NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO LABORATORIAL E CLÍNICA DE
INDIVÍDUOS CHAGÁSICOS TRATADOS COM
BENZONIDAZOL E NÃO TRATADOS
RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE BERILO, VALE
DO JEQUITINHONHA, MG.
AUTOR: GIRLEY FRANCISCO MACHADO DE ASSIS
ORIENTADORA: Profa. Dra. Marta de Lana CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Rosália Morais Torres
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
S237a Assis, Girley Francisco Machado de
Avaliação laboratorial e clínica de indivíduos chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, Brasil [manuscrito] / Girley Francisco Machado de Assis - 2011.
xvii, 128 f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas.
Orientadora: Profª. Drª. Marta de Lana.
Co-orientadora: Profª. Drª. Rosália Morais Torres.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.
1. Trypanosoma Cruzi - Teses. 2. Chagas, Doença de - Teses. 3. Quimioterapia - Teses. 4. Benzonidazol - Teses. I. Universidade Federal de
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AVALIAÇÃO LABORATORIAL E CLÍNICA DE
INDIVÍDUOS CHAGÁSICOS TRATADOS COM
BENZONIDAZOL E NÃO TRATADOS
RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE BERILO, VALE
DO JEQUITINHONHA, MG.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração Imunobiologia de Protozoários.
Universidade Federal de Ouro Preto Ouro Preto - 2011
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AVALIAÇÃO LABORATORIAL E CLÍNICA DE INDIVÍDUOS CHAGÁSICOS TRATADOS COM BENZONIDAZOL E NÃO TRATADOS RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE BERILO, VALE
DO JEQUITINHONHA, MG.
COLABORADORES:
PEDRO ALBAJAR VIÑAS
Departamento de Controle de Doenças Tropicais Negligenciadas, Organização Mundial de Saúde
JOÃO CARLOS PINTO DIAS
Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, MG.
OLINDO ASSIS MARTINS FILHO
Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, MG.
MARIA TEREZINHA BAHIA
Laboratório de doença de Chagas, NUPEB, UFOP.
GEORGE LUIS LINS MACHADO COELHO
Laboratório de doenças Parasitárias, UFOP.
Universidade Federal de Ouro Preto Ouro Preto – 2011
IV
Dedico este trabalho aos meus queridos pais (Geraldo e Vilma), aos meus irmãos (Girlaine, Géferson, Geomar e George), ao meu avô (José Antônio) e a minha noiva Fernanda que sempre apoiaram as minhas decisões. Sem a compreensão de vocês
com certeza este caminho percorrido seria muito mais tortuoso...
V
É bem melhor arriscar coisas grandiosas,
Alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se à derrota, Do que formar filas com os pobres de espírito Quem nem gozam muito e nem sofrem muito,
Porque vivem nessa penumbra cinzenta Que não conhece vitória nem derrota.
Teodore Roosevelt
Vale que vale cantar Vale que vale viver Vale do Jequitinhonha
Vale eu amo você.
VI
obrigado pelos ensinamentos científicos e de vida, pois estes 10 anos de convivência foram muito gratificantes para a minha formação. Obrigado pelo incentivo, apoio permanente, pelo carinho, pela compreensão e pela confiança em mim depositada durante todos estes anos.
À Profa Rosália Morais Torres grande companheira e amiga em diversas excursões a Berilo. Dona de um coração gigantesco e apaixonada com o que faz. Muito obrigado por acreditar neste projeto e pelas infinitas conversas e apoio essencial para a conclusão deste trabalho.
Ao Dr. Pedro Albajar-Viñas pela dedicação e apoio incondicional prestado ao Projeto de Berilo. Muito obrigado pelos ensinamentos que com certeza levarei por toda a minha vida.
Ao Dr. João Carlos Pinto Dias pelo apoio, pelos exemplos de simplicidade, grandiosidade e profissionalismo.
Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho pelas brilhantes idéias e por abrir as portas do seu laboratório quando sempre precisamos.
À Profa Maria Terezinha Bahia pela boa convivência nestes 10 anos, pelas conversas e apoio sempre que necessário.
Ao Prof. George Luis Lins Machado Coelho pela grande contribuição no desenho dos estudos e análises dos dados.
Ao Prof. Evandro Marques de Menezes Machado pelas conversas, atenção, apoio e ensinamentos. Exemplo de tranqüilidade e sabedoria.
Ao Prof. André Talvani pela amizade, convivência e boas idéias compartilhadas.
Ao grande amigo Flávio Andrade que sempre apoiou os projetos envolvendo o Vale do Jequitinhonha.
VII
nossas infinitas viagens não medindo esforços, em especial ao Rogélio, José Roberto, José Raimundo, Seu Paulo, Marcinho e Zezinho.
Ao padre José Nuno pela garra, dedicação, apoio e atenção. Pessoa fundamental para a manutenção dos projetos e exemplo de luta em pró dos pacientes chagásicos deste município.
Ao atual prefeito (Lázaro) e o secretário de saúde (Fábio) que receberam o projeto de braços abertos, apoiando todas as nossas iniciativas.
A todos os agentes municipais de saúde que sempre contribuíram para o bom funcionamento do serviço. Sem a ajuda de vocês não teríamos chegado até aqui.
A todas as pessoas de Berilo que contribuíram de diversas maneiras para o bom andamento do projeto, em especial a Elizabeth (pousada) e Nenem (restaurante).
A todos os funcionários da secretaria municipal de saúde, hospital municipal e equipes do PSF que sempre nos ajudaram no agendamento dos pacientes.
A todos os amigos do Laboratório de doença de Chagas, Laboratório de Imunopatologia, Laboratório de doenças Parasitárias e Laboratório de Biomarcadores, CPqRR, FIOCRUZ, BH.
VIII
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao grande e eterno amigo Cláudio Waldete (in memoriam), vulgo Ioiô, que me recebeu em Berilo de braços abertos, apoiando todas as nossas iniciativas.
IX
Um dos maiores desafios na doença de Chagas é avaliar o impacto do tratamento etiológico nos parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes tratados. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a efetividade do benzonidazol na evolução clínica dos pacientes chagásicos tratados e não tratados, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. A primeira parte deste trabalho teve como propósito avaliar 94 pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, utilizando sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI), sorologia alternativa (rec-ELISA e FC-ALTA) e métodos parasitológicos (HC e PCR). A sorologia convencional permitiu categorizar os pacientes em três grupos: tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC), segundo o critério clássico de cura (negativação de dois testes sorológicos negativos) ou critério mais rigoroso (negativação de três testes sorológicos negativos). O critério clássico revelou 78,7% dos pacientes TNC, 8,5% TEA e 12,8% TC. Já o critério mais rigoroso revelou 63,8% dos pacientes TNC, 28,7% TEA e 7,4% TC. As associações de dois testes da sorologia convencional (ELISA+IFI, ELISA+HAI e IFI+HAI) foram avaliadas e demonstraram resultados semelhantes entre associações de ELISA+IFI e IFI+HAI com o critério mais rigoroso. A rec-ELISA e a FC-ALTA apresentaram resultados mais consistentes com o critério de cura mais rigoroso, mas cada teste revelou isoladamente um paciente negativo não revelado pela sorologia convencional. A HC revelou falha terapêutica em 17% (16/94) dos pacientes, todos categorizados como TNC por ambos os critérios. A PCR apresentou resultados negativos consistentes com os demais métodos sorológicos e parasitológicos empregados como critério de cura. A avaliação clínica revelou no grupo TC maior percentual de forma indeterminada, ausência de forma digestiva e menor percentual de forma cardíaca. A segunda parte deste trabalho avaliou comparativamente os resultados da efetividade terapêutica e evolução clínica de 29 dos 94 pacientes tratados na fase crônica da infecção, utilizando o critério de cura atual. Não foi observada cura parasitológica e nem mesmo queda sorológica em nenhum paciente em todos os períodos pós-tratamento. A HC revelou falha terapêutica em 10,3% (3/29) dos pacientes e a PCR apresentou um percentual de positividade de 58,6% (17/29). A avaliação clínica destes pacientes, treze anos pós-tratamento, revelou uma evolução progressiva em 27,6% (8/29) dos pacientes. O índice de evolução clínica dos pacientes tratados na forma indeterminada foi quatro vezes menor se comparado com aqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva antes do tratamento. Na terceira parte deste trabalho foram avaliados os aspectos laboratoriais e clínicos de 58 pacientes chagásicos dos quais 29 foram tratados com benzonidazol há 13 anos e 29 não tratados. A HC apresentou maior percentual de positividade entre os não tratados quando comparados com os tratados (27,6% x 6,9%). Foi observada uma queda sorológica significativa no grupo tratado quando comparado com o não tratado, sendo esta mais elevada nos pacientes tratados na forma indeterminada. Os pacientes tratados apresentaram menor percentual de evolução clínica quando comparados com os não tratados (27,6% x 65,5%) e os tratados na forma indeterminada apresentaram menor índice de evolução quando comparados com os não tratados (1,3% x 4.3%). Em conjunto, estes resultados revelam um baixo percentual de cura parasitológica em pacientes chagásicos tratados na fase crônica da infecção, mas um melhor prognóstico da doença foi observado em pacientes tratados na forma indeterminada quando comparados com o grupo não tratados.
X
One of the biggest challenge in Chagas disease is to assess the impact of the etiological treatment in laboratorial and clinical parameters in treated patients. Thus, the goal of this work was to evaluate the benznidazol efficacy and the clinical evolution of treated and not treated patients from Berilo municipality, MG, Brazil. In the first part of this work 94 chagasic patients treated at least 10 years before were evaluated by conventional serology (ELISA, IIF and IHA), alternative serology (rec-ELISA and FC-ALTA) and parasitological methods (HC e PCR). Taking into account the conventional serology, patients were categorized in three groups: TNC (treated not cured), TUE (treated under evaluation) and TC (treated cured) following the classic cure criteria (negativation of two serological tests) or the more rigorous criteria (negativation of three serological tests). The classic criteria revealed 78.8% of TNC patients, 8.5% of TUE and 12.8% of TC. The more rigorous criteria revealed 63.8% of TNC patients, 28.7% of TUE and 7,4% TC. The results of the associations of the conventional serological tests (ELISA+IIF, ELISA+IHA and IIF+IHA) revealed similar results between ELISA+IIF and IIF+IHA with the more rigorous criteria. The rec-ELISA and FC-ALTA showed results more consistent with the more rigorous cure criteria, but each test alone showed a negative patient not detected by the conventional serology. The HC revealed therapeutic failure in 17% (16/94) of the patients categorized as TNC by both criteria. The PCR showed negative results consistent with the other serological and parasitological tests employed as cure criteria. The clinical evaluation revealed in TC group higher percentage of indeterminate form of the disease, absence of digestive form and lower percentage of cardiac form. In the second part of this work it was evaluated comparatively the results of therapeutic efficacy and clinical evolution of 29 out of 94 treated patients assessed before treatment, nine and 13 years after treatment using the current cure criteria. It was not observed parasitological cure and even signficant serological decrease in any patient at all periods after treatment. The HC revealed therapeutic failure in 10.3% (3/29) of the patients and the PCR showed a percentage of positivity of 58.6% (17/29). The clinical evaluation of these patients, 13 years after treatment, revealed a progressive evolution in 27.6% (8/29). The index of clinical evolution of patients treated in the indeterminated clinical form of the disease was four times lower if compared with patients that were with cardiac and/or digestive form before treatment. In the third part of this work it was evaluated the laboratorial and clinical parameters of 58 chagasic patients, 29 treated 13 years before and 29 not treated. The HC showed higher percentage of positivity in not treated patients when compared to treated patients (27.6% x 6.9%). It was observed a significant decrease of the serological titles in treated patients when compared with not treated. Treated patients showed significant lower percentage of clinical evolution when compared with not treated patients (27.6% x 65.5%), while patients treated in the indeterminated form of the disease showed the significant lower índex of evolution when compared with the not treated (1.3% x 4.3%). Togheter these results reveal a low percentage of parasitological cure in chagasic patients treated in the chronic phase of the infection, but a better prognosis of the disease was observed in patients, treated in the indeterminate form of the disease when compared with the not treated group.
XI
Tabela I - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo o critério clássico de cura (dois testes sorológicos negativos) ou o critério de três testes sorológicos negativos. ... 52 Tabela II - Idade, sexo, forma clínica (1997 – 2006 – 2010) e resultado dos métodos de hemocultura e PCR dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há 13 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 63
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Figura 1 - Divisão das mesorregiões e localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais. ... 34 Figura 2 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol, há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo a idade antes do tratamento e tempo pós-tratamento. ... 50 Figura 3 - Reatividade na sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI) dos 94 pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 51 Figura 4 - Representação individual da reatividade dos soros de pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, categorizados pelo critério clássico de cura e três testes sorológicos negativos versus rec-ELISA e FC-ALTA. TNC= tratado não curado, TEA= tratado em avaliação e TC= tratado curado. ... 53 Figura 5 - Distribuição dos pacientes chagásicos considerados tratados curados (TC) segundo o critério clássico de cura e o critério mais rigoroso (três testes negativos) frente aos resultados da sorologia alternativa. ... 55 Figura 6 - Percentuais de resultados positivos para a técnica de hemocultura e PCR realizada em amostras de sangue coletadas dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais 10 anos, categorizados segundo o critério de cura clássico e o critério de três testes sorológicos negativos. ... 56 Figura 7 - Percentuais de positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 57 Figura 8 - Positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%. ... 57
XIII
Figura 9 - Percentuais das formas clínicas encontradas nos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 58 Figura 10 - Percentuais de formas clínicas dos pacientes chagásico tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, categorizados em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC) segundo o critério mais rigoroso (três testes sorológicos negativos). ... 59 Figura 11 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados e tratados curados (TC) pelo critério cura de três testes sorológicos negativos por faixa etária quando tratados (A) e por tempo pós-tratamento (B). ... 60 Figura 12 - Resultados das técnicas de hemocultura e PCR realizadas em pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. POS= positivo NEG= negativo ... 61 Figura 13 - Absorbância de soros dos pacientes chagásicos obtidos antes do tratamento (AT – 1997), nove anos (PT – 2006) e treze anos (PT – 2010) pós-tratamento avaliados pelo teste de ELISA “in house” (diluição do soro 1:80). ... 62 Figura 14 - Percentuais de evolução clínica geral (A, B e C) e anual (D, E e F) dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol avaliados nos períodos de 1997 – 2006, 2006 - 2010 e 1997 – 2010. ... 64 Figura 15 - Percentuais de positividade da técnica de hemocultura e PCR entre os pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 66 Figura 16 - Absorbância dos soros dos pacientes chagásicos antes do tratamento e de seus respectivos controle e treze anos depois avaliados pelo teste de ELISA (A) e estratificados segundo a forma clínica (B). ... 68 Figura 17 - Percentual de evolução clínica geral e por formas clínicas dos pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) após 13 anos (1997 – 2010). ... 69
XIV
AT – Antes do tratamento
BRD – Bloqueio de ramo direito BZ – Benzonidazol
CARD/DIG – Forma cardíaca ou digestiva CCC – Cardiopatia Chagásica Crônica
dATP 2’ - Desoxinucleotídeo de Adenosina-5’-trifosfato DCh – doença de Chagas
dCTP 2’ - Desoxinucleotídeo de Citocina-5’-trifosfato dGTP 2’ - Desoxinucleotídeo de Guanina-5’-trifosfato DNA – Ácido desoxirribonucléico
dNTP’s 2’ - Desoxinucleotídeos-5’-trifosfato DO – Densidade Óptica
dTTP 2’ - Desoxinucleotídeo de Timina-5’-trifosfato ECG – Eletrocardiograma
ELISA – “Enzime-linked immunosorbent assay” FC – Forma cardiaca
FC-ALTA – “Anti-live trypomastigotes antibody by flow-cytometry FD – Forma digestiva
FI – Forma indeterminada
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz FM – Forma mista
HAI – Hemaglutinação indireta HC – Hemocultura
ICT - Índice Cardiotorácico IFI – Imunofluorescência indireta IgG – Imunoglobulina G
kDa – quilodalton
LAFEPE – Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco LIT – “Liver infusion triptose”
LMCo – Lise mediada pelo complemento MS – Ministério da Saúde
XV
NFX – Nifurtimox
OMS – Organização Mundial de Saúde PBS – “Phosphate buffer solution”
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PPFP – Percentual de parasitos fluorescentes positivos PT – Pós-tratamento
Rec-ELISA – ELISA recombinante Rx – Raio-X
SFB – Soro fetal bovino
SNA – Sistema Nervoso Autônomo TC – Tratados curados
TEA – Tratados em avaliação TNC – Tratados não curados
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais UFOP – Universidade Federal de Ouro Preto WHO – “World Health Organization”
XVI
1 - INTRODUÇÃO...1
1.1 – Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi ...2
1.2 - Aspectos clínicos da infecção pelo Trypanosoma cruzi ...3
1.3 - Diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi ...8
1.3.1 – Testes sorológicos ... 12
1.4 - Tratamento etiológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi ... 16
1.5 - Critérios de cura na doença de Chagas ... 20
1.6 - Doença de Chagas no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 23
2 - OBJETIVOS ... 27
2.1 – Objetivo geral ... 28
2.2 – Objetivos Específicos ... 28
3 - CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 32
3.1 – Características da área de estudo ... 33
3.2 – População em estudo ... 34
3.3 – Avaliação laboratorial ... 35
3.3.1 – Métodos parasitológicos ... 36
3.3.2 – Testes sorológicos convencionais ... 38
3.3.3 – Testes sorológicos alternativos ... 40
3.4 – Critério de cura ... 42
3.5 – Avaliação Clínica ... 43
3.5.1 – Avaliação Clínica – casuística completa ... 43
3.5.2 – Avaliação Clínica – casuística parcial ... 43
3.5.3 - Avaliações dos pacientes nove e treze anos após tratamento etiológico... 46
3.6 – Análise Estatística... 47
4 - RESULTADOS ... 48
4.1 – Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) ... 49
XVII
4.1.2 – Avaliação laboratorial ... 50
4.1.4 - Idade quando tratado e tempo pós-tratamento versus cura ... 59
4.2 – Efetividade terapêutica e evolução clínica (coorte descritiva de pacientes tratados) ... 60 4.2.1 – Avaliação laboratorial ... 60 4.2.3 – Avaliação clínica ... 62 4.3 - Estudo de intervenção ... 65 4.3.1 - Avaliação laboratorial ... 65 4.3.2 – Avaliação clínica ... 69 5 - DISCUSSÃO ... 70
5.1 – Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) ... 71
5.2 - Efetividade terapêutica e evolução clínica em parte da casuística: coorte descritiva de pacientes tratados (n=29) ... 81
5.3 – Estudo de intervenção: parte da casuística ... 85
6 - CONCLUSÕES ... 90 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 93 8 - ANEXOS ... 115 Anexo I... 116 Anexo II... 117 Anexo III ... 125 Anexo IV ... 126
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1.1 – Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi
A Tripanossomíase Americana resulta da infecção de várias espécies de mamíferos pelo protozoário Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909) que pertence à família Trypanosomatidae (ordem Kinetoplastida). O nome doença de Chagas (DCh) para a doença humana homenageia seu descobridor, o médico e cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas, que entre 1907 e 1909, trabalhava no controle de um surto de malária no município de Lassance, em Minas Gerais, durante a construção da estrada de ferro Central do Brasil. Chagas percebeu que muitas pessoas daquela região apresentavam uma doença até então desconhecida e descobriu seu agente etiológico, o vetor, os reservatórios silvestres descrevendo ainda os efeitos da doença no organismo humano (CHAGAS, 1909; 1911). Já em 1911 ele antecipava as conseqüências sociais da doença e conclamava as autoridades para que considerassem a endemia como um problema do Estado.
Após cem anos de sua descoberta, a doença de Chagas ainda constitui um dos sérios problemas de saúde pública da América Latina. A infecção humana apresenta ampla distribuição no continente americano, sendo conhecida a existência de vetores da doença desde o sul dos Estados Unidos até Argentina (MILES et al., 2004). A doença ocorre em toda a América Latina, mas as manifestações clínicas e características epidemiológicas variam de uma região endêmica para outra, assim como as taxas de prevalência, a linhagem do parasita, os vetores e os hospedeiros.
Após a implementação de programas de controle em vários países, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima uma prevalência de infecção pelo T.
cruzi em 10 milhões de pessoas distribuídas em 21 países (WHO, 2010). A grande
importância desta doença está relacionada à sua elevada prevalência e extensa distribuição geográfica, somadas à alta letalidade observada em algumas das formas clínicas da doença (SCHMUÑIS, 1997; UCHÔA et al., 2002). Estimativas do Banco Mundial nos dão uma idéia da importância social das distintas doenças infecciosas na América Latina em termos de anos de vida útil perdidos, colocando a doença de Chagas no quarto lugar, depois das enfermidades respiratórias agudas, das diarréias e da AIDS (WORLD BANK, 1993).
3
Um marco de considerável relevância foi assumido pelos ministros de saúde dos países do Cone Sul (Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai) reunidos em Brasília, em julho de 1991, onde aprovaram a Iniciativa Internacional de Controle da DCh. Esta iniciativa apresentava como objetivos a eliminação da infestação domiciliar por Triatoma infestans e interrupção de transmissão de T. cruzi por via transfusional (SCHOFIELD & DIAS, 1999; MONCAYO, 1999). Este exemplo foi seguido pelos países do Pacto Andino (Colômbia, Equador, Peru e Venezuela) e da América Central (El Salvador, Guatemala, Honduras e Nicarágua) a partir de 1997 (WHO, 1997; MONCAYO, 1999). A extensão desta iniciativa para outras áreas foi acompanhada de adaptações frente a realidades epidemiológicas locais (MONCAYO, 2003). Vale ressaltar que a Iniciativa dos países do Cone Sul das Américas não deve ser entendida como o marco inicial de todo o controle da DCh na sub-região, pois vários países já tinham um programa de controle antes mesmo da iniciativa.
A transmissão da doença de Chagas por vetores domiciliados e/ou transfusão sanguínea foi interrompida no Uruguai em 1997, no Chile em 1999 e no Brasil em 2006. No Brasil, 80% da área endêmica está sob vigilância epidemiológica, com taxas de infestação domiciliar por triatomíneos inferior a 5%. Da mesma forma, é observada uma forte redução da infecção entre doadores de sangue (MORAES-SOUZA, 1999; MONCAYO e SILVEIRA, 2009), nos casos de transmissão congênita (GONTIJO et al., 2009) e entre escolares (7-14 anos) como demonstrado pelo nosso grupo em trabalhos realizados nos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas (BORGES et al., 2006) e em outras regiões do país (SILVEIRA & VINHÃES, 1999).
1.2 - Aspectos clínicos da infecção pelo Trypanosoma cruzi
Carlos Chagas definiu duas fases evolutivas na doença: aguda e crônica e fez a observação sobre o evidente contraste entre a elevada prevalência de casos crônicos frente à pequena incidência de casos agudos (CHAGAS, 1911).
A fase aguda da doença de Chagas compreende os fenômenos clínicos que se estabelecem nos primeiros meses de infecção (dois a quatro) e, do ponto de vista laboratorial, caracteriza-se pela demonstração do parasito no sangue por meio de
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exame direto (LARANJA, 1953). O sinal de porta de entrada é geralmente uma lesão inflamatória da pele com uma formação cutânea ligeiramente saliente, arredondada, com alguns centímetros de diâmetro, eritematosa, dura, quente e circundada por edema elástico, assemelhando-se a um furúnculo que não chega à supuração, denominada chagoma de inoculação (MAZZA e FREIRE, 1940). Quando a porta de entrada se dá na região ocular, forma-se o sinal de Romaña (ROMAÑA, 1935) caracterizado por edema bipalpebral unilateral, elástico e indolor, de início geralmente brusco e coloração róseo-violácea das pálpebras. Depois que Romaña descreveu o sinal que leva o seu nome, individualizando-o, conceituando-o e realçando seu valor diagnóstico, difundiu-se mais o reconhecimento de casos agudos.
A fase aguda da doença é inaparente ou oligossintomática na grande maioria dos casos, com manifestações clínicas diversas tais como: febre, edema, hipertrofia dos linfonodos, hepatomegalia, esplenomegalia e insuficiência cardíaca. Casos graves são, geralmente, associados às crianças menores de dois anos de idade, com quadro de morbi-mortalidade mais intenso, representado por miocardite e meningoencefalite aguda (BRENER, 1992) e morte entre 1 a 45% dos casos (DIAS, 1984). O prognóstico da fase aguda da doença de Chagas depende da idade do paciente, bem como do tipo e da intensidade das manifestações. Após a fase aguda, o indivíduo evolui naturalmente para a fase crônica, caracterizada pela dificuldade de detecção do parasito no sangue periférico, desaparecimento das manifestações clínicas, desaparecimento progressivo de IgM e elevação dos anticorpos específicos da classe IgG.
A fase crônica da doença de Chagas é caracterizada pela baixa parasitemia ou parasitemia subpatente e parasitismo tissular escasso, não sendo possível detectar o
T. cruzi através de métodos parasitológicos diretos. O diagnóstico é baseado mais
usualmente na detecção de anticorpos da classe IgG contra T. cruzi no soro de indivíduos chagásicos principalmente através de métodos sorológicos convencionais, tais como: enzyme linked immunossorbent assay (ELISA), hemaglutinação indireta (HAI) e imunofluorescência indireta (IFI). Esta fase está subdividida em três formas clínicas: indeterminada, cardíaca e digestiva (PRATA, 1990). A maioria dos indivíduos (50-70%) desenvolve a forma indeterminada da doença crônica, caracterizada por um
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longo período assintomático que pode durar por toda a vida. Entretanto, mesmo após um longo período assintomático, 25% dos indivíduos podem desenvolver a forma cardíaca da doença de Chagas, 6% a forma digestiva e 3% podem sofrer envolvimento do sistema nervoso periférico (COURA 1983, 1985; PEREIRA 1985; MONCAYO, 1999).
A maioria dos casos agudos não tratados evolui para a forma clínica indeterminada, assintomática. De acordo com os critérios estabelecidos na I Reunião de Pesquisa Aplicada em doença de Chagas (1984), esta fase é caracterizada pela positividade sorológica e/ou parasitológica para T. cruzi, ausência de sintomas e/ou sinais da moléstia, eletrocardiograma convencional normal e estudos radiológicos do coração, esôfago e cólon normais. Na maioria das vezes, os indivíduos chagásicos portadores desta forma clínica da doença desconhecem a presença da infecção e apresentam bom prognóstico a médio e longo prazo, mas devem ser acompanhados regularmente (MACÊDO, 1997). Embora apresentem bom prognóstico, sabe-se que cerca de 2 – 5% desses pacientes evoluem anualmente para a forma cardíaca e/ou digestiva (MACÊDO, 1980; MANZULLO et al., 1982; DIAS, 1989; CASTRO et al., 1994). Entretanto, quando exames propedêuticos mais aprimorados, como a monitorização eletrocardiográfica contínua com o sistema Holter, teste ergométrico e ecocardiograma são executados, uma parcela de indivíduos nesta forma da doença apresentará alguma alteração (RASSI et al., 1992; DIAS, 1996).
A forma cardíaca, por sua vez, é responsável pela maioria dos óbitos decorrentes da infecção chagásica, sendo considerada a forma clínica mais grave da infecção pelo T. cruzi. Em áreas endêmicas, a maioria dos casos de cardiopatia é atribuída à tripanosomíase. Chagas em 1922, já descrevia a cardiopatia chagásica crônica (CCC) como uma característica especifica da Tripanossomíase Americana. Em colaboração com VILLELA descreveu as alterações cardíacas essenciais e as principais manifestações clínicas desta forma da doença (CHAGAS e VILLELA, 1922).
A cardiopatia chagásica crônica é caracterizada, do ponto de vista anatomopatológico, por áreas de fibrose substituindo a massa muscular cardíaca e ocasionando a interrupção das fibras do coração, destruição do sistema nervoso autônomo (SNA) simpático e parassimpático e pela presença de um exsudato
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inflamatório ativo. A hipertrofia, dilatação e alteração da arquitetura do músculo cardíaco induzem ao aumento do tamanho do coração caracterizado pela cardiomegalia. Em casos avançados de cardiomegalia, fenômenos tromboembólicos e sinais de congestão passiva são os principais achados patológicos. O aneurisma cardíaco apical é um achado freqüente e bastante característico da cardiopatia chagásica crônica (WHO, 2002).
Nas fases iniciais da cardiopatia chagásica crônica são detectadas alterações discretas e inespecíficas no ECG. Apesar de não haver um padrão eletrocardiográfico exclusivo da doença de Chagas, algumas alterações eletrocardiográficas têm sido mais associadas à cardiopatia chagásica, como o bloqueio de ramo direito isolado ou associado ao bloqueio da divisão ântero-superior do ramo esquerdo. Embora haja alguma diferença regional, as alterações eletrocardiográficas consideradas como mais freqüentes na cardiopatia chagásica são, em ordem decrescente: extra-sístoles ventriculares isoladas ou repetitivas; alterações primárias da repolarização ventricular, que pode simular cardiopatia isquêmica; zonas eletricamente inativas; bloqueios atrioventriculares; bloqueio de ramo esquerdo por disfunção sinusal e taquiarritmia supraventricular (GASCON et al., 2006; XAVIER et al., 2006). Em casos mais avançados da cardiopatia, tais alterações, além de serem mais graves podem se sobrepor, constituindo um conjunto de anormalidades. Radiografias de tórax são relevantes no manejo dos pacientes nessa forma, pois permitem uma categorização mais precisa através da análise do tamanho do coração e da circulação pulmonar. Em fases mais avançadas da cardiopatia chagásica, observa-se aumento acentuado da silhueta cardíaca, identificado através da observação do cálculo do índice cardiotorácico (ICT). As radiografias que apresentam sinais de hipertensão venocapilar, crescimento de cavidades ou um ICT superior a 0,5 são consideradas alteradas. Na cardiopatia chagásica crônica, a disfunção sistólica global do ventrículo esquerdo apresenta-se como um importante fator prognóstico. Uma classificação para insuficiência cardíaca considerando a função sistólica do ventrículo esquerdo obtida através de ecocardiografia foi adotada para identificação de subgrupos de cardiopatas chagásicos crônicos. Essa normatização colabora para o manejo do paciente em nível prognóstico e terapêutico (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005).
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A partir da criação do Centro de Estudos da Moléstia de Chagas em Bambuí, em 1943, vários pesquisadores se dedicaram a mostrar a importância social da cardiopatia chagásica crônica (CCC). Importantes estudos clínico-epidemiológicos para avaliação da morbidade e a evolução da doença foram realizados no Brasil e em outros países do Cone Sul. Merece destaque o inquérito eletrocardiográfico realizado no Brasil com o objetivo de avaliar a prevalência da CCC, realizado por MACÊDO et al. (1982). Dados preliminares deste estudo permitiram estimar uma prevalência de alterações eletrocardiográficas entre os soropositivos de 37,4%. Foi possível também verificar uma maior prevalência de alterações eletrocardiográficas nos Estados de Minas Gerais, Bahia, Goiás e Piauí. Em outros estados como Rio Grande do Sul, não foram encontradas diferenças entre as freqüências de alterações eletrocardiográficas entre indivíduos chagásicos e não chagásicos. DIAS (1982) reexaminando após 27 anos, pacientes com quadros agudos conhecidos verificou uma associação significativa entre os quadros agudos clinicamente mais graves e a presença de ECG alterados. Entre outros achados, o autor chama a atenção para o caráter precoce e progressivo do bloqueio de ramo direito (BRD), que surge, em média 15 anos após a infecção, mas algumas vezes já está presente depois do primeiro ano da fase aguda.
A forma digestiva se expressa por anormalidades esofágicas e intestinais que caracterizam o megaesôfago e o megacólon chagásicos (REZENDE, 1997). As alterações do trato digestivo resultam principalmente do comprometimento do sistema nervoso entérico, em particular do plexo mientérico de Auerbach. As células nervosas desse plexo sofrem fenômenos degenerativos em meio ao processo inflamatório encontrado em suas vizinhanças e seu número se reduz acentuadamente (ANDRADE & ANDRADE, 1966; TAFURI & BRENER, 1967). O mecanismo de destruição neuronal não é bem conhecido, porém admite-se que esteja ligado à imunidade celular (TEIXEIRA et al., 1980; SANTOS & HUDSON, 1981). A desnervação ocorre de maneira irregular e em intensidade variável, em função de fatores ligados ao parasito e ao hospedeiro ainda não completamente elucidados. No caso das formas digestivas, admite-se que a cepa do parasito seja o fator mais importante na gênese das diferenças regionais da DCh (DIAS, 2000).
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Vale a pena ressaltar que certa proporção de chagásicos crônicos apresenta a forma mista da doença que corresponde à associação da forma cardíaca e digestiva (REZENDE, 1997). Não se admite, atualmente, que exista a forma crônica nervosa da doença devido à ausência de evidências de um substrato anátomo-patológico que a justifique. Esta forma foi admitida naqueles indivíduos que apresentavam manifestações neurológicas diversas e, eventualmente, déficit mental, alterações que foram atribuídas a seqüelas da meningoencefalite da fase aguda (VIEIRA, 1966; QUEIROZ, 1973). HOFF et al. (1978) mostraram que a presença de T. cruzi pode ser detectada no líquido cefalorraquidiano na maioria dos pacientes com a forma aguda da doença de Chagas, mesmo na ausência de sinais clínicos de meningoencefalite. Esta invasão do sistema nervoso pelo T. cruzi pode ser, portanto, muito freqüente e silenciosa, restando saber mais e melhor sobre as suas seqüelas, e se de fato existem.
1.3 - Diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi
O diagnóstico da infecção pelo T. cruzi deve ser apoiado na epidemiologia e clínica e confirmado, quanto à etiologia, pelo diagnóstico laboratorial. Este oferece importantes subsídios, desde que realizado com técnicas apropriadas, reagentes adequados e seguindo as boas práticas de laboratório. O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por meio da busca do parasito ou de anticorpos produzidos contra o parasito. Além disto, os exames são direcionados em função da fase da infecção. Embora o diagnóstico laboratorial seja efetuado habitualmente usando-se sangue venoso, outros líquidos orgânicos podem ser utilizados para a investigação parasitológica durante a fase aguda, ou sorológica, tais como: líquor, urina, líquido pericárdico, etc. Outro suporte muito utilizado para coleta de material orgânico em grandes inquéritos sorológicos é o papel de filtro. Para todo método laboratorial é necessário conhecer sua especificidade e sensibilidade. A especificidade indica a capacidade do teste em detectar a população não infectada. Sendo assim, um teste extremamente específico será capaz de detectar todos os pacientes não infectados. A sensibilidade indica a capacidade do teste em detectar todos os indivíduos infectados. Desta maneira, um teste pouco sensível deixará de detectar alguns indivíduos
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portadores da infecção. Para melhorar a sensibilidade e especificidade podemos utilizar de algumas estratégias, como empregar mais de um teste, repetir coleta de material, variar os valores de ponto de corte (cut-off), utilizar antígenos recombinantes e peptídeos sintéticos. Para isto, é necessário conhecer o objetivo do diagnóstico laboratorial para que as intervenções e/ou ajustes sejam bem conduzidas. Em relação aos métodos utilizados no diagnóstico da infecção pelo T. cruzi, os parasitológicos são de extrema especificidade (100%), pois o agente etiológico é direta ou indiretamente demonstrado. No entanto, esses testes apresentam baixa sensibilidade na fase crônica. Já os métodos sorológicos apresentam alta sensibilidade (95-100%) com a desvantagem de menor especificidade (92-98%), revelando assim a probabilidade e não a certeza do diagnóstico, já que temos as eventuais reações cruzadas, principalmente com Leishmania.
O diagnóstico parasitológico na fase aguda da doença de Chagas é facilmente realizado pela comprovação direta das formas tripomastigotas do T. cruzi em amostras de sangue examinado entre lâmina e lamínula. Devido à grande quantidade de parasitos circulantes nesta fase da doença, podemos utilizar diversos métodos diretos para a observação, tais como: exame a fresco, esfregaço sanguíneo, gota espessa, micro-hematócrito e técnica de concentração de Strout. Na fase crônica, devido à baixa parasitemia, os parasitos podem ser detectados utilizando métodos parasitológicos indiretos, tais como: hemocultura (HC), xenodiagnóstico e reação em cadeia da polimerase (PCR). Estes métodos não estão disponíveis em laboratórios de análises clínicas comuns, pois são métodos extremamente laboriosos, demorados, requerem equipamentos sofisticados e apresentam altos custos, sendo realizados apenas em centros de pesquisas. Apesar de serem extremamente específicos, os métodos parasitológicos apresentam baixa sensibilidade principalmente nos pacientes que se encontram na fase crônica da infecção (CHIARI et al., 1989; GALVÃO et al., 1993).
A técnica de hemocultura é utilizada desde a década de 50, com resultados inicialmente inferiores aos obtidos com o xenodiagnóstico (PIFANO, 1954; CHIARI e BRENER, 1966). O interesse em sua utilização foi retomado no Brasil após o trabalho de ALBUQUERQUE et al. (1972), que encontraram positividade de 97,4% em 38 chagásicos na fase crônica, por meio de seis coletas de sangue de cada paciente.
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Estes resultados estimularam outros pesquisadores como MOURÃO & MELLO (1975) que encontraram positividade de 45% e CHIARI & DIAS (1975) que encontraram positividade de 43,7%. O sucesso alcançado foi devido a modificações na técnica, como a retirada de plasma contendo anticorpos, coleta de maior volume (30mL) e o processamento a 4˚C (CHIARI et al., 1989; LUZ et al., 1994). Vários autores têm demonstrado também que quando a hemocultura é repetida duas ou três vezes no mesmo paciente, coletas seriadas, os resultados em termos de positividade aumentam de maneira considerável (CHIARI et al., 1989; LUZ et al., 1994; CASTRO et al., 2002).
O xenodiagnóstico foi descrito inicialmente por BRUMPT em 1914, sofrendo modificações sucessivas visando otimizar os resultados (SCHENONE et al., 1968; CERISOLA et al., 1974). Consiste basicamente na alimentação de ninfas do triatomíneo, livres de infecção, com sangue do paciente. Caso o parasito esteja presente, o mesmo multiplicará no tubo digestivo do triatomíneo sendo eliminado nas fezes e urina das ninfas examinadas 30 e 60 dias após o repasto sanguíneo. Pode ser natural, quando os triatomíneos são alimentados diretamente na pele do paciente, ou artificial, quando os triatomíneos são alimentados com o sangue coletado do paciente, mantido com anticoagulante até o momento do repasto. O xenodiagnóstico artificial tem sido cada vez mais empregado, com resultados equiparáveis ou melhores que o xenodiagnóstico natural (SANTOS et al., 1995; PINEDA et al., 1998; SILVA et al., 1998), sendo muito utilizado em caso de pacientes hospitalizados (onde não podemos entrar com triatomíneos), no caso em que indivíduos hiperalérgicos apresentem reações adversas e/ou recusa por parte dos mesmos. A positividade do xenodiagnóstico em pacientes chagásicos tem apresentado cifras em torno de 13 até 58.5%, com exame único, e depende da região, da quantidade de ninfas utilizadas e da espécie do triatomíneo aplicado (CERISOLA et al., 1974; BORGES e COURA, 1987). Outros autores têm demonstrado que quando este exame tem sido repetido, empregando uma série de aplicações, a taxa de positividade aumenta consideravelmente (COURA et al., 1991; CASTRO et al., 1993).
Os trabalhos pioneiros utilizando o princípio de replicação de um fragmento do DNA foram introduzidos por SAIKI et al. (1985), MULLIS et al. (1986) e MULLIS & FALOONA, 1987. Nos anos 90, a técnica de PCR foi introduzida como método de
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diagnóstico devido à sua grande capacidade em detectar quantidades ínfimas de DNA (MOSER et al., 1989; ÁVILA et al., 1991, 1993; RUSSOMANDO et al., 1992; BRITTO
et al., 1993; WINCKER et al. 1994; GOMES et al., 1998; CAMPOS et al., 2002). A
aplicação da hibridização para detecção de DNA, amplificado pela PCR no sangue, tem demonstrado aumento na sensibilidade da técnica (SILBER et al., 1997; GOMES et al., 1998). O seu emprego como diagnóstico alternativo tem contribuído, por exemplo, na elucidação de casos com sorologia convencional discordante e controle pós-terapêutico (BRITTO et al., 1995; SILVEIRA et al. 2000, SOLARI et al. 2001, GALVÃO et al. 2003; SCHIJMAN et al., 2003; ZULANTAY et al., 2004; BRITTO, 2009). Atualmente, a técnica de PCR tem sido recomendada como complementar para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi devido à sua maior sensibilidade em relação aos métodos parasitológicos convencionais (MS, 2005). Assim como os métodos parasitológicos indiretos, xenodiagnóstico e hemocultura, os resultados obtidos pela técnica de PCR são bastante variáveis. Estudos realizados por diferentes autores têm demonstrado variações de 45 a 100% na sensibilidade da PCR em sangue de pacientes chagásicos crônicos quando comparados aos testes sorológicos (ÁVILA et al., 1993; WINCKER et
al., 1994; GOMES et al., 1998). Essas diferenças parecem depender dos iniciadores
utilizados, do volume de sangue coletado, da origem geográfica dos indivíduos estudados, da faixa etária, dos níveis parasitêmicos, do método de extração de DNA utilizado e também de características genéticas das cepas do parasito (CASTRO et al., 2002).
Recentemente foi realizado um Workshop & Simposium em Buenos Aires, Argentina, patrocinado pela WHO-TDR e com a presença de diversos pesquisadores da América Latina e Europa, com o objetivo de padronizar e validar o uso da reação em cadeia da polimerase para detecção da infecção pelo Trypanosoma cruzi em amostra de sangue (TDR/WHO, 2008, SCHIJMAN et al., 2011).
O diagnóstico na fase crônica da DCh é realizado freqüentemente após suspeita clínica e/ou evidências epidemiológicas e confirmado pela presença de anticorpos
anti-Trypanosoma cruzi presentes no soro. Estes anticorpos podem ser detectados por
técnicas da sorologia convencional, como ELISA, HAI e IFI, e por técnicas de sorologia não convencional como lise mediada pelo complemento (LMCo), reação de
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imunofluorescência por citometria de fluxo (FC-ALTA) pesquisando os anticorpos análogos ao anticorpos líticos e denominados anticorpos anti-tripomastigota vivo (MATINS-FILHO et al., 1995).
Nos dias atuais, a maioria dos pacientes se encontra na fase crônica da infecção, onde a parasitemia é muito baixa, sendo assim os métodos sorológicos são os de primeira escolha para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi, sendo os mais econômicos, rápidos e eficazes. Mesmo na ausência do agente etiológico, após tratamento, os anticorpos específicos se encontram em concentrações elevadas durante vários meses ou anos em função do tempo de infecção do paciente. Por outro lado, temos a existência de reações cruzadas, pelas quais um estímulo antigênico similar, embora não idêntico, pode gerar anticorpos que sejam detectados por diferentes métodos utilizados proporcionando assim resultados falsos positivos. Esta situação pode ser observada em infecções concomitantes ou exclusivas com parasitos similares antigenicamente, como são as leishmanias e outros tripanosomatídeos. Diante do exposto, podemos perceber que embora a sorologia seja o método de escolha para o diagnóstico laboratorial, ela apresenta algumas limitações, inerentes à sua própria natureza.
Para assegurar o melhor desempenho dos testes sorológicos, a WHO (1991) preconiza a utilização de duas técnicas sorológicas de princípios diferentes para estabelecer o diagnóstico da infecção por T. cruzi.
1.3.1 – Testes sorológicos
ENGVALL & PERLMANN (1972) foram os responsáveis pela introdução do ensaio de ELISA como testes imunoenzimáticos para a detecção de anticorpos, cabendo a VOLLER et al. (1975) a sua aplicação e padronização para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi. Segundo CAMARGO (1987), uma das vantagens do ELISA é a de que o resultado é expressão da capacidade de ligação dos anticorpos de uma forma direta, e não por titulação como a obtida por hemaglutinação e imunofluorescência indireta que pesquisam em até que diluição a reação é observada. A intensidade de cor
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revelada através da leitura em espectrofotômetro indica a concentração de anticorpos existentes na amostra de soro avaliada.
O desempenho de diferentes conjuntos diagnósticos existentes no mercado para o teste imunoenzimático foi objeto de avaliação, obtendo-se sensibilidade de 97,7 a 100% e especificidade de 93,3 a 100% (ASTORGA et al., 1990; OELEMANN et al., 1998; CABALLERO et al., 2007).
O antígeno mais utilizado na sensibilização de placas é proveniente de extrato bruto de formas epimastigotas de cepa Y (mantidas em meio LIT), porém outros antígenos recombinantes, peptídeos sintéticos e antígenos semi-purificados estão sendo empregados atualmente revelando bons resultados de sensibilidade e especificidade (MENDES et al., 1997; UMEZAWA et al., 1999; FERREIRA et al., 2001; SILVEIRA et al., 2001; UMEZAWA et al., 2004)
O teste de IFI é utilizado universalmente para o diagnóstico sorológico de diversas doenças infecciosas desde 1950. Permite, com o auxílio de microscópio com luz ultravioleta e o conjugado de anticorpo anti-IgG humano com isotiocianato de fluoresceína para as diferentes doenças, com variação apenas do antígeno a ser utilizado (FIFE & MUSCHEL, 1959). Este teste foi estabelecido para o diagnóstico da doença de Chagas a partir dos trabalhos de padronização da técnica realizados por CAMARGO (1966). A IFI requer maior número de passos que o teste de HAI, assim como mais reagentes, aumentando as possibilidades de erros técnicos. A leitura é subjetiva, como no teste de HAI, sendo extremamente importante o equipamento de leitura, que deve estar bem ajustado. A grande vantagem é a extrema sensibilidade que o teste apresenta, proporcionando assim a visualização de títulos elevados de anticorpos nos soros da população infectada.
O teste de HAI foi introduzido para o diagnóstico da doença de Chagas em 1962 (CERISOLA et al., 1962) e tem sido amplamente utilizado na América Latina (KNIERIM
et al., 1966; NEAL et al., 1970). No Brasil foi padronizado por CAMARGO et al. (1971)
e sua ampla utilização se deve à facilidade de execução, rapidez de leitura (1 a 2h) e de não necessitar de equipamentos adicionais. Outra vantagem deste teste é a sua simplicidade de execução, que consiste em dois passos: a diluição dos soros e a introdução do antígeno, o que contribui para evitar erros técnicos. Existem múltiplas
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variedades descritas de HAI, utilizando hemácias de diferentes espécies (humana, de aves, de carneiro, etc), assim como métodos de sensibilização e origem dos antígenos. No Brasil, o antígeno que tem sido comumente empregado é feito com a cepa Y, enquanto que na Argentina, com a cepa Tulahuen. Outra vantagem deste teste é a sua simplicidade de execução. Este teste aproxima-se do ideal devido à facilidade de execução, mas apresenta como limitação a sensibilidade, algo menor que a dos outros testes, motivo pelo qual sempre deve ser acompanhado de uma segunda prova, de maior sensibilidade, como o teste IFI ou ELISA.
Alguns trabalhos demonstram a dualidade de anticorpos em pacientes chagásicos crônicos infectados por T. cruzi (KRETTLI & BRENER, 1976; 1982). Os soros desses pacientes reconhecem epítopos de tripomastigotas vivos, sendo estes anticorpos protetores, denominados também de anticorpos funcionais ou líticos. Eles são identificados pelo teste de lise mediada pelo complemento (LMCo) que simula o mecanismo de resposta imune humoral fundamental no controle da parasitemia no indivíduo chagásico crônico. Os outros anticorpos não são protetores, não aderem aos epítopos da membrana dos tripomastigotas vivos, sendo somente detectados pela sorologia convencional. Com estas peculiaridades, foi possível estabelecer um critério de cura para animais ou pacientes baseado na pesquisa de anticorpos líticos pelo teste de LMCo (KRETTLI & BRENER, 1982).
O teste de LMCo consiste em incubar tripomastigotas do T. cruzi vivos (sanguíneos obtidos de animais imunossuprimidos ou de cultura celular) com o soro-teste diluído e soro fresco humano normal como fonte de complemento. A suspensão dos tripomastigotas e diluída a 1:2 e 1:4, e o número de parasitas móveis é contado em câmara de Neubauer ao microscópio na objetiva de 40X. Testes com lises promovidas pelo complemento maiores que em 20% dos parasitos são considerados como positivos. Esta modalidade de teste contribui ainda para o diagnóstico sorológico em casos de sorologia discordante e no controle de cura pós-terapêutica específica. Entretanto as dificuldades oriundas do teste, tais como a manipulação de tripomastigotas vivo, a utilização de Complemento, a dificuldade de sua leitura feita em câmara de Neubauer e a dificuldade de sua reprodutibilidade impediram a utilização
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generalizada e rotineira deste método como ferramenta para o diagnóstico e controle de cura.
MARTINS-FILHO et al., (1995) introduziram a imunofluorescência indireta através da citometria de fluxo na tentativa de substituir a LMCo principalmente devido ao fato da LMCo ser uma técnica muito trabalhosa, que oferece risco ao operador e de leitura subjetiva. A citometria de fluxo é menos trabalhosa, apresenta maior sensibilidade, praticidade e maior segurança na leitura, além de não necessitar da adição de Complemento para a execução da técnica. Esta técnica foi em seguida validada em relação à técnica de LMCo em um estudo duplo-cego com 94 amostras de soro codificadas de pacientes chagásicos não tratados, tratados em diferentes fases da DCh (aguda, subaguda e crônica) classificados como tratados curados, tratados não curados e tratados sob avaliação. Os resultados obtidos mostraram alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti-tripomastigota vivo pela citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 2002), confirmando os dados de MARTINS-FILHO et al. (1995) que sugerem o uso desta técnica principalmente no monitoramento da eficácia do tratamento. A citometria de fluxo é uma técnica de análise automatizada através da qual uma única partícula pode ser caracterizada física e bioquimicamente em meio líquido. A caracterização inclui tamanho, granulosidade (ou complexidade interna) e intensidade da fluorescência. Todos esses parâmetros podem ser detectados simultaneamente, medidos, armazenados e analisados no computador sendo visualizados na forma de um fluorograma. Esse método apresenta uma grande versatilidade, uma vez que permite o desenvolvimento de estudos que empregam tanto formas tripomastigotas vivas quanto formas epimastigotas fixadas (CORDEIRO et al., 2001; VITELLI-AVELAR, 2007).
A introdução da citometria de fluxo como um método sensível para a detecção de anticorpos trouxe uma nova perspectiva não só para os estudos da doença de Chagas (CORDEIRO, 2000), mas também para os estudos de diversas doenças parasitárias como leishmaniose (ROCHA, 2005), babesiose (BITTAR, 2002), erliquiose canina (MOREIRA, 2005) e doenças causadas por vírus (MARTINS, 2004; SILVA, 2005). Atualmente a citometria de fluxo tem sido muito utilizada na determinação da relação das células CD4+/CD8+ em pacientes HIV positivos.
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1.4 - Tratamento etiológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi
Pouco progresso tem sido obtido no tratamento das pessoas infectadas pelo T.
cruzi embora a incidência de novas infecções tenha diminuído em todo o continente Sul
Americano (URBINA, 2001, MONCAYO, 2003). Apesar do grande esforço das autoridades sanitárias em conter a transmissão da doença de Chagas por via vetorial (com o uso de inseticidas de ação residual, que promoveram uma drástica diminuição na densidade triatomínica) e por via transfusional (DIAS, 1994), existe ainda um grande número de indivíduos infectados, principalmente na América Latina, que necessitam de diagnóstico, manejo clínico adequado e eventualmente tratamento etiológico (LUQUETTI, 1997; BLANCO et al., 2000).
O tratamento etiológico da doença de Chagas já ultrapassou a fase experimental e a sua aplicação clínica permitiu ao médico diante do paciente com doença de Chagas, assumir uma nova atitude, abandonando a prática de mero espectador de um fenômeno sabidamente conhecido, a evolução natural da doença, para tentar modificar esta evolução mediante o uso de um quimioterápico ativo (CANÇADO, 1997). No entanto, o problema ainda não está resolvido. Existem sérias dificuldades a vencer, a começar pela alta toxicidade dos medicamentos ativos e a incerteza ainda reinante na apreciação do grau de eficiência terapêutica na fase crônica da doença.
Os primeiros compostos empregados para o tratamento da doença de Chagas não apresentaram resultados efetivos contra o parasito, como os compostos de arsênico, tártaro emético e cloreto de mercúrio, empregados experimentalmente por MAYER & ROCHA LIMA (1912,1914). A primeira tentativa de tratamento etiológico em humano foi realizada por SALVADOR MAZZA (1937) utilizando um derivado quinolínico (Bayer 7602). Outros compostos como os derivados de bismuto (STEIN, 1933) e bisquinaldinas (JENSCH, 1937) foram testados em camundongos, mas não apresentaram efeitos tripanosomicida.
Após a Segunda Guerra Mundial (1939 – 1943), uma série de drogas foi testada em animais e em pacientes chagásicos, tais como alguns antimaláricos, arsenobenzólicos, iodeto de sódio, violeta genciana, anti-histamínicos, anfotericina B,
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vários antibióticos e alguns nitrofuranos (BRENER, 1968; CANÇADO, 1968), mas nenhum composto se revelou eficaz.
BRENER (1968) realizou uma avaliação experimental criteriosa de várias drogas “in vivo” e “in vitro” contra T. cruzi, registrando 27 compostos e mais de 30 antibióticos (ensaiados entre 1912 e 1962) que foram inativos. Dentre os compostos, alguns apresentavam um efeito supressor na parasitemia e na letalidade da doença, mas não proporcionavam cura parasitológica. Segundo BRENER (1984), os requisitos mais importantes para uma droga ideal para a quimioterapia da DCh são: capacidade para induzir cura parasitológica em ambas as fases (aguda e crônica) da doença, atividade oral em dose única ou em poucas doses, ausência de efeitos colaterais significantes, viável para tratamento ambulatorial com monitoramento mínimo e baixa probabilidade de desenvolvimento de parasitas resistentes.
Atualmente apenas duas classes de compostos apresentam eficácia comprovada na quimioterapia da doença de Chagas: nitrofuranos e nitroimidazólicos.
Em 1972, o laboratório Bayer anunciou a síntese de um nitrofurano (1,1-dioxido da tetraidro-3-metil-4[(5-nitrofurfurilideno)amino]-2H-1,4-tiazina) conhecido como nifurtimox. O mecanismo de ação do nifurtimox é mediado por radicais livres que são gerados pela droga, tais como ânions superóxidos e peróxidos de hidrogênio (DOCAMPO & STOPPANI, 1979). Este medicamento foi amplamente utilizado no tratamento da infecção pelo T. cruzi proporcionando bons resultados principalmente quando administrado na fase aguda da infecção (BLANCO et al., 2000; BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000; SCHIJMAN et al., 2003).
Os trabalhos pioneiros de GRUNBERG et al. (1968) demonstraram a atividade quimioterápica contra o T. cruzi do derivado 2-nitroimidazólico (N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida) conhecido como benzonidazol. Este fármaco, produzido a princípio pela Hoffman – La Roche sob a denominação de Rochagan, foi introduzido na
Argentina e no Brasil em 1978, sendo atualmente o único fármaco disponível no Brasil para o tratamento da infecção pelo T. cruzi. O mecanismo de ação do benzonidazol consiste na diminuição da síntese de proteínas, redução de incorporação dos precursores de RNA e diminuição da incorporação de timidina em DNA, resultando assim em uma diminuição na biossíntese de macromoléculas (POLAK & RICHLE,
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1978). Este composto tem sido empregado no tratamento específico de pacientes chagásicos na fase aguda, promovendo curas parasitológicas de 50-70% (BRENER et
al., 1993). Resultados significativamente inferiores são encontrados na fase crônica da
doença.
Ambos os fármacos apresentados estão longe de ser o medicamento ideal devido aos efeitos colaterais observados em alguns pacientes, tais como anorexia, vômito, dermatite por hipersensibilidade, polineuropatia periférica e depressão da medula óssea.
O tratamento da doença de Chagas humana com o Benzonidazol (BZ) e o Nifurtimox (NFX) fornece resultados distintos tanto na fase aguda como crônica, principalmente em indivíduos chagásicos de áreas geográficas distintas. Um dos fatores que contribui para este fato é a cepa do parasito (FILARDI & BRENER, 1987). Geralmente cepas do Rio Grande do Sul, Argentina e Chile apresentam elevada susceptibilidade à droga (COURA & CASTRO, 2002). É sabido que nestas regiões, há um predomínio de T. cruzi II (TIBAYRENC & AYALA, 1988), especialmente do “clone maior” 32 ou T. cruzi 2b (BRISSE et al, 2000) ou T. cruzi II (Satellite Meeting, 2009), que se mostrou mais sensível a drogas tanto “in vitro” (REVOLLO et al., 1998) quanto “in vivo” (TOLEDO et al., 2003).
Embora haja divergência quanto às percentagens de cura no tratamento etiológico da doença de Chagas, há consenso sobre a sua utilidade salvo em condições onde é contra-indicado tais como na gestação, insuficiência hepática e renal grave e em idosos. A comprovação de cura, especialmente na fase crônica, depende de fatores como o tempo de seguimento e os exames laboratoriais utilizados.
Nos últimos anos, uma grande variedade de drogas tem sido investigada com o propósito de desenvolver uma quimioterapia segura, eficaz e específica para DCh. Estudos recentes levando em conta aspectos bioquímicos básicos do T. cruzi têm permitido a identificação de novos alvos para a quimioterapia que inclui inibidores da síntese de purinas (Allopurinol), inibidores da síntese de ergosterol (cetoconazol, itraconazol, miconazol, fluconazol, econazol, etc.) e outros derivados azólicos (ravuconazol, albaconazol, pozaconazol, fexinidazol, etc) (BAHIA et al., 2005).
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Segundo o Consenso Brasileiro (2005), na fase aguda o tratamento deve ser realizado em todos os casos e o mais rápido possível após confirmação diagnóstica, independentemente da via de transmissão (oral, congênita, transfusional ou acidental). Vale ressaltar ainda que a doença de Chagas aguda é de notificação compulsória.Tanto o BZ como o NFX, apresentam alta eficácia na fase aguda da infecção, revelando índices de cura que variam de 40% a 76% (ANDRADE et al. 1992; BAHIA-OLIVEIRA et al. 2000; CANÇADO, 2002, SHIKANAI YASUDA, 1990). De acordo com CANÇADO (2002), a negativação da sorologia nesta fase da infecção, ocorre entre 11 a 12 meses em 50% dos indivíduos chagásicos e que 14 meses pós-tratamento todos os indivíduos chagásicos já são soronegativos.
BAHIA-OLIVEIRA et al. (2000) avaliando 25 indivíduos tratados na fase aguda da infecção, seguidos clinicamente por 14-30 anos, encontraram 40% de cura e 28% de pacientes dissociados. Não foi observado nenhum sintoma clinico nem alteração cardíaca no grupo considerado curado e apenas dois pacientes considerados dissociados apresentaram alterações cardíacas leves enquanto 50% dos pacientes não curados apresentaram alterações cardíacas mais graves. Os autores sugerem também neste estudo que a persistência de células T reconhecendo antígenos de T. cruzi não seria suficiente para desencadear patologias cardíacas, reforçando assim a hipótese que a presença do parasita pode ser essencial para o desenvolvimento de miocardiopatia chagásica. Esses dados reforçam mais ainda a importância do diagnóstico precoce e do tratamento etiológico nesta fase da infecção.
Na doença de Chagas congênita, o tratamento precoce do recém-nascido com BZ ou NFX tem eficácia terapêutica que varia de 66% a 100% dos casos (RUSSOMANDO et al., 1998; BLANCO et al., 2000; SCHIJMAN et al., 2003).
Na última década, verificou-se que o BZ e o NFX têm apresentado altas taxas de cura que variam de 62% a 87% em infecções crônicas recentes tanto no Brasil como em outros países (ANDRADE et al., 1996; ANDRADE et al., 2004; SOSA-ESTANI, 1998; SILVEIRA et al., 2000; STREIGER et al. 2004).
A maior limitação ao uso das drogas tripanosomicidas é a baixa atividade antiparasitária na fase crônica tardia da doença, especialmente no Brasil (COURA e CASTRO, 2002; GUEDES et al. 2006) cujas razões ainda não são bem conhecidas. Os
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índices de cura alcançados pelos diversos autores variam de 0% a 19.1% (FERREIRA, 1990; VIOTTI et al., 1994; SUASNÁBAR et al., 2000; LAURIA-PIRES et al., 2000; BRAGA et al., 2000; GALLERANO & SOSA, 2001; BRITTO et al. 2001; CANÇADO, 2002; FABBRO et al., 2007; FERNANDES et al., 2009). Por outro lado tem sido verificado por alguns autores que indivíduos chagásicos tratados na fase crônica da infecção, embora não parasitologicamente curados, apresentam uma redução significativa no surgimento de alterações eletrocardiográficas (SUASNÁBAR et al., 2000; VIOTTI et al., 1994; ZULANTAY et al., 2005) e evolução clínica mais lenta (SEGURA et al., 1994, VIOTTI et al., 2006, SOSA-ESTANI & SEGURA, 2006) com reversão da fibrose em modelo murino (ANDRADE et al. 1991). Outros trabalhos vêm demonstrando o efeito benéfico do tratamento etiológico da doença de Chagas, proporcionando assim cura parasitológica ou retardo na evolução da doença (FRAGATA-FILHO et al., 1995; COURA et al., 1997; FABRO et al., 2000; LANA et al., 2009).
Embora haja divergências quanto às percentagens de cura no tratamento etiológico da doença de Chagas há certo consenso sobre a sua utilidade em certas circunstâncias, tais como: fase da doença, idade do paciente e condições associadas. A comprovação de cura, especialmente na fase crônica, depende de fatores como o tempo de seguimento e os exames utilizados. Por estas razões, o Consenso Brasileiro em doença de Chagas recomenda o tratamento a todo paciente soropositivo que se encontra na fase aguda, infecção congênita e fase crônica recente. Nos casos de fase crônica tardia ou de maior duração, o tratamento está indicado na forma indeterminada e nas formas cardíacas e digestivas leves. O tratamento está indicado também em casos de transplantes, infecção acidental e em pacientes imunodeprimidos caso haja reativação.
1.5 - Critérios de cura na doença de Chagas
Para avaliar a resposta à quimioterapia específica da DCh duas categorias de testes laboratoriais estão disponíveis, incluindo métodos parasitológicos e testes sorológicos. Os métodos parasitológicos são baseados na demonstração do parasita
