Bioinformática Estrutural Aula 2

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Bioinformática Estrutural

Aula 2

03 de Junho de 2013

Paula Kuser-Falcão

Paula.kuser-falcao@embrapa.br

Laboratório de Bioinformática Aplicada Embrapa Informática Agropecuária

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CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS

Determinação da Estrutura

tri-dimensional de Proteínas

utilizando

difração de Raios-X

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O processo completo

consiste em produzir cristais de proteínas (>0.1 mm na sua menor dimensão), nos quais as moléculas estejam razoavelmente bem

ordenadas para que o feixe de raios-X incidente sobre esse

cristal seja difratado gerando um

padrão de reflexões que, através da análise dos dados

cristalográficos, produzam um

mapa tri-dimensional de densidade eletrônica da molécula. Um modelo

da proteína com sequência conhecida deve então ser modelado neste mapa.

CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS

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POR QUE RAIOS-X ?

Adaptado de http://www.ipac.caltech.edu/Outreach/Multiwave/

O uso de radiação eletromagnética para visualizar

objetos requer que a radiação tenha um comprimento de onda comparável às menores características que

desejamos resolver. Os raios-X tem um comprimento de onda de 1.54Å. Este valor é próximo à distância entre átomos de carbono numa ligação peptídica, sendo então ideal para estudar estruturas de proteínas.

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Incidir Raios-X sobre uma única molécula resultaria num sinal extremamente fraco que nunca poderia ser detectado acima do nível de barulho, gerado pelo espalhamento da água e do ar. Um cristal arranja um número grande de moléculas na mesma orientação, então as ondas espalhadas podem ser adicionadas em fase aumentando o sinal a um nível que possa ser medido.

O cristal atua como um amplificador.

POR QUE CRISTAIS?

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Obtenção de cristais

A obtenção de cristais

adequados

é o maior

gargalo no processo de elucidação de uma

nova estrutura

Cristal adequado significa: - altamente ordenado;

- difrata a alta resolução; - tamanho suficiente.

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•

Uma gota é formada misturando-se volumes iguais de solução de proteína e de uma solução precipitante. gota contendo proteína e precipitante 1. Cristalização da proteína

•

Inicialmente a concentração de precipitante na gota é metade da sua concentração no poço.

•

Um volume bem maior de precipitante é colocado em um reservatório abaixo da gota.

Método de

difusão de

vapor com

a gota

sentada

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GP120 - uma glicoproteína do envelope exterior do vírus HIVtipo 1 Universidade de Columbia EUA Proteína que liga

quitina Tjaard Pijning RU Groninger Lisozima Eddie Snell NASA Dihidrolipoamida desidrogenase Tassie & Roeber NASA

Biliverdina-IX redustase complexada com NADP Rosa Perez-Luque IBMB-CSIC Barcelona

Exemplos de cristais de proteínas já estudados

1. Cristalização da proteína

TIM Aparício LNLS

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Raios-X e Cristais de

Proteínas

O Experimento :

Uma vez obtido, o cristal da proteína é irradiado com Raios-X

2. Irradiar os cristais com Raios-X e coletar os padrões de difração

Placa de Imagem

Espelhos para focalizar o feixe de raios-x

Os raios-X são difratados pelo cristal

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Padrão de Difração

de Raios-X

 O espalhamento do feixe de

raios-X pelo cristal produz o padrão de difração;

2. Irradiar os cristais com Raios-X e coletar os padrões de difração

 A organização dos pontos

no padrão está relacionada com a distribuição de

moléculas no cristal;

 Diferenças de intensidade

relacionam-se com a distribuição dos átomos na molécula.

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Mapa de densidade

eletrônica

O resultado do experimento não é a figura dos átomos , mas um mapa de distribuição dos elétrons na molécula, isto é, um mapa de densidade eletrônica. No entanto, uma

vez que os elétrons são mais localizados ao redor do núcleo, o mapa de densidade eletrônica nos dá uma boa

idéia da molécula.

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Resolução baixa: poucos detalhes além do formato da

molécula podem ser observados.

Resolução média: é possível discernir o dobramento da

molécula, embora vão ocorrer muitas quebras no mapa de densidade.

Resolução alta: a maioria ou todos os átomos da molécula

podem ser resolvidos,o que significa que podemos ter suas coordenadas (x,y,z)

7.0 Å é uma resolução

baixa para proteína 3.0 Å é uma resolução _média 1.6 Å é alta resolução

Posição do CO não está bem definida Quebra na densidade eletrônica

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Resolução

Todos os modelos tem uma incerteza na posição dos átomos.

Valores numéricos pequenos para resolução significam uma pequena incerteza, então resolução alta; valores altos significam uma grande incerteza, então resolução baixa.

A resolução é medida em Ångstroms (Å).

Está diretamente relacionada com a distância mínima a que dois objetos podem estar e ainda serem vistos como dois objetos.

Para resolver questões em nível atômico (catálise enzimática, ligantes, interação proteína-ácido

nucléico, etc) a alta resolução é mais útil.

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Resolução é um indicador do nível de detalhes disponível no dado experimental.

Low resolution: <3.0A

Medium resolution: 1.8-3.0A High Resolution: 1.0 – 1.8A Atomic Resolution: >1.0A

Nem todas as partes da estruturas tem

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Mapa de densidade

eletrônica Átomos são inseridos na densidadepara construir o modelo da proteína

Ajustando o modelo

na densidade

eletrônica

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5. Construção do modelo da proteína

Uma vez obtido o mapa de densidade eletrônica, é necessário colocar a sequência de aminoácidos da proteína dentro da densidade para construir o modelo:

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Refinamento

O modelo inicial geralmente possui muitos erros porque erros ocorrem durante o experimento. Para poder

explicar a biologia do modelo é preciso melhorar esse modelo inicial. Isso é feito com:

Refinamento: ajuste automático dos parâmetros do

modelo para e imposição de algumas regras físico-químicas, como distâncias mínimas, cargas, etc;

Controle de qualidade: verificação se o modelo parece

como uma proteína real;

Reconstrução manual: ajuste manual do modelo para

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Uma vez obtida a estrutura tri-dimensional da proteína podemos utilizá-la para: entender seu funcionamento...

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… visualizar partes específicas de uma proteína como sítios de ligação, para entender como a ligação acontece...

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Azul: cargas positivas

… visualizar a distribuição de cargas na superfície da proteína, etc.

Vermelho: cargas negativas

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A informação estrutural é essencial para entender como as moléculas biológicas funcionam e fornece conhecimento para a obtenção de novos medicamentos para cura de doenças como AIDS, Câncer, anemia, diabetes, etc.

HIV protease ligado a um inibidor

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Validação e Qualidade

Erros nas estruturas

Completely wrong

Wrong trace, incorrect fold of protein

Register errors, where trace of protein is not in keeping with sequence order.

Partial errors

Incorrectly built loops.

Wrong residues built into the structure (i.e., Proline instead of Aspartic acid).

Bad data quality

Bad geometry and stereochemistry.

Incorrect positioning of ligands etc due to lack of experimental evidence.

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This is supposed to be

Phenylalanine and should look

like:

BUT….

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This is supposed to be a sugar and should look like:

BUT….

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• This is supposed to

be another sugar

(sucrose) and

should look like:

BUT….

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Wrong Structures !!

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PDB entry 1PTE PDB entry 3PTE

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UAB Researcher involved in fraud !

After a thorough examination of the available data, which included a re-analysis of each structure alleged to have been fabricated, the committee found a preponderance of evidence that structures 1BEF, 1CMW, 1DF9/2QID, 1G40, 1G44, 1L6L, 2OU1, 1RID, 1Y8E, 2A01, and 2HR0 were more likely than not falsified and/or fabricated and recommended that they be removed from the public record. The former employee was H.M. Krishna Murthy, who was found by the Investigation Committee to be solely responsible for the fraudulent data.

The coordinates for 2HR0 do not form a connected network of molecules in the crystal lattice.

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Algumas Verdades sobre as Estruturas

• Nunca acredite numa estrutura logo de

cara.

• Qualquer estrutura é apenas tão boa

quando o dado experimental que foi usado

na sua determinação.

• Apenas porque foi publicada na

Nature/Cell/Science não significa que a

estrutura não pode ter falhas.

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Ground rules for Bioinformatics

 Não acredite sempre no que os programas lhe dizem

Muitas vezes eles podem lhe induzir para a conclusão errada e algumas vezes estão errados!

 Não acredite sempre no que os bancos de dados lhe

dizem

 Não acredite sempre no que os professores lhe dizem

 Ou seja, seja um usuário crítico

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Indicadores de Qualidade das Estruturas

1. Diagrama de Ramachandran

2. Geometria and Estereoquímica

3. R-factor/FreeR-factor (X-ray

crystallography)

4. Correlação entre dado experimental e

estrutura

5. Resolução dos dados no qual a estrutura

foi baseada ( X-ray crystallography

)

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Ramachandran Plot

Um exemplo real. Todos os resíduos não glicina estão em regiões permitidas.

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• Idealmente, não deve haver

valores discrepantes no

Diagrama de

Ramachandran, exceto

glicina e prolina, que são aminoácidos "especiais".

• No entanto, pode haver

alguma explicação

racional para o cientista depositar a estrutura com outliers. (Consulte sempre a publicação!).

• _{Numa boa estrutura}

espera-se encontrar 85-90% dos

resíduos nas regiões

vermelhas.

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Verificação da Geometria e Estereoquímica

• Sempre olhe a

estrutura em

visualizadores

gráficos.

• Use ferramentas como

PDBeAnalysis,

PDBSum para

analisar as

estruturas.

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R-Factor

• R-factor is a measure of the

agreement between the

crystallographic model and the

experimental X-ray diffraction

data.

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Então o que você deve procurar…

Estruturas com resolução maior Boa geometria e estreoquímica R-factor baixo

Grande correlação entre dado experimental e estrutura Estruturas completas (preste atenção na Sequência e

quanto dela está representada na estrutura), sem conflitos de sequência

Estruturas complexadas com ligantes bound podem ser mais

úteis para análise do que a forma sem ligante (apo-form).

Nota: Essas são regras gerais que podem ajudá-lo a

escolher a melhor estrutura para sua análise, quando mais do que uma estrutura para a mesma proteína está

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Alguns programas para Validação da Estrutura Procheck http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/proche ck.html WHATCHECK: http://swift.cmbi.ru.nl/gv/whatcheck/ JCSG Validation: http://www.jcsg.org/scripts/prod/validation1.cgi PDBeAnalysis: http://www.ebi.ac.uk/pdbe-as/PDBeValidate