Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae)

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae). GERMANA FREIRE ROCHA CALDAS. RECIFE 2010.

(2) GERMANA FREIRE ROCHA CALDAS. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae). Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco,. como. requisito. parcial. para. obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador:. Prof.. Dr.. Almir. Gonçalves. Wanderley Co-orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa. Recife 2010.

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(4) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Reitor Amaro Henrique Pessoa Lins Vice-Reitor Gilson Edmar Gonçalves e Silva Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação Anísio Brasileiro de Freitas Dourado Diretor do Centro de Ciências da Saúde José Thadeu Pinheiro Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde Márcio Antonio de Andrade Coelho Gueiros Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Dalci José Brondani Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Antonio Rodolfo de Farias Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Pedro José Rolim Neto Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Beate Saegesser Santos.

(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Reitor Amaro Henrique Pessoa Lins Vice-Reitor Gilson Edmar Gonçalves e Silva Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação Anísio Brasileiro de Freitas Dourado Diretor do Centro de Ciências da Saúde José Thadeu Pinheiro Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde Márcio Antonio de Andrade Coelho Gueiros Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Dalci José Brondani Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Antonio Rodolfo de Farias Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Pedro José Rolim Neto Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Beate Saegesser Santos.

(6) Dedico aos meus pais Francisco e Francisca pelo amor, confiança e apoio incondicional. Em especial à minha querida e amada avó Helena (in memorian) por. todo amor,. companheirismo e exemplo de vida..

(7) AGRADECIMENTOS. A Deus, por me guiar pelos caminhos do bem e por colocar pessoas tão especiais no meu caminho. Ao Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley, por ter me recebido de braços abertos em seu laboratório, pela confiança em mim depositada, orientação, incentivo, amizade e disponibilidade durante todo o desenvolvimento desse trabalho. Ao Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa, por ter me dado a oportunidade de conhecer a ciência ainda em tempo de graduação. Obrigado por aceitar mais uma vez participar dos meus projetos, agora como co-orientador, e por todo conhecimento e atenção dispensados mesmo que a distância. A Lusani (Tia Lusa), grande mulher, madrinha, amiga e mais do que tudo uma mãe para mim; agradeço pela confiança, incentivo e apoio incondicional em todos os momentos da minha vida. A Ana Claudia (Tia Claudia), grande amiga, pelas palavras de incentivo em todos os momentos deste trabalho, assim como a todos os meus familiares sempre tão presentes e tão estimuladores do meu sucesso. A vovó Maria, por sempre me receber com um sorriso no rosto e me ensinar que nunca devemos desistir do que queremos. Ao meu querido namorado (quase esposo) Alexandre, por sempre acreditar nos meus ideais e mais ainda por sempre afirmar que tudo vai dar certo. Por todos os momentos de compreensão quando eu estive ausente e pela paciência nos meus momentos de humor inconstante. A Profa. Simone Sette Lopes Lafayette e a Profa. Maria do Carmo Corrêa de Araújo Fraga pela amizade, ensinamentos transmitidos e colaboração em muitos momentos..

(8) Ao meu querido professor e amigo Francisco Gilberto de Oliveira, que mesmo distante não deixou de me incentivar. Aos meus colegas do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia por todo auxílio e companheirismo que deram durante o tempo em que trabalhamos juntos. Em especial, a minha amiga Juciene (Ju) pelo carinho, companheirismo e parceria durante os experimentos, pessoa com a qual dividi grandes momentos e que vou guardar para sempre no meu coração. A Rejane, Nielson e Zenira, pela disponibilidade constante e enorme apoio técnico, a Sr. Fredson por ser sempre tão solícito e por nos proporcionar tantos momentos de descontração. Aos meus colegas do Laboratório de Pesquisas de Produtos Naturais - Ceará, pelo espírito de coletividade ao me permitirem exclusividade nos momentos de coleta do óleo essencial. Aos meus amigos da Pós-Graduação Aluizio, Kilmara e Lucas, pelos bons momentos de convivência desde o início do curso, e por sempre me atenderem quando eu me encontro perdida com alguma dúvida. A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela concessão da bolsa de estudo e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo suporte financeiro..

(9) “O futuro não é um lugar onde estamos indo, mas um lugar que estamos criando. O caminho para ele não é encontrado, mas construído e o ato de fazê-lo muda tanto o realizador quanto o destino”. Antoine de Saint-Exupéry.

(10) RESUMO A espécie Hyptis martiusii Benth. pertence à família Lamiaceae e cresce em abundância no nordeste brasileiro, onde é popularmente conhecida como cidreira-do-mato ou cidreira-brava. Suas folhas e raízes são tradicionalmente usadas na medicina popular no tratamento de doenças intestinais e estomáquicas. Caracteriza-se por fornecer um óleo essencial rico em compostos terpênicos, uma classe de compostos que tem demonstrado potencial atividade antiulcerogênica. Com base no interessante perfil fitoquímico desta espécie, este estudo teve como objetivo caracterizar os constituintes químicos e avaliar a possível ação antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii (OEHM) em modelos de úlceras experimentais in vivo em roedores. Foram utilizados modelos agudos de úlcera gástrica induzidos por indometacina, etanol absoluto e etanol acidificado. O volume, pH e acidez total do suco gástrico foram determinados pelo método da ligadura pilórica, e a motilidade gastrintestinal utilizando o método de esvaziamento gástrico e trânsito intestinal. A análise química do OEHM identificou 24 constituintes representando 92% e indicou a ocorrência de mono e sesquiterpenos. Foi observado que o OEHM (100, 200 e 400 mg/kg) administrado por via oral apresentou significativo efeito gastroprotetor dose-dependente nos modelos de lesões gástricas induzidas por etanol absoluto (70%), etanol acidificado e indometacina, indicando que ele exerce uma ação citoprotetora e que provavelmente atue aumentando os fatores de proteção da mucosa gástrica como muco e/ou bicarbonato. Quando administrado intraduodenalmente, aumentou o pH e diminuiu a acidez gástrica apenas com as maiores doses, porém não alterou o volume do suco gástrico; sugerindo que a diminuição da acidez gástrica envolve um mecanismo antissecretório, via receptores e/ou mediadores da célula parietal. O OEHM reduziu a taxa de esvaziamento gástrico apenas com as maiores doses, mas não apresentou influência sobre o trânsito intestinal em nenhuma das três doses administradas. Desta forma, conclui-se que o óleo essencial de Hyptis martiusii possui efeito gastroprotetor por um mecanismo de ação ainda não esclarecido, e que provavelmente este efeito possa estar relacionado à presença de terpenos. Palavras-chave: Hyptis martiusii, óleo essencial, gastroprotetor, úlcera..

(11) ABSTRACT The species Hyptis martiusii Benth. belongs to the family Lamiaceae and grows in abundance in northeastern Brazil, where is popularly known as cidreira-do-mato or cidreira-brava. Its leaves and roots are traditionally used in folk medicine in the treatment of intestinal and stomachic diseases. Characterized by providing an essential oil rich in terpene compounds, a class of compounds that has demonstrated potential antiulcer activity. Based on the interesting phytochemical profile of this species, this study aimed to characterize the chemical constituents and evaluate the possible antiulcerogenic action of essential oil from leaves of Hyptis martiusii (EOHM) in models of experimental ulcers in vivo in rodents. Were used acute models of gastric ulcer induced by indomethacin, absolute ethanol and acidified ethanol. The volume, pH and total acidity of gastric juice were determined by the pyloric ligature method and gastrointestinal motility using the method of gastric emptying and intestinal transit. Chemical analysis of EOHM identified 24 constituents representing 92% and indicated the existence of mono and sesquiterpenes. It was observed that EOHM (100, 200 and 400 mg/kg) administered orally showed significant gastroprotective effect dosedependent in the models of gastric lesions induced by absolute ethanol (70%), ethanol acidified and indomethacin, indicating that the EOHM exerts a cytoprotective and which probably acts by increasing the protective factors of gastric mucosa as mucus and/or bicarbonate. When administered intraduodenally, increased the pH and decreased the gastric acidity only with the highest doses, however not changed the volume of gastric juice, suggesting that the decrease in gastric acidity involves an anti-secretory mechanism, via receptors and/or mediators of parietal cell. The EOHM reduced the rate of gastric emptying with only the highest doses, but did not show influence on intestinal transit in neither of three doses. Thus, it is concluded that the essential oil of Hyptis martiusii has gastroprotective effect by a mechanism of action not yet unclear and probably this effect observed may be related to the presence of the terpenes. Keywords: Hyptis martiusii, essential oil, gastroprotective, ulcer..

(12) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO DA LITERATURA Figura 1. Exemplos de compostos monoterpênicos de ocorrência em óleos essenciais (Simões; Spitzer, 2002)............................................................................... 27. Figura 2. Exemplos de compostos sesquiterpênicos de ocorrência em óleos essenciais (Simões; Spitzer, 2002)............................................................................... 27. Figura 3. Hyptis martiusii Benth. destacando capítulos florais e folhas ..................... 31. Figura 4. Folhas secas e trituradas e óleo essencial de Hyptis martiusii.................... 31. ARTIGO: Antiulcerogenic activity of the essential oil of Hyptis martiusii Benth. (Lamiaceae) Figure 1. Chromatographic profile of essential oil from leaves of Hyptis martiusii by gas chromatograph coupled to a mass spectrometer.............................................. 52. Figure 2. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM: 100, 200 and 400 mg/kg, p.o.), vehicle (C: Tween 80 at 1%, 1 mL/100 g) and pantoprazole (P: 40 mg/kg, p.o.) on gastric lesions induced by administration of absolute ethanol (A) and HCl/ethanol (B)…………………………………………………………………. 53. Figure 3. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM: 100, 200 and 400 mg/kg, p.o.), vehicle (C: Tween 80 at 1%, 1 mL/100 g) and pantoprazole (P: 40 mg/kg, p.o.) on gastric lesions induced by indomethacin (30 mg/kg, s.c.)….............. 54. Figure 4. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM: 100, 200 and 400 mg/kg, p.o.), vehicle (C: Tween 80 at 1%, 1 mL/100 g) and pantoprazole (P: 40 mg/kg, p.o) on gastric secretion in rats……………................................................... 55. Figure 5. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM: 100, 200 and 400 mg/kg, p.o.), vehicle (C: Tween 80 at 1%, 1 mL/100 g) and atropine (A: 3 mg/kg, s.c.) on gastric emptying in rats……………………………………………………... 56. Figure 6. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM: 100, 200 and 400 mg/kg, p.o.), vehicle (C:Tween 80 at 1%, 1 mL/100 g) and atropine (A: 3 mg/kg, s.c.) on intestinal transit in rats…………………………………………………….... 57.

(13) LISTA DE TABELAS. ARTIGO: Antiulcerogenic activity of the essential oil from the leaves of Hyptis martiusii Benth. (Lamiaceae) Table 1. Chemical constituents of essential oil from leaves of Hyptis martiusii Benth.……………………………………………………………….…………….… 58 Table 2. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM) under gastric lesions induced by absolute ethanol and HCl/ethanol.…………….……..………… 59 Table 3. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM) under gastric lesions induced by indomethacin.……………………………….….….…………… 60 Table 4. Effect of essential oil from Hyptis martiusii (EOHM) on gastric secretion in rats subjected to pylorus ligature........................................................................... 61.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AINE. Anti-inflamatório não-esteroidal. B-16. Células de câncer de pele. CAT. Catalase. CEM. Células leucêmicas adultas. COX I. Ciclooxigenase I. COX II. Ciclooxigenase II. GC. Cromatografia gasosa. GPx. Glutationa peroxidase. GST. Glutationa S-transferase. H+/K+/ATPase. Bomba de prótons. HL-60. Células leucêmicas infantis. HTC-8. Células de câncer de colo. i.p.. Intraperitonial. i.d.. Intraduodenal. IR. Índice de retenção. MCF-7. Células de câncer de mama. MS. Espectroscopia de massa. NO. Óxido nítrico. NQO1. NAD(P)H quinona oxidoredutase 1. OEHM. Óleo essencial de Hyptis martiusii. OMS. Organização Mundial de Saúde. PGs. Prostaglandinas. ROS. Espécies reativas do oxigênio. s.c.. Via subcutânea. sec. Segundos. SOD. Superóxido dismutase. v.o.. Via oral.

(15) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 15. 2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................... 18. 2.1 Considerações sobre as úlceras pépticas.......................................................... 18. 2.1.1 Etiologia................................................................................................ 18. 2.1.2 Fatores protetores................................................................................... 19. 2.1.3 Modelos de ulcerogênese....................................................................... 21. 2.1.4 Terapêutica............................................................................................. 23. 2.2 Plantas medicinais ........................................................................................... 24. 2.3 Óleos essenciais............................................................................................... 25. 2.4 Hyptis martiusii Benth..................................................................................... 28. 3 OBJETIVOS............................................................................................................. 33. 3.1 Geral................................................................................................................. 33. 3.2 Específicos....................................................................................................... 33. 4 ARTIGO: Antiulcerogenic activity of the essential oil of Hyptis martiusii Benth. (Lamiaceae)..................................................................................................... 35. ABSTRACT........................................................................................................... 35. INTRODUCTION.................................................................................................. 36. MATERIAL AND METHODS............................................................................. 37. RESULTS.............................................................................................................. 42. DISCUSSION........................................................................................................ 44. ACKNOWLEDGEMENTS................................................................................... 47. REFERENCES...................................................................................................... 47. 5 CONCLUSÃO.......................................................................................................... 63. 6 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 65.

(16) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 1. Introdução.

(17) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 1 INTRODUÇÃO Há muito que as civilizações utilizam os recursos da natureza como matéria-prima na obtenção de cura ou alívio de diversas doenças. O conhecimento e o uso empírico das plantas medicinais pela população em virtude de seus efeitos terapêuticos vêm sendo acumulado durante séculos e em muitas comunidades e grupos étnicos ainda é considerado como o único recurso terapêutico (Di Stasi et al., 1996). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 85% da população dos países em desenvolvimento fazem uso de plantas medicinais para tratarem de problemas relacionados à atenção primária da saúde. No Brasil, mesmo não se tendo exatidão do número de pessoas que fazem uso de plantas, a sua utilização como recurso terapêutico é uma tendência e inclui desde o consumo da planta fresca e seus derivados, como também de medicamentos fitoterápicos (Carvalho et al., 2007). O uso da fitoterapia vem crescendo no Brasil, na ordem de 10 a 15% ao ano, podendo alcançar a mesma eficácia dos sintéticos e com redução dos efeitos colaterais (Ramos et al., 2005). Dos medicamentos sintéticos disponíveis, a população consome apenas 37%, dependendo quase que exclusivamente de medicamentos de origem natural (Stangarlin et al., 1999; Funari, Ferro, 2005). Estima-se que 50% do total dos fármacos empregados na terapêutica utilizados mundialmente na clínica sejam derivados de produtos naturais e que 25% das drogas descobertas em estudos com produtos naturais sejam oriundas de plantas superiores (Gurib-Fakim, 2006). O Brasil possui uma biodiversidade abundante se comparada a de outros países e o número de espécies alcança cerca de 20% do número total existente no planeta (Calixto, 2003). Da flora brasileira, menos de 5% das espécies representam a fitoterapia mundial, significando que um verdadeiro arsenal terapêutico de princípios ativos podem ser extraídos da natureza (Barata, 2005). Isso é um ponto importante no que se refere à capacidade de uso e aproveitamento dos recursos biológicos que nos são oferecidos. Dentre as diversas fontes de novas moléculas farmacologicamente ativas, as plantas medicinais são consideradas uma importante fonte de moléculas para o tratamento da úlcera gástrica (Schmeda-Hirschmann; Yesilada, 2005). Publicações recentes demonstram que diversas plantas e substâncias isoladas têm se mostrado promissoras no tratamento de desordens gástricas por apresentarem potencial atividade gastroprotetora (Andreo et al., 2006; Pertino et al., 2007; Falcão et al., 2008; Moraes et al., 2009; Hiruma-Lima et al., 2009), tais 15.

(18) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. compostos apresentam estruturas químicas diversas e atuam por diferentes mecanismos de ação (Schmeda-Hirschmann; Yesilada, 2005). A úlcera péptica é uma doença comum, de alta incidência clínica e cuja etiologia é influenciada por um desequilíbrio entre os vários fatores agressivos e defensivos da mucosa, acentua-se negativamente quando é afetada por fatores como estresse, cigarro, uso abusivo de álcool, deficiências nutricionais e ingestão contínua de anti-inflamatório do tipo nãoesteroidal (Belaiche et al., 2002). A terapêutica atual, baseada na inibição da secreção ácida gástrica por antagonistas de receptores histaminérgico do tipo H2 e inibidores da bomba de prótons, tem sido associada a um aumento na taxa de cura dos casos de úlceras (Orlando et al., 2007). Contudo, além do tratamento apresentar um alto custo dificultando o uso por populações de baixa renda, o uso prolongado dessas drogas provoca efeitos colaterais graves e quase sempre leva o paciente à desistência do tratamento. Nesse contexto fica evidente a importância de estudos que investiguem o potencial antiulcerogênico de plantas medicinais ou de seus compostos isolados, como alternativas capazes de atenuar os efeitos agressivos das úlceras. Neste trabalho foi avaliado o efeito gastroprotetor da espécie Hyptis martiusii, espécie popularmente conhecida como cidreira-do-mato e que fornece um óleo essencial de composição química rica em compostos terpênicos, os quais são descritos na literatura como possuidores de diversas propriedades medicinais, inclusive atividade gastroprotetora. Considerando a escassez de estudos realizados com esta espécie e que a população a utiliza com fins medicinais para o tratamento de doenças intestinais e estomáquicas; o estudo se concentrou na caracterização química do óleo essencial de Hyptis martiusii e na avaliação da atividade antiulcerogênica em modelos agudos de lesões gástricas, assim como foram avaliadas também a influência do óleo na atividade anti-secretória gástrica basal e na motilidade gastrointestinal.. 16.

(19) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 2. Revisão de Literatura. 17.

(20) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 2.1 Considerações sobre as úlceras pépticas 2.1.1. Etiologia Em condições fisiológicas normais, o estômago apresenta um balanço entre os fatores. agressores (ácido clorídrico, pepsina, enzimas digestivas, bile, gastrina e histamina) e os mecanismos protetores (muco, bicarbonato, microcirculação da mucosa, motilidade, prostaglandinas, óxido nítrico, regeneração celular e fator de crescimento epidermal), portanto não ocorrendo nenhum dano significativo à mucosa (Arrieta et al., 2003; Wallace, 2005; Lima et al., 2006). As úlceras pépticas são lesões no trato gastrointestinal que geralmente ocorrem no estômago e duodeno sendo caracterizadas por danos na mucosa secundários a ação agressiva dos sucos ácido-pépticos (Ramakrishnan; Salinas, 2007). Em geral são provocadas quando há um desequilíbrio do meio, que pode ser ocasionado por aumento dos fatores agressores ou por diminuição da resistência gástrica, trazendo como conseqüências irritação, ulceração da mucosa e sangramento (Sairam et al., 2002). Há muito que a presença de ácido no estômago é associada como causa da úlcera péptica, no entanto, sua presença exclusiva é condição necessária, mas não suficiente para o desenvolvimento da úlcera, uma vez que a maioria das pessoas produz grandes quantidades de ácido e não desenvolvem úlceras (Gustafson; Welling, 2010). Atualmente, sabe-se que vários fatores estão envolvidos no seu aparecimento, entre eles se incluem a infecção por Helicobacter pylori, uso crônico de anti-inflamatório do tipo não-esteroidal (AINE), uso de outros fármacos como corticosteróides, bisfosfonatos, anticoagulantes e quimioterápicos, isquemia da mucosa gástrica, idade, fatores genéticos e até o estilo de vida que engloba o estresse, uso abusivo de álcool, tabagismo e hábitos alimentares (Baggio et al., 2003; Newton, 2005; Dembinski et al., 2005; Jainu, Devi, 2006; Stewart, Ackroyd, 2008). Outras causas raras específicas como o estado de hipersecreção gástrica (síndrome de Zollinger-Ellison), doença de Crohn, doença de Behcet’s com envolvimento gastroduodenal, úlceras malignas não diagnosticadas, infecções virais (citomegalovírus) ou infecções por outra. 18.

(21) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Helicobacter (Helicobacter heilmannii) também podem ser responsáveis pelo surgimento das úlceras pépticas (Chow, Sung, 2009; Malfertheiner et al., 2009). Diversos estudos têm evidenciado que a prevalência dos casos de úlceras pépticas e suas complicações como hemorragia, perfuração ou obstrução gástrica, podem ocorrer em qualquer idade, mas se mostram mais acentuados na população acima de 50 anos, fato que pode estar relacionado à infecção por H. pylori, a ingestão de álcool, fumo e ao uso contínuo de AINE (Hallas et al., 2007; Ramakrishnan, Salinas, 2007). 2.1.2. Fatores protetores A mucosa gástrica se utiliza de vários mecanismos defensivos na busca pela. manutenção da sua integridade contra a agressão provocada pelo ácido clorídrico, pepsina, bile, AINE, entre outros. A capacidade de certos fatores endógenos em promover a proteção da mucosa por meio de mecanismos adicionais, não relacionados à inibição da secreção gástrica é conhecida como “citoproteção gástrica” (Martin; Wallace, 2006). Constituem os principais fatores protetores da mucosa, o muco, o bicarbonato, as prostaglandinas, o fluxo sanguíneo adequado da mucosa, a somatostatina, o óxido nítrico e os compostos sulfidrílicos (Tsukimi et al., 2001; Sairam et al., 2002). A primeira linha de defesa contra o ácido é o muco que juntamente com o bicarbonato formam uma camada contínua sobre o epitélio gástrico servindo de barreira contra autodigestão (Allen; Flemström, 2005). O muco recobre toda a mucosa gástrica e se apresenta na forma de um gel viscoso, elástico, aderente, transparente que contém água (95%) e glicoproteínas (5%). Atua prevenindo a colonização bacteriana, é capaz de agir como antioxidante reduzindo os danos causados pelos radicais livres na mucosa, protege a mucosa contra as forças mecânicas da digestão, retendo água e diminuindo a difusão de íons H+ da luz para a membrana apical das células parietais, além de lubrificar a superfície gástrica (Repetto; Llesuy, 2002). O bicarbonato (íon HCO3-) é secretado pelas células superficiais do estômago e pelas glândulas de Bruuner no duodeno. Está presente abaixo ou na camada mucosa, assim há a neutralização dos íons H+ que se difundem na superfície da mucosa, quando a mesma fica em contato com o líquido que contém pH elevado em relação a luz do estômago. Qualquer fator que diminua a disponibilidade de HCO3- pode aumentar a vulnerabilidade da mucosa ao ácido (Wallace; Granger, 1996). 19.

(22) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. O fluxo sangüíneo na mucosa gástrica por meio de diversos eventos contribui para a manutenção da integridade do estômago. A microcirculação protege a mucosa ao suprí-la com quantidades suficientes de oxigênio, nutrientes e hormônios, além de participar da remoção de íons H+, da produção de muco, secreção de bicarbonato, remoção, diluição e neutralização dos produtos do metabolismo celular e de substâncias tóxicas que se difundem do lúmen (Kawano, Tsuji, 2000; Martin, Wallace, 2006). As prostaglandinas e o óxido nítrico representam uns dos mais importantes mediadores locais e, em condições basais, participam na modulação de muitas funções celulares exercendo um papel protetor em várias condições fisiopatológicas como doenças vasculares, lesões gástricas, disfunção erétil e processos de memória e aprendizagem (Mollace et al., 2005). As prostaglandinas (PGs) são sintetizadas a partir de diferentes ácidos graxos essenciais, entre eles, o ácido araquidônico (AA), do qual derivam as prostaglandinas conhecidas como da série-2, e incluem a prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina D2 (PGD2), prostaglandina I2 (PGI2), prostaglandina F2α e tromboxano A2 (TXA2) (Chiba et al., 2008). A geração contínua das PGE2 e PGI2, principais prostaglandinas sintetizadas pela mucosa gástrica, é crucial para manutenção da integridade da mucosa. Elas atuam por diferentes efeitos, tais como a inibição da secreção ácida, estimulação da secreção de muco e bicarbonato, inibição da apoptose, aumento ou manutenção do fluxo sangüíneo da mucosa e citoproteção do trato gastrointestinal (Atay et al., 2000; Takeuchi et al., 2001; Martin, Wallace, 2006; Laine et al., 2008). O óxido nítrico (NO) é sintetizado pela NO-síntase (NOs) a partir de oxigênio (O2) e L-arginina (Khattab et al., 2001, Wang et al., 2008). Devido a sua habilidade de aumentar o fluxo sangüíneo da mucosa gástrica, regular a produção de muco e inibir a agregação de neutrófilos às células endoteliais, tem sido relatado como um modulador fundamental na integridade da mucosa gástrica juntamente com as PGs endógenas (Takeuchi et al., 2001; Tanaka et al., 2001; Khalifa et al., 2002). Os compostos sulfidrílicos não-protéicos atuam como gastroprotetores ao limitar a produção de radicais livres e possibilitar a produção e manutenção do muco unindo suas subunidades por pontes dissulfeto. Uma vez que esses grupamentos são bloqueados, as pontes são rompidas e o muco torna-se mais solúvel, ficando a barreira mucosa mais susceptível a agentes nocivos (Avila et al., 1996). O aumento significativo desses grupamentos promove a gastroproteção (Sener-Muratoglu et al., 2001). 20.

(23) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. A somatostatina é um peptídeo inibitório liberado pelas células D da mucosa antral e oxíntica do estômago. Promove a inibição da secreção ácida por dois mecanismos, um que atua diretamente sobre as células parietais e o outro que atua indiretamente inibindo a secreção de histamina das células enterocromafins (ECL) e de gastrina das células G (Komasaka et al., 2002). São importantes também as defesas antioxidantes que protegem a mucosa contra o estresse oxidativo causados pelas espécies reativas de oxigênio (ROS), como por exemplo, o ânion superóxido (O2-), radical hidroxila (OH) e peróxido de hidrogênio (H2O2), e incluem glutationa e outras moléculas de baixo peso molecular e as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx). Outras enzimas, como a NAD(P)H quinona oxidoredutase 1 (NQO1) e a glutationa S-transferase (GST), também protegem as células contra o estresse oxidativo (Matés, 2000). Em condições fisiológicas normais, esses mecanismos de defesa atuam mantendo baixos os níveis de radicais livres na célula (Michiels et al., 1994). A SOD remove os ânions superóxidos do ambiente celular pela conversão de dois radicais superóxidos em peróxido de hidrogênio oxigênio (Fattman et al., 2003). A CAT contém um grupamento heme no seu sítio ativo responsável pela sua atividade catalítica, onde duas moléculas de H2O2 são transformadas em duas de H2O e O2 (Michiels et al., 1994; Matés, 2000). A GPx possui um papel crítico na defesa contra o estresse oxidativo pois também pode catabolisar o H2O2 e se apresenta de dois tipos; como GPx dependente de selênio (Se) sendo capaz de reduzir o H2O2 e hidroperóxidos orgânicos e como GPx independente de Se, sendo inativa com o H2O2 só catalisando a redução de hidroperóxidos orgânicos (Matés, 2000; Cnubben et al., 2001). 2.1.3. Modelos de Ulcerogênese É possível observar a ulcerogênese experimentalmente por meio de diversos modelos. nos quais se utilizam diferentes indutores como os AINE entre eles indometacina, piroxicam e ácido acetilsalicílico (Konturek et al., 1984; Avila, 1996; Rao et al., 2000; Sairam et al., 2002), etanol (Robert et al., 1979), etanol acidificado (Mizui; Douteuchi, 1983) e ácido acético (Takagi et al., 1969). Esses modelos são frequentemente utilizados porque incluem os agentes etiológicos mais comuns na doença da úlcera péptica humana e reproduzem em animais lesões gástricas similares as observadas em humanos. 21.

(24) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Os AINEs embora sejam amplamente utilizados no tratamento de diversas doenças ainda são considerados um problema devido suas propriedades agressivas sobre o trato gastrintestinal, as quais incluem dispesia, erosões, úlceras pépticas e complicações como sangramento e perfuração da mucosa gástrica (Kim, 2008). Os danos na mucosa estão associados à capacidade dos AINEs em inibir a ciclooxigenase (COX), expressa em grandes quantidades no trato gastrointestinal e responsável por manter a integridade da mucosa pela geração contínua de prostaglandinas. Tal inibição suprime consequentemente a síntese das PGs; além disso, provoca danos ao endotélio vascular, redução do fluxo sangüíneo, formação de trombos e ativação de neutrófilos (Lu, Grahan, 2006; Barbastefano et al., 2007). A indometacina e outros AINEs como o piroxicam e o ácido acetilsalicílico são conhecidos por atuarem induzindo a lesão na mucosa gástrica. Eles inibem a produção de PGs, o que resulta em aumento da produção de ácido e esgotamento do conteúdo de prostaglandinas citoprotetoras endógenas, diminuindo a citoproteção gástrica promovida pela secreção de muco e bicarbonato no lúmem gástrico (Wallace, Devchand, 2005; Konturek et al., 2005). A indução de lesões da mucosa gástrica por etanol absoluto e ácido clorídrico (HCl) tem sido relatada por envolver a depressão dos mecanismos de defesa gástrica e a estase do fluxo sanguíneo gástrico, que contribui para uma intensificação das lesões e o desenvolvimento dos aspectos necro-hemorrágicos do tecido (Andreo et al., 2006). O etanol é capaz de destruir as células da mucosa independentemente da secreção ácida seja por contato direto ou indireto (Robert et al., 1979) promovendo distúrbios na microcirculação da mucosa, aparecimento de radicais livres, aumento da peroxidação lipídica, diminuição dos grupamentos sulfidrílicos não-protéicos (GSH) e da produção de muco gástrico e inibição de prostaglandinas (Szabo, Vincze, 2000; Abdel-Salam et al., 2001). O etanol atua destruindo as células epiteliais no estômago, provocando a infiltração de células inflamatórias que por fim produzem vasoconstrição, edema submucoso e lesões hemorrágicas (Park et al., 2004). A indução de úlceras gástricas por ácido acético consiste no modelo em que a úlcera e o processo de reparação mais se assemelham aos observados em humanos. O ácido acético provoca um aumento no volume de ácido, principal responsável pela necrose da mucosa e obstrução pilórica (Takagi et al., 1969; Okabe, Agamase, 2005). Outro método utilizado como parâmetro na avaliação da atividade antiulcerogênica é o método da ligadura pilórica, por meio dele é possível avaliar o efeito sistêmico de substâncias com potencial efeito gastroprotetor e sua interferência sobre parâmetros da secreção ácida 22.

(25) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. como volume, pH e acidez total. A obstrução promovida pela ligadura pilórica causa acúmulo de ácido no conteúdo gástrico e distensão exagerada da mucosa, consequentemente levando a uma hipersecreção gástrica e à formação de úlceras. Acredita-se que esta hipersecreção ácida seja estimulada por reflexo vago-vagal, que estimula a secreção do hormônio gastrina, cuja função no trato gástrico é estimular as células parietais a secretar HCl; no entanto, os mecanismos envolvidos ainda não são completamente esclarecidos (Baggio et al., 2003; Andreo et al., 2006). 2.1.4. Terapêutica Apesar dos avanços na compreensão da etiologia, nas modalidades de diagnóstico e na. disponibilidade de modernos tratamentos farmacológicos dos sintomas dispépticos, a úlcera péptica e suas complicações ainda continuam sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo (Yuan et al., 2006; Birdane et al., 2007). A doença afeta milhões de pessoas em todo mundo, só nos Estados Unidos aproximadamente 500 mil pessoas desenvolvem úlceras pépticas a cada ano. Os custos diretos ou indiretos de cuidados da doença são estimados em cerca de US$ 10 bilhões (Ramakrishnan; Salinas, 2007). Os fatores de risco predominantes na úlcera péptica permanecem sendo a Helicobacter pylori e o uso de anti-inflamatório do tipo não-esteroidal. Mais de 50% da população mundial tem infecção crônica da mucosa gástrica por H. pylori, mas somente 5-10% dos infectados desenvolvem úlceras (Malfertheiner et al., 2009). Nesses casos a H. pylori é responsável em até 95% das úlceras duodenais e 70% das úlceras gástricas (Napolitano, 2009). A incidência de úlceras relacionadas a esse agente tem diminuído nos últimos anos e, em contrapartida, a proporção de pacientes com úlceras atribuídas ao uso contínuo de AINE e agentes antiplaquetários subiram (Chow; Sung, 2009). A terapêutica atual é baseada na inibição da secreção ácida gástrica por meio de antagonistas de receptores histaminérgico do tipo H2, inibidores da bomba de prótons, antimuscarínicos, bem como terapia ácido-independente provida por antimicrobianos contra o Helicobacter pylori, sucralfato e bismuto (Bighetti et al., 2005). Contudo, o uso prolongado dessas drogas além de produzir reações adversas como hipersensibilidade, arritmia, impotência, ginecomastia e mudanças hematopoiéticas (Chan, Leung, 2002; Yuan et al., 2006), pode também aumentar o risco de desenvolvimento de câncer (La Vechia, Tavani, 2002; Raghunath et al., 2005). 23.

(26) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Dados da literatura demonstram que o tratamento da úlcera péptica enfrenta problemas como diminuição na eficácia da erradicação da H. pylori, ineficácia da atual terapêutica na prevenção e reincidência de úlceras em pacientes usuários de AINE, assim como nos casos de úlceras gástricas não associadas à utilização de AINE e à presença da H. pylori (Yuan et al., 2006). Segundo Fan et al. (2005) a úlcera péptica é uma doença comum de elevada incidência clínica e que apresenta recidivas. Enquanto a taxa de cura está em torno dos 95%, a taxa de recidivas da doença está entre 65 – 80 % dentro de um ano após o tratamento e cerca de 100% após dois anos. Sendo esse o caso, fica evidente a importância de experimentos que avaliem a atividade farmacológica de compostos que possam prevenir o seu aparecimento e/ou controlar seus efeitos agressivos ao homem. O desenvolvimento de novas drogas a partir de compostos obtidos de plantas pode possibilitar um conhecimento mais detalhado a cerca dos mecanismos desencadeadores da úlcera assim como, alternativas de controle no processo de reparação das mesmas. 2.2 Plantas medicinais As lesões gastrintestinais vêm tornando-se um dos principais focos de investigações experimentais e clínicas, adquirindo ênfase comercial para desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (Whittle, 2004). Historicamente, muitas espécies de plantas tidas popularmente como medicinais foram introduzidas nas primeiras farmacopéias por apresentarem características terapêuticas marcantes no tratamento dos distúrbios gastrointestinais. Uma grande variedade de substâncias químicas isoladas, mistura de ervas e extratos tiveram suas atividades terapêuticas comprovadas de plantas em modelos experimentais de indução de úlcera (Zayachkivska et al., 2005; Schmeda-Hirschmann; Yesilada, 2005). Segundo Lewis e Hanson (1991), destacam-se como principais classes de compostos com atividade antiulcerogênica os terpenos, triterpenos, flavonóides, compostos fenólicos, taninos, alcalóides, glicosídeos, saponinas e polissacarídeos. Estes compostos apresentam atividade antiulcerogênica por possivelmente atuarem estimulando os fatores de proteção da mucosa gástrica, aumentando a produção de prostaglandinas e/ou estimulando a secreção de muco e bicarbonato (Hiruma-Lima et al., 2002a). O que possibilita considerar as plantas medicinais e seus princípios ativos como. 24.

(27) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. fontes potenciais de novas moléculas farmacologicamente ativas, que poderão vir a ser úteis na descoberta de novas terapêuticas para o tratamento das úlceras pépticas. 2.3 Óleos essenciais Os óleos essenciais são princípios encontrados em várias espécies vegetais, podem receber diferentes designações tais como óleos “voláteis, aromáticos ou etéreos” de acordo com suas características físico-químicas (Siani et al., 2000). Segundo Bakkali et al. (2008), atualmente cerca de 3000 óleos essenciais são conhecidos, dos quais 300 são comercialmente importantes, especialmente para a indústria de produtos farmacêuticos, sanitários, cosméticos, agrícolas, alimentos e perfumaria. De acordo com a família a que pertence às espécies, os elementos voláteis podem estar concentrados em órgãos anatômicos específicos, tais como flores, folhas, cascas do caule, madeira, raízes, rizomas, frutos e sementes, podendo variar na sua composição de acordo com a localização em uma mesma espécie (Dorman; Deans, 2000). Outros fatores podem interferir também na composição do óleo essencial de uma mesma espécie vegetal, dentre os quais se incluem: a época de coleta, condições climáticas e de solo, localização geográfica, ciclo vegetativo da espécie e processo de obtenção (Simões, Spitzer, 2002; Gottlieb, 1987 apud Fabrowski, 2002; Zygadlo, Juliani, 2003). Na natureza a produção de óleos pelas plantas se faz necessária, uma vez que eles desempenham importantes funções como agentes antibacterianos, antivirais, antifúngicos, inseticidas e contra o ataque de herbívoros, as plantas os utilizam também na atração de insetos e outros agentes fecundadores (Bakkali et al., 2008). Os óleos essenciais em geral são líquidos, no entanto, podem apresentar-se como sólidos ou semi-sólidos à temperatura ambiente, se evaporam quando expostos ao ar em temperatura ambiente, a maioria é transparente, incolor ou fracamente amarelado, e apresentam um sabor acre e picante. Na presença de luz, calor, umidade, ar e metais são instáveis devendo ser acondicionados em recipientes de cor âmbar, hermeticamente fechados e em lugar fresco e seco (Matos, Matos, 1989; Bakkali et al., 2008). Diferentes métodos podem ser aplicados para obtenção de óleo essencial a partir de plantas aromáticas tais como a extração por enfloração (Enfleurage), destilação pelo vapor, extração por diferentes solventes apolares tais como éter, éter de petróleo e diclorometano, por gás carbônico (CO2) supercrítico ou por prensagem (Simões, Spitzer, 2002; Bakkali et al., 25.

(28) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 2008). Entre esses métodos a destilação por arraste de vapor d’água é mais frequente, como os óleos possuem tensão de vapor mais elevada que a da água, eles são arrastados pelo vapor e então condensados por resfriamento (Barbosa, 2003). A maior parte dos óleos essenciais consiste numa mistura complexa de princípios ativos que variam na sua composição química. Pode-se encontrar cerca de 20 - 60 componentes em concentrações muitos diferentes, bem como a presença de dois ou três destes constituintes em concentrações relativamente elevadas. Em geral tais componentes determinam as propriedades biológicas do óleo (Bakkali et al., 2008). Quimicamente os óleos essenciais são constituídos de derivados de fenilpropanóides, provindos do ácido chiquímico, grupo que incluem compostos aromáticos e alifáticos tais como hidrocarbonetos, alcoóis, ésteres, éteres, aldeídos, cetonas, lactonas, fenóis, éteres fenólicos, entre outros (Guenther, 1972; Dorman, Deans, 2000); ou de terpenóides originados a partir do ácido mevalônico, cujos compostos derivam da condensação de um número variável de unidades pentacarbonadas conhecidas por unidades isoprênicas (C5) e se classificam de acordo com o número dessas unidades em monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40). Os constituintes majoritários dos óleos essenciais são os monoterpenos (Figura 1) e os sesquiterpenos (Figura 2). Os monoterpenos são as moléculas mais representativas constituindo cerca de 90% e permitem uma grande variedade de estruturas (Bakkali et al., 2008).. 26.

(29) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. O. OH. terpinoleno. mentol. cânfora. limoneno. O O. O. fenchona. mirceno. nepetalactona. α-pineno. Figura 1. Exemplos de compostos monoterpênicos de ocorrência em óleos essenciais (Simões; Spitzer, 2002). OH nerolidol. HO. farnesol. γ-bisaboleno. β-cariofileno. CO2H. ácido abscísico. β-selineno. Figura 2. Exemplos de compostos sesquiterpênicos de ocorrência em óleos essenciais (Simões; Spitzer, 2002). 27.

(30) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Do ponto de vista biológico, os compostos terpênicos demonstram uma variedade de propriedades medicinais interessantes dentre elas a atividade gastroprotetora. O potencial antiulcerogênico de diversos terpenóides já foi avaliado cientificamente, entre eles estão o ácido oleanólico – triterpeno (Astudillo et al., 2002), a trans-crotonina – lactona sesquiterpênica. (Hiruma-Lima et al., 2002b), a onodorpicrina – lactona sesquiterpênica. (Almeida, 2005), ferruginol – diterpeno (Rodriguez et al., 2006), ácido acetil-aleuritólico – triterpeno (Pertino et al., 2007) e limoneno – monoterpeno (Moraes et al., 2009). 2.4 Hyptis martiusii Benth. A família Lamiaceae, compreende cerca de 250 gêneros e 6970 espécies (Judd et al., 1999), as quais possuem hábito heterogêneo onde se incluem ervas, arbustos ou árvores; de distribuição cosmopolita, mas centrada, principalmente, na região mediterrânea onde constitui parte integrante da vegetação (Bordignon, 1990). Dentre os representantes desta família, as espécies do gênero Hyptis vêm sendo amplamente estudadas do ponto de vista etnofarmacológico, farmacológico e químico, principalmente devido à diversidade de constituintes bioativos encontrados nos óleos essenciais aromáticos e extratos, os quais possuem efeitos biológicos interessantes. A química da família Lamiaceae, em especial a do gênero Hyptis é de notável variabilidade, estão presentes compostos como flavonóides, lactonas, lignanas, alguns derivados fenólicos e ácidos graxos (Falcão e Menezes, 2003). Nos óleos os compostos terpenoídicos parecem ser os principais responsáveis pela atividade citotóxica e incluem diferentes monoterpenos, diterpenos, triterpenos e sesquiterpenos, sendo os triterpenos considerados componentes majoritários (Menezes, 1994; Falcão et al., 2003). Outras substâncias também foram relatadas tais como hidrocarbonetos, ácidos graxos, esteróides entre outras (Falcão e Menezes, 2003). Várias espécies desse gênero têm importante ação farmacológica como anestésico, antiespasmódico, anti-inflamatório, além de abortivo em doses elevadas (Di Stasi et al., 1996), antiplasmódica (Chukwujekwu et al., 2005), antidepressiva (Bueno et al., 2006), antinociceptivo e antiedematogênica (Lisboa et al, 2006). Algumas espécies são usadas no tratamento de infecções gastrointestinais, câimbras e dores, no tratamento de infecções de pele, bem como apresentam efeito antigripal (Corrêa, 1931; Septimio, 1994; Morais et al., 2005). 28.

(31) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Muitos dos óleos aromáticos são usados pela população como alternativa terapêutica e já possuem atividade farmacológica comprovada por vários estudos (Falcão, 2003). Foram comprovadas atividades inseticida (Araújo et al., 2003), larvicida (Costa et al., 2005), antisséptica (Pereda-Miranda et al.,1993), antifúngica (De Oliveira et al., 2004), antibacteriana (Souza et al., 2003), antinociceptiva (Menezes et al., 2007) e antiulcerogênica (Lee et al., 1988; Barbosa, Ramos, 1992) dentre outras. A espécie Hyptis martiusii Benth. pertence à família Lamiaceae, sendo popularmente conhecida como cidreira-do-mato ou cidreira-brava. Segundo Martius (1864, apud Silveira; Pessoa, 2005) esta espécie é descrita como um arbusto ereto e ramoso, de 1,6 - 2,3 m de altura, suas flores são delicadas, brancas e reunidas em inflorescências globulosas terminais (Figura 3). Sua ocorrência se dá no norte, sudeste e nordeste do Brasil. No nordeste cresce em abundância, encontrando-se amplamente disseminada no Sul do Ceará, na Chapada do Araripe (Silveira; Pessoa, 2005) e no estado do Pernambuco onde sua ocorrência vai desde a zona da mata à zona de caatinga (Almeida; Albuquerque, 2002). As partes mais utilizadas com fins medicinais pela população são as folhas e raízes; a infusão ou decocção das folhas é usada contra doenças intestinais e estomáquicas, enquanto as raízes em decocto são usadas contra inflamações de ovário (Agra et al., 2008). A espécie H. martiusii caracteriza-se por ser potencialmente fornecedora de óleos essenciais aromáticos, a exemplo de outras espécies de Hyptis (Figura 4). Em investigações realizadas anteriormente por Araújo et al. (2003), relatou-se a composição química do óleo essencial obtido por hidrodestilação, a partir das folhas e flores frescas, tendo sido identificados 26 constituintes representando 93,2% do óleo essencial das folhas e 27 constituintes representando 87,7% do óleo essencial das inflorescências. A composição do óleo essencial das folhas de H. martiusii é constituída por mono e sesquiterpenóides, apresentando como componentes majoritários o 1,8-cineol (24,3%), δ-3careno (22,5%), biciclogermacreno (6,3%) e o β-cariofileno (6,2%); enquanto nas inflorescências o óleo tem como componentes δ-3-careno (13,5%), viridifloreno (8,3%), βcariofileno (6,6%), α-pineno (5,8%) e germacreno B (5,21%) (Araújo et al., 2003). A partir de métodos cromatográficos convencionais, alguns destes constituintes já foram isolados e submetidos à avaliação toxicológica. Araújo et al. (2003) comprovaram o efeito inseticida do óleo essencial e do composto isolado 1,8-cineol, obtidos a partir das folhas de H. martiusii, contra larvas Bemisia argentifolii e de Aedes aegypti. Essa atividade inseticida contra o Aedes aegypti foi confirmada posteriormente por Costa et al. (2005), que 29.

(32) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. também relataram pela primeira vez a atividade do óleo essencial das folhas contra as larvas de Culex quinquefasciantus. Dentre outros compostos já isolados de Hyptis martiusii, destacam-se dois diterpenos abietanos, denominados carnasol e 11,14-diidroxi-8,11,13-abietatrieno-7-ona; ambos isolados do extrato hexânico das raízes com comprovado efeito antiproliferativo em certas linhagens de células tumorais (HL-60, CEM, HTC-8, MCF-7 e B-16) e sobre o crescimento de ovos de ouriço-do-mar (Costa-Lotufo et al., 2004) apresentando baixa toxicidade para a célula. Das raízes também foi relatada recentemente a atividade citotóxica de dois outros diterpenos, o novo 7β-hidroxi-11,14-dioxoabieta-8,12-dieno e o já conhecido 7α-acetoxi-12-hidroxi-11,14dioxoabieta-8,12-dieno, sobre cinco linhagens de células de tumorais, tal atividade pode estar relacionada à inibição da síntese de DNA (Araújo et al., 2006). Em estudo realizado por Coutinho et al. (2008), o extrato etanólico das folhas de Hyptis martiusii apresentou comprovado efeito antibacteriano, podendo ser usado como um agente anti-Staphylococcus. Apesar de a família Lamiaceae ter sua química e farmacologia bem estudada, muitas espécies ainda são inéditas sob esses aspectos. Poucos relatos farmacológicos sobre H. martiusii foram encontrados na literatura e nenhum que relate a atividade antiulcerogênica do óleo essencial da espécie. Estes dados reforçam ainda mais a importância deste estudo quando se considera a agregação de valores terapêuticos ao óleo de H. martiusii.. 30.

(33) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Figura 3. Hyptis martiusii Benth. (A), destacando capítulos florais e folhas (B).. Figura 4. Folhas secas e trituradas (C) e óleo essencial de Hyptis martiusii (D).. 31.

(34) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 3. Objetivos. 32.

(35) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 3 OBJETIVOS 3.1 GERAL Avaliar a atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth. 3.2 ESPECÍFICOS Caracterizar os constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii; Avaliar a atividade antiulcerogênica, in vivo, do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii, através de modelos agudos de úlcera induzidos por etanol; HCl/etanol e indometacina; Investigar a atividade antissecretória ácida gástrica basal do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii, pelo método da ligadura pilórica; Avaliar as alterações na motilidade gastrointestinal utilizando os métodos de esvaziamento gástrico e trânsito intestinal.. 33.

(36) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 4. Artigo Artigo submetido ao Journal of Ethnopharmacology. 34.

(37) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. Antiulcerogenic activity of the essential oil of Hyptis martiusii Benth. (Lamiaceae) Germana Freire Rocha Caldasa, Juciene Bezerra Rodrigues da Silvaa, Rafaella Farias da Nóbregab, Iggor Macêdo do Amaral Costab, Fabíola Fernandes Galvão Rodriguesc, José Galberto Martins da Costac, Almir Gonçalves Wanderleya,b* a. Department of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pernambuco, Zip Code 50740-521, Recife - PE, Brazil b Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Pernambuco, Zip Code 50670-901, Recife - PE, Brazil c Laboratory of Research in Natural Products, Department of Biological Chemistry, Regional University of Cariri, Zip Code 63105-100, Crato - CE, Brazil *Corresponding author at: Department of Physiology and Pharmacology, CCB, University Federal of Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50670-901 – Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil – Tel.: +55 81 21268530; fax.: +55 81 21268976. E-mail address: almirgw@globo.com.br (A. G. Wanderley). ABSTRACT Ethnopharmacology relevance: Hyptis martiusii (Lamiaceae) grows in abundance in the northeastern Brazil where is popularly known as cidreira-do-mato or cidreira-brava. Its leaves and roots are traditionally used in folk medicine in the treatment of intestinal and stomachic diseases. Aim of the study: To characterize the chemical constituents, to evaluate the antiulcerogenic activity of essential oil from leaves of Hyptis martiusii (EOHM) in models of experimental ulcers in vivo in rodents. Materials and Methods: Were used models of acute gastric ulcer induced by oral administration of indomethacin, absolute ethanol and acidified ethanol. The volume, pH and total acidity of gastric secretion were determined by the pyloric ligature method and the gastrointestinal motility using gastric emptying and intestinal transit methods. Results: Chemical analysis revealed the presence of 24 constituents (mono and sesquiterpenes) representing 92% of essential oil. It was observed that EOHM showed significant dose-dependent gastroprotective effect in models of acute injury induced by absolute ethanol, acidified ethanol and indomethacin. In pylorus ligature, EOHM increased the pH and decreased the gastric total acidity only with the highest doses, however not changed the volume of gastric juice. The EOHM reduced the rate of gastric emptying with only the highest doses, but did not show influence on intestinal transit in neither of three doses. Conclusion: Thus, it is concluded that the essential oil of Hyptis martiusii has gastroprotective effect by a mechanism of action not yet unclear and that which probably this effect observed may be related to the presence of the terpenes. Keywords: Hyptis martiusii, essential oil, gastroprotective, ulcer. 35.

(38) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. 1. Introduction. Peptic ulcer are lesions in the gastrointestinal tract that usually occur in the stomach and duodenum characterized by mucosal damage secondary to the aggressive action of pepsin and gastric acid secretion. The disease affects millions of people around the world, only in the United States approximately 500,000 people develop peptic ulcers each year. The direct costs or indirect care of the disease are estimated at about $ 10 billion (Ramakrishnan and Salinas, 2007). Currently, it is known that several factors are involved in its appearance, which include Helicobacter pylori infection, chronic use of nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID), use of other drugs such as corticosteroids, bisphosphonates, anticoagulants and chemotherapy, ischemia gastric mucosa, age, genetic factors and until the lifestyle that includes stress, alcohol abuse, smoking and dietary habits (Dembinski et al., 2005; Jainu and Devi, 2006; Stewart and Ackroyd, 2008). The treatment of peptic ulcer disease in general is based on inhibition of gastric acid secretion by histaminergic H2-receptor antagonists, proton pump inhibitors, antimuscarinics, as well as acid-independent therapy provided by antimicrobials against H. pylori, sucralfate and bismuth (Bighetti et al., 2005). However, prolonged use of these drugs also produce adverse reactions (Chan and Leung, 2002), may also increase the risk of developing cancer (Raghunath et al., 2005). Among the various sources of new pharmacologically active molecules, medicinal plants are considered an important source of molecules for the treatment of gastric ulcer (Schmeda-Hirschmann and Yesilada, 2005). The chemical composition of the family Lamiaceae, especially the genus Hyptis is remarkable variability, are present compounds such as terpenes, flavonoids, lactones, lignans, phenolic derivatives, steroids and others (Falcão and Menezes, 2003). Hyptis martiusii Benth. is a small shrub that belongs to the Lamiaceae family, commonly found in the north, southeast and northeastern Brazil (Almeida and Albuquerque, 2002). This species grows in abundance in the northeastern where is popularly known as cidreira-do-mato or cidreira-brava (Araújo et al., 2003). According to ethnopharmacological studies, the relevant parts of this plant used for medicinal purposes by the population are the leaves and roots. The infusion or decoction of the leaves from Hyptis martiusii is used against intestinal diseases and stomachic, while the roots in decoction are used for inflammation of 36.

(39) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. the ovary (Agra et al., 2008); however, there are no pharmacological data to prove these indications. Antimicrobial, antitumoral, cytotoxic and insecticidal activities were identified (Araújo et al., 2006; Araújo et al., 2003; Costa-Lotufo et al., 2004; Costa et al., 2005; Coutinho et al., 2008), but no antiulcerogenic activity has been reported according to a literature survey. The present work evaluated the antiulcerogenic activity of essential oil from leaves of Hyptis martiusii using models of acute ulcer induced by indomethacin, ethanol and acidified ethanol. Additionally were determined the parameters (volume, pH and total acidity) of gastric secretion by the method of pyloric ligature and gastrointestinal motility in rodents. 2. Materials and methods 2.1. Plant material and extraction of essential oil Leaves of Hyptis martiusii Benth. (Lamiaceae) were colleted from Araripe Plateau, in the county of Crato, Ceará, Brazil. The botanical identification was performed by Edson P. Nunes and a voucher specimen deposited at Prisco Bezerra Herbarium, from the Department of Biology, Federal University of Ceará (UFC), under the registration no. 43038. The essential oil was extracted from the dried leaves (700 g) of Hyptis martiusii using steam distillation for 3 h. The mixture water/oil was collected in Clevenger type apparatus modified (Gottlieb and Magalhães, 1960), dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The essential oil obtained was stored amber bottle at 5°C until the accomplishment of the pharmacological experiments and phytochemical analyses. 2.2. Gas chromatography coupled to a mass spectrometry analysis Oil analysis was performed in a gas chromatographer coupled to a mass spectrometer (GC-MS, SHIMADZU QP5050A) equipped with a DB-5HT capillary column (30 m x 0.251 mm, 0.1 µm film thickness) the following specifications: helium as carrier gas at 1.7 mL/min); injector temperature 270 ºC and detector temperature 290 ºC; linear velocity of 47.3 cm/sec; flow carrier of 24 mL/min; pressure of 107.8 kPa; column temperature 60 ºC (2 min) - 180 ºC (1 min) at 4 ºC/min, then 180 - 260 ºC a 10 ºC/min (10 min). The mass spectrometer was operated using 70 eV of ionization energy. Identification of individual components of the 37.

(40) Caldas, G. F. R. Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii Benth (Lamiaceae).. essential oil was based in the interpretation on their mass spectral fragmentation using standards of computer library MS searches (Wiley 229), retention indices and comparison with mass spectral database and literature data (Adams, 2001; Alencar et al., 1990). 2.3. Animals Male and female Wistar rats (Rattus norvegicus var. albinus) weighing between 180200 g and 150-180 g respectively, were utilized for antiulcer experiments and male Swiss mice (35-40 g) were utilized for toxicity experiment. The animals were obtained from the Department of Physiology and Pharmacology from Federal University of Pernambuco (UFPE) and Research Center Aggeu Magalhães (CPqAM/Fiocruz/UFPE), Pernambuco, Brazil. They were maintained under standard environmental conditions (12 h dark/light cycle) and temperature (22 ± 2 °C). Water and industrialized dry food (Labina®, Purina, Brazil) were available ad libitum. All the experimentals protocols were submitted and approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the Biological Science Center - UFPE, under license no. 007764/2009-94 in accordance with the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 2.4. Acute toxicity Acute toxicity studies were performed on male Swiss mice as described by Souza Brito (1994). The animals were randomly divided into two groups (n = 5/group) and deprived of feed for 12 h with access to water ad libitum. The treated group received EOHM at a single oral dose of 5.0 g/kg and the control group received distilled water (10 mL/kg). The observations were performed at 30, 60, 120, 180 and 240 min after the oral treatments and daily for 14 days after of treatment. Were recorded daily behavioral changes, clinical sings of toxicity and mortality, the body weight, consumption of food and water based on Hippocratic screening (Malone and Robichaud, 1977). 2.5. Antiulcerogenic activity Each experimental model presented two control groups, positive (pantoprazole, 40 mg/kg) and negative (vehicle - 1% Tween 80® aqueous solution), and a group treated with 38.