to avoid the loss of dentin caused by erosive and abrasive-erosive challenges [Kato et al. 2009, 2010a,b; Magalhães et al, 2009].
Considering fluoride (F) toothpastes, their action in preventing dentin erosion when not associated with other potentially relevant cations appears to be dependent on the maintenance of demineralized organic matrix [Ganss et al., 2010]. DenBesten et al. [2002] showed that F could alter the activity of MMP-20 in the enamel and recently Kato et al.
[2014] also suggested that F was able to inhibit both MMP-2 and -9 in a dose response manner, thereby giving the F a possible MMPs inhibition potential.
Some toothpastes were marketed presenting fluoride associated to therapeutic agents (bioactive agents) as the Pro-Argin ™ technology and NovaMin® as well as pastes with hydroxyapatite nanoparticle [Huang et al., 2011] that promise to act in the treatment of dentin hypersensitivity, through the formation of a reparative layer mechanism on the exposed dentin and within the dentinal tubules, repairing and protecting this dentine following acid challenges. According to Carvalho et al. [2013], calcium, phosphate and fluoride ions are released and arranged in fluoroapatite and calcium fluoride (CaF2) in demineralized tooth surface. Studies indicate these dentifrices to prevent the acid erosion and reduce sensitivity [Fowler et al., 2006; Newby et al., 2006; Zero et al., 2006; Lussi et al, 2008; Kato et al, 2010; Jham, 2010; Burwell et al, 2010; La Torre, Greenspan, 2010; West et al, 2011; Earl et al, 2011], however, there are few comparative studies in the literature.
Then, the objective of this study was to comparatively evaluate in vitro the effect of a MMP inhibitor (green tea) associated with toothpastes containing different desensitizing agents in the prevention of progression of dental erosion associated with abrasion in bovine dentin under pH cycling. It was used as evaluation method of this effect, the profilometric measurement of surface roughness (SR) expressed in microns and the resulting percentage change of the surface profile of the dentin (% SPC), as well as evaluation by scanning electron microscope (SEM), the diameter of the dentinal tubules through a specific software.
The null hypothesis tested was that the use of green tea associated with different products did not minimize the erosive effects caused by an acidic drink and abrasion using profilometry and percentage change of the surface profile of the dentin, as well as the diameter of dentinal tubules as response variables.
Material and Methods
Experimental Design
One hundred ten previously eroded bovine dentin blocks were randomly assigned to eleven treatment groups (n = 10): G1 – erosive challenge (EC) (cola drink, 4x/90s/day), no abrasion (erosion only) (ERO); G2 – EC, green tea (Yamamotoyama Midori Indústria de Chá Ltda, São Miguel Arcanjo, SP, Brazil) (GT) immersion (1 min) plus abrasion with fluoride (F)-free toothpaste Sensodyne® Original (SO) (GlaxoSmithKline, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) (GT+SO); G3 – EC plus abrasion with SO toothpaste (SO); G4 – EC, GT immersion plus
abrasion with Sensodyne® Repair&Protect (RP) (7.5% w/w NovaMin® - calcium sodium phosphosilicate, titanium dioxide, silica and 1450 ppm fluorine as NaMFP; GlaxoSmithKline, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) (GT+RP); G5 – EC plus abrasion with RP toothpaste (RP); G6 – EC, GT immersion plus abrasion with Colgate® Sensitive Pro-Relief (PR) (80000 ppm arginine, bicarbonate, calcium carbonate and 1450 ppm fluorine as NaMFP; Colgate Palmolive, São Bernardo do Campo, SP, Brazil) (GT+PR); G7 – EC plus abrasion with PR toothpaste (PR); G8 – EC, GT immersion plus abrasion with one conventional F toothpaste Crest® (FD) (1.100 ppm as NaF; Procter and Gamble Co., Cincinnati, OH, USA) (GT+FD); G9 – EC plus abrasion with FD toothpaste (FD); G10 – EC, GT immersion plus abrasion with SO and treatment with Desensibilize Nano P (NP) (nanostructured calcium phosphate as hydroxyapatite nanoparticles and 9000 ppm fluorine as NaF; FGM, Joinville, SC, Brazil) (GT+NP) and G11 – EC plus abrasion with SO and treatment with NP paste (NP). Remineralization with artificial saliva was performed between cycles and overnight for 5 days. Abrasion (280 strokes/min; load 100g) with the diluted toothpaste slurry (1:3 ratio) was performed each day immediately after the first and last EC. The factors studied were: type of paste (5 types) and conditions (3 types: erosion (ERO) + no abrasion (ABR); ERO + GT+ ABR and ERO + ABR). The surface wear and tubule diameter were analyzed as response variables.
Preparation of Dentin Specimens
Bovine incisors stored in saturated 0.1% thymol solution (pH 7.0) were used. One hundred ten enamel sections (4 x 4 mm) were prepared and mounted with sticky wax on Plexiglas blocks. The enamel surface of the sections was removed using a diamond bur (KG Sorensen 4054, Cotia, SP, Brazil) until dentin exposure. Then, the exposed dentin was ground flat with water-cooled silicon carbide (SiC) paper discs (600 and 1,200 grades; Buehler, Lake Bluff, Ill., USA) and polished with felt paper wet with diamond suspension (1µm; Buehler) resulting in dentin slabs of approximately 2 mm in thickness. After the polish, the specimens were cleaned in an ultrasonic device with deionized water for 5 min.
The baseline surface roughness (BR) of the dentin was determined by contact profilometry (SJ-301 Mitutoyo 178-953-3 A, Mitutoyo Sul Americana Ltda, Santo Amaro, SP, Brasil.). The profilometric traces were taken across the exposed surface. Three readings were performed on each block and the average wear depth was calculated (µm) [Novaski, 1994].
Initial Erosive Lesion Formation
The dentin blocks were individually immersed in 0.1% citric acid (pH 2.5) for 30 min (30mL/block) in order to promote initial erosive lesions [Hara and Zero, 2008a]. After rinsing with deionized water, the dentin blocks were gently dried with paper cloth and an initial surface roughness analysis (IR) was performed as previously described.
In order to maintain reference surfaces for lesion-depth determination, prior to the experiment, two layers of nail varnish were applied on 2/3 of the surface of each specimen to maintain reference surfaces for the dentin tissue loss determination after the experiment (1 mm of the exposed dentin area).
A sample size of 10 specimens was calculated considering an α-error level of 5% and a β-error level of 20% based on data of previous studies [Magalhães et al., 2010; Magalhães et al., 2012].
Erosive challenge and Treatments
All specimens were submitted to a 5-day erosive de- and remineralization cycling plus abrasion. Erosion was performed with a freshly opened bottle of cola drink (Coca-Cola® Company Spal, Porto Real, RJ, Brazil, pH 2.6, 30 ml/specimen, unstirred, 25ºC) four times daily for 90 s each and then, the samples were rinsed with deionized water (5 s) and transferred to artificial saliva (30ml/specimen) for 2 h [Magalhães et al., 2012]. The artificial saliva was renewed daily and consisted of 0.67g/l NaCl; 0.1168g/l CaCl2; 8g/l CMC; 0.0408g/l MgCl2; 0.96g/l KCl; 1g/l C8H8O3; 24g/l C6H14O6; 964.938ml/l H2O; 0.274g/l KH2PO4 (pH 6.8).
After the first and last erosive challenges, the specimens were exposed to abrasion with the respective toothpastes diluted in artificial saliva (1:3 ratio) at room temperature and abraded by brushing with a soft, round-end bristled toothbrush (Oral B® 30, Procter and Gamble, São Paulo, Brazil) fixed to an automatic brushing machine (MEV2, Odeme Biotechnology, Joaçaba, SC, Brazil) adjusted to a constant brushing frequency of 280 strokes/min and a constant brushing load of 100g. During abrasion, the dentin blocks were kept dipped in slurry.
Samples from G2, G4, G6, G8 and G10 were immersed in green tea during 1 min previous to abrasion. Specimens from G10 and G11 were treated with Desensibilize Nano P according to manufacturers’ instructions immediately after abrasion. The green tea was prepared according to manufacturers’ instructions: infusion of 2 g of the herb (Cammelia
sinensis leaves exposed to steam and presented as a sachet) into 200 ml of boiled water (100º
C) for 1 min. The tea was cooled off for 4 min at room temperature. The fluoride content of the tea was 0.87 mg fluoride/l and its pH, 7.0 [Kato et al., 2009].
All solutions were replaced daily, in order to avoid bacterial growth. Between challenges and dentifrice treatments, the blocks were washed with deionized water, in order to avoid contamination of the solutions.
The dentin blocks were stored in artificial saliva among acid challenges, abrasion and treatments.
Final profilometric analysis
After pH cycling, the mean final roughness (FR) was calculated using the same parameters as baseline. The dentin specimens were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the demineralized organic layer. For profilometric measurement, the nail varnish was carefully removed using a scalpel and acetone solution (1:1 water) [Magalhães et al., 2012]. The specimens were slightly dried, which means that only the excess of water was gently removed with filter paper and immediately analyzed. Three profile measurements were performed in the center of each specimen at intervals of 0.5 mm. The percentage of surface profile change (%SPC) was then calculated: (%SPC = ((IR - FR)/(IR)) ×100). One sample from each group was selected and a 3-D topographic analysis was also performed using a contact 3-D Profilometer (Form Talysurf 60i, Taylor Hobson, Leicester, UK) and compared to healthy (HD) and eroded dentin (ED) blocks. For each specimen, an area of 1 mm2 (1 x 1 mm) was scanned with a 20 nm z-resolution, employing 4,000 steps in the x-axis and a spacing of 2 µm in the y-axis.
Scanning Electron Microscopy
All dentin blocks from each group were also analyzed by scanning electron microscopy (SEM) (Phenom® ProX, Phenom, Eindhoven, The Netherlands) in low vacuum with acceleration voltage set to 25kV made under magnification of 5.500x, in a 10μm scale generating 110 micrographs of 2.500μm2 of total area per block. The number of dentinal tubules per mm2 as well as the diameter of the opened tubules was counted by one calibrated examiner, in the center of each specimen side on the micrographs by means of Image Tool® 3.0 software (University of Texas Health Science Center in San Antonio, Copyright© 1995-2002). The calibration was based upon the scale bar on the micrograph [Siviero et al., 2006].
After these measurements, one dentin block from each group was analyzed in a 3D SEM (Jeol JSM-6510LV, Tokyo, Japan) with acceleration voltage set to 25 kV and compared to healthy (HD) and eroded dentin (ED) blocks. They were immersed in Karnovsky’s fixative for 24 h and extensively washed in 0.1 M cacodylate buffer. Then, they were dried at room temperature for 24 h in desiccators and lightly gold-sputtered. The magnifications used were -2,500-, and -8,000-fold.
Statistical analysis
Statistical procedures were performed with the SPSS statistical software package for Windows, version 20.0 (IBM Corporation, New York, USA). The data of wear were analyzed with Kruskal-Wallis test. The test also calculated the 95% confidence intervals (CI). Mann-Whitney test was used to analyze the interactions among groups concerning factors such as the conditions of the challenge (ERO + no abrasion, ERO + GT +ABR or ERO + ABR), the toothpastes used and the number and diameter of the dentin tubules. The significance level was set at 0.05.
Results
The mean surface roughness (IR) values after previous erosion with citric acid and the mean roughness values following the erosive/abrasive challenges and treatments (FR) are shown in Table 1.
It was observed a statistically significant difference among groups (H= 41.68; p=0.000; p <0.05). The results showed that the use of green tea previous to abrasion with F-free and desensitizers toothpastes had a better result in the FR of the samples statistically significant (p<0.05) when compared to the same groups without green tea. On the other hand, regarding FD and NP pastes, green tea did not enhance their protection against erosion/abrasion, even though the FR values have been lower when green tea was used previously. These two groups and also F-free and RP both without green tea had the highest FR values among experimental groups. Erosion only led to a lower FR value among groups statistically significant (p=0.000), however, compared to the groups of F-free and desensitizers toothpastes associated with green tea use, this difference was not statistically significant (p>0.05).
Regarding mean surface profile change (%SPC), FD group led to statistically significant highest dentin profile change (46.24%) (p=0,000) among experimental groups except for GT+FD (32.89%), NP (31.40%), GT+NP (27.37%), and RP (20.69%), which did not significantly differ from each other and FD group (p>0.05), followed in descending order by SO (16.81%), PR (13.22%), ERO (5.67%), GT+PR (0.52%), GT+RP (-2.93%) and GT+SO (-4.77%) groups. The box-and-whisker plots for the data of all groups in the study are presented in Figure 2.
The SEM analysis of the samples is shown in Fig. 3 and 4. It was observed in SEM that the number of dentin tubules was similar for all groups (p>0.05) (Fig. 3), whereas the diameter of the tubules had a statistically significant difference among groups (H= 73.94; p=0.000; p <0.05) (Fig.4).
The highest values were found in SO (3.47), RP (3.36) and FD (3.23) groups that had the higher diameter statistically significant (p<0.05) when compared to their groups with previous use of green tea (1.77, 2.46 and 2.57, respectively). However, PR group (3.28) did not differ from GT+PR (2.72), same as observed with NP (2.95) and GT+NP (2.51) groups. ERO showed a mean value of 2.62 in the tubules’diameter that did not differ from the GT groups regardless the experimental toothpastes (Fig. 4).
The qualitative evaluation of the 3-D profilometric and 3-D SEM images are presented in Fig. 5 and 6. The 3-D profilometric analysis of the topography showed that dentin surfaces in all experimental groups presented irregularities when compared to healthy dentin. However, GT groups showed smoother surfaces, on the other hand, the other groups without GT were more irregular, exhibiting a more evident porous layer on the tissue similar as in eroded dentin (ED) (Fig. 5). Regarding the SEM images, it can be observed a better tubule occlusion when GT was used previously, regardless the paste used, as these images resemble that of the healthy dentin (HD) with its tubules filled with material similar to smear layer (Fig. 6).
Discussion
The present study assessed the effect of desensitizing toothpastes with or without previous usage of green tea compared to F-free and a conventional fluoride toothpastes on eroded bovine dentin wear by erosive/abrasive processes as well as dentine tubules diameter in SEM images by means of Image Tool® software. The study design allowed the
investigation of whether the test toothpastes protected the eroded dentin against additional erosive challenge caused by dietary acids such as soft drinks. The response variables chosen to assess this effect were profilometric measurements of surface wear (SW), SW change (%) and tubule occlusion.
Contact profilometry is widely used for this purpose [Wiegand et al., 2007a; Wiegand et al., 2007b; Kato et al., 2009; Kato et al., 2010], however, it is important to point out that, for this methodology to be used, it is essential to keep the specimens moistened before and during analysis, in order to avoid shrinkage of collagen fibrils, which could interfere with the results [Kato et al., 2009], this recommendation was followed in the present study.
The substrate chosen for this experiment was bovine dentin as a substitute for human teeth. Kato et al [2009] have shown that the activities of MMP-2 and -9 were similar when compared the bovine dentin crown to human dentin crown, indicating that there is a presence of both pro-enzyme form as the active form of these MMPs in this tissue. Besides, Schilke et al. [2000] have also demonstrated in their study that corresponding coronal dentine layers of human deciduous and permanent molars, and of bovine central incisors, are not significantly different in their number of tubules per mm2 and their tubule diameter; therefore, bovine incisor crown dentine is a suitable substitute for human molar dentine in experimental studies. It was used for this experiment artificial saliva to dilute the toothpastes at 1:3 ratio. This diluent and the dilution rate were chosen based on studies by Hara et al. [2008b] and Tursi et al. [2010] on abrasion of eroded dentin. Turssi et al. [2010] claim that the proportions of 1:3 and 1:4 resemble those observed during clinical brushing and they are probably the most used in in vitro studies. Clinically, these dilution rates may represent the different slurries formed in the mouth during brushing, with a more concentrated dilution at the initial stages. As saliva mixes with the toothpaste, higher dilutions are achieved. They also observed that the dilution rate of the toothpastes is relevant for the brushing abrasion of exposed root dentin, since friction may be greater when dilution of the toothpaste is decreased and thereby an increased surface roughness may occur.
Previous studies [Eisenburger et al., 2003; Hooper et al., 2003; Turssi et al., 2004; Lussi et al. 2004; Wiegand et al., 2007c; Magalhães et al., 2007, 2008; Rios et al., 2006, 2008; Moretto et al., 2010] have shown that abrasion of eroded teeth led to higher wear than erosion alone, same as observed in this study (Table 1 and Fig. 1). According to Attin et al. [2004] and Magalhães et al. [2008], tooth wear is a multifactorial condition caused by chemical (erosion) and mechanical (abrasion and attrition) processes, since the softened zone by erosive
challenge is more susceptible to mechanical forces, such as abrasion. This aspect is especially important in eroded dentin, where the exposed organic matrix acts as a protective layer against further demineralization, and excessive toothbrushing could impair this matrix [Kato et al., 2009].
The event that GT groups had FR values similar to the ERO group in the present study can be explained by the fact that green tea can reduce dentin wear under erosive/abrasive conditions due to the presence of EGCG (~ 400 μM), a well-known MMP inhibitor [Demeule et al., 2000] in the tea, as shown in other studies [Kato et al., 2009; Magalhães et al., 2009a].
The EGCG concentration in the green tea used in the present study was 0.185 mg/mL, which is above the reported values for the inhibition of MMP-2 and MMP-9 (10 and 0.6 μg/mL of EGCG, respectively) [Kato et al., 2009]. However, the quantity used in this in vitro study would not cause any toxicological problems if this protocol had been in vivo, as Chow et al. [2003] have reported that, tea polyphenol products in amounts equivalent to the EGCG content in 8-16 cup of green tea once a day is safe.
The study protocol simulated as closely as possible an in vivo situation, since MMPs become activated at a low pH and that their degrading activity is enhanced by the subsequent neutralization of the pH which occurs in erosion process [Magalhães et al., 2009a].
Cola drink used in this study to produce the erosive demineralization has a pH of 2.6 and this low pH might have activated the dentin-derived MMPs that exhibited their degrading potential in the following remineralization period, as MMPs, although activated, cannot degrade the organic matrix of dentin at acidic pH, since they are neutral proteases and function only in neutral pH [Kato et al., 2009]. Thus, the interval between each erosive challenge (2 h) in the present study, could allow for remineralization and also pH neutralization due to salivary buffers, which is essential for enhancing the degrading activity of the organic matrix by MMPs as stated by Kato et al. [2009].
The fluoride (F) toothpaste used (FD group) was not able to prevent erosion progression even with the previous use of GT, same as observed in NP and GT plus NP groups (Table 1). The efficacy of F to inhibit dentin erosion seems to be highly dependent on the organic matrix. According to reports of Ganss et al. [2004], the organic matrix layer of demineralized dentin exhibit a buffering capacity, which might prevent deeper dentin areas from low pH values and reduce further demineralization in the presence of high amounts of fluoride. Furthermore, Kato et al. [2014] showed in their study that NaF was able to completely inhibit the activity of MMP-2 and MMP-9 at high F concentrations (5,000 ppm).
Crest® has 1,100 ppm of NaF, such F concentration is much lower than that tested by Kato et al. [2014], which could help to explain the absence of the erosion inhibiting-effect of the FD groups.
The possible mechanism by which NaF inhibits the MMPs is not known so far. Considering that MMPs are Zn2+ and Ca2+ dependent enzymes, and F is highly electronegative, it seems logical that excess F could make these cations unavailable to participate in the catalytic process [Charone et al., 2014].
Considering the NP group, it had the highest FR values among groups (Table 1). Souza e Silva [2013] in her study also observed a higher dentin wear when using hydroxyapatite pastes compared to 2% NaF experimental toothpaste in erosive/abrasive challenges in bovine dentin both in vitro and in situ. Same as observed in the present in vitro study. The author concluded that hydroxyapatite pastes seem not to be as effective in reducing dentin erosion as they are in enamel, as shown in the study of Huang et al. [2009] and Min et al. [2011]. Then, future researches are necessary to clarify the effect of this paste on the progression of dentin erosion.
The %SPC of all groups is depicted in Figure 2. This is the first study in the literature that evaluated these data regarding dentin erosion/abrasion; therefore, it cannot be discussed with other researches. The findings in the present study can possibly be explained by the representative 3-D reconstructed images showing the topography of the groups displayed in Fig. 5. It was observed that dentin surfaces in all experimental groups presented irregularities when compared to healthy dentin; however, PR, RP and SO groups with GT showed images similar to healthy dentin, with smoothest surfaces compared to their groups without GT, same as observed in FD and NP groups (with and without GT) that presented images that resemble the image of the control group (eroded dentin) showing more peaks and valleys suggesting a more evident porous layer in the tissue.
Poggio et al. [2014] observed by AFM images, that the protective agents present in toothpastes form aggregates and/or precipitates of mineral substances, more or less abundant and this justifies roughness values, significantly higher than those expected when considering the intact dentin.
Souza et al. [2014] also found in their research that the group with fluoride toothpaste showed more irregularities, although their study was in demineralized enamel. Zhang et al. [2011] observed in demineralized deciduous enamel that after application of NaF toothpaste, numerous particles and amorphous crystals are arranged in the surface but heterogeneously.
Turssi et al. [2011] observed in eroded enamel that the application of fluoride toothpaste seemed to lead to the deposition of a mineral phase on the tissue. These findings, although in enamel tissue could explain the higher values change on the surface of the dentin that might be associated to these irregularities also observed by Poggio et al. [2014] and in the present research. However, more researches are necessary in eroded dentin to confirm the results of this study.
Considering the results of the diameter of the tubules found in the present study (Fig. 4), GT improved the tubule occlusion when associated to RP and FD. On the other hand, PR and NP did not differ from their counterpart groups with GT, which means that GT did not affect PA and NP pastes. This is the first study in the literature that used green tea previously to abrasion with bioactive toothpastes. Olley et al. [2012] observed in situ, that arginine toothpaste resulted in significant dentine occlusion compared to sodium fluoride toothpaste and water. Arginine is an amino acid found naturally in saliva. The combination of arginine and calcium carbonate mimics saliva’s ability to occlude and seal open dentinal tubules, the result is a plug which renders that tooth surface resistant to acid and thermal attacks thereby reducing fluid movement [Sharif et al. 2013]. Olley et al. [2012] stated that clinically, arginine works by absorbing onto the surface of calcium carbonate forming positive charged alkaline agglomerate. This alkaline agglomerate has a high affinity to dentine and relies on the deposition of calcium and phosphate from saliva to occlude the dentine tubules. Same as observed by Parkinson et al. [2010] in vitro and in the present study by SEM images (Fig. 5). Magalhães et al. [2007] claimed that conventional fluoride-containing toothpastes do not appear to be able to protect efficiently against erosion, also observed in this study, that FD had a higher tubule diameter, similar to SO group.
Poggio et al. [2014] studied several toothpastes including PR and RP on their role of preventing dentin erosion and observed by SEM and AFM that RP provided higher protective effect against dentin demineralization among the studied toothpastes. The authors observed in the RP group that the tubules were almost completely filled; in addition, the mineral crystals precipitating during the remineralizing treatment appeared better associated with the collagen network. According to Wefel [2009], in RP toothpaste, the active ingredient (calcium sodium phosphosilicate) reacts when exposed to aqueous media and provides calcium and phosphate ions that form a hydroxycarbonate apatite (HCA) with time. The combination of the residual NovaMin® particles and the HCA layer results in the physical occlusion of dentinal tubules, which will relieve hypersensitivity. Du Min et al. [2008] and Joshi et al. [2013] also found
