UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ANGÉLICA COSTA ARANHA CAMACHO PEREIRA
EFEITO DA ROSUVASTATINA E DAPAGLIFLOZINA NA MICROBIOTA INTESTINAL E NA SENSIBILIDADE À INSULINA DE CAMUNDONGOS
C57BL6/J EM DIETA HIPERLIPÍDICA
CAMPINAS 2017
ANGÉLICA COSTA ARANHA CAMACHO PEREIRA
EFEITO DA ROSUVASTATINA E DAPAGLIFLOZINA NA MICROBIOTA INTESTINAL E NA SENSIBILIDADE À INSULINA DE CAMUNDONGOS
C57BL6/J EM DIETA HIPERLIPÍDICA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.
ORIENTADOR: MARIO JOSE ABDALLA SAAD
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
ANGÉLICA COSTA ARANHA CAMACHO PEREIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARIO JOSE ABDALLA SAAD.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ANGÉLICA COSTA ARANHA CAMACHO PEREIRAORIENTADOR (A) PROF(A). DR(A). MARIO JOSE ABDALLA SAAD
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). MARIO JOSE ABDALLA SAAD
2. PROF(A). DR(A). RAQUEL FRANCO LEAL
3. PROF(A). DR(A). PATRICIA ALINE BOER
4. PROF(A). DR(A). CARLA ROBERTA DE OLIVEIRA CARVALHO
5. PROF(A). DR(A). SÉRGIO ATALA DIB
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a meus pais, Pedro e Benedita, que me proporcionaram a oportunidade de buscar o caminho do conhecimento e me ensinaram a importância do trabalho e da dedicação. Ao meu marido, Rodnei, meu grande incentivador. As minhas filhas, Camila e Carolina, minha razão de viver. Obrigada pelo estímulo e apoio incondicionais.
AGRADECIMENTOS
“Se quiser ir apenas rápido, vá sozinho; se quiser ir longe, vá com alguém.” (provérbio africano)
Esse trabalho não teria sido possível sem o apoio e o auxílio de algumas pessoas. Quero a elas expressar meu sincero agradecimento.
Ao meu orientador, Dr. Mario José Abdalla Saad, exemplo de dedicação profissional, pela grande oportunidade a mim concedida. Obrigada pela confiança, estímulo e atenção dedicados à concretização deste sonho.
Aos membros da banca examinadora, pela honra em tê-los como avaliadores deste trabalho e pelos valiosos conselhos e sugestões.
À minha família e amigos, pelo apoio e torcida, e por acreditarem comigo neste sonho que se concretiza.
À Dioze e Andrey, pela generosa disposição em me auxiliar em todos os momentos. Obrigada pela amizade, palavras, estímulos, conselhos e contribuição incomensurável nos procedimentos necessários à realização deste trabalho.
As minhas amigas Kelly e Francine, pelo auxílio, companheirismo, e pelos momentos compartilhados. Por toda a ajuda nos experimentos. Pelos bate-papos e palavras de incentivo. Sem vocês não teria sido possível.
Aos meus companheiros de laboratório pela valiosa amizade, atenção e colaboração.
Ao Sr. Luís Janeri (in memorian), Sr. Jósimo Pinheiro e Sandra, pelo constante suporte, apoio e atenção.
À equipe do biotério (Sr. Zé, Sr. Antônio e Sr. Marino) e do CEMIB (Érica), obrigada por cuidarem com tanta dedicação dos nossos animais experimentais.
Às agências de fomento FAPESP, CNPQ, CAPES e INCT, pela bolsa de estudos concedida e pelo financiamento das pesquisas que permitiram o desenvolvimento deste trabalho.
RESUMO
A obesidade é um problema crescente e atinge um número cada vez maior de indivíduos em todo o mundo. Ela está correlacionada ao desenvolvimento de diversos distúrbios metabólicos, como resistência à insulina, diabetes tipo 2, dislipidemias e doenças cardiovasculares. Nos últimos anos, a microbiota intestinal tem sido amplamente correlacionada a esses distúrbios metabólicos. Dentre os fármacos muito utilizados na prática clínica, para tratar comorbidades relacionadas à obesidade, estão a dapagliflozina e a rosuvastatina. Sendo assim, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da administração destes fármacos sobre a microbiota intestinal e os parâmetros metabólicos de camundongos submetidos à dieta hiperlipídica. Para tanto, camundongos C57BL6/J machos foram divididos em quatro grupos: controle (C); controle tratado com dapagliflozina (C+DP) ou rosuvastatina (C+RS); dieta (DH) e dieta tratado com dapagliflozina (DH+DP) ou rosuvastatina (DH+RS). Os fármacos foram administrados por via oral, através de gavagem, durante 30 dias. O tratamento com dapagliflozina induziu uma melhora na tolerância à glicose e resistência à insulina, nos animais em dieta hiperlipídica, além de uma melhora na sinalização da insulina em fígado, músculo e tecido adiposo. Da mesma forma, a dapagliflozina alterou a composição da microbiota intestinal, promovendo uma redução na proporção de Bacteroidetes e um aumento de Proteobacteria no grupo controle e, de maneira menos pronunciada, no grupo em dieta hiperlipídica. Observou-se, também, um aumento relativo na prevalência de Akkermansia, Faecalibacterium, Bilophila e Ruminococcus nos animais em dieta hiperlipídica
que receberam tratamento. E uma redução do gênero Allobaculum neste mesmo grupo. O transplante da microbiota intestinal dos animais em dieta tratados com dapagliflozina não produziu o mesmo efeito do fármaco em animais obesos. O tratamento com rosuvastatina reduziu a glicemia de jejum, a tolerância à glicose e a resistência à insulina, além de aumentar a fosforilação da Akt em fígado e músculo dos animais em dieta hiperlipídica. Além disso, produziu alterações na microbiota intestinal, reduzindo a proporção de Bacteroidetes e promovendo um aumento de Firmicutes, nos animais controle. Por outro lado, nos animais em dieta, aumentou a prevalência de Bacteroidetes, enquanto a proporção de
Bilophila e uma redução de Allobaculum nos animais em dieta hiperlipídica que
receberam tratamento com esse fármaco. O transplante da microbiota intestinal dos animais em dieta tratados com rosuvastatina não reproduziu o efeito deste fármaco em animais obesos. Assim, concluímos que ambas, dapagliflozina e rosuvastatina, são capazes de modificar a microbiota intestinal dos animais com obesidade induzida por dieta. Ambas também produzem efeitos positivos sobre o metabolismo e a homeostase da glicose nesses animais. Entretanto, as alterações da microbiota não parecem ter correlação com seus efeitos metabólicos.
ABSTRACT
Obesity is a growing problem and affects an increasing number of individuals all over the world. It correlates with the development of several metabolic disorders, including insulin resistance, type 2 diabetes, dyslipidemia and cardiovascular diseases. In recent years, gut microbiota has been largely related to these metabolic disorders. Among the drugs most used in clinical practice to treat obesity-related comorbidities are dapagliflozin and rosuvastatin. Thus, the main objective of this study was to evaluate the effects of dapagliflozin and rosuvastatin administration on gut microbiota and metabolic parameters of mice fed a high-fat diet. Therefore, C57BL6/J male mice were divided into four groups: control group; control group plus dapagliflozin or rosuvastatin; high-fat diet group and high-fat diet plus dapagliflozin or rosuvastatin. Drugs were administered orally by gavage for 30 days. Dapagliflozin treatment induced an improvement in glucose tolerance and insulin resistance on high-fat diet mice. In addition, there was an improvement in insulin signaling in liver, muscle and adipose tissue. Likewise, dapagliflozin altered the composition of the gut microbiota, promoting a reduction in the proportion of Bacteroidetes and an increase of Proteobacteria in the control group and, in a less pronounced way, in the high-fat diet group. There was also a relative increase in the prevalence of Akkermansia, Faecalibacterium, Bilophila, and
Ruminococcus in high-fat diet mice treated with this drug. And, also, a reduction of Allobaculum gender in the same group. The gut microbiota transplantation from
high-fat fed mice treated with dapagliflozin did not reproduce the same effect of drug administration in obese animals. Rosuvastatin treatment reduced fasting glucose, glucose tolerance and insulin resistance, and improved Akt phosphorylation in liver and muscle of high-fat fed mice. In addition, it produced alterations in gut microbiota, reducing the proportion of Bacteroidetes and promoting an increase of Firmicutes, in the control animals. On the other hand, in animals on high-fat diet, the prevalence of Bacteroidetes increased, while the proportion of Firmicutes remained unchanged. There was also an increase of the genus Bilophila and and a reduction of Allobaculum in high-fat fed mice that received treatment with this drug. The gut microbiota transplantation from high-fat fed mice treated with rosuvastatin did not reproduce the effect of drug administration in obese animals. Thus, we conclude that both, dapagliflozin and
rosuvastatin, are able to modify the gut microbiota of diet induced obese mice. Both, also, have positive effects on glucose metabolism and homeostasis of these animals. However, the changes on gut microbiota do not seem to correlate with their metabolic effects.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGL Ácidos Graxos LivresAKT Proteína quinase B
ANOVA Análise de Variância
CLAMS Comprehensive Lab Animal Monitoring System
DEXA Dual-energy X-ray absorptiometry
DM2 Diabetes mellitus tipo 2
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético
ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
GTT Glucose Tolerance Test - Teste de Tolerância a Glicose
GLUT 4 Transportador de Glicose 4
HMG-CoaR 3- hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase
IMC Índice de Massa Corpórea
IKKβ IκB quinase β
IL-6 Interleucina-6
IRS-1 Insulin Receptor Substrate 1 - Substrato 1 do receptor de insulina
IR Insulin Receptor- Receptor de insulina
ITT Insulin Tolerance Test- Teste de Tolerância à Insulina
JNK c-jun N-terminal quinase
LPS Lipopolissacarídeo
Na2S Sulfeto de Sódio
PI3K Fosfatidilinositol 3 quinase
PMSF Fluoreto de fenilmetilssulfonila
PKC Proteína Kinase C
RT- PCR Real Time Polimerase Chain Reaction - Reação em cadeia da
polimerase
RER Respiratory Exchange Ratio
SGLT2 Co-transportador de sódio/glicose tipo 2
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TLR4 Toll like receptor 4
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Ingredientes e Composição Nutricional entre a dieta padrão AIN93G e a dieta modificada hiperlipídica aplicada em nosso laboratório...32
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. A via de sinalização da insulina e os possíveis pontos em que ela pode
sofrer interferências que podem levar a resistência à insulina ...20
Figura 2. Relação entre citocinas pró-inflamatórias e resistência à insulina nos tecidos periféricos...23
Figura 3. Fórmula molecular da dapagliflozina...27
Figura 4. Etapa da síntese do colesterol inibida pelas estatinas...28
Figura 5. Delineamento Experimental...33
Figura 6. Caracterização do Peso Corporal e Ingestão Alimentar- dapagliflozina...45
Figura 7. Caracterização da Composição Corporal- dapagliflozina...46
Figura 8. Respirometria- dapagliflozina...47
Figura 9. Calorimetria e Atividade Locomotora-dapagliflozina...48
Figura 10. Caracterização da Tolerância à Glicose no Tratamento com Dapaglifozina...49
Figura 11. Caracterização da Tolerância à Insulina no Tratamento com Dapaglifozina...50
Figura 12. Clamp Euglicêmico-Hiperinsulinêmico – dapagliflozina...50
Figura 13. Via de Sinalização da Insulina em Animais Tratados com Dapagliflozina...52
Figura 14. Análise metagenômica da prevalência de filos na microbiota intestinal após tratamento com dapagliflozina...54
Figura 15. Análise metagenômica da prevalência de gêneros na microbiota intestinal após tratamento com dapagliflozina...56
Figura 16. Dosagem sérica de LPS- dapagliflozina...57
Figura 17. Dosagem sérica de IL-6 e TNFα- dapagliflozina...58
Figura 18. Expressão do mRNA das proteínas de junção em cólon de animais tratados com dapagliflozina...59
Figura 19. Expressão das proteínas de junção Claudina e ZO-1 em cólon de animais tratados com dapagliflozina ...60
Figura 20. Parâmetros metabólicos dos animais em dieta hiperlipídica que receberam transplante de microbiota- dapagliflozina...62
Figura 21. Caracterização do Peso Corporal e Ingestão Alimentar- rosuvastatina...63
Figura 22. Respirometria- rosuvastatina...65
Figura 23. Calorimetria e Atividade Locomotora- rosuvastatina...66
Figura 24. Caracterização da Tolerância à Glicose no Tratamento com Rosuvastatina ...68
Figura 25. Caracterização da Tolerância à Insulina no Tratamento com Rosuvastatina...69
Figura 27. Via de Sinalização da Insulina em Animais Tratados com Rosuvastatina...72
Figura 28. Análise metagenômica da prevalência de filos na microbiota intestinal após tratamento com rosuvastatina...74
Figura 29. Análise metagenômica da prevalência de gêneros na microbiota intestinal após tratamento com rosuvastatina...76
Figura 30. Dosagem sérica de LPS- rosuvastatina...77
Figura 31. Dosagem sérica de IL-6 e TNFα- rosuvastatina...78
Figura 32. Expressão do mRNA das proteínas de junção em cólon de animais tratados com rosuvastatina...80
Figura 33. Expressão da proteína de junção Ocludina em cólon de animais tratados com rosuvastatina...82
Figura 34. Parâmetros metabólicos dos animais em dieta hiperlipídica que receberam transplante de microbiota- rosuvastatina...84
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO... 19 OBJETIVOS... 30 MATERIAIS E MÉTODOS ... 31 RESULTADOS... 44 DISCUSSÃO... 83 CONCLUSÃO... 96 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 971- INTRODUÇÃO
Atualmente, a obesidade é considerada um problema de saúde pública já que sua prevalência vem crescendo mundialmente, afetando um grande número de indivíduos.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de 1 bilhão de adultos em todo o mundo foram classificados com sobrepeso (IMC ≥ 25 kg / m2) e 300 milhões como clinicamente obesos (IMC ≥ 30kg / m2) em 2002. A razão para o aumento da prevalência da obesidade é atribuída à maior abundância de alimentos e aos níveis mais baixos de atividade física (Haffner S, 2006). Dados recentes indicam que esses números continuam a crescer. Em 2014, mais de 1,9 bilhões de adultos, acima de 18 anos, apresentavam sobrepeso. Destes, mais de 600 milhões eram obesos (WHO, 2016).
O aumento da prevalência de diabetes tipo 2 está intimamente correlacionado ao aumento da obesidade. Cerca de 90% dos casos de diabetes tipo 2 é atribuído ao excesso de peso. Além disso, cerca de 197 milhões de pessoas em todo o mundo têm tolerância à glicose reduzida, mais comumente por causa da obesidade e da síndrome metabólica associada. Este número deverá aumentar para 420 milhões até 2025 (Hossain P et al, 2007).
A resistência à insulina (RI) é uma condição que acompanha a obesidade e o diabetes mellitus tipo 2 . Ela é caracterizada por uma diminuição da resposta à este hormônio em seus vários tecidos como o hepático, o músculo esquelético e o tecido adiposo. Nestes, ocorre menor captação de glicose induzida por insulina (Kahn, 1994; Saltiel e Kahn, 2001). A evolução desse quadro pode resultar em intolerância à glicose e, posteriormente, evoluir para o diabetes tipo 2 (Ye J, 2013).
Em condições fisiológicas, a sinalização intracelular da insulina inicia-se após a sua ligação ao receptor específico de membrana, denominado receptor de insulina (IR). Trata-se de uma proteína heterotetramérica com atividade quinase, composta por duas subunidades alfa (α) e duas subunidades beta (β) (Saltiel e Kahn, 2001). As subunidades α encontram-se na face externa da membrana
celular, enquanto as subunidades β são proteínas transmembrana. A insulina liga-se a porção α do liga-seu receptor, estimulando a autofosforilação das subunidades β, que apresentam atividade tirosina quinase intrínseca. A ativação do IR estimula a fosforilação em tirosina de diversos substratos, entre eles, o substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) e 2 (IRS-2) (Pessin e Saltiel, 2000). A fosforilação das proteínas IRSs permite a criação de sítios de ligação para outras proteínas como a fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), promovendo sua ativação. A ativação da PI3K, indiretamente, aumenta a fosforilação em serina da proteína serina/treonina quinase B (Akt). A Akt atua aumentando a captação periférica de glicose, principalmente nos tecidos muscular e adiposo, por aumentar a translocação dos transportadores de glicose (GLUTs), do citoplasma para a membrana plasmática, o que resulta em captação celular de glicose por difusão facilitada após a ingestão alimentar (Abel et al, 2001).
Figura 1: A via de sinalização da insulina e os possíveis pontos em que ela pode
Levando-se em consideração a cascata de eventos que compõe a via de sinalização da insulina, o IR é, em si, uma molécula cuja regulação negativa pode contribuir para a diminuição da ação deste hormônio. Sendo assim, mutações genéticas nesse receptor ou redução de sua expressão ou atividade podem contribuir para o seu mau funcionamento (Accili D et al, 1992; Le Marchand-Brustel Y et al, 1985).
Em estados de resistência à insulina, mediadores como IL-1β e ácidos graxos livres (AGL) levam à ativação de serinas quinases como IKKβ, JNK e PKCs por meio de vias de sinalização intermediárias. As serina-quinases são potentes inibidores da via de sinalização da insulina. Elas atuam aumentando o número de resíduos de serina e treonina fosforilados no IRS-1, tornando esse substrato mais refratário à associação com o receptor de insulina e, conseqüentemente, reduzindo sua fosforilação em tirosina, o que pode contribuir para a resistência à insulina durante situações de estresse fisiológico, como inflamação e obesidade (Zick Y, 2005; Boura-Halfon e Zick, 2009).
A obesidade é caracterizada por uma inflamação crônica e subclínica que está intimamente relacionada a resistência à insulina e a patogênese do diabetes tipo 2. A inflamação associada à obesidade começa no tecido adiposo com a infiltração de macrófagos e elevada expressão de citocinas pró-inflamatórias (Xu H et al, 2003; Ye e Mcguinness, 2013). Esses macrófagos são a principal fonte de TNFα e IL-6, que contribuem para o desenvolvimento de resistência à insulina em tecidos como o múscular esquelético e hepático (Hotamisligil GS et al, 1995; Bastard JP et al, 2006).
Entre as citocinas pró-inflamatórias, o TNFα é um dos principais agentes de indução de resistência à insulina (Hotamisligil e Spiegelman, 1994). Ele diminui a sinalização da insulina ao inibir a fosforilação em tirosina, estimulada por insulina, através da fosforilação em serina 307 do IRS-1 (Paz K et al, 1997; Aguirre V et al, 2002). Estudos mostraram que, quando os adipócitos eram tratados com TNFα, a sinalização da insulina foi prejudicada, principalmente devido a alterações na transcrição de moléculas responsáveis por essa sinalização, em particular o IR, o IRS-1, e Glut4 (Sthephens JM, 1992). Os estudos com animais também
mostraram que a indução de níveis aumentados de TNFα levava a resistência à insulina e que o bloqueio de funções desta citocina por intervenções genéticas e farmacológicas melhoravam essa condição (Hotamisligil GS et al, 1993; Uysal KT
et al, 1997; Ventre J et al, 1997). Outros trabalhos realizados em modelos animais
de obesidade, e também em humanos obesos, uniformemente mostraram aumento dos níveis de TNFα circulante (Katsuki A et al, 1998; Winkler G et al, 1998). Estes estudos foram o início da correlação entre inflamação e a resistência à insulina induzida pela obesidade.
A Interleucina 6 (IL-6) é outra citocina pró-inflamatória envolvida no desenvolvimento de diabetes tipo 2 em humanos (Pradhan A et al, 2001).
Estudos em cultura primária de hepatócitos de rato e em linhagem de células de hepatocarcinoma humano, HepG2, demonstraram que o IL-6 causa diminuição da fosforilação em tirosina do IRS-1 e diminuição da associação da subunidade p85 de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) com o IRS-1 em resposta a níveis fisiológicos de insulina. Além disso, a ativação dependente de insulina da Akt é também marcadamente inibida por tratamento com IL-6, sugerindo um papel direto desta na resistência à insulina nos hepatócitos (Senn J et al, 2002). No entanto, estudos com animais produziram resultados contraditórios em relação ao papel desta citocina no desenvolvimento de resistência à insulina. A infusão aguda de IL-6 em camundongos induz a resistência à insulina espontânea na ausência de obesidade (Kim H J et al, 2004). No entanto, em outro estudo, camundongos
knockout para IL-6 desenvolveram obesidade e resistência à insulina de início
tardio (Wallenius V et al, 2002).
Isso pode indicar que, embora certas citocinas sejam necessárias para iniciar a inflamação e resistência à insulina durante a fase inicial de desenvolvimento da obesidade, as mesmas podem não ser necessárias em fases posteriores. Outra possibilidade é que sejam necessárias várias citocinas para regular coordenadamente o desenvolvimento da doença. Uma única citocina não é suficiente para mediar a complexa inflamação e resistência à insulina induzida pela obesidade (Lee e Lee, 2014).
Figura 2: Relação entre citocinas pró-inflamatórias e resistência à insulina nos tecidos periféricos (adaptado de Bastard JP et al, 2006).
Recentemente, diversos estudos têm apontado a microbiota intestinal como um importante fator no desenvolvimento de distúrbios metabólicos como obesidade e diabetes (Tilg H et al, 2014; Saad MJA et al, 2016). Trabalhos utilizando modelos animais e humanos sugerem que estas doenças estão associadas a uma profunda disbiose e vários deles surgiram na tentativa de desvendar a relação entre a composição da microbiota intestinal e o desenvolvimento destas doenças (Turnbaugh PJ et al, 2009; Ley R et al, 2006; Qyn J et al, 2012; Zhang X et al, 2013).
A microbiota intestinal humana é composta por uma grande diversidade de microorganismos, dentre eles bactérias, vírus e protozoários. As bactérias, por estarem presentes em um grande número (aproximadamente 100 trilhões de bactérias habitam o intestino humano), possuem um papel bastante importante na homeostase do organismo de seu hospedeiro (Savage DC, 1977; Bäckhed F et al,
2005). Elas afetam a obtenção de nutrientes, a regulação energética e a imunidade do intestino e do organismo como um todo (Bocci V, 1992; Sekirov e Finlay, 2009; Tsukumo DM et al, 2014). No total, a microbiota intestinal consiste de aproximadamente 500-1000 espécies sendo que os filos mais abundantes no intestino humano são Firmicutes e Bacteroidetes. Outros filos, como:
Proteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria, Fusobacteria e Cyanobacteria,
estão presentes em menores proporções (Qin J et al, 2010; Gill SR et al, 2006; Turnbaugh PJ et al, 2007).
Um estudo recente demonstrou claramente a relação entre o desenvolvimento da obesidade e a composição da microbiota intestinal. Ridaura e colaboradores (Ridaura VK et al, 2013) recrutaram quatro pares de gêmeas idênticas discordantes para a obesidade e transferiram a microbiota intestinal para camundongos germ-free. Os animais que receberam um transplante de doadores humanos obesos (Ob) desenvolveram aumento da adiposidade em comparação com aqueles que receberam transplantes dos doadores humanos magros (LN).
Co-housing de camundongos que abrigavam as bactérias cultivadas a partir da
microbiota dos obesos (Obch) com camundongos que continham as bactérias
cultivadas a partir da microbiota dos magros (Lnch) preveniu o desenvolvimento do aumento da adiposidade nos camundongos Obch. Isto ocorreu em paralelo com a
colonização do intestino bem sucedida dos animais Obch por bactérias dos
camundongos Lnch. Este mesmo estudo também identificou a dieta como um fator
importante na transmissão da microbiota e fenótipo do doador. Cepas bacterianas derivadas dos camundogos Lnch colonizaram e melhoraram o excesso de
adiposidade dos camundongos Obch, quando estes foram alimentados com uma
dieta de baixo teor de gordura e rica em fibras. O mesmo não ocorreu quando os animais foram alimentados com uma dieta rica em gordura saturada e pobre em fibras.
Este e outros estudos demonstram que muitos fatores podem influenciar a composição da microbiota intestinal e dentre eles estão enfermidades, medicamentos e genética do hospedeiro. Mas a dieta é o fator que tem maior influência sobre a sua diversidade (Maukonen e Saarela, 2015; Scott KP et al, 2013).
Cani e colaboradores (Cani PD et al, 2007) demonstraram que uma dieta rica em gordura alterou profundamente a composição da microbiota intestinal em camundongos e que a diminuição de Bifidobacterium spp estava inversamente correlacionada com peso corporal, massa gorda, resistência à insulina e inflamação.
Em outro estudo, animais obesos alimentados com essa dieta apresentaram alta quantidade de microrganismos da classe Mollicutes (pertencente ao filo Firmicutes), que apresentam alta expressão de β-frutosidase, uma enzima capaz de degradar carboidratos que contêm frutose, como a sacarose (Turnbaugh PJ et al, 2008).
A dieta hiperlipídica é capaz de mudar a microbiota do animal em apenas um dia. Ela promove aumento dos filos Firmicutes e Proteobacteria e diminui a presença de Bacteroidetes (Hildebrandt M et al, 2009). Em outro estudo, conduzido por Turnbaugh e colaboradores (Turnbaugh PJ et al, 2009), a microbiota intestinal de humanos adultos foi transplantada em animais germ-free, criando um modelo animal representativo do ecossistema intestinal humano. Quando esses animais foram posteriormente colocados em uma dieta rica em gorduras, houve uma rápida mudança na diversidade da microbiota, com um aumento de Firmicutes (especialmente das classes Erysipelotrichi e Bacilli) e uma redução proporcional de Bacteroidetes.
Cani e colaboradores também demonstraram em uma série de estudos que uma dieta rica em gorduras (72% de gordura saturada) é capaz de promover modificações na microbiota intestinal, além de elevar os níveis plasmáticos de LPS (que é um componente da parede de bactérias gram-negativas). Esse aumento de LPS, por sua vez, é devido ao aumento da permeabilidade intestinal, dada pela redução das proteínas “tight junctions” (ocludina e ZO-1), provocada pela dieta hiperlipídica. Estas proteínas são responsáveis por manter os enterócitos conectados entre si, tornando o epitélio intestinal impermeável. Este seria, então, o gatilho para um processo inflamatório subclínico, caracterizado como um estado de “endotoxemia metabólica”, que culminaria em aumento da deposição de gordura, inflamação sistêmica e específica do tecido (por exemplo,
hepático, múscular esquelético e adiposo) e em resistência à insulina (Cani PD
et al, 2007; Cani PD et al, 2008).
Em resumo, é possível que a resistência à insulina na obesidade tenha início com a alteração da microbiota e maior absorção de produtos bacterianos e LPS, mas, posteriormente, o fenômeno inflamatório subclínico sistêmico adquire um papel relevante na patogênese da obesidade e do diabetes tipo 2.
Nesta intrincada rede de mecanismos que correlacionam a obesidade a comorbidades como a resistência à insulina, diabetes tipo 2, dislipidemias e doenças cardiovasculares, a terapêutica inclui uma vasta gama de agentes farmacológicos.
Dentre eles, estão os fármacos hipolipemiantes, utilizados no tratamento das dislipidemias. A farmacoterapêutica para quadros de dislipidemia utiliza-se de diversas classes de fármacos como resinas sequestrantes de ácidos biliares, fibratos, ácido nicotínico, inibidores seletivos da absorção de colesterol e inibidores da 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima-A (HMG Coa) redutase (estatinas) (Paham K, 2006; O’Connor P et al, 1990).
No caso do diabetes tipo 2, a terapêutica pode variar imensamente. Podem ser utilizados derivados da sulfoniluréia (como a glimepirida), biguanidas (como a metformina), agonistas do PPARγ (como a pioglitazona), incretinas (incluindo agonistas do receptor do peptídeo 1 semelhante a glucagon), inibidores de dipeptidil peptidase 4 (DPP-4) e inibidores do co-transportador de sódio/glicose 2 (SGLT2) . Estes agentes podem ser utilizados individualmente ou em combinação com tratamentos bem estabelecidos (Verma e Hussain, 2016; Tahrani A et al, 2016).
No presente estudo, foram utilizados dois fármacos comumente escolhidos na prática clinica, a dapagliflozina e a rosuvastatina.
As gliflozinas são uma nova classe de antidiabéticos orais que atuam especificamente inibindo a função do co-transportador de sódio/glicose 2, nos rins. A dapagliflozina, que pertence a essa classe de medicamentos, é um inibidor potente, altamente seletivo e reversível do SGLT2, o principal transportador
responsável pela reabsorção da glicose do filtrado glomerular. Com isso, ela melhora o controle glicêmico em pacientes com diabetes mellitus tipo 2, reduzindo a reabsorção renal de glicose e levando à excreção do excesso dessa glicose na urina (glicosúria) (Hasan FM et al, 2014; Bonner C et al, 2015).
Os co-transportadores SGLT2 são responsáveis pela reabsorção da maior parte da glicose filtrada pelos rins (cerca de 90%). A inibição farmacológica desses co-transportadores reduz a hiperglicemia por aumentar a excreção urinária de glicose. A quantidade de glicose excretada na urina depende tanto do nível de hiperglicemia quanto da taxa de filtração glomerular. Os resultados de numerosos ensaios clínicos aleatórios, controlados com placebo, mostraram reduções significativas nos níveis de hemoglobina glicada (HbA1c) e uma diminuição significativa da glicemia de jejum durante o tratamento com essa classe de fármacos, tanto em monoterapia quanto em adição a outras terapias de redução da glicose, incluindo a insulina, em doentes com DM2 (Scheen A, 2015).
Quanto à farmacocinética, a dapagliflozina é rapidamente absorvida após administração por via oral, sendo sua biodisponibilidade em torno de 78%. Possui meia-vida de 13 h. Após a administração de uma dose de 50 mg de [14C]-dapagliflozina, 96% é recuperado, sendo 75% na urina e 21% nas fezes. Nas fezes, aproximadamente 15% da dose é excretada na forma de droga inalterada (Obermeier M et al, 2010; Nair e Wilding, 2010; Kasichayanula S et al, 2014; Tahara A et al, 2016).
As estatinas, classe farmacológica da qual faz parte a rosuvastatina, são fármacos hipolipemiantes, que atuam reduzindo a síntese do colesterol, através da inibição da enzima HMG-Coa redutase (Holdgate GA et al, 2003).
A rosuvastatina é um enantiômero único que é administrado sob a forma de um sal de cálcio. Ela é relativamente mais hidrofílica que as outras estatinas (McTaggart F et al, 2001).
Nos estudos “in vitro” e “in vivo”, a rosuvastatina inibe a enzima HMG-CoA redutase e a síntese de colesterol a uma extensão significativamente maior do que outras estatinas. Os efeitos da rosuvastina se mostraram seletivos para as células hepáticas, com a captação mínima por células não hepáticas (Keating G
et al, 2008).
A rosuvastatina aumenta a depuração plasmática de lipoproteína de baixa densidade (LDL) por aumentar a expressão dos receptores de LDL hepáticos (Igel M et al, 2002).
As propriedades farmacocinéticas da rosuvastatina são proporcionais à dose, com pouca ou nenhuma acumulação após administração repetida. Sua biodisponibilidade absoluta é de aproximadamente 20%. Seu metabolismo ocorre principalmente através do citocromo P450 (CYP) 2C9. N-des-metil-rosuvastatina é o metabólito principal. Esse fármaco sofre excreção biliar, predominantemente, com 90% de uma dose oral única de rosuvastatina radioativa recuperada nas fezes, sendo 92%, como o composto inalterado (Scott LJ et al, 2004).
Face ao exposto, como nenhum trabalho procurou abordar o efeito do tratamento com dapagliflozina e rosuvastatina na microbiota intestinal relacionando-os com os parâmetros metabólicos, o presente estudo procurou investigar essas possíveis alterações em modelo animal de obesidade induzida por dieta hiperlipídica.
2-
OBJETIVOS
2.1- Geral
Avaliar os efeitos do tratamento com dapagliflozina ou rosuvastatina sobre a microbiota intestinal e os parâmetros metabólicos de camundongos submetidos à dieta hiperlipídica.
2.2- Específicos
Avaliar os efeitos do tratamento com dapagliflozina ou rosuvastatina nos seguintes aspectos:
• Composição da microbiota intestinal dos animais tratados e não tratados com os fármacos;
• Peso corporal e ingestão alimentar;
• Glicemia de jejum, tolerância à glicose e insulina e utilização da glicose; • Via de sinalização da insulina nos tecidos insulino-responsivos (fígado,
músculo esquelético e tecido adiposo), através da análise da fosforilação das proteínas IRβ e Akt;
• Níveis séricos de LPS, TNF-α e IL-6
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Materiais
Tampão TRIS-HCl, fluoreto de fenilmetilssulfonila (PMSF), aprotinina, ditiotreitol (DTT) foram da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A membrana de nitrocelulose (0,25 mm), os reagentes e os aparelhos para o gel de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) foram da Bio-Rad (Richmond, CA). Os anticorpos anti-IRβ, anti-p-IRβ, anti-Akt, anti-p-Akt Ser 473 e anti-claudina foram importados da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos anti-ocludina e anti-ZO-1 foram da Abcam (Cambridge, UK). Insulina recombinante humana (Humulin®) foi fabricada pela Elli Lilly Co (Indianapolis, IN). A dapagliflozina foi obtida comercialmente sob o nome de Forxiga® 10 mg (Bristol
Meyers Squibb). A rosuvastatina foi obtida na forma de principio ativo puro (Botica
Ouro da Mata).
3.2- Animais
Nesse estudo foram utilizados camundongos C57BL/6J machos obtidos no centro de Bioterismo (CEMIB) da UNICAMP, com quatro semanas de vida. Os camundongos eram acondicionados em novo ambiente e mantidos, sob condições estáveis, a 25°C, com ciclos claro-escuro fixos (12/12 horas), com livre acesso à água e alimentação com dieta padrão (Nuvilab com 70% de carboidrato, 20% de proteína e 10% de gordura). Ao completarem 8 semanas de vida, os camundongos foram randomicamente divididos em dois grupos. Um grupo foi mantido em ração padrão e outro grupo passou a ser alimentado com dieta hiperlipídica (com concentração de lípides correspondendo a 55% do conteúdo calórico total da dieta, compostos por ácidos graxos saturados) por 12 semanas, antes do inicio do tratamento. Todo experimento foi conduzido de acordo com as normas da Comissão de Ética na Experimentação Animal da Universidade (CEUA/IB - UNICAMP) – protocolo n° 3611-1 (anexo).
Tabela 1. Ingredientes e Composição Nutricional entre a dieta padrão AIN93G e a dieta modificada hiperlipídica aplicada em nosso laboratório
3.2.1- Divisão dos grupos
Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (n=5 animais/grupo) e os experimentos foram repetidos por 3 vezes.
Para o tratamento com dapagliflozina, foram utilizados os seguintes grupos:
-C: animais alimentados com ração padrão e tratados com veículo;
-C+DP: animais alimentados com ração padrão e tratados com dapagliflozina; -DH: animais alimentados com dieta hiperlipídica e tratados com veículo;
-DH+DP: animais alimentados com dieta hiperlipídica e tratados com dapagliflozina.
Já para o tratamento com rosuvastatina, foram utilizados os seguintes grupos:
-C: animais alimentados com ração padrão e tratados com veículo;
-C+RS: animais alimentados com ração padrão e tratados com rosuvastatina; -DH: animais alimentados com dieta hiperlipídica e tratados com veículo;
-DH+RS: animais alimentados com dieta hiperlipídica e tratados com rosuvastatina.
3.2.2- Protocolo de administração dos fármacos
O início do tratamento com os fármacos se deu quando os animais completaram 12 semanas em dieta hiperlipídica. Tanto a dapagliflozina quanto a rosuvastatina foram diluídas em água e administradas por via oral, uma vez ao dia, durante o período de 30 dias. As dosagens utilizadas foram de 1mg/Kg (Han S et al, 2008; Obermeier M et al, 2010) e 20 mg/kg (Fraulob JC et al, 2012) respectivamente (Figura 5).
3.2.3-Determinação da massa corporal
A massa corporal foi determinada por balança de precisão, sempre no início de cada semana e seguiu até o final do tratamento dos animais.
3.2.4- Avaliação da ingestão alimentar
Durante 6 dias após o término do tratamento com os fármacos, os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas individuais (Tecniplast®). Os dois primeiros dias representaram a fase de adaptação, na qual não houve medida de ingestão. Após a adaptação de 48 horas, iniciou-se o controle de ingestão durante 4 dias consecutivos a cada 24 horas. A ingestão alimentar foi determinada pela aferição da diferença de peso entre o alimento oferecido e o alimento restante na gaiola.
3.3- DEXA (Dual-energy X-ray absorptiometry)
Para determinação da composição corporal dos animais foi utilizado o equipamento modelo Discovery, do tipo DEXA, fabricado pela HOLOGIC, gentilmente cedido pelo Serviço de Medicina Nuclear do HC/UNICAMP. A análise trata-se de uma exploração fundamentada na passagem de baixas doses de raios-X (2 feixes colimados de 38 e 70 KeV de energia) absorvidos pelos animais que ao interagirem com estruturas ósseas e tecidos moles resultam em absorções e atenuações que foram posteriormente interpretadas pelo software. Após a ilustração e processamento das imagens pelo computador, a densidade mineral óssea, a massa óssea e a massa magra (absoluta, em gramas), além da porcentagem de gordura foram geradas a partir de um único escaneamento de corpo inteiro. Estas informações forneceram, portanto, uma análise global da distribuição da gordura corporal. Antes da realização deste experimento os animais tiveram livre acesso à água e alimentação. Os animais foram previamente sedados com ketamina e xilazina (0,32ml de ketamina/ 0,2ml de Xilazina) para
permanecerem imóveis durante o teste, que foi realizado antes e ao final do tratamento com as drogas.
3.4- Avaliação de calorimetria indireta (respirometria) e atividade locomotora
O consumo de oxigênio, produção de dióxido de carbono, quociente de troca respiratória (RER) e a atividade locomotora foram mensurados nos animais após o término dos 30 dias de tratamento com os fármacos.
As medidas foram realizadas através de um sistema de calorimetria de circuito aberto indireto (CLAMS - Comprehensive Lab Animal Monitoring System: Oxymax-CLAMS da Columbus Instruments, OH-USA) onde os animais foram mantidos em gaiolas individuais e o tempo de avaliação foi de 48 horas sendo 24 horas de adaptação e mais 24 horas de mensuração do gasto energético.
O fluxo de ar foi monitorado pelos sensores que foram previamente calibrados antes do início dos experimentos com os padrões de gás primários contendo concentrações conhecidas de O2, CO2 e N2 (Air Liquid, São Paulo,
Brasil). Sensores de O2 e CO2 captaram as amostras de ar para estimar os
valores de consumo de O2 (VO2) e produção de dióxido de carbono (VCO2). Os
dados foram calculados pelo software Oxymax Windows (Columbus Instruments, OH-USA). As medidas de VO2 e VCO2 são expressas em ml/kg/hr. O RER é
calculado usando a razão de VCO2/VO2. A atividade locomotora espontânea foi
avaliada no período de 24h, utilizando sensores de movimentos presentes na gaiola.
3.5- Dosagem sérica das concentrações de glicose
A quantificação das concentrações da glicose plasmática foi determinada com fitas reativas e glicosímetro (Optium Xceed – Abbot, Berkshire, Inglaterra).
3.5.1- Medida da glicemia de jejum
A glicemia de jejum dos animais foi medida ao final do tratamento com os fármacos. Os animais ficaram em jejum de 6 horas e o sangue foi coletado pela veia caudal.
3.5.2- Teste de tolerância glicose (GTT)
Após jejum de 6 horas, a primeira coleta de sangue foi realizada no tempo 0. Em seguida, a glicose (1g/Kg) foi injetada via intraperitoneal nos camundongos e as amostras de sangue foram coletadas da veia caudal nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos para determinação da glicose sérica. A Tolerância à glicose foi avaliada pela análise da área sob a curva (AUC).
3.5.3- Teste de tolerância à insulina (ITT)
Foi realizado após jejum de 6 horas para avaliar a sensibilidade periférica à insulina no animal intacto após o tratamento com os fármacos. A primeira coleta de sangue foi realizada no tempo 0. Em seguida, foi administrada a insulina regular (1,5 U/Kg) intraperitoneal nos camundongos e as amostras de sangue foram coletadas da veia caudal nos tempos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos para determinação da glicose sérica. A tolerância à insulina foi avaliada pelo clearance de glicose sobre os minutos iniciais do desafio de insulina. A velocidade constante do decaimento da glicose (Kitt) foi calculada usando a fórmula Kitt = 0,693/(t1/2). O t1/2 da glicose plasmática, por sua vez, é calculado a partir da inclinação da curva de regressão mínima, durante a fase linear de declínio da concentração plasmática.
3.5.4- Clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico
Para a realização desse procedimento experimental, os animais tratados com dapagliflozina, rosuvastatina e os seus controles, foram expostos a jejum de 12h e anestesiados (IP) com uma mistura de 1:3 de cloridrato de ketamina (50 mg/ml) e diazepan (5,0 mg/ml). Após a perda dos reflexos corneano e pedioso foi
implantado um cateter na veia jugular esquerda (para infusão) e a obtenção das amostras de sangue (quantificação das concentrações da glicose plasmática) foram coletados da veia caudal dos animais.
O experimento consiste na infusão contínua de insulina regular (30 mU.kg-1min-1), com a coleta de glicemia em intervalos de 5 minutos durante o
período de 2 horas. Para a manutenção da concentração de glicose plasmática nos níveis observados em jejum, uma solução de glicose 5% foi infundida nos animais e as taxas de infusão da glicose foram corrigidas a cada 5 minutos, se necessário, para manter a euglicemia entre 90 e 100 mg/dl, tentando atingir uma fase de equilíbrio (steady-state). As infusões de glicose são reguladas por bombas eletrônicas de infusão contínua.
O cálculo do consumo de glicose é feito com base no volume de glicose infundida em condições de "steady-state".
3.6- Extração dos Tecidos
Após jejum de 12 horas, os animais foram anestesiados por meio da administração intraperitoneal de ketamina (100 mg/Kg) e diazepan (5 mg/Kg) e a perda dos reflexos pedioso e corneano foi utilizada como controle da anestesia.
Inicialmente foi aberta a cavidade abdominal e retirados fragmentos dos tecidos a serem estudados (grupo negativo – sem estímulo agudo de insulina). Para os animais do grupo positivos (com estímulo de insulina), foi injetada insulina regular na veia porta na concentração de 1U. Em seguida, foram extraídos fragmentos de fígado após 30 segundos da infusão de insulina, fragmentos do músculo após 90 segundos e fragmentos do tecido adiposo após 120 segundos.
Para os estudos de expressão gênica e sequenciamento do gene 16S para metagenômica, os animais não foram submetidos a jejum. Assim, foram retirados fragmentos do tecido do cólon, assim como o conteúdo fecal desta porção intestinal.
3.7- Western blotting
3.7.1- Extração de proteínas
Para a avaliação da fosforilação das proteínas, os tecidos foram homogeneizados em tampão de extração contendo 1% de Triton X 100, 100mM de Tris (pH 7,4), 100mM de pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio, 10mM de EDTA, 10mM de ortovanadato de sódio, 2mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina. O homogeneizado foi centrifugado a 11000 rpm por 40 minutos a 4ºC, para remoção do material insolúvel. Uma parte do sobrenadante foi utilizada para determinar a concentração proteica de cada amostra pelo método colorimétrico de Biureto (Henry R, 1957); e a outra parte foi utilizada para avaliação do extrato total, ou seja, separação das proteínas por eletroforese em SDS-PAGE. O volume das amostras foi normalizado por concentração proteica.
3.7.2- Análise protéica por immunoblotting
Os extratos proteicos foram ressuspensos em tampão de Laemmli (100 µL de tampão/400 µL de amostra), contendo 100 mM de DTT. Após aquecimento a 100°C por 5 minutos, foram aplicadas no SDS-PAGE de 1,5mm, 100µg de proteína por amostra, sendo o gel balizado por marcador de peso molecular comercial, PageRuler (Bio Rad). A eletroforese foi realizada em cuba de minigel da Bio Rad, com solução tampão para eletroforese previamente diluída. O
SDS-PAGE foi submetido a 60 volts inicialmente até a passagem pela fase de
empilhamento (stacking) e 120 volts até o final do gel de resolução (resolving). As proteínas separadas em SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD banhadas com tampão de transferência durante 60 minutos a 120 Volts em gelo, como descrito por Towbin e colaboradores (Towbin et al., 1979). As membranas com as proteínas transferidas foram incubadas em solução bloqueadora (leite desnatado Molico® 5%, Tris 10 mM, NaCl 150 mM e Tween 20 0,02%) por duas horas a temperatura ambiente a fim de diminuir a ligação inespecífica dos anticorpos à membrana de nitrocelulose. Depois de lavadas em solução basal, estas membranas foram então incubadas
com anticorpos específicos, mantidas a 4 °C, overnight, sob agitação contínua. Em seguida, as membranas foram novamente lavadas com solução basal e a detecção das bandas foi realizada utilizando anticorpo secundário ligado a uma molécula de peroxidase, que reagiu à solução de quimioluminescência (SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific) seguindo as instruções do fabricante. As membranas foram reveladas através do software Image Lab em fotodocumentadora. Após a revelação e identificação das bandas, estas foram quantificadas através de densitometria óptica e análise por software específico para análise de bandas UN-SCAN-IT™ 6.0. Com estes dados foi realizada análise estatística comparando as bandas obtidas entre os diferentes grupos.
3.8- Dosagem sérica de LPS
Amostras de soro estéril foram obtidas da veia porta e diluídas à 20% (vol./vol.) com água livre de endotoxina e então aquecida à 70ºC por 10 minutos para inativar as proteínas séricas. Então, o LPS foi quantificado usando kit comercial Limulus Amebocyte Assay (Cambrex, Walkersville, MD, USA) de acordo com o protocolo do fabricante.
3.9- Dosagem sérica das concentrações plasmáticas de citocinas
Ao final do tratamento com os fármacos, amostras de sangue foram coletadas para a determinação dos níveis séricos das citocinas IL-6 e TNFα. Foram utilizados kits de ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) da marca
Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA). As amostras foram processadas de
acordo com as instruções dos fabricantes e a leitura foi realizada em leitor de ELISA a 450 nm. As concentrações das citocinas presentes nas amostras foram calculadas a partir de uma curva padrão e suas concentrações expressas em pg/ml.
3.10- Análise por RT-PCR
3.10.1- Extração de RNA de cólon
Após os tratamentos com dapagliflozina e rosuvastatina, os fragmentos do cólon foram homogeneizados em Polytron em um volume de 1 mL de Trizol. Após a homogeneização, o material insolúvel foi removido por centrifugação a 12.000 g, por 10 minutos, a 4ºC. O sobrenadante, contendo o RNA, foi então transferido para outro tubo e mantido em repouso por 5 minutos, o que permitiu a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas. Em seguida, foi adicionado 0.2 mL de clorofórmio/1mL de Trizol e a amostra foi agitada vigorosamente por 15 segundos e incubada em temperatura ambiente por 3 minutos. Após centrifugação a 12.000 g, por 15 minutos, a 4ºC, a amostra ficou separada em duas fases: a inferior, de coloração rosada, denominada orgânica e a superior, mais clara, denominada aquosa, que abrange cerca de dois terços do volume total. Nestas fases estão solubilizados o DNA e o RNA, respectivamente, além da banda de proteínas presente entre as duas. A fase aquosa foi coletada e transferida para um novo tubo, onde o RNA foi precipitado através de incubação por 10 minutos, à temperatura ambiente, com 0.5 mL de isopropanol, seguida de centrifugação a 12.000 g, por 10 minutos, a 4ºC. Para lavar o RNA, o precipitado foi ressuspendido em 1 mL de etanol 75% e a amostra centrifugada a 7.500 g, por 5 minutos, a 4ºC. O RNA foi eluído em 50 µl de água RNAse-free e quantificado em espectrofotômetro a 260nm. A integridade do RNA obtido foi determinada submetendo as amostras à eletroforese em gel de agarose (1,5%). O RNA obtido foi tratado com DNase a fim de eliminar qualquer contaminação com DNA genômico.
3.10.2- Reação de transcrição reversa
A fita-molde de cDNA foi obtida através de uma reação de transcrição reversa. Para tanto, as amostras de RNA foram submetidas a uma seleção do RNAm, utlizando-se um primer oligo dT, e posteriormente à transcrição com a enzima transcriptase Superscript III. Após a transcrição em cDNA, a amostra foi tratada com RNAse A para eliminação de resíduos de RNA.
3.10.3- PCR quantitativo (qPCR) – Real Time PCR
As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Foram utilizados primers para amplificação dos genes das proteínas claudina, ocludina e zonulina 1. O gene 18S (TaqManTM - Applied Biosystems) foi escolhido como controle endógeno da reação, o qual serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda 18S está marcada com o fluoróforo VIC, enquanto que os outros primers supracitados estão marcados com o fluoróforo FAM. Para a quantificação relativa dos genes em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 6,25µL de TaqMan Universal PCR
Master Mix 2x, 0,625µL da solução de primers e sonda, 1,625µL de água e 4,0µL
de cDNA, sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0 µL de água ao invés do cDNA. As condições de ciclagem utilizadas foram: 50ºC por 2 minutos, 95ºC por 10 minutos e 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
3.11- Transplante da microbiota intestinal
O transplante foi realizado utilizando o conteúdo fecal do ceco e cólon de animais em dieta hiperlipídica tratados com dapagliflozina e rosuvastatina por 30 dias e também de seus controles. Como receptores foram utilizados animais C57BL6J, machos, mantidos em dieta hiperlipídica por 12 semanas. Antes do transplante, esses animais foram tratados por 3 dias consecutivos com 200 µl de um cocktail de antibióticos (ampicillina, 1 g/l; metronidazol, 1 g/l; vancomicina, 0.5 g/l; neomicina, 0.5 g/l), administrado por via oral (gavagem), uma vez ao dia. No quarto dia, aproximadamente 0,5g do pool de fezes (conteúdo fecal do ceco e cólon), congelado a -80°C, foi suspenso em 5 ml de PBS contendo Na2S (0,2g/l) e
cisteína (0,5g/l). Essa suspensão foi administrada por via oral (gavagem), na quantidade de 200 µl, aos animais, após 4 h de jejum. Esse procedimento foi repetido 1 vez por semana, por 3 semanas consecutivas. Durante todo o
experimento os animais foram mantidos em gaiolas com micro-isoladores em estantes ventiladas, e mantidos em maravalha esterilizada, além de receberem dieta hiperlipídica irradiada por radiação gama e água autoclavada ad libitum (Caesar R et al, 2015).
3.12- Análise da microbiota por sequenciamento do RNAr 16S
O DNA total da microbiota intestinal foi extraído com o kit QIAmp DNA
Stool. Para cada amostra, o gene RNAr 16S foi amplificado utilizando-se o
iniciador direto composto 5´ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3´ : a sequência em itálico corresponde ao adaptador Nextera® transposase sequences A, e a sequência em negrito é o iniciador amplamente conservado 338F. O iniciador reverso usado foi 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGC AC -3’ a sequência em itálico corresponde ao adaptador Nextera® transposase sequences B e a sequência em negrito é o iniciador de ampla utilização 533R. Posteriormente foram utilizadas para o preparo das bibliotecas o kit Illumina
Truseq DNA Sample Preparation v2 com código de barra para cada amostra. O
sequenciamento foi realizado no equipamento Illumina Hiseq2000 pelo Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD).
3.13- Apresentação dos dados e análise estatística
Para verificar a ocorrência de diferenças significativas entre os grupos estudados foi utilizada a Análise de Variância (ANOVA). Nos casos em que houve diferença significativa, o pós-teste de Bonferroni foi utilizado para detectar diferenças existentes entre todos os grupos. O nível de significância foi de 5% (p<0,05), sendo os resultados expressos como média ± erro padrão da média.
Para o caso em que foram comparados duas médias (transplante), a análise estatística foi demonstrada pelo Test t de Student, não pareado, com nível de significância de 5% (p<0,05), sendo os resultados expressos como média ± erro padrão da média.
Para análise da metagênomica, os dados foram processados pela plataforma Hiseq2500 (Illumina) e analisados utilizando o software Illumina 16S
Metagenomics que executa a classificação taxonômica da região v3/v4 do gene
16S rRNA por meio do banco de dados GreenGenes. Com os dados obtidos da plataforma, foi realizada análise estatística pelo ANOVA ou Test t de Student, não pareado, com nível de significância de 5% (p<0,05), sendo os resultados expressos como média ± erro padrão da média.
4- RESULTADOS
• DAPAGLIFLOZINA
4.1- Peso corporal e ingestão alimentar
Para a avaliação do peso corporal, os animais foram tratados com dapagliflozina por um período de 30 dias e pesados semanalmente.
A Figura 6 mostra dados de peso e ingestão alimentar comparativos considerando os quatro grupos do estudo: controle (C), controle tratado com dapagliflozina (C+DP), dieta hiperlipídica (DH) e dieta hiperlipídica tratado com dapagliflozina (DH+DP).
Não foram observadas diferenças significativas entre o peso corporal dos animais controle e controle tratado com dapagliflozina, tampouco entre os animais em dieta hiperlipídica, tratados ou não com o fármaco (Figura 6A). Como esperado, houve diferença significativa no peso corporal dos grupos alimentados com as diferentes dietas (ração padrão ou dieta hiperlipídica). Vale ressaltar que, na quarta semana de tratamento, verificou-se uma tendência em redução do peso corporal dos animais em dieta hiperlipídica tratados com o fármaco, sendo que, ao final do tratamento, estes tiveram variação de peso significativamente menor que seu controle em dieta hiperlipídica, sem tratamento (Figura 6B).
Foi analisada, também, a ingestão alimentar dos animais, durante um período de quatro dias, ao final do tratamento. Observou-se que não houve diferença na ingestão alimentar entre os grupos que receberam a mesma dieta (Figura 6C).
Figura 6: Caracterização do Peso Corporal e Ingestão Alimentar-dapagliflozina. (A): Peso corporal (B): Variação do peso corporal (C): Ingestão Alimentar. Os dados estão apresentados em média ± EPM (n=20 para peso corporal e variação do peso corporal; n=5 para ingestão alimentar), ANOVA; pós-teste de Bonferroni. *p<0,05 vs C; #p<0,01 vs C+DP; §p<0,01 vs DH.
4.2- CARACTERIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL
Utilizando o método de densitometria por dupla emissão de raios-X (DEXA), avaliou-se a composição corporal antes e após o tratamento com dapagliflozina (Figura 7). Não houve diferença estatística entre os grupos estudados antes e após o tratamento tanto para o percentual de massa magra (Figura 7B) quanto para o percentual de massa gorda (Figura 7A). Como esperado, foi encontrada diferença significativa apenas entre os grupos controle,
alimentados com ração padrão, e os grupos alimentados com dieta hiperlipídica, independentemente do tratamento com o fármaco.
Figura 7: Caracterização da Composição Corporal- dapagliflozina. (A): Percentual de Massa gorda. (B): Percentual de Massa magra Os dados estão apresentados em média ± EPM (n=5). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. *p<0,001
vs C (pré); #p<0,001 vs C+DP (pré); **p<0,001 vs C (pós); § p<0,001 vs C+DP
(pós).
4.3 – Efeitos da dapagliflozina sobre os parâmetros metabólicos
4.3.1 – Respirometria
Após 30 dias de tratamento com dapagliflozina, a taxa metabólica dos animais foi verificada durante 24 horas e está representada nas Figuras 8 e 9.
Constatou-se que os valores de consumo de O2 (Figura 8A), produção de
CO2 (Figura 8B) e o quociente respiratório (RER) (Figura 8C) não apresentaram
diferença significativa entre os grupos tratados com o fármaco em relação aos respectivos controles, tanto no ciclo claro quanto no ciclo escuro.
Como esperado, houve diferença significativa na produção de CO2 (Figura
8B) e no quociente respiratório (RER) (Figura 8C), entre os grupos controle, alimentados com ração padrão, e os grupos em dieta hiperlípidica, independentemente do tratamento com o fármaco, em ambos os ciclos.
Também se observou que a calorimetria não diferiu entre os grupos tratados com dapagliflozina e os seus respectivos controles. Por outro lado, esta foi significativamente maior nos grupos que receberam dieta hiperlipídica, quando comparados aos grupos em ração padrão, independente do tratamento com o fármaco, tanto no ciclo claro, quanto no ciclo escuro (Figura 9A).
Não foram observadas diferenças significativas na atividade locomotora dos grupos estudados, em nenhum dos períodos (Figura 9B).
Figura 8: Respirometria- dapagliflozina. (A): Consumo de O2. (B): Produção de
CO2. (C): Quociente Respiratório (RER). Os dados estão apresentados
em média ± EPM (n=5). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. *p<0,05 vs C (claro); #p<0,01 vs C+DP (claro); §p<0,01 vs C (escuro); &p<0,001 vs
Figura 9: Calorimetria e Atividade Locomotora- dapagliflozina: (A): Calorimetria (B): Atividade locomotora. Os dados estão apresentados em média ± EPM (n=5). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. *p<0,05 vs C (claro); #p<0,05 vs C+DP (claro); §p<0,05 vs C (escuro); &p<0,05 vs C+DP (escuro).
4.3.2 – Teste Intraperitoneal de tolerância à glicose (GTT)
Após o tratamento com dapagliflozina, os animais em dieta hiperlipídica apresentaram uma redução significativa na glicemia de jejum, quando comparados ao seu controle, em dieta hiperlipídica, não tratado, retornando aos níveis do controle em ração padrão (Figura 10A). Além disso, esses animais apresentaram melhora na tolerância à glicose em relação ao seu controle em dieta, que não recebeu tratamento (Figura 10B). Este resultado foi confirmado através da área sob a curva da glicemia significativamente menor deste grupo (Figura 10C).
Figura 10: Caracterização da Tolerância à Glicose no Tratamento com Dapagliflozina. (A): Glicemia de Jejum. (B): Teste de tolerância à glicose. (C): AUC. Os dados estão apresentados em média ± EPM (n=13). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. * p<0,05 vs C; # p<0,001 vs C+DP; § p<0,05 vs DH.
4.3.3 - Teste Intraperitoneal de tolerância à insulina (ITT)
Após 30 dias de tratamento com dapagliflozina, avaliou-se o grau de sensibilidade à insulina nos grupos estudados.
Pode-se observar um aumento da constante de decaimento da glicose (Kitt) do grupo em dieta hiperlipídica tratado com o fármaco quando comparado ao grupo em dieta hiperlipídica, sem tratamento, retornando ao nível do controle, em ração padrão (Figura 11A). Esses resultados indicam uma melhora na sensibilidade à insulina nesses animais.
Figura 11: Caracterização da Tolerância à Insulina no Tratamento com Dapagliflozina. (A): KITT. Os dados estão apresentados em média ±
EPM (n=10). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. * p<0,05 vs C; # p<0,001
vs C+DP; § p<0,01 vs DH.
4.3.4 - Clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico
Utilizando o clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico, avaliou-se o consumo de glicose dos animais tratados com dapagliflozina, a fim de mensurar a sensibilidade tecidual à insulina. A figura 12A mostra que houve um aumento significativo da taxa de infusão de glicose no grupo em dieta hiperlipídica tratado com dapagliflozina quando comparado ao seu controle, sem tratamento, corroborando com a melhora na sensibilidade à insulina demonstrada no resultado anterior.
Figura 12: Clamp Euglicêmico-Hiperinsulinêmico- dapagliflozina (A): Taxa de Infusão de Glicose. Os dados estão apresentados em média ± EPM
(n=5). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. * p<0,001 vs C; # p<0,001 vs C+DP; § p<0,05 vs DH.
4.4 – Efeitos da dapagliflozina na via de sinalização da insulina
Através das alterações na fosforilação das proteínas IRβ e Akt, verificou-se, molecularmente, os efeitos do tratamento com dapagliflozina sobre a via de sinalização da insulina em fígado, músculo esquelético e tecido adiposo.
Na figura 13 A-C avaliou-se o efeito do tratamento com dapagliflozina sobre a fosforilação do IRβ. Pode-se observar que a administração deste fármaco aumentou significativamente a fosforilação em tirosina de IRβ do grupo em dieta hiperlipídica (DH+DP), quando comparado ao seu controle sem tratamento (DH), em fígado (Figura 13A), músculo (Figura 13B) e tecido adiposo (Figura 13 C). Adicionalmente, constatou-se também um aumento significativo na fosforilação em serina da Akt, neste mesmo grupo, nos três tecidos mencionados (Figura 13 D, E e F).
Em conjunto, estes resultados mostram que o tratamento com
dapagliflozina foi capaz de restaurar a sensibilidade à insulina em fígado, músculo e tecido adiposo dos animais em dieta hiperlipídica.
Figura 13: Via de Sinalização da Insulina em Animais Tratados com Dapagliflozina. Blots representativos da fosforilação de IRβ em tirosina (A-C), Akt em serina473 (D-F) (painéis superiores) e a expressão da proteína total (painéis inferiores) no fígado, músculo esquelético e tecido adiposo. Os dados estão apresentados em média ± EPM (n=5-6). ANOVA; pós-teste de Bonferroni. *p < 0,05 vs C(+); #p < 0,01 vs C+DP(+); §p < 0,05 vs DH(+).
