Influência da infecção pelo vírus da artrite-encefalite
caprina nos perfis soro-epidemiológicos em caprinos
infectados pelo
Toxoplasma gondii e Neospora caninum
Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para a obtenção do Título de Doutor em Medicina Veterinária.
Orientador: Prof. Adjunto José Rafael Modolo
Botucatu 2005
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Stachissini, Anee Valéria Mendonça.
Influência da infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina nos perfis soro-epidemiológicos em caprinos infectados pelo Toxoplasma gondii e
Neospora caninum / Anee Valéria Mendonça Stachissini. – 2005.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2005.
Orientador: José Rafael Modolo Assunto CAPES: 50502050
1. Saude animal 3. Saúde pública 2. Caprino - Doenças CDD 636.089446
Palavras-chave: CAEV; Caprinos; Co-infecção; Neospora caninum ; Toxo-
...minha mais linda razão
de viver e de ser feliz;
...minha mais importante razão
de buscar ser melhor a cada dia...
“Osni”
...pelo amor que tem dedicado a mim e a nossa
filha,
por continuar meu grande companheiro,
por me incentivar a alcançar meus objetivos...
por fazer da nossa vida uma bela canção.
A vocês dedico essa parte da minha vida
Aos meus pais, Gervásio e Dora
...que mesmo distantes, mantiveram-se dispostos a
me oferecer palavras serenas, por muitas vezes me
acalmando e dando forças pra continuar...
A vocês devo minha educação e formação como
pessoa.
A vocês oferecerei tudo, sempre!
A Deus, pelos ensinamentos oportunos, que me ajudam a crescer a cada dia.
Ao Prof. Adjunto José Rafael Modolo, Área de Planejamento em Saúde Animal e Saúde Pública da FMVZ-UNESP / Botucatu, novamente, pela orientação, amizade, incentivo e confiança.
Ao Prof. Titular Hélio Langoni, Área de Zoonoses da FMVZ-UNESP / Botucatu, pela orientação, pelos ensinamentos transmitidos e por colocar o laboratório de zoonoses à nossa disposição para que pudéssemos realizar parte deste trabalho.
À Profª Ass. Dra. Solange Maria Gennari, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da FMVZ-USP / São Paulo, pela atenção desde o primeiro contato e pelo valioso auxílio para que fosse possível a realização do diagnóstico da neosporose.
Ao Dr. J. P. Dubey, Animal Parasitic Diseases Laboratory, United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, Estados Unidos, que, por intermédio da Profª Dra. Solange Maria Gennari, colocou seu laboratório e equipe à nossa disposição, realizando o diagnóstico da neosporose.
Ao Prof. Titular Carlos Roberto Padovani, Departamento de Bioestatística do IB-UNESP / Botucatu, pela total disponibilidade, paciência e bom humor durante as consultorias para a realização das análises
estatísticas deste estudo.
Ao Prof. Dr. Flávio Ferrari Aragon, Departamento de
Bioestatística do IB-UNESP / Botucatu, pelo auxílio nas análises estatísticas. À Dra. Lígia B. Simões, pelo pronto atendimento à nossa solicitação e elaboração dos mapas que tão bem ilustram este trabalho.
distância.
Ao amigo Aristeu Vieira da Silva, pelas dicas, esclarecimentos e incentivo quando nasceu a idéia deste estudo.
Ao pós-graduando André Peres Barbosa de Castro, pelos primeiros ensinamentos sobre RIFI.
Aos residentes Juliano Leônidas Hoffmann e Veruska Maia da Costa e ao funcionário Benedito Donizete Menozzi, Área de Zoonoses do Depto. de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ-UNESP / Botucatu, pelo auxílio com as lâminas para o diagnóstico da toxoplasmose.
Aos funcionários da Biblioteca do Campus de Botucatu, em particular Rosemary Cristina da Silva, pelo carinho e pela cuidadosa revisão das referências bibliográficas, e Selma Maria de Jesus, pela elaboração da ficha catalográfica.
A Adriana Interdonato Passaroni, pela tradução do resumo para o inglês.
A Adriana Ribeiro Fontes pela revisão do português e auxílio na editoração deste trabalho.
A todos os professores da pós-graduação da área de Vigilância Sanitária da FMVZ-UNESP / Botucatu, pelos conhecimentos transmitidos durante o curso.
Ao Prof. Ass. Dr. Sony Dimas Bicudo, Departamento de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP / Botucatu, pela orientação durante parte desse curso.
Às funcionárias Tânia Maria Martins e Adriana Cristina Pavan Vieira, Depto. de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ-UNESP /
A todos os colegas do curso de pós-graduação, pelo respeito e companheirismo.
Aos caprinocultores que nos permitiram colher o material deste estudo e prestaram as informações necessárias.
À minha família, que sempre esteve na torcida para que tudo desse certo.
À família “Pontes Ribeiro”, pelos bons momentos que temos vivido e especialmente à “Dri”, que deixou de lado suas preocupações e me“ajudou”, nos horários mais inusitados.
A meus chefes mediato e imediato, Dr. Celso Fernandes Joaquim e Luiz Carlos Scandarolli, pela compreensão e apoio para que eu pudesse concluir esse curso. Também pela amizade e orientação nos trabalhos que estamos realizando juntos.
Aos agentes de inspeção João Batista Correa, Mário Kiyoshi Kikuti e Roberto Carlos Rodrigues, por “agüentarem as pontas” sempre que foi preciso.
Às famílias Scandarolli e Corrêa, que me receberam com tanto carinho em seus lares.
Aos amigos, especialmente Bel, João, Ana e Tio Piro, pelo carinho que têm demonstrado à nossa família, especialmente à pequena Marília, o que, de maneira indireta, ajudou no desenvolvimento deste estudo.
Graduação da FMVZ-UNESP / Botucatu, pela paciência e pelos serviços prestados.
À FUNDUNESP pelo apoio financeiro, o que possibilitou a finalização deste estudo.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para que fosse possível concluir mais esta importante etapa de minha vida.
De repente, a vida começou a impor-se, a desafiar-me com
seus pontos de interrogação, que se desmanchavam para dar
lugar a outros. Eu liquidava esses outros e apareciam novos...
Por muitos anos procurei-me a mim mesmo. Achei.
Agora não me digam que ando à procura da originalidade,
porque já descobri onde ela estava, pertence-me, é minha.
... e eu não sabia que minha história era mais bonita que a de
Robinson Crusoé.
STACHISSINI, A.V.M. Influência da infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina nos perfis soro-epidemiológicos em caprinos infectados pelo Toxoplasma gondii e Neospora caninum. Botucatu, 2005. 103p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de Concentração: Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
RESUMO
Objetivando avaliar os perfis soro-epidemiológicos das infecções por T. gondii e N. caninum em caprinos leiteiros do estado de São Paulo; possíveis riscos da ocorrência de sorologia positiva ao T. gondii para a saúde pública; possíveis associações de co-infecção com o vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) e estabelecer um indicador quantitativo de saúde dos capris (“status sanitário”), foram obtidos soros de 923 caprinos de 17 propriedades. Os animais eram de ambos os sexos, idade acima de três meses, subdividida em três faixas etárias: <1 ano, entre 1 e 4 anos e > 4 anos. Para a detecção de anticorpos anti-T. gondii, anti-N. caninum e anti-CAEV foram utilizados,
respectivamente, reação de imunofluorescência indireta (RIFI≥16), teste de aglutinação para Neospora (NAT≥25) e imunodifusão em gel de agarose (IDGA, positivo ou negativo). Em todos os capris foi
aplicado um questionário com informações epidemiológicas e de esfera reprodutiva. Todos os resultados estatísticos foram discutidos no nível de 5% de significância. As taxas de positividade foram de 23,40% para T. gondii e 19,77% para N. caninum. Duas propriedades não
apresentaram positividade para T. gondii e em uma não houve animal soropositivo para N. caninum. Não houve associações entre
freqüências de soropositividade e sexo para ambas as infecções. O aumento da idade influenciou positivamente nas taxas de anticorpos anti-T. gondii, mas não para N. caninum. A presença de gatos e cães nos capris foi associada ao aumento das taxas de positividade para toxoplasmose e neosporose, respectivamente. A soropositividade isolada para T. gondii e N. caninum não influenciou na ocorrência de falhas reprodutivas. Não houve associação entre ocorrência de
anticorpos anti-CAEV e taxas de positividade para ambos agentes. A ocorrência de falhas reprodutivas foi associada à co-infecção pelo CAEV e T. gondii ou N. caninum. O “status sanitário” dos capris variou de 32,38% a 96,40%, de acordo com a ocorrência de positividade para as infecções. Os resultados permitiram concluir que os agentes T. gondii e N. caninum estão amplamente difundidas em capris do estado de São Paulo. Variáveis como idade, no caso de T. gondii, e presença dos hospedeiros definitivos para ambos agentes devem ser consideradas na epidemiologia das infecções. O risco de transmissão de T. gondii à saúde pública deve ser considerado, uma vez que em algumas
propriedades há animais com sorologia positiva ao agente e comercialização de produtos “in natura”, como leite e carne. A
ocorrência da CAE não predispõe os animais à infecção peloT. gondii ou N. caninum, mas influencia na manifestação clínica das doenças. O estabelecimento de um indicador quantitativo de saúde nos capris, o “status sanitário”, permitiu classificá-los de acordo com a ocorrência das infecções.
Palavras chave: CAEV; caprinos; co-infecção; Neospora caninum;
STACHISSINI, A.V.M. Influence of infection by caprine
arthritis-encephalitis virus in the sero-epidemiological profiles on infected goats by Toxoplasma gondii and Neospora caninum. Botucatu, 2005. 103p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária, Área de Concentração: Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
ABSTRACT
With the aim of evaluating the seroepidemiological profiles of the toxoplasmosis and neosporosis in dairy goats from São Paulo state; possible risks of the toxoplasmosis for the public health and the associations of the diseases with the co-infection by the caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV); and to stablish a quantitative indicator of the health (“sanitary status”) of the farms, 923 caprine serum samples were obtained from 17 different properties. The animals were male and female , over three months old, subdivided in three age groups: < 1 year-old, between 1 and 4 years-old and > 4 years-old. For toxoplasmosis, neosporosis and caprine arthritis-encephalitis diagnosis, were used, respectively, indirect immunofluorescent antibody test (IFAT≥16), Neospora agglutination test (NAT≥25) and agar gel immunodiffusion (IDGA, positive or negative). A questionnaire
containing reproductive and epidemiologic information was applied for all the farms. All the discussion were realized at 5% significance level. The positivity rates were 23.40 % for the toxoplasmosis and 19.77 % for the neosporosis. Two properties presented no positive result for T. gondii and in one there was no seropositive animal for N. caninum. There were no associations between the frequency of seropositivity and sex for
both diseases. A more advanced age influenced positively in the occurrence of anti-T. gondii antibodies, but there no statistical
difference for N. caninum. The presence of cats and dogs in farms was associated to the raise of positive rates for toxoplasmosis and
neosporosis, respectively. The seropositivity for just one of the agents (T.
gondii or N. caninum) did not influence the ocurrence of reproductive
failures. There was no association between anti-CAEV antibodies and the presence of antibodies anti-T. gondii or anti-N. caninum. The
reproductive failures occurrence was associated to the co-infection by the CAEV and T. gondii or N. caninum. The “sanitary status” of the farms variated from 32.38% to 96.40%, according to the positivity of the
infection. By the results the conclusion is that the toxoplasmosis and neosporosis are diffused on the São Paulo state. Variables like age, in the case of toxoplasmosis, and the presence of definite hosts for the both diseases must be considered in their epidemiology. The risk of transmition by T. gondii to the public health should be considerate, once some farms have animals with positive sorology to the agent and trade products “in natura”, as milk and meat. The occurrence of CAE do not predispose the goats to the infection by T. gondii or N. caninum, but the clinical demonstration of the diseases is influenced by the
lentivirus.Stablishment of a quantitative indicator of the health on the farms (“sanitary status”), permited classify them according to the occurrence of the infection.
Key words: CAEV; caprine; co-infection; Neospora caninum;
Figura 1 - Localização geográfica dos capris estudados... 37 Figura 2 - Freqüência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii conforme
a localização dos capris... 51 Figura 3 - Tipo de comercialização de produtos de origem caprina
realizado pelas propriedades... .... 52 Figura 4 - Mapa indicando o “status sanitário” dos capris conforme
freqüência de positividade ... 67
Quadro
1- Freqüência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e presença de gatos nos capris... ... 50 Quadro
2-
Freqüência de positividade de anticorpos anti-Neospora caninum e ocorrência de cães nos capris... 57
Tabela 1 - Freqüência absoluta de caprinos segundo sexo e faixa etária em capris do estado de São Paulo. Botucatu. 2005... 38 Tabela 2 - Freqüência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em caprinos
do estado de São Paulo, pela reação de imunofluorescência indireta, nas diferentes tilulações testadas. Botucatu. 2005... 46 Tabela 3 - Distribuição (%) da positividade de anticorpos
anti-Toxoplasma gondii em caprinos do estado de São Paulo, pela reação de imunofluorescência indireta (≥16), por
propriedade. Botucatu. 2005... 47
Tabela 4 - Freqüência relativa (%) da presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em caprinos do estado de São Paulo, pela reação de imunofluorescência indireta (≥16), segundo o sexo.
Botucatu. 2005... 48
Tabela 5 - Freqüência relativa (%) da presença de anticorpos anti-T. gondii em caprinos do estado de São Paulo, pela reação de imunofluorescência indireta (≥16), segundo faixa etária. Botucatu. 2005... 48 Tabela 6 - Freqüência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em
caprinos do estado de São Paulo, pela reação de imunofluorecência indireta (≥16), de acordo com a presença ou ausência de gatos nos capris. Botucatu. 2005... 49 Tabela 7 - Freqüência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em caprinos
do estado de São Paulo, pela reação de imunofluorecência indireta (≥16), de acordo com a ocorrência de falhas reprodutivas nos capris. Botucatu. 2005... 49 Tabela 8 - Freqüência de anticorpos anti-Neospora caninum em
caprinos do estado de São Paulo, pela NAT (≥25), nas diferentes titulações testadas. Botucatu. 2005... 53 Tabela 9 - Distribuição (%) da positividade de anticorpos anti-Neospora
caninum em caprinos do estado de São Paulo, pela NAT (≥25), por propriedade. Botucatu. 2005... 54 Tabela 10 - Freqüência relativa (%) da presença de anticorpos
anti-Neospora caninum em caprinos do estado de São Paulo, pela NAT (≥25), segundo sexo. Botucatu. 2005... 55 Tabela 11 - Freqüência relativa (%) da presença de anticorpos
anti-Neospora caninum em caprinos do estado de São Paulo, pela NAT (≥25), segundo a faixa etária. Botucatu. 2005... 55
com a presença ou ausência de cães nos capris. Botucatu. 2005... 56 Tabela 13 - Freqüência de anticorpos anti-Neospora caninum em
caprinos do estado de São Paulo, NAT (≥25), de acordo com a ocorrência de falhas reprodutivas nos capris. Botucatu. 2005... 56 Tabela 14 - Distribuição (%) da positividade de anticorpos anti-CAEV em
caprinos do estado de São Paulo, pela IDGA, por
propriedade. Botucatu. 2005... 58
Tabela 15 - Distribuição dos caprinos quanto às associações de ocorrência de infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina e Toxoplasma gondii. Botucatu. 2005... 59 Tabela 16 - Distribuição dos caprinos quanto às associações de
ocorrência de infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina e Neospora caninum. Botucatu. 2005... 60 Tabela 17 - Medidas descritivas das taxas de positividade para anticorpos
anti-CAEV, anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum em caprinos do estado de São Paulo, segundo a ocorrência de falhas reprodutivas nos capris. Botucatu. 2005... 61 Tabela 18 - Medidas descritivas da associação da resposta dos caprinos
do estado de São Paulo ao CAEV e Toxoplasma gondii, de acordo com a ocorrência de falhas reprodutivas nos capris. Botucatu. 2005...
62 Tabela 19 - Medidas descritivas da associação da resposta dos caprinos
do estado de São Paulo ao CAEV e Neospora caninum, segundo a ocorrência de falhas reprodutivas nos capris. Botucatu. 2005... 63 Tabela 20 - Medidas descritivas da freqüência de respostas positivas dos
caprinos do estado de São Paulo, de acordo com a ocorrência de falhas reprodutivas nos capris. Botucatu. 2005... 64 Tabela 21 - Medidas descritivas do “status sanitário (%)” dos capris do
estado de São Paulo, segundo a ocorrência de falhas reprodutivas. Botucatu. 2005... 65 Tabela 22 - “Status sanitário” dos capris do estado de São Paulo, de
acordo com a freqüência de respostas positivas às enfermidades. Botucatu. 2005... 66
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………..………... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA...………... 18
2.1. Toxoplasma gondii...………....……... 19
2.1.1. Toxoplasma gondii em caprinos……….……... 21
2.1.2. Toxoplasmose caprina e saúde pública... 26
2.2. Neospora caninum...………... 28
2.2.1. Neospora caninum em caprinos...………... 31
2.3. Artrite-encefalite caprina... 32
2.4. Toxoplasma gondii e Neospora caninum em animais imunocomprometidos... 33
3. OBJETIVOS... 36
4. MATERIAL E MÉTODOS... 37
4.1. Área de estudo... 37
4.2. Animais... 38
4.3. Colheita de sangue... 38
4.4. Informações epidemiológicas e relativas a falhas reprodutivas..………... 39
4.5. Procedimentos laboratoriais... 40
4.5.1. Reação de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii... 40
4.5.2. Teste de aglutinação para Neospora para detecção de anticorpos anti-Neospora caninum... 42
4.5.3. Imunodifusão em gel de agarose para o dianóstico da artrite-encefalite caprina... 42
4.6. Metodologia estatística... 43
5. RESULTADOS... ... 46
5.1. Toxoplasma gondii... 46
5.2. Neospora caninum... 53
5.3. Vírus da artrite-encefalite caprina... 58
5.3.1. Co-infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina e Toxoplasma gondii. 59 5.3.2. Co-infecção pelo vírus da artrite-encefalite caprina e Neospora caninum.. 60
5.4. Associações de infecção e falhas reprodutivas... 61
5.5. “Status sanitário”... 65
Atualmente a caprinocultura no Brasil apresenta-se em expansão e a produção de carne e leite de caprinos é uma fonte alternativa de alimento para o homem. No entanto, a falta de informações a respeito da ocorrência e epidemiologia de
enfermidades transmissíveis que ocasionam perdas econômicas por problemas reprodutivos ou outros leva a um sub aproveitamento do potencial desse mercado.
Uma das doenças transmissíveis bastante freqüente nos
pequenos ruminantes é a toxoplasmose, sendo os caprinos seriamente afetados. Nestes, a infecção por Toxoplasma gondii durante a prenhez pode causar morte embrionária, reabsorção, mumificação ou morte fetal, aborto, natimortos ou morte perinatal. Os cabritos sobreviventes podem estar infectados, apresentando pior desenvolvimento quando comparadas com os não infectados, gerando prejuízos aos produtores.
Além da importância dessa enfermidade para a espécie caprina, é necessário ressaltar que a carne e o leite de cabras
infectadas são potenciais fontes de infecção de toxoplasmose para o homem. A infecção primária em gestantes e, conseqüentemente, do feto, por via transplacentária, constitui um dos aspectos mais graves da toxoplasmose humana, representando importante causa de
alterações neonatais como lesões oculares, microcefalia, hidrocefalia, calcificações cerebrais, alterações psicomotoras e retardo mental.
Outra situação que coloca a toxoplasmose como uma das enfermidades mais importantes da atualidade é o aumento
progressivo de uma população de risco representada por indivíduos imunodeficientes - seja por enfermidades infecciosas, neoplasias,
cortisonoterapia e estresse – já que o T. gondii é um agente oportunista e, nesses casos, pode desencadear manifestações de febre,
lesões oculares e miocárdicas, linfocitose e encefalite toxoplásmica, uma das mais importantes causas de mortalidade em aidéticos.
A infecção por Neospora caninum também tem sido relatada como responsável por danos reprodutivos aos caprinos e os dados sobre sua ocorrência mundial e no Brasil são bastante escassos. Na literatura consultada, foi encontrado apenas um estudo sobre a
prevalência dessa doença, realizado em 2003 no estado de São Paulo. Provocada por um lentivírus, a artrite-encefalite caprina (CAE) é outra enfermidade que afeta a produtividade dos rebanhos.
Levantamentos epidemiológicos realizados em diversos países,
inclusive no Brasil, constatam sua ampla distribuição mundial. Apesar da intensificação das pesquisas, não existem dados sobre a ocorrência concomitante dessa doença com outras. Estudos nesse sentido
tornam-se importantes, visto que a CAE pode levar a disfunções imunológicas e possivelmente a imunodepressões, facilitando a infecção por outros agentes, principalmente aqueles considerados oportunistas.
Diante da importância dessas enfermidades para a espécie caprina e do aspecto de saúde pública da toxoplasmose, é
necessário que os procedimentos preventivos tornem-se mais eficazes. Caso contrário, toda a integração da cadeia produtiva estará comprometida, trazendo imensuráveis prejuízos ao produtor rural e também à população humana. Sendo assim, as propriedades que investirem em programas de prevenção e controle em seus rebanhos poderão ser as primeiras a se beneficiar de uma nova
mentalidade de comércio, na qual produtos de elevada qualidade e obtidos a partir da preocupação com a saúde do consumidor têm maior aceitação no mercado.
2. REVISÃO DE LITERATURA
A produção de leite e carne de caprinos em países em desenvolvimento tem evoluído e representa uma alternativa como fonte de alimentos para o homem (Souza, 1999). No Brasil, o quadro não é diferente. O país possui o nono maior rebanho caprino do globo, 0,75% dele concentrado no estado de São Paulo, somando uma
população estimada de 71.730 animais (BRASIL, 2005).
De acordo com a FAO (2005), de 1996 a 2002 a taxa de crescimento desse rebanho foi de 21,13%, e o abate desses animais aumentou de dois milhões para dois milhões e quinhentas mil cabeças no período entre 1979 e 2002, o que representa um índice de
crescimento de 25,0%.
Apesar do imenso potencial existente para o consumoda carne e do leite caprinos, seus mercados ainda não foram
devidamente explorados frente à inexistência de uma estrutura eficaz de comercialização, à falta de manejo adequado dos rebanhos e à falta de informação sobre doenças transmissíveis, principalmente as que afetam a reprodução, incluindo a toxoplasmose e a neosporose (Souza, 1999; Figliuolo, 2003).
No que diz respeito à artrite-encefalite caprina, segundo Leite et al. (2004), apesar da intensificação das pesquisas sobre a doença, no Brasil há pouco conhecimento dos caprinocultores acerca das conseqüências da disseminação dessa doença, que tem como
prejuízos diretos e permanentes, perdas de animais e redução do lucro, além de perdas indiretas, também significativas.
2.1. Toxoplasma gondii
A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial que acomete seres humanos e animais de sangue quente, podendo levar a aborto e natimortalidade (Acha & Szyfres, 1986).
O agente etiológico da toxoplasmose, o Toxoplasma gondii (Nicole & Manceaux, 1909), juntamente com os parasitas dos gêneros
Besnoitia (Henry, 1913), Hammondia (Frenkel et al., 1970) e Neospora
(Dubey et al., 1988), formam a subfamília Toxoplasmatinae (Biocca, 1957). Pertencem à família Sarcocystidae (Poche, 1913), cujo ciclo de vida é alternado entre um hospedeiro intermediário, definido como o hospedeiro dos estágios assexuados, e um hospedeiro definitivo, que alberga os estágios sexuados. Possuem como formas de
desenvolvimento o taquizoíto, o bradizoíto e os esporozoítos em oocistos (Macedo, 1994).
O T. gondii é parasita específico do hospedeiro definitivo (membros da família Felidae, felídeos domésticos e silvestres), mas possui uma ampla variação de hospedeiros intermediários. Os felídeos são infectados pela ingestão de carne contendo bradizoítos no interior dos cistos teciduais ou quando ingerem oocistos infectantes. No
intestino delgado dos hospedeiros definitivos, o parasito passa por um ciclo evolutivo típico dos coccídios, que resulta na eliminação de oocistos não esporulados nas fezes. Após vários dias, os oocistos esporulam, tornando-se infectantes por longos períodos, que podem ultrapassar um ano. Os gatos e felídeos silvestres têm, portanto, um papel crucial na epidemiologia da toxoplasmose (Mainar et al., 1996),
contaminando as pastagens e as águas (Van Der Puije et al., 2000). A ingestão do oocisto esporulado é a principal via de transmissão para os herbívoros, dentre eles os ovinos e caprinos (Engeland et al., 1996), seguida da transmissão vertical (Esteban-Redondo & Innes, 1997).
Ao serem ingeridos pelos hospedeiros intermediários, os
oocistos rompem-se no intestino, liberando esporozoítos que dividem-se rapidamente nas células intestinais e nos linfonodos associados,
formando taquizoítos que invadem os tecidos, formando cistos. Estes, quando intactos, provavelmente não causam danos e podem persistir por longos períodos ou por toda a vida do hospedeiro sem levar à resposta inflamatória ou despertar resposta tecidual significante (Duarte & Andrade Jr., 1994). O destino dos cistos teciduais não é totalmente conhecido, mas se propõe que às vezes estes possam se romper durante a vida, liberando os bradizoítos, que podem ser
destruídos pelo sistema imune ou formar novos cistos (Dubey, 1993). A ingestão de carne crua ou mal cozida contendo esses cistos promove uma nova infecção em uma via alternativa do ciclo (Sibley, 2003).
Portanto, quando presentes nos animais de produção, os cistos tissulares são uma importante fonte de infecção para o homem e provavelmente se mantêm por toda a vida nos tecidos de seus hospedeiros. Estes cistos são mais freqüentemente observados em
suínos, ovinos e caprinos infectados, e com menor freqüência em cães, eqüinos, aves domésticas e coelhos. Raramente se encontram cistos em tecidos de bubalinos e bovinos (Tenter et al., 2000).
Nos hospedeiros intermediários, os cistos teciduais podem causar lesões no sistema nervoso, miocárdio, tecido pulmonar e placenta (Chiari & Neves, 1984).
Outra possível fonte de infecção é o leite e seus derivados. Após infecção artificial, Hiramoto et al. (2001) verificaram que a infecciosidade de cistos de T. gondii foi mantida no leite de vaca, mesmo quando este foi armazenado por vinte dias a 4°C. Os cistos resistiram, inclusive, aos processos de manufatura de queijo fresco, permanecendo viáveis por um período de dez dias nas mesmas condições de refrigeração.
Quando atingidos pela toxoplasmose, além de servirem como fonte de contaminação, os animais destinados ao consumo humano também representam prejuízos econômicos a seus criadores, devido a abortos e mortes neonatais (Buxton, 1998).
2.1.1.Toxoplasma gondii em caprinos
A infecção por T. gondii é relativamente comum nos pequenos ruminantes, sendo considerada importante causa de
abortos em ovinos em vários países (Dubey & Kirkbride, 1989). Entre os animais de produção, os caprinos são os mais seriamente afetados, sendo que a infecção por T. gondii durante a prenhez pode causar morte embrionária, reabsorção, mumificação ou morte fetal, aborto, natimortos ou morte perinatal. Os cabritos sobreviventes podem estar infectados, gerando prejuízos aos produtores (Dubey & Adams, 1990; Engeland et al., 1996). As taxas de mortalidade perinatal, incluindo abortos e morte de neonatos nos rebanhos afetados, podem alcançar 50% e uma alta taxa de ocorrência de animais soropositivos entre
cabras e caprinos lactentes pode ser encontrada nos rebanhos com problemas de abortamentos (Chiari et al., 1987). Nos caprinos adultos, o T. gondii pode também causar encefalite, nefrite, hepatite,
Em um estudo experimental (Dubey, 1989), após inoculação de oocistos de T. gondii em cabras de dois a quatro anos e em
cordeiros de dois a três meses de idade, demonstrou-se que o agente é mais patogênico para estas espécies do que para os outros
ruminantes, sendo os animais jovens mais suscetíveis à doença do que os adultos.
Dubey et al. (1980) inocularam 13 caprinos com T. gondii e verificaram que três animais morreram, dois apresentaram prostração e tiveram que ser sacrificados, três abortaram, dois pariram animais
débeis e dois pariram fetos mortos. Todos os inoculados apresentaram febre e anorexia. Em outro trabalho, além do aborto e do isolamento de T. gondii de diversos tecidos, Dubey (1981) descreve títulos de anticorpos maiores ou iguais a 64, mensurados pela prova de Sabin-Feldman (SF), em todos os animais, a partir de duas ou três semanas após a inoculação.
Vitor et al. (1992) inocularam 11 cabras com 107 taquizoítos e observaram transmissão congênita do T. gondii em sete das oito cabras inoculadas entre o 52° e o 67° dias de gestação (cinco abortos e dois partos normais com animais debilitados). Três cabras inoculadas entre o 100° e o 133° dias de gestação pariram crias aparentemente
normais, apesar da ocorrência de transmissão congênita em um dos animais.
Apesar dos estudos citados, é importante ressaltar que nessa espécie a presença de anticorpos anti-T. gondii sem associação a problemas clínicos é também um achado muito comum (Machado & Lima, 1987; Opel et al., 1991).
Com referência à disseminação do T. gondii no organismo dos caprinos, Dubey et al. (1980) infectaram 13 animais e verificaram, por meio de inoculação em camundongos, a distribuição do agente no sangue, leite e em outros tecidos, como cérebro, medula espinhal, pulmões, coração, diafragma, baço e retina, entre outros.
Em Minas Gerais, após inoculação de T. gondii, Vitor et al. (1991) analisaram a saliva, urina e o leite de cabras para detecção de taquizoítos. Mediante bioensaio em camundongos foi demonstrada a presença de T. gondii em 3,7% das amostras de urina, 1,4% das
amostras de saliva e 12,7% das amostras de leite.
A eliminação do agente pelo leite também foi demonstrada por Chiari & Neves (1984) e, no sêmen, por Dubey & Sharma (1980).
Apesar de a eliminação de T. gondii em vários tipos de
secreções e excreções de caprinos já ter sido demonstrada por vários autores, não há comprovação da transmissão horizontal intra-espécie. Chiari et al. (1987) sugerem que esse tipo de contaminação pode ter acontecido em rebanhos por eles estudados, pela ingestão de
secreções infectadas.
Com relação aos levantamentos soro-epidemiológicos,
estudos utilizando vários testes sorológicos foram realizados em todo o mundo, mostrando a alta prevalência da toxoplasmose nas mais diversas espécies animais, principalmente as de produção, o que, pelas lesões causadas, leva a grandes perdas econômicas (Dubey & Adams, 1990; Gandahusada, 1991; Garcia-Vazquez et al., 1993;
Hashemi-Fesharki, 1996; Samad et al., 1997, Nieto & Melendez, 1998). No Brasil, Gondim et al. (1999) relataram, no estado da Bahia, a ocorrência de toxoplasmose em 28,93% dos caprinos, 8,75% dos
ovinos, 3,85% dos búfalos e 1,03% dos bovinos estudados, salientando a importância da carne e do leite de cabras como potenciais fontes de infecção por T. gondii para seres humanos, devido às altas taxas de soropositividade nesta espécie.
Entre os testes sorológicos utilizados para o diagnóstico da toxoplasmose, os principais são: reação de Sabin-Feldman (SF), imunofluorescência indireta (RIFI), teste de aglutinação direta e
indireta, ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e testes de hemaglutinação passiva (Macedo, 1994).
O teste de Sabin-Feldman é sensível e específico, porém
trabalhoso e demorado, tendo sido substituído em diversos laboratórios por métodos mais simples, principalmente a RIFI, que apresenta títulos de anticorpos comparáveis àqueles do SF (Uggla, 1986 apud Figliuolo, 2003).
Nos EUA, trabalhando com soros de diferentes espécies animais, Dubey (1985) obteve índices de positividade de 22,7% para caprinos na prova de Sabin-Feldman, com títulos maiores ou iguais a 16. Dubey & Adams (1990) estudaram a prevalência da toxoplasmose caprina na região noroeste dos EUA nos anos de 1982 a 1984, usando o teste de aglutinação modificado (MAT) e considerando como
indicativo de animais positivos aqueles cujos soros reagiram a diluições iguais ou superiores a 40. A soroprevalência encontrada foi de 22,1% e observou-se aumento de acordo com a idade.
Em um estudo sorológico em quatro estados do México, Garcia-Vazquez et al. (1993) detectaram anticorpos anti-T.gondii em animais de cinco das nove fazendas estudadas. Entre os 707 soros analisados pelo método ELISA, 23 (3,2%) foram positivos.
Na Nova Zelândia, Opel et al. (1991) detectaram anticorpos para T. gondii em 7% dos cabritos, considerando positivos aqueles com títulos iguais ou superiores a 64 no teste de aglutinação em látex (LAT). Na Espanha, trabalhando com caprinos provenientes da Ilha Grande Canária, Rodríguez-Ponce et al. (1995) determinaram uma
soroprevalência de 63,31% de animais positivos pelo ELISA. Uma baixa prevalência foi encontrada na Venezuela, por Nieto & Meléndez
(1998), que detectaram, por meio do teste de hemaglutinação indireta (HI), 6,3% dos 438 caprinos analisados com títulos de anticorpos anti-T.
gondii iguais ou superiores a 64. Os autores citam o clima árido da
região como possível explicação para a dificuldade de transmissão por oocistos.
Diversos estudos verificando a alta prevalência de anticorpos anti-T. gondii nas espécies caprina e ovina já foram realizados no Brasil (Chiari et al., 1987; Machado & Lima, 1987; Sella et al., 1994; Gondim et al., 1999; Figliuolo et al., 2004; Mainardi et al., 2003).
Ao estudar a prevalência da toxoplasmose caprina na região da grande Porto Alegre, RS, Araújo et al. (1984) detectaram 16,1% de reagentes, com títulos iguais ou superiores a 64, empregando o teste de HI.
No estado de Minas Gerais, Chiari et al. (1987) relataram soropositividade em 68% dos caprinos testados, atingindo 92,4% na área urbana de Belo Horizonte e 32% na área rural do Estado.
Machado & Lima (1987), estudando a prevalência da toxoplasmose caprina também em Minas Gerais, detectaram pela RIFI (≥16) 36,8% de animais reagentes.
Sella et al. (1994), em estudo realizado no estado do Paraná, encontraram 30,71% de caprinos positivos pela RIFI, com títulos iguais ou superiores a 64, salientando que há um aumento na freqüência de sororeagentes em animais adultos.
Figueiredo et al. (2001), em trabalho realizado em Uberlândia, Minas Gerais, detectaram índices de soroprevalência que variaram de 19%, utilizando o teste de HI, e 19,5%, utilizando-se RIFI e ELISA. Os
animais que apresentaram títulos iguais ou maiores a 64 foram considerados positivos.
No estado de Pernambuco, em um estudo realizado por Silva et al. (2003) a partir de amostras de soros obtidas no ano de 1997, verificou-se, pela RIFI, uma positividade de 40,4%, dos 213 soros testados.
Em um estudo realizado com amostras séricas de diversas espécies no estado de São Paulo, Meireles et al. (2003) encontraram presença de anticorpos anti-T. gondii em 34 de 200 caprinos, pelo teste ELISA. Mainard et al. (2003), em um outro estudo realizado no estado de São Paulo, verificaram 14,5% de soropositividade em caprinos pela RIFI. Em um recente estudo realizado por Figliuolo et al. (2004), também no estado de São Paulo, verificou-se soropositividade em 28,68% dos caprinos testados, com títulos variando de 64 a 32.768. Constatou-se, ainda que houve pelo menos um animal reagente em todas as
propriedades estudadas, o que indica a grande disseminação deste agente nos rebanhos do estado. A autora ressalta que problemas reprodutivos devido ao T. gondii podem estar ocorrendo e devem ser objeto de estudo. Observou-se uma associação positiva entre o
tendência foi observada por Machado & Lima (1987), Dubey & Adams (1990), Opel et al. (1991), Garcia-Vazquez et al. (1993) e Sella (1994).
2.1.2. Toxoplasmose caprina e saúde pública
Em humanos, a toxoplasmose é considerada uma das
infecções parasitárias mais comuns do mundo, com uma ocorrência estimada em um a dois bilhões de indivíduos infectados
(Esteban-Redondo et al., 1999; Tonelli, 2000). Inquéritos epidemiológicos mostram que 70% a 90% das populações apresentam anticorpos
anti-Toxoplasma (Remington & McLeod, 1990). No Brasil, 50% a 80% da
população adulta é soropositiva (Oréfice & Bonfioli 2000).
Uma importante fonte de infecção são os caprinos infectados pelo T. gondii. A transmissão pode se dar mediante o consumo da carne e do leite de animais contaminados (Figueiredo et al., 2001), sendo a ingestão de leite “in natura” de cabras infectadas
considerada potencial forma de transmissão da toxoplasmose caprina a humanos (Vitor et al., 1991; Dubey, 1996). Este fato é de extrema importância para a saúde pública, visto que o consumo de leite de cabra é elevado em crianças alérgicas ao leite de vaca (Figueiredo et al., 2001).
Vários surtos de toxoplasmose relacionados ao consumo de leite cru de cabras infectadas foram relatados (Riemann et al., 1975; Sacks et al., 1982; Chiari & Neves, 1984; Luft & Remington, 1984; Skinner et al., 1990).
Quanto à transmissão pelo consumo de carne contaminada sem tratamento térmico, Dubey (1980) verificou que o risco existe. Por meio de bioensaio em camundongos para detectar cistos de T. gondii em tecidos de caprinos infectados natural e experimentalmente, o autor os encontrou com maior freqüência no fígado e rins, observando que sua persistência é mais longa na musculatura esquelética do que no cérebro. Foram encontrados cistos também no coração e
diafragma.
Apesar de ser muito comum a presença de anticorpos no homem, a doença toxoplasmose é relativamente rara, sendo em geral encontrada em apenas 10% a 20% dos casos (Bonametti et al., 1997; Viegas et al., 2002).
Um importante grupo de risco para a toxoplasmose é o de gestantes que nunca tiveram contato com o parasita e adquiriram a infecção. Pela transmissão transplacentária, podem ocorrer graves lesões nos fetos (Sabin, 1941). Na maioria dos recém-nascidos
infectados não há sinais clínicos, mas as seqüelas da infecção
congênita são freqüentes no decorrer da vida (Remington et al., 1995 apud Galisteo Jr., 2004).
Em países da Europa, como França e Áustria, estima-se que a cada mil nascimentos ocorram três a quatro casos de transmissão congênita da toxoplasmose (Smyth, 1994 apud Galisteo Jr., 2004).
No Brasil, no estado do Rio Grande do Sul, foram analisados 140914 recém-nascidos, tendo sido possível determinar uma
prevalência de um para cada 3000 nascidos vivos (Neto et al., 2000). Em Campos de Goytacazes, no estado do Rio de Janeiro, as
estatísticas são ainda maiores, sendo detectados cinco casos de toxoplasmose congênita para cada 2550 recém-nascidos (Petersen et al., 2001). No estado de São Paulo (região metropolitana), estima-se
que devam nascer cerca de 230 a 300 crianças infectadas por ano, cerca de uma a cada 1000 partos (Guimarães et al., 1993).
A toxoplasmose também pode afetar o grupo das pessoas que apresentam imunodepressão, como os transplantados, os indivíduos em tratamento de câncer e os infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) (Galisteo Jr., 2004).
A partir de 1981, com o aparecimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (aids), o interesse pela toxoplasmose aumentou, uma vez que a doença se tornou uma importante causa de mortalidade e morbidade de pacientes infectados pelo lentivírus HIV (Macedo, 1994). Nestes, o parasita é responsável pelo
desenvolvimento de uma variedade de sintomas, mas o mais freqüente é a encefalite, na qual a rápida multiplicação dos taquizoítos resulta na destruição dos tecidos neurais. Um aspecto
importante a ser levado em contaé a possível reativação da infecção (devido aos cistos latentes), causada pela liberação de bradizoítos que se transformam em taquizoítos provocando doença grave, principalmente lesões cerebrais (Luft & Remington, 1992).
Em países como a África, 50% dos indivíduos com aids
desenvolvem encefalite devido à toxoplasmose (Clumeck et al., 1984). Nos EUA, cerca de 18 a 25% dos pacientes com aids manifestam
toxoplasmose e podem apresentar alguma seqüela (Kasper & Buzoni-Gatel, 1998), gerando um gasto estimado de 23 a 106 milhões de dólares por ano em tratamento (Roberts et al., 1994).
No Brasil, vários inquéritos realizados em populações urbanas, rurais e indígenas demonstraram a prevalência de sororeagentes, geralmente maior que 50% das amostras (Coutinho et al., 1981). A toxoplasmose cerebral é bastante prevalente entre as doenças
associadas quando da notificação dos casos de aids em pacientes com mais de 12 anos: representa 3,75% dos casos notificados no período de 1980 a 1996 (Brasil, 1996).
Em São Paulo, levantamentos realizados em 1988 e 1991 apresentaram, respectivamente, 21% e 46% de encefalite por toxoplasma em pacientes com o HIV (Passos et al., 2000), sendo a toxoplasmose uma das principais causas associadas em mortes por aids - 12,2% dos óbitos (Santos et al., 2000).
2.2. Neospora caninum
Assim como a toxoplasmose, a neosporose é uma enfermidade abortiva, causada por um protozoário parasita, N.
caninum, estruturalmente muito similar ao T. gondii, porém distintos
antigenicamente (Dubey, 2003). Até 1988 foi identificada
erroneamente como T. gondii (Dubey et al., 1988). Apresenta um grande número de hospedeiros, mas até o momento não há
evidências da capacidade do N. caninum infectar o homem (Dubey, 2003). No entanto, devido a dois macacos Rhesus (Macaca mulata) terem apresentado susceptibilidade à infecção por N. caninum (Barr et al., 1994) há a preocupação sobre o potencial zoonótico do agente.
Diversos estudos foram conduzidos no sentido de verificar a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em seres humanos. Graham et al. (1999) não verificaram anticorpos para o agente na diluição 1:160 de soros de 199 doadores e 48 trabalhadores rurais na Irlanda do Norte. Petersen et al. (1999) não encontraram anticorpos para o
mesmo agente em 76 mulheres com histórico de aborto usando ELISA,
caninum em soros de humanos usando immunobloting, entretanto
estes soros foram negativos no teste de aglutinação (NAT). Trees & Williams (2000) encontraram baixos títulos (RIFI <200) em duas de
quinhentas pessoas na Inglaterra (quatrocentos trabalhadores rurais e cem mulheres com histórico de aborto).
A infecção por N. caninum tem sido diagnosticada em bovinos no mundo inteiro (Anderson et al., 1991; Kim et al., 2000; Canada et al., 2002; Corbellini et al., 2002). É considerada uma importante e comum causa de abortamentos endêmicos e
epidêmicos em fazendas de manejo intensivo (Anderson et al., 1995).
N. caninum pode ocorrer em outras espécies de ruminantes.
No Brasil, Fujii et al. (2001) realizaram estudo com bubalinos no estado de São Paulo, demonstrando também alta prevalência da doença nesses animais. As 222 amostras de sangue colhidas foram submetidas à RIFI e ao NAT para pesquisa de anticorpos contra N. caninum,
obtendo-se 63,9% e 53% de reagentes, respectivamente.
Em caprinos e ovinos o agente também ocorre e está associada a abortamentos e nascimentos de filhotes fracos e
prematuros (Dubey & Lindsay, 1990; Dubey et al., 1992; Barr et al., 1992; Lindsay et al., 1995; Dubey et al., 1996b; Buxton et al., 1997; Jolley et al., 1999; Corbellini et al., 2001).
Do mesmo modo que o T. gondii, o N. caninum apresenta um ciclo de vida alternado entre um hospedeiro intermediário e um
hospedeiro definitivo, neste caso, cães e coiotes (McAllister et al., 1998; Basso et al., 2001; Gondin et al., 2004). Os canídeos infectam-se por ingestão de cistos teciduais dos hospedeiros intermediários, após o que se dá a fase intestinal (enteroepitelial) do ciclo, originando os oocistos
que, liberados para o exterior com as fezes, poderão contaminar a água e as pastagens. Após um período de cerca de 24 horas, os oocistos esporulam, tornando-se infectantes para o hospedeiro intermediário e para o próprio cão, que também atua como
hospedeiro intermediário. Uma vez ingeridos, os oocistos esporulados libertam os taquizoítos que irão originar os cistos teciduais, localizados principalmente no sistema nervoso central, nervos periféricos e retina (Dubey, 1999). Possivelmente outros canídeos silvestres, além dos ora comprovados, também possam fechar o ciclo do protozoário, como cachorros do mato, uma vez que neles já foram encontrados
anticorpos anti-Neospora (Cañón-Franco et al., 2004).
A transmissão vertical ou transplacentária ocorre, podendo a infecção do feto ser letal ou subletal, originando cabritos
cronicamente infectados que perpetuam a infecção na exploração (Anderson et al., 1997).
A neosporose causa desordens neuromusculares, paralisia e morte em cães, além de abortamentos e mortalidade neonatal em bovinos, ovinos e caprinos (Barber et al., 1997).
Um dos testes sorológicos mais utilizado para detectar anticorpos específicos para N. caninum é a RIFI que, quando
comparado ao NAT (Romand et al., 1998), mostrou equivalência de resultados para o diagnóstico da neosporose em várias espécies
hospedeiras. As vantagens do NAT são: custo mais baixo, fácil leitura e realização e requer o mínimo de equipamentos e materiais
laboratoriais.
Em caprinos experimentalmente infectados pelo N. caninum observaram-se abortamentos, mortes fetais e nascimento de animais prematuros e o agente foi isolado da placenta de cabras
experimentalmente inoculadas (Dubey et al., 1992; Lindsay et al., 1995). Dubey et al. (1996b) relataram um caso de abortamento de uma cabra de três anos de idade proveniente da Costa Rica.
Baseado na estrutura dos cistos tissulares e nos resultados da imunoistoquímica, acredita-se que este seja o primeiro caso de abortamento associado ao N. caninum nessa espécie.
No Rio Grande do Sul, Corbellini et al. (2001) diagnosticaram infecção congênita em um cabrito que apresentava dificuldade em ingerir o leite materno e se levantar, ataxia e opistótonos. Os sinais neurológicos tornaram-se mais severos no terceiro dia após o
nascimento, quando o animal foi eutanasiado. Cistos que estavam presentes no córtex medular e medula oblonga reagiram
intensamente com soro policlonal anti-N. caninum.
Com o intuito de estudar as reações cruzadas entre o N.
caninum, T. gondii e Sarcocystis spp, Dubey et al. (1996a) analisaram
soros de caprinos e ovinos para pesquisa de anticorpos anti-N.
caninum pela RIFI, MAT e SF. Não ocorreu reação cruzada entre estes
agentes.
De acordo com a literatura consultada, o único estudo sobre prevalência de N. caninum em caprinos foi realizado em 2004, por Figliuolo et al., no estado de São Paulo. Verificou-se soropositividade em 6,34% dos caprinos testados pela RIFI, com títulos variando de 50 a 12.800.
2.3. Artrite-encefalite caprina
A artrite-encefalite caprina (CAE) é uma enfermidade de caráter persistente, curso progressivo, e se caracteriza como uma síndrome multissistêmica, na qual as principais manifestações clínicas são artrite, mamite e/ou pneumonia em animais adultos, e a
leucoencefalomielite, em jovens (Cork et al., 1974). O CAEV, agente etiológico da CAE, é um RNA vírus pertencente à família Retroviridae, grupo Lentivirus, ao qual também pertencem os vírus da pneumonia progressiva dosovinos, da anemia infecciosa eqüina e das
imunodeficiências humana, felina e bovina (Brown, 1986). Possui
afinidade pelas células da linhagem mononuclear-fagocitária, sendo que a expressão do genoma viral depende do estado de maturação de monócitos em macrófagos (Narayan et al., 1983). As células
infectadas pelo vírus estimulam, de forma exacerbada, os linfócitos T, induzindo-os a uma hiperproliferação e a uma reatividade linfocitária inespecífica, levando a danos imunomediados (Garcia, 1993).
Devido à ampla distribuição mundial (Crawford & Adams, 1981; Adams et al., 1984; Belino & Ezeifeka, 1984, Campbell & Thomas, 1984; Dawson & Wilesmith, 1985; East et al., 1987; Gonzales et al., 1987; Jiménez et al., 1992; Bélanger & Leboeuf, 1993; Loung et al., 1993; Greenwood et al., 1995; Rowe & East, 1997) a CAE é considerada hoje uma das principais doenças de caprinos, tendo alta incidência em áreas endêmicas e afetando animais de todas as idades (Norman & Smith, 1983; Al-Ani & Vestweber, 1984; Modolo et al., 2003). Ocorre, sobretudo, nos países de desenvolvida indústria leiteira, levando a
grandes perdas econômicas, relacionadas à baixa produção de leite; à redução da performance reprodutiva, com baixo aproveitamento do potencial genético dos animais infectados; à diminuição do período de vida útil; à renovação forçada do rebanho e à
mortalidade dos cabritos, afetando negativamente as características produtivas (Smith & Cutlip, 1988; Greenwood, 1995; Rowe & East, 1997).
No Brasil já foi diagnosticada em vários estados (Fitterman, 1988; Garcia et al., 1992; Hotzel et al., 1993; Assis & Gouveia, 1994; Castro et al., 1994; Pinheiro et al., 1996; Ramos et al., 1996; Alves & Pinheiro, 1997; Modolo et al., 1998).
Resultados de um inquérito sorológico realizado em 2002 (Leite et al., 2004), em diferentes regiões do estado de São Paulo,
demonstraram que 100% das 17 propriedades estudadas possuiam pelo menos um animal soropositivo ao vírus, evidenciando a grande disseminação dessa doença no Estado. Num total de 1030 caprinos, a prevalência encontrada foi de 43,01%. As propriedades formadas com animais importados da França tiveram maiores taxas de positividade em relação às formadas com animais não importados. Da mesma maneira, os capris formados por animais vindos de outros estados apresentaram maior porcentagem de positivos do que aqueles formados por animais vindos do próprio estado de São Paulo. Os autores sugerem que o trânsito interestadual e internacional dos animais pode ter contribuído para a difusão da enfermidade e que este deve ser considerado importante fator de risco, havendo, portanto, a necessidade de ter sua fiscalização intensificada.
2.4. Toxoplasma gondii e Neospora caninum em animais imunocomprometidos
Assim como no homem, as infecções por protozoários em animais imunodeprimidos são comuns (Tizard, 1988). De acordo com estudos de soroprevalência, apesar das altas taxas de positividade os hospedeiros definitivos da toxoplasmose (membros da família Felidae) nem sempre manifestam a doença (Dubey, 1976; Dubey, 1986).
Entretanto, fatores iatrogênicos ou naturais que promovem alterações dos mecanismos de defesa, como a infecção pelo vírus da
imunodeficiência dos felinos (VIF), podem reativar a infecção latente, resultando em quadros sintomáticos de toxoplasmose (Witt et al., 1989; Heidel et al., 1990). Segundo Lucas et al. (1998), gatos infectados pelo VIF apresentaram maior freqüência de infecção toxoplásmica com relação a animais não infectados, concordando com o trabalho de Witt et al. (1989).
Em um estudo sobre a infecção cutânea simultânea com os protozoários Leishmania infantum e N. caninum em um cão com lesões, Tarantino et al. (2001) ponderaram ser possível que os efeitos imunossupressivos da infecção por Leishmania - que tem o macrófago como principal célula hospedeira - ou o uso prolongado de terapia com esteróides possa ter contribuído para o desenvolvimento da neosporose no cão. Em outro estudo, Cringoli et al. (2002) concluem que o maior fator de risco para a sorologia positiva ao N. caninum foi a presença de anticorpos para L. infantum. O contrário também é
verdadeiro: o maior fator de risco para L. infantum foi a presença de anticorpos para N. caninum. Os resultados apresentados pelos autores indicam que a co-presença de anticorpos é muito comum em cães e
que a infecção por um protozoário aumenta a susceptibilidade para o outro.
Nos caprinos, a infecção pelo CAEV predispõe sensivelmente os animais a contrair outras doenças, o que é explicado, em parte, pelo efeito depressivo que o lentivírus pode produzir sobre o sistema imunológico do hospedeiro (Zink et al., 1990). Entretanto, não há registros na literatura sobre a associação entre essa importante enfermidade e outras.
Como já foi demonstrado, a toxoplasmose, a neosporose e a CAE são enfermidades de grande importância nos rebanhos caprinos, principalmente em função das perdas econômicas que podem gerar. Além disso, como zoonose de transmissão comprovada mediante consumo de alimentos de origem caprina, a toxoplasmose torna-se preocupante e pode ser elevada ao patamar das enfermidades mais importantes da atualidade, pois leva a graves problemas de saúde nos indivíduos imunodeficientes e idosos (população com índices
crescentes em nosso país).
Nesse sentido, estudos sobre prevalência, correlações
epidemiológicas e inter-relação entre estas enfermidades tornam-se necessários, pois trarão conhecimentos que poderão levar à
prevenção e a uma produção saudável. Assim será possível agregar valores à caprinocultura, além de garantir, em parte, o que preceitua o atual conceito de Segurança Alimentar e Nutricional (Menezes,
1998): “condições, a todos os indivíduos, de acesso a alimentos básicos de qualidade, em quantidade suficiente, de modo permanente e sem comprometer o acesso a outras necessidades essenciais, com base em práticas alimentares saudáveis, contribuindo assim, para uma
existência digna, em um contexto de desenvolvimento integral da pessoa humana”.
Considerando ser a toxoplasmose relativamente comum nos
pequenos ruminantes, podendo acometer seriamente os caprinos infectados e causar sérios prejuízos;
- considerando que a carne de caprinos e o leite de cabras
infectadas são potenciais fontes de infecção por T. gondii para o ser humano;
- considerando que a neosporose pode levar a sérios problemas reprodutivos na espécie caprina e os dados sobre a prevalência e epidemiologia dessa enfermidade são bastante escassos;
- considerando ser a CAE uma enfermidade prevalente nos rebanhos caprinos, que predispõe os animais a outras doenças;
o presente estudo teve como objetivos:
- estimar as freqüências de anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum em caprinos do estado de São Paulo, pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e pelo teste de aglutinação direta (NAT), respectivamente;
- verificar possíveis associações entre positividade de cada agente e faixas etárias, sexos dos animais, ocorrência de problemas
reprodutivos nos capris e presença de gatos ou cães nas
propriedades (respectivos hospedeiros definitivos de T. gondii e N.
caninum);
- avaliar possíveis associações entre a ocorrência de anticorpos para o vírus da CAE e sorologia positiva para T. gondii e N. caninum;
ou N. caninum e ocorrência de problemas reprodutivos nos capris; - estabelecer um indicador quantitativo de saúde dos capris -“status
4.1. Área de estudo
Os animais do presente estudo foram provenientes de 17 propriedades localizadas em diferentes municípios do estado de São Paulo, como ilustra a Figura 1. Todas as propriedades eram voltadas para a produção de leite e apresentavam manejo intensivo.
Graus N Botucatu Pardinho Lençóis Paulista Batatais Jaboticabal Moji-Guaçu
Pirassununga São Sebastiãoda Grama
Serra Negra S. José dos Campos Monteiro Lobato Piquete Itapetininga Araçoiaba da Serra
PiedadeCotia São Paulo
-53 -52 -51 -50 -49 -48 -47 -46 -45 Longitude W -25 -24 -23 -22 -21 -20 L a titude S 0 1 2
Foram utilizadas amostras de soros de 923 animais de ambos os sexos, sem especificação de raça, com idade acima de três meses, compondo três faixas etárias (tabela 1). A idade dos animais foi
informada pelos proprietários ou obtida por verificação da data de nascimento identificada em brincos.
Tabela 1. Freqüência absoluta de caprinos segundo sexo e faixa etária em capris do estado de
São Paulo. Botucatu. 2005
Sexo Faixa etária
Machos Fêmeas Total
< 1 ano 10 171 181
1 4 anos 34 584 618
> 4 anos 7 117 124
Total 51 872 923
4.3. Colheita de sangue
As amostras de sangue de todos os animais com mais de três meses de idade de cada propriedade foram colhidas durante os anos de 2001 e 2002, por meio de venopunção jugular, em tubos a vácuo estéreis sem anticoagulante. Os tubos foram centrifugados a 2000 rpm por dez minutos, para obtenção de soro, e estocados a -200C para posterior realização das provas sorológicas: imunodifusão em gel de agarose (IDGA) para o diagnóstico da CAE, RIFI para o diagnóstico da toxoplasmose e NAT para o diagnóstico da neosporose.
4.4. Informações epidemiológicas e relativas a falhas reprodutivas
Durante o período das colheitas de sangue, foi aplicado um inquérito para levantamento epidemiológico relacionado à toxoplasmose e neosporose e sobre problemas reprodutivos em cada capril, conforme segue:
CARACTERÍSTICAS DO CAPRIL
Presença de gatos: Sim Não Presença de cães: Sim Não Tipo de criação: Intensiva Extensiva Abortos: Sim Não
Nascimento de natimortos: Sim Não
Nascimento de cabritos debilitados: Sim Não
Comercialização de leite: “In natura” Pasteurizado Comercialização de carne: Sim Não
4.5. Procedimentos laboratoriais
4.5.1. Reação de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii
A sorologia dos caprinos para T. gondii foi realizada no Laboratório de Zoonoses do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ/UNESP, Botucatu/SP utilizando-se a RIFI, segundo o método descrito por Camargo (1974).
4.5.1.1. Sensibilização das lâminas com antígeno de
Toxoplasma gondii
A solução antigênica foi obtida a partir de lavados peritoneais de camundongos, previamente inoculados intraperitonialmente com suspensão de taquizoítos de T. gondii. Após a obtenção, o lavado foi transferido para um tubo de centrífuga (50 ml), adicionando-se
solução de formol 2% (9,8 ml de solução salina + 0,2 ml de formol puro) em igual volume. A solução foi incubada à temperatura de 37º C por trinta minutos, sendo homogeneizada suavemente, por inversão, a cada dez minutos. Então, foi feita a centrifugação da suspensão antigênica inativada a 3000 rpm por dez minutos, descartando-se o sobrenadante. Ao sedimento foram acrescentados dois a três ml de solução salina tamponada 0,01M pH 7,2 (SST). Procedeu-se à
homogeneização em vórtex e nova centrifugação a 3000 rpm por dez minutos. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento adicionou-se
com uma lamínula 24 x 60 mm. A concentração foi observada em lâmina pela contagem de taquizoítos, que deveria chegar a trinta a quarenta por campo.
A sensibilização das lâminas foi feita com a adição de 10 µl da solução antigênica em cada um dos poços, retirando-se o excesso por aspiração após dois a três minutos (tempo necessário para ocorrer a fixação dos taquizoíto), restando uma fina película sobre cada poço. Depois de secas em temperatura ambiente, as lâminas foram estocadas em laminários e mantidas entre -18ºC e -20ºC.
4.5.1.2. Reação de imunofluorescência indireta
Os soros foram diluídos em SST 0,01M pH 7,2, considerando-se a diluição 1:16 como ponto de corte. Foram distribuídos 10 µl de cada diluição dos soros nos poços das lâminas fixadas previamente com o antígeno, utilizando-se em cada uma um controle positivo e um negativo. As lâminas foram incubadas em estufa a 37oC, em câmara úmida por 30 minutos, e lavadas duas vezes por dez minutos em SST. Depois foram secas. A seguir, acrescentou-se a cada reação 10 µl do conjugado anti-IgG caprina, marcado com o isotiocianato de
fluoresceína e diluído 1:100 em solução de azul de Evans, a qual havia sido previamente diluída a 1:5 em SST. As lâminas foram novamente incubadas em estufa a 37ºC, em câmara úmida por trinta minutos, a seguir lavadas duas vezes por dez minutos em SST 0,01M pH 7,2 e, então, secas. Pingou-se solução glicerinada pH 8,5 cobrindo-as com lamínulas. A leitura foi realizada em microscópio de fluorescência, com objetiva de 40X e ocular de 10X, seguindo-se o seguinte critério: foram considerados positivos os soros que apresentaram fluorescência
completa e intensa na borda de pelo menos 50% dos taquizoítos. Aqueles que não tiveram fluorescência ou naqueles em que essa foi
positivos na diluição 1:16 passaram por diluições seriadas,
quadruplicando-se a anterior, até a quinta diluição, ou seja: 1:64, 1:256, 1:1024 e 1:4096. Após serem feitas nos controles, as leituras foram
realizadas nos outros poços das lâminas, sem discordância dos resultados esperados.
4.5.2. Teste de aglutinação para detecção de anticorpos
anti-Neospora caninum
O NAT (Neospora Agglutination Test) foi realizado no Animal Parasitic Diseases Laboratory, United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, Estados Unidos, pela equipe do Dr. J. P. Dubey. Utilizou-se a técnica descrita por Romand et al. (1998), com taquizoítos da cepa NC-1 de N. caninum. Os soros foram inicialmente analisados na diluição 1:25 e os positivos diluídos 1:100 e 1:500 e titulados.
4.5.3. Imunodifusão em gel de agarose para o diagnóstico da CAE
Este exame foi realizado no Laboratório de Planejamento em Saúde Animal e Saúde Pública do Departamento de Higiene
Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu/SP (FMVZ/UNESP).
técnica de IDGA, de acordo com Cutlip et al. (1977). Para a realização do teste foi preparada solução de agarose 1%, diluída em solução salina tamponada com fosfatos (1,18 mol/l NaCl, 0,01 mol/l PO4--), pH 7,4. Após completa dissolução pelo calor, a solução foi então resfriada até a temperatura aproximada de 45-50ºC e distribuída em placas de petri de vidro 100x15mm (15 ml por placa), permanecendo em
temperatura ambiente até sua solidificação e armazenagem a 2-8ºC por, no mínimo, 24 horas. No momento do uso, o gel foi perfurado com moldes de 5mm de diâmetro e 3mm de distância entre as bordas, sendo um central e outros seis distribuídos em torno deste, com
capacidade de 25 µl de material por poço. O soro padrão e os testes foram distribuídos em poços alternados e o antígeno no poço central. O antígeno utilizado foi produzido por amostra de CAEV cedida por Dr. Yahia Chebloune, do Laboratoire Associé de Recherches Sur Les
Lentivirus Chez Les Petits Ruminants, INRA - ENVL, França, isolada por Crawford et al. (1980) e replicada em células de membrana sinovial caprina (MSC) por Abreu et al. (1998).
As placas foram incubadas a 20-250 C para leitura após 24 horas e a 2-8ºC para leitura 48 horas depois.
A interpretação foi feita de acordo com as normas internacionalmente aceitas, obtendo-se resultados positivos ou negativos a partir da observação da formação de linha de
precipitação entre o soro teste e o antígeno. Foi considerado positivo o soro cuja linha de precipitação apresentou identidade com a linha formada pelo soro padrão. Aqueles em que não houve formação de linha de precipitação ou a linha formada não teve identidade com a do soro padrão (linha inespecífica) foram considerados negativos.
4.6. Metodologia estatística∗
A análise estatística deste estudo foi realizada considerando-se os seguintes procedimentos:
1. No estudo da presença de anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum nos caprinos utilizou-se a construção dos intervalos de 95% de confiança para a proporção de ocorrência (sucessos), considerando a distribuição binomial das probabilidades (Norman & Streiner, 1994).
2. Para o estudo das associações de ocorrência de toxoplasmose e neosporose nesses rebanhos com os respectivos dados epidemiológicos foi utilizado o Teste de Associação de Goodman para contrastes entre e dentro de populações multinomiais (Goodman, 1964, 1965). Na indicação das
significâncias para contrastes multinomiais foram utilizadas letras minúsculas para comparações entre linhas, fixada a categoria de resposta (coluna). Para a interpretação dos resultados procedeu-se da procedeu-seguinte maneira: duas proporções procedeu-seguidas de uma
mesma letra minúscula não diferiram (P>0,05) quanto às
respectivas linhas na categoria de resposta em consideração. Duas proporções seguidas de letras minúsculas diferentes diferiram (P<0,05) quanto às respectivas linhas na categoria de resposta em consideração.
3. Para o estudo da co-infecção da toxoplasmose ou neosporose com o vírus da artrite-encefalite caprina foi utilizado o “teste de duas proporções binomiais” (Norman & Streiner, 1994).
∗ Consultores: Prof.Titular Carlos Roberto Padovani e Prof. Dr. Flávio Ferrari Aragon, Departamento de Bioestatística,
