Isolamento e potencial enzimático de fungos associados ao intestino de larvas
de Stenochironomus Kieffer (Insecta: Diptera: Chironomidae)
Isolation and enzymatic potential of fungi associated with the gut of
Stenochironomus Kieffer larvae (Insecta: Diptera: Chironomidae)
DOI:10.34117/bjdv6n5-347Recebimento dos originais: 10/04/2020 Aceitação para publicação: 18/05/2020
Enide Luciana Belmont-Montefusco
Doutoranda em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Endereço: Av. General Rodrigo Octavio Jordão Ramos, 1200 - Coroado I, Manaus - AM, Brasil
E-mail: lucianabelmont22@gmail.com Jéssica Batista de Oliveira
Graduada em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Endereço: Av. General Rodrigo Octavio Jordão Ramos, 1200 - Coroado I, Manaus - AM, Brasil
E-mail: jessicabatista115@gmail.com Heloise Bentes Mar
Graduada em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Endereço: Av. General Rodrigo Octavio Jordão Ramos, 1200 - Coroado I, Manaus - AM, Brasil
E-mail: heu.loise@gmail.com Pamella S. Santa-Rosa
Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Endereço: Av. General Rodrigo Octavio Jordão Ramos, 1200 - Coroado I, Manaus - AM, Brasil
E-mail: pamellasuely@gmail.com Neusa Hamada
Doutora em Entomologia pela Clemson University (USA) Instituição: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA Endereço: Av. André Araújo, 2936 - Petrópolis, Manaus - AM, Brasil
E-mail: nhamada@inpa.gov.br Carlos Gustavo Nunes-Silva
Doutor em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Endereço: Av. General Rodrigo Octavio Jordão Ramos, 1200 - Coroado I, Manaus - AM, Brasil
RESUMO
Os insetos possuem como estratégia alimentar a utilização de substratos celulósicos como fonte de energia. Esses substratos, geralmente, estão colonizados por microrganismos, os quais convertem o substrato vegetal a um estado nutricional palatável por meio da produção de enzimas. Fungos filamentosos tem despertado grande interesse por serem bons produtores de enzimas extracelulares e com grande potencial de aplicação nas áreas da biotecnologia. Dessa forma, o estudo foi desenvolvido com o objetivo de isolar e avaliar a atividade celulolítica de fungos filamentosos associados ao intestino de larvas de Stenochironomus Kieffer (Insecta: Diptera: Chironomidae). A avalição da produção de celulases foi realizada em placas de Petri contendo meio sintético com CMC como única fonte de carbono, utilizando-se o teste qualitativo com vermelho Congo para a determinação dos índices enzimáticos. Foram isoladas 49 colônias com um total de 293,3 UFC/mL. Os fungos identificados foram Aspergillus Micheli ex Haller, Cladosporium Link, Penicillium Link e
Trichoderma Persoon. Dos 49 isolados fúngicos 35 produziram halo de hidrólise com índices
enzimáticos entre 1,0 e 3,1, indicando o potencial de produção de enzimas celulolíticas por esses fungos. Este estudo contribui para o conhecimento sobre fungos associados, assim como a presença de fungos celulolíticos no intestino de insetos aquáticos reforça o potencial biotecnológico para a prospecção de enzimas celulolíticas.
Palavras-chave: Celulases; fungos filamentosos; insetos aquáticos. ABSTRACT
Insects have as a feeding strategy the use of cellulosic substrates as an energy source. Usually, these substrates are colonized by microorganisms, which convert the plant substrate to a palatable nutritional state by means of enzymes production. Filamentous fungi have aroused great interest for being good producers of extracellular enzymes and a great potential application in areas of biotechnology. Thus, this study was developed with the aim to isolate filamentous fungi from the intestine of larvae of Stenochironomus Kieffer and to evaluate the cellulolytic activity of these fungi. For enzymatic synthesis, the production of mycelium was performed in Petri dishes with synthetic medium with CMC, using Congo red qualitative test to determine the enzymatic index. A total of 293.3 UFC/mL and 49 strains were isolates. The fungi identified were Aspergillus Micheli ex Haller,
Cladosporium Link, Penicillium Link and Trichoderma Persoon. Of the 49 fungal isolates 35
produced halo hydrolysis, enzymatic indices between 1.0 and 3.1, indicating the potential for cellulolytic enzyme production by these fungi.This study contributes to the knowledge of associated fungi, as well as the presence of cellulolytic fungi in the gut of aquatic insects reinforces the biotechnological potential for prospecting cellulolytic enzymes.
Keywords: Cellulases; filamentous fungi; aquatic insects. 1 INTRODUÇÃO
Muitos microrganismos são transientes ao longo do sistema digestivo de insetos podendo ser ingeridos com o alimento ou podendo residir no trato digestivo. Estes microrganismos exercem papéis importantes, ajudando a definir as características metabólicas nos insetos, servindo de alimento e, por meio dos insetos, ter uma disseminação facilitada (BRENNAN et al., 2004; VISÔTTO, 2007). Muitas das deficiências nutricionais sofridas pelos insetos, os quais se alimentam de uma ampla variedade de dietas, podem ser supridas pela presença de microrganismos (TAMAS et al., 2002).
Os microrganismos podem estar envolvidos no processo alimentar dos insetos, já que estes se alimentam de dietas com moléculas complexas, como a celulose (WATANABE; TOKUDA, 2010)
ou com deficiência nutricional, como o floema. Alguns insetos usam a matéria orgânica alóctone como recurso alimentar somente depois desta ter sido condicionada, ou seja, colonizada por microrganismos, os quais convertem esse tecido a um estado nutricional palatável (CUMMINS et al., 1989) e de fácil degradação (BRUNE, 2006). Assim, os microrganismo auxiliam na digestão da matéria orgânica ingerida, pois sua capacidade em degradar a celulose é alta e amplamente distribuída entre vários gêneros de fungos (MATTANOVICH et al., 2009).
Estudos sobre a associação entre fungos e insetos ainda são restritos na Amazônia (e.g., RIOS-VELASQUEZ et al., 2002, ALENCAR et al., 2003; PEREIRA et al. 2009; FONSECA et al. 2011; SANTOS et al. 2018) sobretudo aqueles relacionados à produção de enzimas celulolíticas. Pesquisas dessa natureza podem contribuir com o conhecimento sobre a biodiversidade fúngica, fornecendo subsídios para compreensão de mecanismos de interações mutualísticas, direcionar estudos sobre a coevolução destes sistemas simbiontes, identificação de espécies novas, descrição das comunidades de microrganismos, bem como a bioprospecção de novas enzimas celulolíticas. Dessa forma, este estudo teve como objetivo isolar e avaliar qualitativamente a atividade celulolítica de fungos filamentosos associados ao trato digestivo de larvas de Stenochironomus Kieffer.
2 MATERIAL E MÉTODOS
As larvas de Stenochironomus foram coletadas em igarapés da Reserva Florestal Ducke (RFD), localizada na Rodovia Estadual AM-010, km-26, Manaus, AM (02°56’21” N, 59°57’43” O). Foram coletadas um total de 25 larvas, as quais tiveram suas superfícies externas desinfectadas em microtubo com 1 mL de álcool 70% por 30 segundos e em seguida transferidas para microtubo contendo 1 mL de água destilada estéril, onde foram armazenadas e transportadas em caixa de isopor com gelo até a realização dos procedimentos laboratoriais.
Para dissecção das larvas utilizou-se pinças e tesoura estéreis, os intestinos foram retirados e transferidos para microtubos contendo 1 mL de água destilada estéril. Uma alíquota de 100 µL de cada amostra foi espalhada por meio da técnica de spread-plate em placas de Petri, em triplicata, contendo meio BDA (Batata Dextrose Ágar) e 0,1 mg/L de antibiótico Cloranfenicol. Um total de 75 placas de Petri foram incubadas em estufa a 27 ºC por 7 dias. Transcorrido o tempo de incubação, realizou-se a contagem dos fungos crescidos e o isolamento dos mesmos por meio do subcultivo de cada um dos isolados em novas placas contendo BDA.
Foi realizado o método de microcultivo, no qual as placas com foram acondicionadas em uma caixa de isopor à temperatura ambiente por 7 a 10 dias, até que se observou desenvolvimento de hifas. Para a fixação das estruturas microscópicas, a lamínula foi retirada com auxílio de uma pinça e montada sobre uma lâmina com uma gota de azul de lactofenol para visualização das estruturas. As
lâminas foram observadas e fotografadas em microscópio óptico, 40x, (Leica Microsystems com uma câmera Leica DFC295 fixada ao microscópio e o programa Leica Application Suite – LAS, 4.2.0) para realizar a identificação morfológica, observando-se o tipo e cor da hifa, forma, disposição e formação de esporos (LACAP et al. 2003, IBRAHIM et al. 2017).
A produção de celulases foi avaliada a partir do crescimento dos isolados fúngicos em meio sintético com carboximetilcelulose (CMC) (NaNO3: 3,0 g.L-1; K2HPO4: 1,0 g.L-1; MgSO4: 0,5 g.L-1;
KCl: 0,5 g.L-1; FeSO4.7H2O: 10,0 mg.L-1; CMC: 10,0 g.L-1; ágar: 20,0 g.L-1) como única fonte de
carbono (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004). As placas foram incubadas por 4 dias a 28 ºC e em seguida submetidas a choque térmico de 50 ºC em estufa por 16 horas, em triplicata. A atividade enzimática foi verificada pela formação de halos de degradação, os quais foram revelados por meio de solução corante de vermelho congo (2,5 g.L-1) e solução de NaCl 0,5 M, ambos em tampão Tris
HCl 0,1 M, pH 8,0 (NOGUEIRA; CAVALCANTI, 1996).
Os diâmetros das colônias e dos halos produzidos foram medidos com auxílio de um paquímetro (mm). A atividade enzimática foi expressa em índice enzimático (IE) mediante a relação do diâmetro halo de degradação e o diâmetro da colônia (IE= dh/dc) (NOGUEIRA; CAVALCANTE, 1996). As linhagens que apresentaram halo de hidrólise foram consideradas como positivas para a presença de celulases e as que alcançaram I.E. ≥ 2,0 como potenciais linhagens para a aplicação biotecnológica (LEALEM; GASHE, 1994; STAMFORD et al., 1998).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de 293,3 UFC/mL de 49 isolados foram contabilizados nas amostras do intestino das larvas de Stenochironomus. Por meio de morfologia macro e microscópica foram identificados quatro gêneros: Aspergillus, Cladosporium, Penicillium e Trichoderma (Figura 1). Aspergillus, Penicillium e Trichoderma são comumente encontrados na natureza, sendo estes já isolados, anteriormente, do intestino de besouros, percevejos, formigas e baratas (GAMA et al., 2002; MOREIRA et al., 2003; MORAES et al., 2004; LEMOS et al., 2006; NUNES; FRIZZAS, 2007; ROJAS-JIMÉNEZ; HERNÁNDEZ, 2015). Todos os isolados foram capazes de crescer no meio de cultivo contendo carboximetilcelulose como única fonte de carbono. Destes, 71,4% (35 isolados) apresentaram atividade celulolítica extracelular e somente 14 demonstraram resultado negativo para esta atividade, não sendo possível observar a formação do halo de hidrólise.
Figura 1 - Aspecto macro e micromorfológico dos fungos isolados do intestino de larvas de Stenochironomus (Diptera: Chironomidae). A1 e A2 – Aspergillus sp; B1 e B2 - Cladosporium sp.; C1 e C2 - Penicillium sp.; D1 e D2 - Trichoderma sp.
Dos 35 isolados que produziram halo de degradação de celulose, 14 apresentaram I.E. ≥ 2,0 (Tabela 1), estes pertencentes aos gêneros Cladosporium (n= 4) e Penicillium (n= 10). Sendo o
Cladosporium sp. A3SA1 o que apresentou maior valor no índice (IE = 3,1). Estes gêneros de fungos, Cladosporium e Penicillium, são descritos como bons produtores de enzimas degradadoras de
celulose (SILVA et al 2015), principalmente, Penicillium spp., cujo tem se mostrado tão bom produtor de celulases quanto Trichoderma spp. (CARVALHO et al. 2014).
Quanto aos isolados do gênero Aspergillus, dois obtiveram I.E. menor que 1,9. Dos isolados pertencentes ao gênero Trichoderma, somente dois apresentaram atividade celulolítica e com I.E. de 1,0. Mesmo as espécies de Trichoderma serem reconhecidas como ótimas produtoras de celulases e
Trichoderma reesei Simmons ser um fungo celulolítico melhor caracterizado e o mais utilizado na
indústria para produção de celulases (KING et al., 2009), neste estudo os isolados deste gênero não demonstram este potencial.
Tabela 1 - Fungos isolados do intestino de larvas Stenochironomus (Diptera) inseto aquático fragmentador, da região Amazônica, Brasil. A tabela mostra a identificação morfológica dos isolados após o crescimento em meio sintético com carboximetilcelulose. I.E. = índice enzimático (índice médio ± desvio padrão, n = 3); (NI) = não foi possível identificar.
ISOLADO IDENTIFICAÇÃO I.E. ISOLADO IDENTIFICAÇÃO I.E.
A1SA1 Penicillium sp. 0,0 ±0,0 A3SA1 Cladosporium sp. 3,1 ±0,5
A1SA2 NI 0,0 ±0,0 A3SB1 NI 1,0 ±0,0
A1SA3 Penicillium sp. 1,4 ±0,2 A3SC1 NI 0,0 ±0,0 A1SA4 Penicillium sp. 1,4 ±0,0 A4SA1 Penicillium sp. 2,3 ±0,1 A1SB2 Penicillium sp. 2,4 ±0,0 A4SB1 NI 1,6 ±0,2 A1SB3 NI 0,0 ±0,0 A4SB2 Penicillium sp. 2,0 ±0,4 A1SC1 Trichoderma sp. 1,0 ±0,0 A4SB3 Penicillium sp. 1,8 ±0,4 A1SC3 Penicillium sp. 2,5 ±0,1 A4SC1 NI 1,9 ±0,1 A1SC4 Aspergillus sp. 0,0 ±0,0 A4SC2 Penicillium sp. 2,1 ±0,6 A1SC5 Aspergillus sp. 1,0 ±0,0 A5SB1 NI 2,0 ±0,2 A1SC6 Penicillium sp. 0,0 ±0,0 A5SB2 NI 2,5 ±0,1 A1SC7 Aspergillus sp. 1,8 ±0,0 A5SB3 Cladosporium sp. 2,9 ±0,4 A2SA1 Penicillium sp. 1,4 ±0,1 A5SC1 Cladosporium sp. 2,2 ±0,3 A2SA2 Penicillium sp. 2,1 ±0,8 A5SC2 NI 0,0 ±0,0 A2SA3 Penicillium sp. 1,1 ±0,1 A6SA1 NI 1,7 ±0,6 A2SA4 Penicillium sp. 2,8 ±0,8 A6SB1 Trichoderma sp. 0,0 ±0,0 A2SA5 Penicillium sp. 2,2 ±0,1 A7SA1 Trichoderma sp. 1,0 ±0,0 A2SA6 Penicillium sp. 0,0 ±0,0 A7SA2 Trichoderma sp. 1,0 ±0,0 A2SA7 Penicillium sp. 0,0 ±0,0 A7SB1 NI 1,9 ±0,3
A2SA8 NI 1,0 ±0,2 A7SC1 NI 0,0 ±0,0
A2SB1 Penicillium sp. 0,0 ±0,0 A8SD1 NI 1,1 ±0,0 A2SB2 Cladosporium sp. 2,0 ±0,5 A8SD2 NI 2,5 ±0,9 A2SB3 Penicillium sp. 2,0 ±0,3 A9SA1 NI 0,0 ±0,0 A2SC1 Penicillium sp. 1,0 ±0,0 A9SD1 Trichoderma sp. 0,0 ±0,0
A2SC2 Penicillium sp. 1,1 ±0,2
4 CONCLUSÃO
Foi possível isolar fungos filamentosos do trato intestinal de larvas de Stenochironomus e, evidenciar que estes são capazes de degradar celulose disponibilizada em meio sólido. Os isolados pertencentes aos gêneros Cladosporium e Penicillium apresentaram índices enzimáticos mais elevados (≥ 2,0) demonstrando que estas linhagens podem ter potencial para produção de enzimas do complexo celulolítico.
Tendo em vista a grande diversidade de fungos associados ao intestino de insetos, estudos para ampliar o conhecimento sobre esses organismos e conhecer as funções exercidas por estes são necessários para detectar novas fontes de celulases.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações - Fundo
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Ação Transversal - Redes Regionais de Pesquisa em Ecossistemas, Biodiversidade e Biotecnologia nº 79/2013. Chamada Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal - REDE BIONORTE, processo nº 407843/2013-2.
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