UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENFERMAGEM
CARLOS JORGE POBLETE JARA
TOPIRAMATO TÓPICO DIMINUI O TEMPO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
EM CAMUNDONGOS DIABÉTICOS
CAMPINAS
2017
CARLOS JORGE POBLETE JARA
TOPIRAMATO TÓPICO DIMINUI O TEMPO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
EM CAMUNDONGOS DIABÉTICOS
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de
Enfermagem da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Mestre em Ciências da Saúde, Área de Concentração:
Enfermagem e Trabalho.
ORIENTADOR: ELIANA PEREIRA DE ARAUJO
COORIENTADOR: MARIA HELENA MELO LIMA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DEFENDIDA PELO ALUNO CARLOS POBLETE JARA, E ORIENTADO PELA Prof.ª Dr ª. ELIANA PEREIRA DE ARAUJO.
CAMPINAS
2017
FICHA CATALOGRÁFICA
Dissertação de Mestrado realizada com apoio financeiro do Grupo
Coimbra de Universidades Brasileiras (GCUB) - Edital 001/2014 – e
CEPID FAPESP OCRC- Processo nº 2013/07607-8
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
CARLOS POBLETE JARAORIENTADOR: ELIANA PEREIRA DE ARAUJO
COORIENTADOR: MARIA HELENA MELO LIMA
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. ELIANA PEREIRA DE ARAUJO
2. PROFA. DRA. GABRIELA FREITAS PEREIRA DE SOUZA
3. PROFA. DRA. BEATRIZ GUITTON RENAUD B. DE OLIVEIRA
4. PROF. DR. MARCO ANDREY CIPRIANI FRADE
5. PROF. DRA. HOSANA GOMES RODRIGUES
Programa de Pós-Graduação em Enfermagem da Faculdade de Enfermagem
da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca
examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
À Professora Eliana Pereira de Araújo, pela oportunidade e orientação
em todas as etapas da realização deste trabalho. Pelo exemplo que nos inspira
a cada dia.
À Professor Lício Augusto Veloso e Professora Maria Helena Melo Lima,
pela orientação.
À Faculdade de Enfermagem da Unicamp e à Professora Roberta Cunha
pela confiança em mim, por me apoiar desde antes da minha chegada ao
Brasil.
À Organização dos Estados Americanos (OEA) e do Grupo de Coimbra
de Universidades Brasileiras (GCUB), à Divisão de Assuntos Educacionais do
Ministério das Relações Exteriores do Brasil e Organização Pan-Americana da
Saúde (OPAS / OMS), pela manutenção econômica.
Aos meus amigos e companheiros do LabSinCel por me ensinar, pela
paciência e confiança, obrigado Vanessa Bobbó, Rodrigo Carraro, Felipe
Correa, Thiago Matos, Joana Gaspar, Bruno Chausse e Albina Ramalho
Garcia.
Aos funcionários do Laboratório de Sinalização Celular, pelo suporte
técnico, Obrigado Erika Anne, Joseane Morari e Gerson Ferraz.
Ao
José
Luis,
por
ser
minha
família
aqui
no
Brasil.
A mi mamá, por todo.
RESUMO
Feridas crónicas de pacientes diabéticos, além de comprometer a qualidade de
vida, são um grave problema de saúde pública. O Topiramato (TPM) tem sido
usado topicamente para tratar feridas e mostrou acelerar o processo de
cicatrização, mas o efeito num modelo de feridas diabético e os mecanismos
moleculares pelos quais age não foi ainda elucidado. O objetivo deste estudo
foi investigar o efeito macroscópico e molecular do TPM tópico no processo de
cicatrização de feridas de camundongos diabéticos e não diabéticos.
Comprovada a hiperglicemia, foi realizada duas lesões excecionais no dorso
dos animais e logo tratadas cada dia com creme enriquecido com Topiramato a
2% ou placebo como controle. Nos dias 1, 3, 7 e 14 os animais foram
sacrificados e o tecido foi extraído para processamento e analise. Os
resultados indicam que o tratamento tópico com TPM acelera o tempo de
cicatrização de feridas em camundongos diabético, porém não acelera nos
animais não diabéticos. No dia 14 o tratamento com TPM aumentou as
citocinas anti-inflamatórias IL-10 e fatores de crescimento e quimioatractores
TGF e SOX-2. Neste dia, o TPM ativa a via de insulina através da fosforilação
de IRS-1 e AKT. Neste sentido, podemos concluir que o uso do creme
enriquecido com TPM a 2% mostrou-se eficaz na aceleração da cicatrização no
modelo de feridas diabético com aumento da ativação da sinalização de
insulina e melhora da expressão de fatores de crescimento e quimioatractores
na fase de remodelação.
Linha de pesquisa: Processo de Cuidar em Saúde e Enfermagem
Palavras-chave: Diabetes Mellitus, cicatrização, Proteínas Proto-Oncogênicas
c-akt
ABSTRACT
Chronic wounds of diabetic patients, in addition to compromising quality of life,
they are a serious public health problem. Topiramate (TPM) has been used
topically to treat wounds and has been shown to accelerate the healing
process, but the effect on a diabetic wound model and the molecular
mechanisms by which it acts has not yet been elucidated. The aim of this study
was to investigate the macroscopic and molecular effect of TPM topical
treatment in the wound healing process on diabetic non-diabetic and mice.
Once hyperglycemia was confirmed, two excisional lesions were performed on
the dorsum of the animals and then treated each day with 2% TPM cream or
placebo cream as a control. On days 1, 3, 7 and 14 the animals were sacrificed
and the tissue was extracted for processing and analysis. The results
demonstrated that topical treatment with TPM cream accelerates wound healing
time in diabetic mice, but does not in non-diabetic animals.
On day 14, the treatment with TPM increased the anti-inflammatory cytokines
IL-10, growth factors, and chemoattractants TGF and SOX2. On this day, TPM
activates the insulin pathway through the phosphorylation of IRS-1 and AKT.
Therefore, we conclude that the use of 2% TPM cream shown to be effective in
accelerating the wound healing time in the diabetic wound model with increased
activation of insulin signaling and improved expression of growth and
chemoattractants factors in the remodeling phase .
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1...15
Figura 2...20
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AKT
Proteína Quinase B
CTL
Não diabético
DM
Diabético
DM2
Diabetes Mellitus tipo 2
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
ECM
Matriz Extracelular
eNOS
Sintetase do Óxido Nítrico Endotelial
EPCs
Células Progenitoras Endoteliais
ERK
Quinases Reguladoras da Sinalização Extracelular
FGF-2
Fator de Crescimento de Fibroblasto 2
IGF-1
Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1
IkB
Inibidor de Kapa B
IL-1
Interleucina 1
IL-1β
Interleucina 1 Beta
IL-6
Interleucina 6
IL-10
Interleucina 10
IMC
Índice de Massa Corpórea
IR
Receptor de Insulina
IRS-1
Substrato 1 do Receptor de Insulina
IRS-2
Substrato 2 do Receptor de Insulina
NO
Óxido Nítrico
NOS
Sintetase do Óxido Nítrico
MCP1
Proteína Quimiotática Monocítica 1
MMP-1
Metaloproteinases 1
MMP-2
Metaloproteinases 2
OMS
Organização Mundial da Saúde
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PI3K
Fosfatidilinositol 3 Quinase
PIP3
Fosfatidilinositol 3 Fosfato
PDGF
Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
PKB
Proteína Quinase B
RNAm
Mensageiro do Ácido Ribonucléico
RNA
Ácido Ribonucléico
SDF-1α
Célula Estromal Derivada do Fator 1 Alfa
SHC
Molécula Adaptadora e Substrato do Receptor de
Insulina
SH2
Segunda Homologia ao Src
Src
Oncogene Originalmente Definido como Produto do
Sarcoma Vírus Rous
TIMP-2
Inibidores de Metaloproteinase 2
TPM
Topiramato
TNFα
Fator de Necrose Tumoral Alfa
TGF-α
Fator de Crescimento Transformador Alfa
TGF-β
Fator de Crescimento Transformador Beta
TPM
Topiramato
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 13
OBJETIVOS ... 19
MÉTODOS ... 20
RESULTADOS ... 25
DISCUSSÃO GERAL ... 68
CONCLUSÃO ... 69
REFERÊNCIAS ... 72
ANEXOS ... 75
INTRODUÇÃO
Atualmente cerca de 382 milhões de pessoas que vivem com Diabetes tipo 2 (DM 2) ao redor do planeta, podendo chegar à 592 milhões de pessoas em 2035 (1) Uma das preocupações constantes do paciente diabético é o desenvolvimento de alterações anatômicas e fisiopatológicas dos pés que leva ao chamado pé-diabético. Dentre as características do pé diabético está a perda sensitivo motora e autonômica, sendo a primeira o tipo mais comum e o principal fator de risco para o desenvolvimento de úlceras nos pés que constitui a mais comum das complicações diabéticas (2)(4). Além disso, distúrbios na defesa imunológica e processo de cicatrizaçãodiminuído, pode facilmente levar a infecção e ulceração, o que aumenta o período de cicatrização e o risco de amputações (1).
A cicatrização é um processo complexo de reconstrução cutânea, caracterizado pela formação de tecido de granulação, que inclui a proliferação de células, a contração da ferida, angiogênese e a deposição de Matriz Extracelular (MEC) (3). Este, é um processo dinâmico onde é necessário a integração de citocinas, quiomicinas, células sanguíneas, células do parênquima (4) e que pode ser dividido didaticamente em três fases que se sobrepõem entre si, a inflamatória, de proliferação e remodelação (4, 5).
A fase inflamatória é caracterizada pela vasodilatação e consequente aumento da permeabilidade dos vasos próximos a ferida, o que permite a migração de macrófagos e neutrófilos atraídos pelos fatores de crescimento e citocinas secretados inicialmente pelas plaquetas agrupadas no local da lesão que também respondem pela formação do tampão hemostático (5). Em resposta a quimioatratores específicos, tais como fragmentos de proteínas da MCE e Proteína Quimioatratora de Monócitos-1 (MCP-1), ocorre a infiltração de monócitos os quais se diferenciam em macrófagos ativados e assim liberam fatores de crescimento que iniciam a formação do tecido de granulação (4). Dentre as substâncias mais importante secretadas nessa fase estão os mediadores do processo de cicatrização, tais como o Fator de Crescimento Transformador- α e β (TGF- α e TGF-β) (5), o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF), que além de serem responsáveis pela formação da nova MCE e de vasos sanguíneos atraem e ativam fibroblastos que estão nas bordas da lesão, estes últimos capazes de secretar Interleucina-1 (IL-1), e Fator de Crescimento Semelhante à Insulina (IGF-I) que darão início a fase proliferativa (4). A interleucina-10 (IL-10) regula esta fase ao diminui a biossíntese de citocinas inflamatórias produzidas pelos monócitos ou macrófagos (6, 7).
Na fase proliferativa, ocorre a ativação de macrófagos e a secreção de fatores de crescimento como TGF-β, MCP-1, PDGF, IGF-1 e o Fator de Crescimento de Fibroblasto-2 (FGF-2) entre outros, e a MEC começa a ser substituída por um tecido conjuntivo mais forte e mais elástico (8) . Os principais acontecimentos deste período é a atividade celular com a criação de uma barreira de permeabilidade no novo tecido (remodelação), o estabelecimento do fornecimento adequado de sangue (angiogênese) e o reforço do tecido cutâneo lesado (fibroplasia) (5).
No final do processo de cicatrização ocorre a maturação e remodelagem da MEC. É nesse momento que a cicatriz adquire sua máxima resistência tênsil quando se inicia a intensa deposição de colágeno (8) , inicialmente de colágeno do tipo III formando fibras desorganizadas e a seguir a deposição do colágeno do tipo I dispostos de forma organizada dando o aspecto característico da cicatriz.
Existem diferentes resultados finais para o processo de cicatrização descrito anteriormente. Por exemplo, no processo de cicatrização fetal, a MEC do tecido cicatricial se apresenta indistinguível do tecido circundante, o colágeno é depositado na ferida com um padrão reticular fino, regenerando um novo tecido substituto sem a criação de cicatriz, em contraste com o modelo de cicatrização pós-natal, onde o colágeno se deposita em pacotes espessos que são organizados em matrizes Figura 1. Efeito da insulina nos mecanismos intracelulares da cicatrização de feridas em diabetes (Adaptado de Lima et al, 2012).
paralelas ao longo de linhas de tensão (9, 10). A IL-10 demonstrou ser crítica na capacidade intrínseca do feto para o reparo tecidual sem a criação de cicatrizes. A superexpressão de IL-10 demonstrou ser efetiva para imitar o fenótipo regenerativo fetal no tecido pós-natal (10).
A Sox-2, um membro da família Sox, é um fator de transcrição chave envolvido na biologia de células precursoras, proliferação e diferenciação celular(11). Sox-2 desempenha um papel vital na auto renovação celular de células precursoras embrionárias indiferenciadas (12). Na pele adulta o processo de cicatrização demonstrou ser dependente da Sox-2. Quando a Sox-2 é diminuída, esta resposta é perturbada gerando uma cicatrização aberrante na pele (13).
No entanto, em indivíduos com DM o processo fica emperrado e muitas vezes a ferida se torna crônica (3, 5, 14), com prolongada inflamação (15), pobre angiogênese e uma menor deposição de colágeno na MEC (16). A menor deposição de colágeno é secundária a destruição excessiva da MEC devido ao ambiente proteolítico aumentado pelo processo inflamatório que se prolonga nesses pacientes (17) . Além, disso, em modelos animais de DM, foi demonstrado que o IGF-I e TGF-β estão significativamente diminuídos no fluído da ferida, em relação aos controles o que também explica a menor deposição de colágeno nessa situação (18). Adicionalmente, outros estudos demonstraram uma diminuição do fator de crecimento vascular endotelial (VEGF) (14), o qual apresenta propiedades angiogénicas(19), e uma redução significativa da síntese de Óxido Nítrico (ON) (20), como também um aumento de enzimas capazes de destruir a MEC como as Metaloproteinases 1 e 2 (MMP-1 e MMP-2) e a redução dos Inibidores de Metaloproteinase-2 (TIMP-2) que são inibidores endógenos dessas enzimas que degradam MEC (17) como tambem uma diminuiçao da IL-10 (21) importante citocina anti-inflamatoria.Todos esses fatores somados ao fato de que a atividade das proteínas envolvidas na via de sinalização da insulina estão significativamente diminuidas em animais diabéticos desencadeiam um retardo no processo cicatricial (22).
A insulina sinaliza por meio de um receptor com atividade tirosina quinase intrínseca, chamado de receptor de insulina (IR). Este receptor é composto por duas subunidades alfa extracelulares e duas subunidades beta transmembrana, ligadas entre si por pontes dissulfeto, formando um complexo heterotetramérico α2β2. Quando a insulina se liga às subunidades α do receptor ativa uma reação de autofosforilação acionando as subunidades β que por sua vez passam a catalisar a fosforilação do IRS-1 e IRS-2 em resíduos tirosina (23) (24). Em seguida com a ativaçao do IRSIRS-1/2 ocorre
a deflagração de uma cascata de sinalização intracelular com o envolvimento da Pi3Quinase e posteriormente da AKT (25, 26), que uma vez ativada promove a transcrição de genes importantes no controle de vários processos biológicos incluindo, além da captação de glicose, proliferação e migração celular (22, 27). Conforme descrito na Figura 1, a ativação da AKT está relacionada ao aumento do VEGF (provavelmente secretados por macrófagos, fibroblastos e células epiteliais) que vão induzir a fosforilação e ativação de eNOS na medula óssea, com consequente mobilização de EPCs na circulação. O Fator Derivado do Estroma 1 alfa (SDF-1α) induz a migração as EPCs no sítio da lesão, onde participam da neovasculogênese(22).
Assim como outros hormônios, a insulina também tem a capacidade de ativar uma outra via por meio da Proteína Ativada por Mitógeno (MAPquinase) e da Quinase Reguladora da Sinalização Extracelular (ERK). ERK ativada pode se translocar para o núcleo, onde catalisa a fosforilação de fatores de transcrição (28) que levam à proliferação e diferenciação celular.
Durante a hipóxia induzida pela ferida, o VEGF é libertado por macrófagos, fibroblastos e células epiteliais induz a fosforilação e ativação de eNOS na medula óssea, resultando em um aumento em níveis de NO, o que desencadeia a mobilização de EPCs da medula óssea para a circulação(29).
No entanto, há situações em que a insulina passa a ter sua função diminuída como na obesidade e DM2. Um dos fatores entre os vários, que levam à resistência a ação da insulina é o processo inflamatório. Com ele ocorre o aumento da produção e secreção de citocinas como Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα), Interleucina- 1 beta (IL-1β), IL-6 ente outras(30-33). O TNF-α pode induzir a ativação da serina/treonina quinase JNK, que desta forma leva a fosforilação em serina do IRS-1 o que contribui para a resistência à transdução do sinal da insulina por meio desta via. A outra via que pode ser ativada tanto pelo TNF-α quanto pela IL-1 β é a via IKK/IkB/NFkB. A ativação de IKK por estas citocinas promove a dissociação deste complexo levando a ativação de NFkB e sua translocação para o núcleo, mas também pode induzir a fosforilação em serina do IRS-1 e mais uma vez diminuição da transdução do sinal insulínico (30-33). Portanto, na pele, a diminuição da atividade desta via pode comprometer o processo de cicatrização (13).Os pacientes paciente com DM2 apresentam resitencia à ação da insulina (34) por diversas causas e a mais comum delas é a diminuição da sinalização da insulina. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade das proteínas envolvidas na via de sinalização de insulina como o Receptor de Insulina (IR), e outras proteínas da via de sinalização
como Substrato 1 e 2 do Receptor de Insulina (IRS-1 e 2) estão significativamente diminuidas em animais diabéticos (22). A diminuição da atividade da insulina ou sua ausência na pele é um importante fator que contribui para o defeito no processo de cicatrização (13).
Sabe-se que a insulina é capaz de estimular o crescimento, proliferação e migração de diferentes tipos de células como queratinócitos, células endoteliais e fibroblastos (13). Isso ocorre por meio da transdução do sinal da insulina por duas vias principais, a do IRS-1 e IRS-2 que quando fosforilado pelo IR leva a ativação da Proteína Quinase B (PKB ou AKT) que por sua vez leva a efeitos metabólicos como a captação de glicose, gliconeogênese e síntese de proteínas (13, 14). Por outro lado, a via da Proteína Quinase Ativada por Mitógeno (MAP kinase) quando fosforilada pelo IR desencadeia uma série de reações em cascata que culmina com a fosforilação da Quinase Regulada por Sinal Extracelular 1 e 2 (ERK-1 e ERK-2) que então se transloca para o núcleo da célula e provoca a transcrição de genes que levam a crescimento e proliferação (13, 14).
Em estudos anteriores foi demonstrado que substâncias administradas topicamente são capazes de ativar a via de sinalização de insulina que levam a melhora do processo cicatricial (22, 35-37). O Topiramato (TPM) é um monossacarídeo inicialmente sintetizado para tratar o diabetes por sua atividade hipoglicemiante, criado durante a busca de um novo medicamento antidiabético (38) (39), porém atualmente é reconhecido como um medicamento eficaz no tratamento de todos os tipos de crises epilépticas, em adultos e crianças (40). Seu uso foi aprovado em 1996 pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos (38).
No início dos anos 2000 dois estudos demonstraram pela primeira vez os efeitos na pele do topiramato administrados oralmente. O primeiro levou a uma melhora na aparência estética de cicatrizes (41) e o segundo foi eficiente para o tratamento da psoríase (42). Além disso em 2010, foi demonstrado que o topiramato, em formulações tópicas, pode ser utilizado para tratar alterações epiteliais, tais como as feridas, reduzindo o tempo de cicatrização e também reduzindo ou eliminando a subsequente cicatriz (43). Porém, em nenhum desses estudos foi avaliado o mecanismo molecular pelo qual o TPM age sobre a pele.
Estudos em animais diabéticos mostraram uma diminuição progressiva dos níveis de glucose em sangue após o tratamento com insulina e topiramato em várias concentrações (39), como também apenas com o TPM (44) (45). Outros estudos demonstraram que o TPM pode levar a um aumento significativo da captação de
glicose estimulada por insulina (45), além de aumento de células beta pancreáticas (39) e até mesmo perda de peso (46).
Recentemente foi demonstrado que o TPM administrado via oral é capaz de aumentar a ativação da via de sinalização de insulina tanto pela via da ERK/MAPK assim como a via do IRS-1/AKT em hipotálamos de camundongos, aumentando a captação de glicose assim como a oxidação de ácidos graxos (47).
Desta forma, a hipotése do nosso trabalho é que a aplicação tópica de TPM pode levar a diminuição do tempo de cicatrização de feridas em uma situação que esse processo está diminuido, como no DM por meio da ativação da via de sinalização da insulina.
A justificativa deste trabalho decorre da necessidade de se encontrar novas opções para o tratamento de feridas por meio de produtos que já estejam liberadas para o uso em humanos e que sejam acessíveis à população. Tal avanço traria benefícios para pacientes com doenças crônicas que apresentam alto risco de desenvolver complicações como infecções, amputações e até mesmo septicemias, o que aumenta a morbidade e sobrecarrega o sistema de saúde ao redor do mundo.
OBJETIVOS
GERAL
Avaliar os efeitos do uso tópico do Topiramato sobre a cicatrização de feridas em camundongos diabéticos e não diabéticos.
ESPECÍFICOS
Determinar o tempo de cicatrização e avaliar os aspectos morfológicos da ferida;
Avaliar a expressão e atividade das proteínas da via de sinalização da insulina: IRS-1, AKT, ERK1;
Avaliar a expressão de proteínas envolvidas com o processo inflamatório e de fatores de crescimento relacionados com o processo cicatricial.
MÉTODOS
Foram utilizados camundongos C57/Black machos recebidos com quatro semanas de vida, provenientes do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB) e mantidos em caixas individuais, com ração padrão para roedores (Purina) e água “ad libitum” e sob condição padronizada de iluminação (ciclo de 12 horas claro/escuro) e temperatura de 22 ± 2ºC.
Desenho experimental
Com 08 semanas de idade os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos: animais controles (CTL) e animais que foram submetidos a indução de diabetes por meio do uso de estreptozotocina (STZ) 150mg/kg via intraperitoneal (DM). Após a verificação da instalação da doença no grupo DM por meio da glicemia capilar (≥ 250mg/dl) (48), os dois grupos de animais foram anestesiados com ketamina cloridrato (100 mg/kg) e xylazina cloridrato (2 mg/kg). Após 10 a 15 minutos, conferida a perda do reflexo córneo e pedioso, foi efetuada a tricotomia dorsal e a excisão da pele por meio de um perfurador de 6 mm, e com numa profundidade que atinja apenas a epiderme e derme. A ferida não foi coberta ou suturada e a cicatrização ocorrerá por segunda intenção. Os animais receberam tratamento de analgesia com Tramadol 20 mg / kg administrada por via subcutânea 30 minutos após o início da cirurgia e continuaram, duas vezes por dia, durante 48 h (49).
Os animais foram então aleatoriamente separados em 04 grupos: 01- Grupo CTL que receberá TPM em creme (óleo-água); 02- Grupo CTL que receberá veículo;
03- Grupo DM que receberá TPM em creme (óleo-água); 04- Grupo DM que receberá veículo.
Realização das Feridas
As feridas foram criadas com um perfurador de biopsia de 6 mm de diâmetro em camundongos anestesiados extraindo a pele e o panniculus carnosus subjacente, seguindo o Modelo de Feridas excisional (50) (51).
Creme de TPM
O creme de TPM foi preparado no Laboratório de Sinalização Celular sob rigorosa biossegurança misturando o veículo (Tabela 1) com Topiramato sólido em pó 98% e conservado 2-8 C º.
Tabela 1 Composição do veiculo
Matéria Prima Quantidade Descrição
1 - Base Líquida 2,00% Agente Co-Emulsionante Não-Iônico
2 - Cosmowax J 13,00% Base Auto-Emulsionante Não-Iônica
3 - Óleo Mineral 5,00% Agente Emoliente
4 - Vaselina Sólida 1,00% Agente Emoliente
5 - Óleo de Silicone 0,50% Agente Emoliente
6 - Nipazol 0,05% Agente Conservante
7 - Oxynex 2004 0,05% Agente Anti-Oxidante
8 - Lauril Sulfato de Sódio 0,50% Agente Co-Emulsionante Aniônico
9 - Nipagim 0,15% Agente Conservante
10 - EDTA Na2 0,20% Agente Sequestrante
11 - Propilenoglicol 5,00% Agente Umectante
12 - Água Purificada...q.s.p. 1.000 mL Veículo
Modelo do Diabetes. Cada animal recebeu uma dose única de 150 mg / kg de ≥98% Estreptozotozina (Sigma-Aldrich®) dissolvida em tampão de citrato de sódio 0,1M por via intraperitoneal (37). Animais não diabéticos receberam apenas o tampão de citrato de sódio por via intraperitoneal. O diabetes foi verificado por níveis de glicose> 250 mg / dl (hiperglicêmico) 10 dias após da injeção de STZ. Animais que apresentaram letargia com limitação de mobilidade ou feridas auto infligidas foram descartados deste experimento. Os grupos foram formados escolhendo o animal com
o maior e o menor peso para cada grupo repetindo isto até completar todos os animais para assegurar uma distribuição equitativa dos pesos entre os grupos.
Avaliação dos efeitos do TPM - Tempo de cicatrização:
Logo após a realização das feridas, iniciou-se o tratamento de acordo com os diferentes grupos acima discriminados e então documentados fotograficamente até o 14º dia na câmera digital Nikon® D3100 utilizando um tripé apropriado. No final do protocolo experimental a avaliação da velocidade de retração realizou-se com auxílio do software Image J.
- Atividade da via de sinalização da insulina e modulação de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento:
Nos dias 3, 7, 14 após incisão das feridas, situação em que, no geral o processo de cicatrização em animais diabéticos e não diabético está nas fases inflamatória, proliferativa e de remodelação (7), os animais foram novamente anestesiados, colocados em decúbito ventral e a seguir retirado o tecido cicatricial. Os fragmentos foram homogeneizados com um polytron PTA20s (Brinkmann Instruments modelo PT 10/35) em volumes de tampão adequados para Western blot ou com TRiZOL® para PCR em Tempo Real e mantidos à 4 ºC e a -80 ºC respectivamente. Os fragmentos utilizados para microscopia foram colocados em paraformaldeído à 4% com tampão fosfato 0,1M, pH 7.4.
Os animais foram sacrificados com o aprofundamento anestésico e deslocamento cervical.
Western blotting
Após rápida fervura (5 min./100C) dos extratos totais protéicos estes foram ressuspensos em tampão de Laemmli, as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas separadas em SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD. A membrana de nitrocelulose foi incubada “overnight” com anticorpos específicos contra as proteínas IRS-1(sc-4250), AKT(sc-135651), ERK1/2(sc-16982), IGF-I (sc-7144), TGF-β (SC-166833), VEGF(SC-7269), JNK(SC-17320) (todos da Santa Cruz biotechnology – Califórnia, USA). A ligação do anticorpo a proteínas não-específicas foi minimizada pela pré-incubação da membrana de nitrocelulose com tampão de bloqueio (5% de leite em pó desnatado; 10 mmol/L de
Tris; 150 mmol/L de NaCl; 0.02% de Tween 20) por 2 horas. O sinal foi detectado através de quimiluminescência utilizando kit da Amersham e seguindo as orientações do fabricante. As bandas identificadas na autorradiografia foram quantificadas através de densitometria óptica.
Extração de RNA e PCR em Tempo Real.
As amostras foram homogeneizadas em reagente de TRIzol® (InVitrogen, São Paulo, Brasil) por 30 s usando um homogeneizador de tecidos (Polytron-Agrgregate, Kinematica, Littau/Luzern, Switzerland) na velocidade máxima. Em seguida foram centrifugadas a 6.000 g, e o conteúdo total de RNA foi isolado de acordo com as instruções do fabricante e quantificado por espectrofotometria. A integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose. A síntese de cDNA foi realizada com 2ug do total de RNA usando o Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems).
A expressão gênica foi analisada através de PCR em Tempo Real usando o sistema gênico (SABioscience). Foram usados os oligonucleotídeos gene-específicos para as proteínas acima descriminadas nos métodos de western blot, sintetizadas pelo fabricante (SABiosciences). Os dados foram analisados usando o sistema PCR Data Analysis Software (Excel & Web based) (SABiosciences).
PCR quantitativo (qPCR) – PCR em tempo real
Alíquotas de 5,0 ng de RNA foram submetidas à transcrição reversa utilizando-se primers hexaméricos randômicos e Superscrit Maloney MLV transcriptase reversa. A avaliação de resultados foi realizada por eletroforese em gel de agarose 3%. As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. O gene GAPDH (TaqManTM - Applied Biosystems) foi escolhido como controle endógeno da reação, o qual serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. Após o cálculo das eficiências de amplificação do gene de interesse e do controle endógeno, foi construído um gráfico de dispersão, o qual tem por finalidade definir qual é a amplitude de concentrações para as quais o sistema é eficiente. Para a quantificação relativa do gene em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em duplicata a partir de: 6,25μL de TaqMan Universal PCR Master Mix 2x, 0,625μL da solução de primers e sonda, 1,625μL de água e 4,0μL de cDNA, sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0 μL de água ao invés do cDNA. As condições de
ciclagem foram: 50o C por 2 minutos, 95o C por 10 minutos e 40 ciclos de 95o C por 15 segundos e 60o C por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
Microscopia Óptica
Após dissecção, os tecidos de pele fixados por imersão em paraformaldeído foram processados com álcool em concentrações crescentes (70%, 80%, 95% e 100%), xilol e parafina, incluídos em blocos de parafina, seccionados em cortes de 5 cm com o auxílio de um micrótomo e fixados em lâminas de microscopia previamente tratadas com polilisina. Para a avaliação da morfologia celular na cicatrização os cortes foram corados com a técnica de hematoxilina e eosina. Os cortes foram incubados 30 segundos com hematoxilina, passados em água destilada e incubados por mais 30 segundos com eosina, seguidos de nova passagem em água destilada e desidratação. As lâminas foram montadas com Entellan e a seguir analisados e a imagem digital captada em microscopia de transmissão óptica.
RESULTADOS
Os resultados deste estudo são apresentados no formato alternativo e inclui
dois artigos.
Article 1
Effects of topical Topiramate in wound healing in mice
Short title: Topiramate in wound healing
Carlos Poblete Jara, RN1,2, Vanessa Cristina Dias Bóbbo, Ms RN1,2, Rodrigo Scarpari Carraro, Ms1,2, Thiago Matos Ferreira de Araujo, PhD 2, Maria H. M. Lima, PhD RN1,2, Licio A. Velloso, MD PhD2, Eliana P. Araújo, PhD RN1,2
1Nursing School, University of Campinas - 13084-970 – Campinas SP, Brazil
2Laboratory of Cell Signaling, University of Campinas - 13084-970 – Campinas SP, Brazil
Eliana P. Araujo
Email pa.eliana@gmail.com
Nursing School, University of Campinas 13084-970 – Campinas SP, Brazil
Abstract
Recent studies have shown that systemic topiramate can induce an improvement on the aesthetic appearance of skin scars. Here, we evaluated topical topiramate as an agent to improve wound healing in c57 mice. Mice were submitted to a 6.0 mm punch for two cutting out wounds in the skin of the dorsal region. Thereafter, the mice were randomly assigned to either vehicle or topical topiramate (20 µl of 2% cream) once a day for 14 days, beginning on the same day of wound generation. We analyzed the wounds samples by real-time PCR, Western blotting, and microscopy. There was no effect of topiramate treatment on the time for complete reepithelization of the wound. However, on microscopic analysis, topiramate treatment resulted in increased granulation tissue, thicker epidermal repair and improved deposition of type I collagen fibers. During wound healing, there were increased expressions of anti-inflammatory markers such as IL-10, TGF-β and reduced expression of the active form of JNK. In addition, topiramate treatment increased the expression of active forms of two intermediaries of the insulin signaling pathway, IRS-1 and Akt. Finally, at the end of the wound healing process, topiramate treatment resulted in increased expression of SOX-2, which is a transcription factor that is essential to maintain cell self-renewal of undifferentiated embryonic stem cells. We conclude that topical topiramate can improve the overall quality of the wound healing in healthy skin of mice. This improvement is accompanied by reduced expression of markers of inflammation and increased expression of proteins of the insulin signaling pathway.
Introduction
Wound healing is an active process that depends on the coordinated actions of distinct cell-types and several endogenously produced substances [45, 27, 12]. In most instances, this physiological process results in appropriate tissue/organ repair [15]. However, under certain conditions, complicating factors, such as the formation of biofilms and infections or the formation of poor scars can lead to delayed wound healing [20, 7, 30]. Therefore, it is important to identify new products and processes that can improve wound healing [32]. Topiramate (TPM) is a drug commonly used in the treatment of epilepsy and other diseases of the central nervous system such as migraine, headaches, and schizophrenia [34, 36, 37]. Studies have shown that TPM has hypoglycemic effects; it can also lead to a reduction of adiposity and food intake, and to an increase in energy expenditure [8, 23, 16, 43]. These effects are caused in part by the activation of the insulin signaling pathway, more specifically by activating protein kinase B (PKB), also known as Akt [8, 7]. In the skin, studies have described that topical TPM has an effect on improving the aspect of the scars produced by trauma and acne [6, 40]. In addition, topical TPM has also beneficial effects on dermatological conditions such as psoriasis [39] and wound healing [42]. However, it is currently unknown the mechanisms mediating the beneficial effects of TPM in the skin.
Studies have shown that insulin can act upon skin cells [5, 26, 38] transducing its signal though the same signaling cascade as present in tissues that are classical targets for its actions, such as the muscle, the adipose tissue and the liver [10, 31]. In experimental models, insulin can stimulate skin healing in healthy rodents and in rodent models of diabetes [3, 25]. In a clinical trial, topical insulin was also capable of improving wound healing in diabetic patients [25]. With these concepts in mind, we hypothesized that TPM could act in the skin, improving wound healing, at least in part, through its action modulating proteins of the insulin signaling
pathway. We chose c57 mice because it is a widely accepted and validated wound healing model for experimenting with healthy and isogenic animals [1, 11].In order to test this hypothesis, we submitted healthy mice to a protocol for induction of a skin wound and treated the animals with either TPM or vehicle. During wound healing, we evaluated the expression of cytokines, growth factors and proteins of the insulin signaling pathway. In addition, we determined the impact of TPM on the quality of the scar and on the pace of wound healing.
Materials and Methods
Experimental animals. The Ethics Committee of the University of Campinas approved all the experiments. Eight-week old male C57BL/6J isogenic mice (n=80), with an average weight of 21,5 grs + 0,9 grs from the University of Campinas Breeding Center were submitted to two full-thickness circular 6 mm biopsy punch made in the skin of the dorsal region according to the mouse excision wound splinting model protocol [50]. The same person did all the biopsies, treatment, and tissue collections to reduce bias and ensure the uniformity. Thereafter, the mice were randomly allocated (five animals per group) to either control (vehicle) or topical TPM treatment. TPM group received a 20 µl of 2% TPM [42] cream once a day for 14 days, beginning on the same day of wound generation (day 0). Mice in the control group were treated once a day with vehicle. The animals were maintained under specific pathogen-free conditions in individual cages, in a regimen of 12h dark and 12h light cycles and a room temperature of 21° C with a standard rodent chow and filtered water available ad libitum. For surgical intervention, the mice were anesthetized with intraperitoneal ketamine hydrochloride (80 mg/kg body weight) and xylazine chlorhydrate (8mg/kg body weight) [19]. For post-surgical analgesia, mice were treated with subcutaneous tramadol chlorhydrate (20 mg/kg body weight) beginning 30 min post-surgery and continued twice a day for 48 h [18]. Animals that presented self-inflicted wounds were discarded from this experiment.
Photo documentation. The wound healing process was photo documented using the D3100 Nikon digital camera (Nikon Systems Inc., Tokyo, Japan). A tripod was used to assurance a similar distance from camera to wound in all experiments (120 wounds). The area of the wound was measured using Image J software (Java).
Tissue extraction for immunoblot. For protein quantification, the skin wound was excised and immediately homogenized in extraction buffer (1% Triton-X 100, 100 mM Tris, pH 7.4, 100 mM sodium pyrophosphate, 100 mM sodium fluoride, 10 mM EDTA, 10 mM sodium orthovanadate, 2 mM PMSF, and 0.1 mg/ml aprotinin) at 4°C with a Polytron PTA 20S homogenizer (Brinkmann Instruments model PT 10/35) operated at maximum speed for 30 sec. The extracts were centrifuged at 15,000 rpm at 4°C in a Beckman 70.1 Ti rotor (Palo Alto, CA) for 45 min, and samples of the supernatants containing 50 g protein were used for western blotting with antibodies against the IRS-1 (sc-560), pIRS-1 (sc17200-r), Akt (sc-8312), pAKT(sc-7985), ERK1/2 (sc-135900), pERK(sc-81492), pJNK (sc-6254), JNK (sc7345), IL-10 (ab9969),TGF-1β (ab6604), α-tubulin (T5168) and β-actin (4967L); all antibodies diluted 1:1000. The band intensities were quantified by optical densitometry (UN-Scan-it Gel 6.1, Orem, Utah, USA).
Transcript expression determination by real-time PCR. Sample aliquots containing 5.0 ng RNA were subjected to reverse transcription using random hexamer primers and Superscript Moloney-MLV reverse transcriptase. PCR reactions were performed in real time using the TaqManTM system (Applied Biosystems). The GAPDH gene (TaqManTM - Applied Biosystems) was employed as the endogenous control for the reaction to which the expression levels of the gene of interest in different samples were normalized. After calculation of the efficiencies of amplification, a scatter plot was constructed to define the series of concentrations for which the system was competent. Primers for the target genes were purchased from Applied Biosystems and IDT DNA Technology against the TGF-1β (Mm.PT.58.43.479940), TNF-α
(Mm00443258_m1), IL-6 (Mm00446190_m1), VEGF-α (Mm.PT.58.14200306), FGF-1 (Mm.PT.56a.41158563), SOX-2 (Mm.PT.58.12958650.g), IGF-1 (Mm.PT.58.5811533), IL-1β n(Mm00434228_m1), MCP-1 (Mm99999056_m1), IL-10 (Mm01288386_m1), SDF-1 (Mm00445553_m1) and GAPDH (4352339E). For the quantification of the gene, the PCR reactions in real time were carried out in duplicate in reactions containing 6.25 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix 2X, 0.625 μl of primers and probe solution, 1.625 μl of water and 4.0 μL of cDNA. The negative control used 4.0 μl of water in place of cDNA. The cycling conditions were as follows: 50 °C for 2 minutes, 95 °C for 10 minutes, and 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 1 minute. The relative gene expression values were obtained by analyzing the results in the program 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
Microscopy. The skin tissues dissected were fixed by immersion in paraformaldehyde, processed in alcohol at increasing concentrations (70%, 80%, 95% and 100%), followed by xylol and paraffin, embedded in paraffin blocks, sectioned at 5.0 µm and placed on microscope slides pretreated with poly-L-lysine. To evaluate cell and extracellular matrix morphology, the wound sections were stained with hematoxylin and eosin. The sections were incubated with hematoxylin for 30 seconds, rinsed in distilled water, incubated for 30 seconds with eosin, rinsed again in distilled water and dehydrated. The slides were mounted in Entellan® and then analyzed; digital images were captured under bright field microscopy. To evaluate collagen fibers, we used Picrosirius red staining. For that, 5.0m wounds sections were processed in 100% xylene, followed by progressive hydration in sequential 100%, 95% and 70% ethanol. The sections were incubated in 0,1% Picrosirius red (EasyPath, Brazil) for 1 h, rinsed in water and incubated in Carazzi´s Hematoxylin for 4 min always at room temperature. The birefringence patterns were examined by microscope (Nikon® Corporation, Kanagawa, Japan) equipped with C-PL polarized filters. The stained collagen fibers were analyzed using ImagePro Plus (v4) as bright green (Type III collagen-like) through to red color (Type I collagen-like) [9, 21].
Wound temperature determination. For determination of temperature in the wound areas we used the infrared camera FLIR® T430sc, and the FLIR® Tools 5.1. Animals were anesthetized with halothane gas until loss of corneal reflexes. The photographs were taken in a room with controlled temperature. The maximum and minimum temperature was calibrated as 40° C and of 21° C in the FLIR® Tools 5.1 software. Before measurement, the mice were acclimatized for 10 minutes at 25° C room temperature in a quiet and light controlled environment. The distance between the camera and the assessed body was 30 cm.
Statistical Analysis. The results are always presented as the mean ± standard error. For the statistical analysis, we first applied the Levene test to confirm for homogeneity of variance. To compare the means between two groups, we used Student’s t-test for independent samples and Spearman rank for independent observations. In all cases, the level of significance considered enough to reject the null hypothesis was 5% (p <0.05). Data were analyzed using the "Statistics for Windows" version 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA).
Results
In the first set of experiments, we evaluated wound healing in wounds with or without splint rings, as previously described [46]. As no difference was found in the different approaches, the remaining of the experiments were performed without splint rings, always.
Topical TPM improves the quality of wound healing. The effect of topical TPM on wound healing was tested during a fourteen-day protocol. As depicted in Figures 1A-1D, for the models either with or without splints rings, topical TPM resulted in no changes in the overall process and pace of healing. However, the histological evaluation (Fig. 1E) revealed that topical TPM resulted in larger fibrin clot on day 7, which was accompanied by a greater area of re-epithelization with presence of crust and greater granulation tissue. On day 14, topical TPM resulted in the formation of a homogeneous epithelium with an aspect of organization that
clearly differs from control; in addition, the dermis was denser suggesting the presence of a more organized collagen deposition and with the presence of more hair follicles (Figure 1E).
Figure 1. The macroscopic and microscopic aspects of the wounds. Wounds with (A-B) and without (C-D) splint rings were photographed (A and C) and measured (B and D) throughout the healing process from day 0 to day 14. Images in A and C are representative of five distinct experiments. In B and D, n=5; *p<0.05 vs. vehicle. E, microphotographs of hematoxylin/eosin staining of 5.0 m sections of wounds obtained from mice treated without splint rings. The images are representative of 3 distinct experiments.
Next, in order to evaluate the quality of the scar, we used Picrosirius red staining to determine type I and type III collagen deposition. As depicted in Figures 2A-2B, 14 days topical TPM resulted in greater density of Type I fibers and greater staining for fibrillar collagen. In addition, we determined wound temperature on day 14, which revealed no difference between the groups (not shown).
Figure 2. Collagen deposition in the wounds. Picrosirius red-stained sections of the skin wounds viewed with circularly polarized light. Wounds were treated with vehicle (A) or TPM 2% (B) for 14 days. The images are representative of three distinct experiments.
TPM modulates growth factors, cytokines, chemokines, and transcription factors during wound healing process. Real-time PCR and immunoblot analysis (Fig. 3A-3K) reveled that, on day 3, topical TPM increased gene expression of TGF-β (Fig. 3G) and protein expression of IL-10 (Fig. 3J), respectively. In addition, topical TPM reduced the expression of phospho-JNK (Fig. 3K). Nevertheless, on day 3, topical TPM had no effect on the expressions of the cytokines/chemokines TNF-α (Fig. 3A), IL-1β (Fig. 3B), IL-6 (Fig. 3C) and MCP-1 (Fig. 3D); the growth factors, VEGF (Fig. 3F) and FGF (Fig. 3H); and the transcription factor SOX-2 (Fig. 3I).
Figure 3. Expression of transcripts and proteins in the wounds treated for three days with topical topiramate. Real time PCR (A-I) and immunoblot (J-K) were employed for measuring the expression of transcripts encoding for TNF- (A), IL-1 (B), IL-6 (C), MCP-1 (D), IL-10 (E), VEGF (F), TGF-1(G), FGF (H) and SOX-2 (I), and the proteins IL-10 (J) and phospho-JNK (K). In all experiments n=5-6; *p<0.05 vs. vehicle.
On day 7, topical TPM produced no changes in the expressions of transcripts encoding for the cytokines/chemokines TNF-α (Fig. 4A), IL-1β (Fig. 4B), IL-6 (Fig. 4C), MCP-1 (Fig. 4D) and IL-10 (Fig. 4E); and the growth factors VEGF (Fig. 4F), TGF-1β (Fig. 4G), and FGF (Fig. 4H). Finally, on day 14, topical TPM resulted in increased expressions of IL-10 (Fig. 5E), SOX-2 (Fig. 5G) and TGF- β (Fig. 5H). No changes were detected on the expressions of transcripts encoding for the cytokines/chemokines TNF-α (Fig. 5A), IL-1β (Fig. 5B), IL-6 (Fig. 5C), and MCP-1 (Fig. 5D), and the growth factor VEGF (Fig. 5F).
Figure 4. Expression of transcripts in the wounds treated for seven days with topical topiramate. Real time PCR was employed for measuring the expression of transcripts encoding for TNF- (A), IL-1 (B), IL-6 (C), MCP-1 (D), IL-10 (E), VEGF (F), TGF-1 (G) and FGF (H). In all experiments n=5-6; *p<0.05 vs. vehicle.
TPM modulates proteins of the insulin-signaling pathway during the healing process. Immunoblot analysis showed that on day 3, topical TPM induced no change in the expressions/phosphorylations of Akt (Fig 6A) and ERK1/2 (Fig 6B) proteins. However, on day 7, topical TPM produced a trend to increase phospho-IRS1 (Fig 6C) and significantly increased phospho-Akt (Fig 6D); no change was determined on phospho-ERK1/2 (Fig. 6E). Nevertheless, on day 14 TPM produced again a trend to increase phospho-IRS-1 (Fig 6F), but no changes were observed on phospho-AKT (Fig 6G).
Figure 5. Expression of transcripts and proteins in the wounds treated for fourteen days with topical topiramate. Real time PCR (A-G) and immunoblot (H) were employed for measuring the expression of transcripts encoding for TNF- (A), IL-1 (B), IL-6 (C), MCP-1 (D), IL-10 (E), VEGF (F) and SOX2 (G), and the protein TGF-1 (H). In all experiments n=5-6; *p<0.05 vs. vehicle.
Discussion
Wound healing is a dynamic and multifaceted process that involves pleiotropic molecular and cellular events [45]. Wound healing depends on two major phenomena, epithelization, and formation with subsequent contraction of the granulation tissue. This second event is essential to maintain tissue stability, reduce wound size and produce resistant scars [29]. Despite the fact that wound healing is a physiological process that takes a period of time determined by the size and severity of the injury to completion, there is great effort to identify new products or methods that accelerate the process and lead to scars of optimal aspect and quality [32].
In the present study, we used topical TPM to evaluate the wound healing process in healthy mice. TPM is an anticonvulsant drug commonly used to treat children and adults diagnosed with a number of neurological and psychiatric conditions [33]. It was first approved for clinical use in 1996 and, despite presenting some side effects it is considered a safe medication for
human use [13]. In a pilot trial using TPM to treat hyperphagia in patients with Prader-Willi syndrome the authors reported an apparent improved healing of skin lesions and the formation of scars with good aesthetic aspect [41]. In order to further investigate the apparently beneficial effects of TPM on scars, the same authors carried out an open-label oral TPM study and found that three months 15 mg oral TPM resulted in considerable improvement of scar aspect regarding thickness and color [40]. Based on the encouraging results reported by Shapira and coworkers [40-42], Bharti and Agarwal [6] conducted a study to determine the effect of 25 mg daily oral TPM for 2-3 months to treat scars generated as a consequence of a number of distinct conditions. As a whole, the authors reported that good/excellent results were obtained in scars generated by acne and varicella [6].
Figure 6. Expression of proteins of the insulin signaling pathway in the wounds treated for three, seven and fourteen days with topical topiramate. Immunoblot (A-G) employed for determining proteins at day 3, AKT (A) and ERK1/ERK2 (B), at day 7, IRS-1 (C), AKT (D), ERK1/ERK/2 I, and at day 14, IRS-1 (F), AKT (G). In all experiments n=05; *p<0.05 vs. vehicle.
In all the three studies reporting the beneficial effects of TPM on scars, the drug was given orally [6, 40, 41]. Although the side effects reported in the studies were minimal, the possibility of using TPM topically would increase considerably the safety of the treatment. Therefore, in the present study we decided to test experimentally the effect of topical TPM on the physiological process of wound healing in healthy mice.
To provide some mechanistic advance in the characterization of the potentially beneficial effect of topical TPM in wound healing we evaluated the expression of some proteins involved in different stages of the healing process, such as cytokines/chemokines, growth factors and transcription factors. In addition, we evaluated the expression and activation status of proteins of the insulin-signaling pathway. The decision to evaluate proteins of the insulin signaling pathway was taken for two reason: i, insulin action is important in wound healing and both experimental and clinical studies have evidenced the beneficial effect of topical insulin in physiological and pathological wound healing [4, 25]; and ii, recent studies have shown that in the central nervous system TPM can act, at least in part by controlling insulin signal transduction[8].
In the first part of the study, we evaluated the impact of topical TPM on the process of healing. The TPM topical treatment was not capable of accelerating the wound healing. Histological aspect of the lesion and particularly the aspect of the scar at the end of the observation period revealed that TPM markedly increased granulation tissue, which was characterized by an apparent greater quantity of fibroblasts, which consequently could result in larger deposition of collagen fibers suggesting that TPM can improve the quality of wound healing in healthy mice. To confirm this hypothesis, we stained tissue with Picrosirius red that revealed an increase of Type I collagen fibers and an improvement of the organization of collagen fibers in the TPM group. Collagen production is an important factor regulating epithelial migration and proliferation [46, 53]. The impairment in wound healing has been associated with a reduction
in collagen fibrils [47]. Type III collagen is a temporary type, produced in the early phases of wound regeneration, whereas Type I collagen is produced during the later phases of the process and is essential to produce a scar of optimal quality [17].
An important outcome of this study was the fact that changes in the macro- and microscopic aspect of the wound healing promoted by TPM were accompanied by the modulation of expression of some proteins involved in different aspects of the wound healing process. On day 3, TPM induced the increases of IL-10 and TGB-β and the reduction of the expression of the active form (phosphorylated) of JNK. On day 14, once again, TPM treatment was accompanied by increased expressions of IL-10 and TGF-β, and by an increased expression of the transcription factor SOX-2. IL-10 is a regulatory cytokine with important functions in the control of inflammation during wound healing [22]. It turns inducing the reduction of the inflammatory response to an injury, which is expected to produce a favorable environment to the differentiation of macrophages of the M2 phenotype [35]. Studies propose that improved levels of IL-10 can be responsible for healing without the formation of scarring [22-24]. TGF-β is a growth factor that also plays a role in the regulation of the inflammatory activity in wounds [51]. In addition, it regulates the differentiation of myofibroblasts in a process that is important for the contraction of the wound and the formation of fibrosis [28-52]. The balance of these two conditions is poorly understood but it is proposed to result from the regulation of inflammatory activity in the wound site [14]. This is, at least in part, dependent of the local expression of TGF-β. Recent work has shown that the balance between wound contraction and fibrosis can also improve the quality of the scar depending on the timing when TGF-β is more active and on the inflammatory response [52]. Taken together, the increased expression of IL-10 and TGF-β suggest that TPM induces a status of low inflammatory activity during wound healing, which is further supported by the low expression of the active form of JNK, a well-known pro-inflammatory intracellular kinase [49]. We believe that the landscape of
cytokine/growth factor regulation induced by TPM is, at least in part, responsible for the improvement of the aspect of the wound.
Another outcome of the TPM treatment was the regulation of proteins of the insulin-signaling pathway. As a whole, TPM induced the expression of active forms of two proteins involved in the transduction of the insulin signal, IRS-1 and Akt. It is currently known that the stimulation of the insulin-signaling pathway with the use of topical insulin improved wound healing in human and animal models [2, 3, 25]. Topical insulin is capable of activating proteins such as IRS-1, PI3K / Akt and VEGF [2, 25, 26] increasing angiogenesis, migration of fibroblasts and keratinocytes and increasing the deposition of type I collagen [4, 26, 28, 54]. The findings of the present work suggest that in skin wounds, TPM can induce the activation of insulin signaling, which is in agreement with findings of a recent study that evaluated the effects of TPM in the brain [8]. In addition to the effects of TPM on markers of inflammation and on the insulin signaling system, on day 14 there was also an increased expression of the transcription factor Sox-2. Studies have shown that is crucial to keep cell self-renewal of undifferentiated embryonic stem cells [55]. Thus, SOX-2 could be one of the final targets of TPM to regulate the quality of scar resulting from the wound healing process.
In conclusion, topical TPM improves the microscopic aspect of the wound healing in the skin of healthy mice. Its beneficial effect is accompanied by the activation of anti-inflammatory markers, insulin signaling and at least one transcription factor involved in regeneration.
The wound healing model in mice, despite being widely used to evaluate macro and microscopic aspects, presents limitations when trying to translate discoveries into human biology, since the skin of these animals differs from the structure of human skin. However, our results could be easily applied in others animal models that present alteration of IL-10, eg psoriasis, in order to understand how TPM affects this type of skin conditions and how this treatment could become a new and economical treatment.
Further studies should evaluate the therapeutic impact of topical TPM in pathological wounds and other healing models more similar to the human skin.
Study Limitations. The limitation of this study is the fact that we use an animal model that does not present the tissue repair physiology close to humans. The perfect animal model would be pigs, because of his similarity with the human skin and in this way, it would be possible to evaluate the scar properly. An important bias is that we do not perform immunoblot for all proteins. The expression of evaluation transcripts cannot be accurate because it does not mean that the protein will be translated and will undergo the same modulation.
Acknowledgements. We thank Dr. E. Roman, G. Ferraz and M. Cruz for technical assistance. Sao Paulo Research Foundation and Coimbra Group of Brazilian Universities Education provided the grants for this study. The authors belong to the Obesity and Comorbidities Research Center, Brazil.
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