Toxoplasma gondii IgM ELISA

Toxoplasma gondii

IgM ELISA

Ensaio imunoenzimático para a determinação quantitativa de anticorpos

IgM contra Toxoplasma gondii em soro e plasma humanos.

RE58381

96

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

1. APLICAÇÕES

Ensaio imunoenzimático para a determinação quantitativa de anticorpos IgM contra Toxoplasma gondii em soro e plasma humanos.

2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO

A toxoplasmose é uma infecção, que é causada pelo parasita toxoplasma gondii. Até 20% da população transporta o agente patogénico, mas apenas algumas apresentam sintomas, porque o sistema imunológico impede a doença de se manifestar. As mulheres grávidas devem, contudo, ser muito cautelosas, já que uma infecção pode ser prejudicial para o feto.

O toxoplasma gondii pertence aos protozoários e é um parasita, que pode infectar várias espécies de mamíferos, entre os quais os seres humanos. Animais como gatos, porcos e ovelhas disseminam oocistos, bem como cistos de tecido, que após a ingestão por seres humanos são convertidos em taquizoítos, podendo estes ser encontrados mais tarde no tecido nervoso e muscular. Quando uma mulher grávida é infectada, os taquizoítas podem atingir o feto através da placenta.

Os sintomas da toxoplasmose são muito diversos e a maioria das pessoas infectadas não se sentem realmente doentes. Um sinal característico da doença é uma sensação do tipo gripal, com gânglios linfáticos inchados e dores musculares, que podem durar meses. A forma grave da toxoplasmose provoca danos cerebrais, nos olhos e órgãos suplementares. Mesmo quando a doença tenha terminado, um tipo crónico reactivo pode desenvolver-se. A transmissão da doença tem lugar principalmente pela ingestão de fezes de gato, por exemplo, durante a jardinagem ou durante o cuidado de animais. No então, os agentes infecciosos podem também aparecer em carne crua ou água contaminada. Normalmente, os sintomas clínicos desaparecem após algumas semanas, mesmo sem tratamento, mas para as mulheres grávidas e pessoas com sistema imunológico deficitário, a terapia com medicamentos deve ser iniciada.

Estão disponíveis os seguintes métodos laboratoriais: Fixação de complemento (FC), imunofluorescência (IFI) ou ELISA. A determinação de anticorpos IgM específicos do vírus em infecções recentes ou reactivadas é de especial importância; o teste de IgG é utilizado para a detecção de imunidade. Se existe uma doença grave hereditária, pode ser tentada a identificação do parasita fora do sangue periférico, do líquido amniótico ou de amostras de tecido.

3. PRINCÍPIO DO TESTE

Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica de sandwich. Os poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços revestidos com antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) específico para a IgM humana. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de anticorpos IgM específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente utilizando a curva de calibração.

4. AVISOS E PRECAUÇÕES

1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.

2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.

3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.

4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.

5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.

6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:

7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.

8. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.

9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN3) como conservante. Em caso de contacto com os olhos

ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN3 pode reagir com o chumbo e o cobre da

canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos.

10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.

5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE

O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.

Os reagentes não abertos permanecem estáveis até a data de validade indicada. O kit é estável até 3 meses após a primeira abertura, quando a Placa de Microtitulação é embalada num saco bem fechado, as garrafas são fechadas as respectivas com tampas e o kit é armazenado a 2-8 °C.

6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS

Soro, Plasma (EDTA, Citrate)

Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.

Armazenamento: 2-8°C -20°C Estabilidade: 2 dias > 2 dias

Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente.

7. MATERIAIS FORNECIDOS

Quantidade Símbolo Componente

1 x 12 x 8 MTP Microplaca

Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos.

1 x 15 mL ENZCONJ IgM Conjugado Enzimático IgM _{Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: anti-humano IgM, conjugado com}

peroxidase, tampão contendo proteína, estabilizantes.

4 x 2 mL CAL A-D Padrão A-D _{1; 10; 30; 120 U/mL. Pronto a usar.}

Padrão A = Controlo Negativo Padrão B = Controlo „Cut-off“ Padrão C = Controlo positivo fraco. Padrão D = Controlo Positivo

Contêm: IgM anticorpos contra Toxoplasma gondii, Soro humano, PBS, estabilizantes.

1 x 60 mL DILBUF Tampão de Diluição _{Cor azul. Pronto a usar. Contêm: PBS Tampão, BSA, < 0.1 % NaN}

3.

1 x 60 mL WASHBUF

CONC

Tampão de Lavagem, Concentrado (10x)

Contêm: PBS Tampão, Tween 20.

1 x 15 mL TMB SUBS Solução de Substrato TMB _{Pronto a usar. Contêm: TMB.}

1 x 15 mL TMB STOP Solução de Paragem TMB

Pronto a usar. 0.5 M H2SO4.

2 x FOIL Película Aderente_{Para tapar a Microplaca durante a incubação.}

1 x BAG Saco Plástico_{Resselável. Para armazenamento a seco de tiras não usadas.}

8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS

1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3% CV). Volumes: 5; 50;100; 500 µL 2. Proveta

3. Tubos (1 mL) para diluição de amostras

4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente

5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático

6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência 600-650 nm)

7. Água bidestilada ou desionizada

9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO

1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.

2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.

3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.

4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem (CV >10%).

5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.

6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços.

7. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.

8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.

10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE

10.1. Preparação de Componentes

Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).

Diluir /

dissolver Componente Diluente Relação Observações Armazena-mento Estabilidade 20 mL WASHBUF 180 mL agua bidest. 1:10 Aquecer até 37°C para dissolver cristais.

Misturar energicamente.

2-8°C 4 sem

10.2. Diluição de Amostras

Amostra diluir com Relação Observações

Soro / Plasma geralmente DILBUF 1:101 p.ex. 5 µL + 500 µL DILBUF

Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas.

11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO

1. Pipetar 100 µL de cada Controlo e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. 2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a 18-25°C.

3. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.

4. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.

5. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min a 18-25°C.

6. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.

7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem

deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.

8. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço. 9. Incubar 20 min a 18-25°C, no escuro. (Sem película aderente.)

10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB a cada poço.

Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo.

11. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência:

600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.

12. CONTROLO DE QUALIDADE

Os resultados do teste são válidos apenas se o teste tiver sido executado seguindo as instruções. Além disso, o operador deve seguir estritamente as regras de GLP (Good Laboratory Practice) ou outros padrões/leis aplicáveis. Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.

No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem.

13. CÁLCULO DE RESULTADOS

A avaliação do teste pode ser feita quer qualitativamente quer quantitativamente.

13.1. Avaliação Qualitativa

O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a partir das densidades ópticas médias da amostra e do valor do cut-off. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas.

Se a densidade óptica da amostra estiver num intervalo de 20 % á volta do valor de cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada como equívoca. Nesse caso, a repetição do teste com o soro ou mesmo com uma nova amostra de um mesmo paciente, tomada após 2-4 semanas, é recomendada. Ambas as amostras devem ser medidas em paralelo numa mesma análise.

DO amostra O índice de Cut-off (COI) das amostras pode ser calculado da

seguinte forma: COI = _{DO Padrão B}

13.2. Avaliação Quantitativa

Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log.

Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.

Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.

Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.

Curva de Calibração Típica

(Exemplo. Não usar para cálculos!)

Padrão U/mL DOMédia

A 1 0.031 B 10 0.464 C 30 1.070 D 120 2.167

14. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

Método Intervalo Interpretação < 8 U/mL negativo 8 – 12 U/mL indeterminado Quantitativa (Curva Padrão) > 12 U/mL positivo < 0.8 negativo 0.8 – 1.2 indeterminado Qualitativa

(Índice de Cut-off, COI)

> 1.2 positivo

Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.

15. VALORES ESPERADOS

Num estudo interno, indivíduos aparentemente saudáveis evidenciaram os seguintes resultados:

Interpretação Toxoplasma gondii n

positivo indeterminado negativo

IgG 172 62.8 % 0.6 % 36.6 %

IgM 175 0.6 % 4.0 % 95.4 % Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.

16. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

A recolha de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.

Para reacções cruzadas, ver DESEMPENHO.

Azidas e timerosal em concentrações > 0.1% interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos. Hemoglobina 8.0 mg/mL Bilirrubina 0.3 mg/mL Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito

significativo (+/-20% do esperado nos resultados do teste até

às concentrações descritas em baixo: Triglicéridos 5.0 mg/mL As características especiais destas amostras devido às diferenças regionais, étnicas ou culturais como altos títulos de anticorpos ou anticorpos heterófilos (factores reumatóides) podem interferir nos resultados do teste. As amostras críticas devem ser confirmadas através de um método adicional ou da utilização de reagentes apropriados.

Toxoplasma gondii IgM

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 1 10 100 1000 (U/mL) (OD)

17. DESEMPENHO

Especificidade Analítica

(Reacção Cruzada) Não foram detectadas reacções cruzadas com:

Rubéola, Citomegalovírus, Bordetella, Borrelia, Brucella e Helicobacter. Interferências de amostras de doentes com uma infecção aguda por EBV não podem ser excluídas.

Precisão Média (U/mL) CVIntervalo (%) CVMédia (%)

Intra-Ensaio 18.9 – 104.3 4.4 – 9.2 7.3 Inter-Ensaio 3.2 – 65.0 2.7 – 18.1 10.2

Inter-Lotes 1.9 – 70.0 0.2 – 23.7 9.7

Sensibilidade Analítica 1.1 U/mL

Intervalo (U/mL) Diluição em Série até Intervalo (%)

Linearidade _{48.2 – 93.5 1/4 76 - 123}

Recuperação Recuperação media após adição de reforço 107 – 112 %

Especificidade Clínica 99% (n = 88)

Sensibilidade Clínica 100% (n = 54)

18. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO

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2. Jenum, P. A. et al.: Improved diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of antitoxoplasma immunoglobulin G activity. J. Clin. Microbiol. 35: 1972 (1997).

3. Kaul, R. et al.: Detection of Immunoglobulin M Antibodies Specific for Toxoplasma gondii with Increased Selectivity for Recently Acquired Infections. J. Clin. Microbiol. 42: 5705 (2004).

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5. Montoya, J. G. et al.: VIDAS test for avidity of Toxoplasma-specific immunoglobulin G for confirmatory testing of pregnant women. J. Clin. Microbiol. 40(7): 2504 (2002).

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7. Pinon, J.M. et al.: Strategy for diagnosis of congenital toxoplasmosis: evaluation of methods for postnatal detection of immunoglobulin G, M and A antibodies. J. Clin. Microbiol. 39: 2267 (2001).

8. Prince, H. E. et al.: Simplified Assay for Measuring Toxoplasma gondii Immunoglobulin G Avidity. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8: 904 (2001).

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and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο

IVD In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.