TEONILDES SACRAMENTO NUNES

TEONILDES SACRAMENTO NUNES

ESTUDOS

BIOSSISTEMÁTICOS

EM

P

ASSIFLORA

L.

SUBGÊNERO

D

EIDAMIOIDES

(H

ARMS

)

K

ILLIP

(P

ASSIFLORACEAE

)

FEIRA DE SANTANA

–

BAHIA

Universidade Estadual de Feira de Santana

Departamento de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Botânica

ESTUDOS

SISTEMÁTICOS

EM

P

ASSIFLORA

L.

SUBGÊNERO

D

EIDAMIOIDES

(H

ARMS

)

K

ILLIP

(P

ASSIFLORACEAE

)

TEONILDES SACRAMENTO NUNES

FEIRA DE SANTANA – BA

Universidade Estadual de Feira de Santana

Departamento de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Botânica

E

S

P

L.

D

(H

)

K

(P

)

Teonildes Sacramento Nunes

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana – BA, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Botânica.

ORIENTADOR:

PROF. DR. LUCIANO PAGANUCCI DE QUEIROZ (UEFS)

CO-ORIENTADOR:

PROF. DR. CASSIO VAN DEN BERG (UEFS)

FEIRA DE SANTANA FEVEREIRO/2009

A minha linda filha Poliana Nunes

Sena, espero que um dia você

consiga me perdoar por todas as minhas ausências em busca de um futuro melhor para nós duas. E a minha pequena Sophia! Eu amo vocês duas!

“Se um homem não sabe o que uma coisa é, já é um avanço do

conhecimento saber o que não é.”

Agradecimentos

Em primeiro lugar e independente de qualquer coisa agradeço imensamente a meu bom Deus, o ser supremo que me deu a vida, e que direcionou meus passos para que eu chegasse até aqui.

Agradeço muito a Universidade Estadual de Feira de Santana, pelo apoio direta ou indiretamente para que eu pudesse concluir este curso trabalhando no herbário. Ao Programa de Pós-graduação em Botânica, pela infra-estrutura e pelas disciplinas, pela disponibilização dos laboratórios, equipamentos e materiais. A Fundação de Amparo à Pesquisa na Bahia (FAPESB) pelo financiamento parcial deste projeto (Processo APR056/2006, Pedido no. 1822/2005), que muito me ajudou nas viagens de coletas, confecção das pranchas e aquisição de materiais de consumo.

Aos coordenadores dos projetos: Instituto do Milênio do Semi-árido - IMSEAR (Dra. Ana Maria Giulietti), Programa de Pesquisa em Biodiversidade - PPBIO (Dr. Alessandro Rapini), Projeto Petrobrás (Dr. Cássio van den Berg) e Projeto Flora da Bahia (Dra. Ana Maria Giulietti), que direta ou indiretamente apoiaram este projeto, financiando as viagens de campo e as atividades em laboratório.

Aos curadores dos herbários nacionais e internacionais que gentilmente concederam, os empréstimos dos materiais com presteza e eficiência, assim como aqueles que me receberam pessoalmente (ver lista de herbários visitados e/ou examinados).

As minhas colegas de trabalho no herbário: Zezé (minha Comadre!), Elaine, Kelly, Patrícia, Renata, Verônica e Silvia, obrigada pela paciência, pela força que vocês me deram para que eu pudesse concluir este trabalho, espero que não tenha prejudicado muito o funcionamento do herbário. Um grande beijo minhas amigas e colegas, a todas vocês esta vitória eu dedico.

Ao meu orientador e “chefe” Luciano Paganucci de Queiroz, meu mais sincero muito obrigada!

Ao curador do herbário CVRD, Renato de Jesus, Sr. Domingos Folli e ao técnico Geovanni pela acolhida, autorização de coleta e companhia no campo, nas coletas das populações. Agradeço muito ao pessoal do Núcleo Pinciguaba, Ubatuba/SP, pela atenção e pelo apoio na ida ao campo, em especial ao Cristo, Sr. Ivo, Sr Roberto e Sr. João Pedro (Casa de farinha), Olinda e Elizangela (Secretária). Ao André Amorim e ao pessoal do CEPEC, principalmente a Cristiane e ao Jomar Jardim. Ao Diogo Amorim, Anderson (UFPE) e Newton (IPA), por me aceitarem em sua expedição de coleta, atrás das Passifloraceae... muito obrigada meninos, foi muito bom estar com vocês..!!

Ao Prof. Dr. Cássio van den Berg pela co-orientação, muito obrigada mesmo! Sem você e suas crises de “Teo você está fazendo tudo errado!”, nada disso seria possível. Aos professores do programa de Pós-graduação em Botânica, em especial: Alessandra Selbach Schnadelbach, Ana Maria Giulietti Harley, Aristóteles Góes Neto, Carlos Wallace, Cássio van den Berg, Eduardo Borba, Francisco Assis, Luciano Paganucci, Nadia Roque & Raymond Mervin Harley, obrigada pela orientação e pelos ensinamentos.

A Dra. Loreta B.Freitas e a equipe do Laboratório de Genética Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela extração dos materiais, pelo apoio com o trabalho de filogeografia e pelas discussões via e-mail. Muito obrigada a todos!

Ao pessoal do Laboratório de Biologia Molecular, LAMOL ou como diz minha Comadre Zezé “LAMAL”, pela paciência e orientação, muito obrigada: Milene, Sabrina, Rick VB, Patrícia Cristina, Patrícia Luz, Reyjane Patrícia, Silvana Monteiro, Ciça, João Rodrigo, Tarcisio (pelas risadas), Lia Andrade, Déa Karla, Simone, Marcos,

Elisa, Floriano, Paulo Ricardo, Felipe e todos os outros que me fizeram companhia durante as incansáveis horas de extração, quantificação, amplificação, etc... muito obrigada pela paciência e pelas horas de conversas sobre tudo. E afinal qual de vocês foi o responsável pela minha orientação no LAMOL?

À Gisele Rocha e ao Laboratório de Microscopia Eletrônica de Varredura da UEFS, pelas imagens de folhas, sementes e de pólen.

A Rita Araújo pela execução conjunta do trabalho com os polens. Obrigada Ritinha! Após tantos anos ainda continuamos aqui nesta UEFS, não é mesmo!

Aproveitando, agradeço a toda a equipe do LAMIV pela ajuda direta ou indiretamente: Paulino, Claúdia Helena, Francisco de Assis, Ricardo Landim, Marileide Dias, Luciene, Kelly, Jailton e todos os estagiários.

Ao amigo Marlon Machado, no auxílio com as bibliografias, com as conversas informais que me ajudaram muito no desenvolvimento desta e principalmente na ajuda com as cervejas geladas, um grande beijo e Deus te abençoe!

A amiga Daniela Carneiro pela ajuda com os mapas e com todas as discussões sobre metodologias, conceitos, filogenias, biogeografias, taxonomias, etc.. Sem esquecer a ajuda que você me deu na minha qualificação! E por último pelas leituras incansáveis nos capítulos finais. Você é a pessoa mais iluminada por Deus que eu conheço. Que ele sempre te abençoe menina Dani! Você e sua família linda! Parabéns!

Amiga Mi (Milene), obrigada por tudo, pela companhia nas coletas, no LAMOL, pelo auxílio com minha qualificação, e pelas discussões e leituras neste trabalho, você foi verdadeiramente uma co-orientadora. Tenha certeza que sem você e sua inexplicável paciência nada disso seria possível, e por extensão agradeço também ao Ivan. Deus os abençoe! Sempre!

Ao Frank Axel (Alemanha), pelas discussões via e-mail, pelas bibliografias e imagens dos tipos, espero um dia te conhecer pessoalmente.

Aos estagiários do herbário, muitos dos quais não fazem mais parte do nosso time, mas fica aqui meu agradecimento sincero: Yuri, Silvinha, Carla, Paula Emanuela, Nara Katary, Cris Viana e todos os outros estagiários de Iniciação Científica e Iniciação Júnior que passaram pelo herbário e os estagiários do LATAXON.

Algumas pessoas foram constantes nestes anos: nas viagens de coletas, nas disciplinas e nas atividades de laboratório, meu agradecimento coletivo a todos vocês: Andréa Karla, Simone, Paula Dib, Élvia, Daiane, Vânia, Maria, Milene, Daniela, Ciça, Jorge, Jomar Jardim e Janaina.

A amiga Vanilda (in memorian), que sempre me incentivou e acreditou no meu trabalho, sei que onde você estiver, você continua me apoiando e me incentivando, com toda a sua teimosia. Fique literalmente com Deus!

Aos amigos-motoristas que sempre me apoiaram e fizeram com que as longas viagens de coletas se tornassem divertidas e menos cansativas: meu muito obrigado ao Bené (Benedito Marques Silva), Sr Miguel Martins (in memorian), Sr Miguel Arcanjo, Lucianinho e o Sr. Ronaldo.

A equipe de limpeza do LABIO, principalmente Edleuza e “Nem” (Maria São Pedro), obrigada pelos cafezinhos de manhã cedinho e pelas merendas deliciosas. Ao pessoal da portaria que sempre vigilantes cuidaram para que eu pudesse ficar horas intermináveis, noites e fins de semana sem me preocupar com a segurança do prédio.

Aos meus pais, a quem dedico todas as vitórias: Seu Pedro e Dona Terinha, muito obrigada pela vida, pela orientação e pela paciência nas minhas ausências. Desculpem-me as falhas, minhas imperfeições e saibam que eu amo muito vocês.

Minhas irmãs, irmãos, cunhados, cunhadas, sobrinhas e sobrinhos eu amo todos vocês!

A minha pequena princesa Sophia, que ainda não conhece a rotina da mãe, mas já sofre por ter que ficar na mesma posição o dia todo, enquanto a mãe escrevia esta tese. Meu pequeno anjo iluminado! Obrigada por existir, obrigada por me escolher como sua mãe... Te amo muito! Você tornará o resto dos meus dias sempre ensolarado. E ao papai Roberto, que chegou agora no finalzinho, mas que sempre teve muita paciência e carinho, você não sabe o quanto você me faz feliz.

E finalmente a minha filha Poliana Nunes Sena, que foi sem sombra de dúvida a mais sacrificada por mim, para que eu pudesse concluir meu sonho, sempre na busca de uma vida melhor para nós duas (agora três). Sei que hoje é mais fácil para você entender, mas sei que já foi muito difícil..., não ter uma mãe presente, ter uma mãe que sempre viaja, que não tem hora para chegar em casa, que sempre trabalha nos fins de semana. Mil perdões minha filha e que daqui para frente tudo seja diferente.

A todos vocês meus mais sinceros agradecimentos!

Sumário Agradecimentos...i Resumo ... ii Abstract... iii Introdução geral... 01 Resultados e discussões... 12

Capítulo 1 – Estudos filogenéticos moleculares em Passiflora L. subgênero Deidamioides (Harms) Killip (Passifloraceae) ... 12

Capítulo 2 – Estudos morfométricos no complexo Passiflora ovalis Vell. ex M.Roemer (Passifloraceae) ... 42

Capítulo 3 – Uso dos marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) na delimitação do complexo Passiflora ovalis Vell. ex M.Roemer (Passifloraceae)... 64

Capítulo 4 – Morfologia polínica de Passiflora L. subgênero Deidamioides (Harms) Killip (Passifloraceae) e suas implicações taxonômicas... 85

Capítulo 5 – Revisão Taxonômica das espécies incluídas em Passiflora L. subgênero Deidamioides (Harms) Killip (Passifloraceae) sensu Feuillet & MacDougal (2003) ... 107

Conclusões Gerais ... 169

Referências Bibliográficas... 171

RESUMO

O presente trabalho consiste no estudo filogenético, sistemático e biossistemático de Passifloraceae: Passiflora L. subgênero Deidamioides (Harms) Killip. Passifloraceae é predominantemente tropical e subtropical, possuindo 28 gêneros e ca. 800 espécies. O gênero Passiflora L., é o mais diverso, com aproximadamente 450 espécies descritas. Atualmente, está subdividido em quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast.; Deidamioides (Harms) Killip, Decaloba (DC.) Rchb. e Passiflora L. O subgênero Deidamioides está subdividido em seis seções com 11 espécies aceitas e cerca de 6 espécies sinonimizadas. Apresenta distribuição na América Central e América do Sul sendo que duas espécies são consideradas endêmicas do Brasil, ocorrendo nos Estados de Pernambuco, Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. Estudos anteriores mostram diversas espécies com posicionamento dentro do subgênero, com circunscrições dúbias e dificuldades taxonômicas na delimitação das seções, principalmente a seção Tetrastylis Barb Rodr., que foi delimitada com duas espécies: P. contracta Vitta, encontrada nos Estados de Pernambuco, Bahia e Espírito Santo, e P. ovalis Vell. ex M.Roemer encontrada em São Paulo e Rio de Janeiro. Para tentar resolver esta problemática, foram utilizados estudos biossistemáticos na delimitação das mesmas, incluindo estudos genéticos com marcadores de ISSR, análises multivariadas com o uso da morfometria geométrica e morfometria tradicional. Para delimitar taxonomicamente o subgênero e rever os limites das seções, foram utilizados estudos filogenéticos baseados em dados morfológicos e moleculares incluindo as 13 espécies desse subgênero. Para comprovar ou não este posicionamento foram utilizadas as regiões de ITS e trnL-F, além de estudos biossistemáticos e palinológicos. O subgênero Deidamioides não se apresentou como monofilético, bem como as suas seções e séries, porém, uma revisão taxonômica das espécies até então pertencentes ao subgênero é apresentada, com descrições, ilustrações, caracterização polínica, mapas de distribuição, comentários e observações ecológicas das espécies, sendo este o primeiro estudo com uma revisão completa para estas espécies. Duas novas espécies foram descritas, ilustradas e mapeadas para o Estado da Bahia, pertencentes à seção Tetrastylis: Passiflora timboënsis T.S.Nunes & L.P.Queiroz e Passiflora igrapiunensis T.S.Nunes & L.P.Queiroz.

ABSTRACT

This work presents a phylogenetic, taxonomic, and biosystematics study of

Passiflora subgenus Deidamioides. The family Passifloraceae is mainly tropical and

subtropical with 28 genera and c. 800 species. Passiflora is the most diverse genus, with ca. 450 published species. The genus is classified in four subgenera: Astrophea (DC.) Mast., Deidamioides (Harms) Killip, Decaloba (DC.) Rchb. and Passiflora L. The subgenus Deidamioides with ca. 13 species, is classified in six sections. It is distributed in Central and South America with two species endemic of Brazil. Previous studies show that several species have problematic circumscription as well as badly defined sections. One example is found in section Tetrastylis Barb. Rodr., which presents conflicting positions in delimiting the complex Passiflora ovalis and P. contracta. In order to solve this problem, it was carried out biosystematics studies based on genetic, traditional and geometric morphometry variability. Phylogenetic studies based on molecular data (ITS and trnLC-F), were carried out to test subgenus and sections monophyly. Thirteen species of sect. Deidamioides were included and the results refuted the monophyly both of the subgenus and the sections. Besides this results an taxonomic revision of the subgenus is presented with descriptions, illustrations, distribution maps and comments of each species, this is the first study with taxonomic revision of this species. Two new species were described and illustrated for the State Bahia: Passiflora timboënsis T.S.Nunes & L.P.Queiroz and Passiflora igrapiunensis T.S.Nunes & L.P.Queiroz.

Introdução geral

A família Passifloraceae é predominantemente tropical e subtropical, encontrada principalmente em regiões de clima quente, possui ca. 28 gêneros e ca. 800 espécies (Cervi 1997; Judd et al. 1999; Ulmer & MacDougal 2004). Durante muito tempo a família Passifloraceae foi considerada como relacionada às famílias Malesherbiaceae, Turneraceae e Flacourtiaceae, integrando a ordem Parietales (Wettstein 1935) com base em dados morfológicos. Bentham & Hooker (1865) consideraram a família como pertencente à ordem Passiflorales, juntamente com Loasaceae, Turneraceae e Malesherbiaceae. A partir de 1964, a família passou a integrar a ordem Violales, próxima a Flacourtiaceae, Violaceae, Scyphostegiaceae, Turneraceae, Achariaceae e Malesherbiaceae, com base nos caracteres morfológicos, tendo como caráter delimitante a placentação parietal (Engler 1894; Takhtajan 1980; Dahlgren 1980; Cronquist 1981; Spichiger & Savolainen 1997). A partir da utilização de dados moleculares (APG I 1998; APG II 2003) a família passou a fazer parte da ordem Malpighiales apresentando como sinapomorfias: estigma seco, exotegma fibroso (desenvolvimento da camada interna do tegumento em células fibrosas), nós trilacunares (número de intervalos no corte do nó caulinar na inserção do pecíolo ou interrupção parenquimatosa), placentação parietal, articulação do pedicelo, margem da folha denteada, gineceu sincárpico tricarpelar (três carpelos fundidos formando um ovário unilocular ou trilocular) (Stevens 2001). Segundo APG II (2003) esta ordem possui ca. 13.100-16.000 espécies, 716 gêneros e 28(-30) famílias, sendo as mais representativas: Euphorbiaceae, Flacourtiaceae, Malpighiaceae, Rhizophoraceae, Salicaceae e Violaceae. A variação no número de famílias pertencentes à ordem se deve ao fato de considerar ou não a inclusão das famílias Rafflesiaceae, sugeridas por Barkman et al (2004) e Nickrent et al (2004) e Centroplacaceae (Davis et al. 2005), através dos estudos realizados com matR, SSU, rDNA, rbcL, atpB, PHYC, 18S e nad1B-C, respectivamente.

Além do trabalho do APG II (2003), esta delimitação também é corroborada por outros estudos moleculares, incluindo dados de rbcL combinados com dados morfológicos, com sustentação de 76% (bootstrap) (Nandi et al. 1998); 18S, rbcL e

atpB, com sustentação de 99% (Soltis et al. 2000); atpB e rbcL - 92% (Savolainen et al.

Chase 2004); atpB, rbcL, 18S e nad1B-C – 100% (Davis et al. 2005); atpB, matK, rbcL e 18S – 100% (Tokuoka & Tobe 2006).

A ordem Malpighiales pertence ao grupo das Eudicotiledôneas (tricolpadas): Rosídeas, posicionada dentro das Eurosideas I, apresentando como grupo irmão as ordens Celastrales e Oxalidales (também conhecido como grupo COM) e estão proximamente relacionadas com um clado onde aparecem as famílias com espécies fixadoras de nitrogênio, incluindo Fabales, Fagales, Cucurbitales e Rosales (APG II 2003, Soltis et al. 2005).

De acordo com APG II (2003), a delimitação de Passifloraceae considera a inclusão de Malesherbiaceae e Turneraceae, tornando a família com delimitação sensu

lato, com ca. 800 espécies e 28 gêneros, próxima às famílias Euphorbiaceae,

Malpighiaceae e Flacourtiaceae.

Bernhard (1999), através de estudos com base em caracteres florais retirou de Passifloraceae a tribo Abatieae, transferindo-a para a família Salicaceae, baseado nas seguintes sinampomorfias: dentes salicóides na margem foliar, estames com iniciação centrífuga, ausência de glicosídeos cianogênicos, anteras pequenas globosas e flores pequenas nas quais as sépalas e pétalas, se ambas estão presentes são em números iguais.

Passifloraceae apresenta como sinapomorfias: a presença de glicosídeos cianogênicos, folhas denteadas, glândulas foliares, cálice e corola formando um tubo, corona extra-estaminal, presença de um hipanto e exotegma paliçado (Stevens 2001). Além desses caracteres a família pode ser reconhecida por apresentar espécies trepadeiras herbáceas, arbustos ou árvores lenhosas, com gavinhas, folhas inteiras ou lobadas, flores 3-bracteadas, bissexuadas, presença de um hipanto, pentâmeras, corona de filamentos presentes, opérculo presente (raramente ausente), androginóforo presente, estames 5(-10), anteras dorsifixas, versáteis, grãos de pólen 3 a 12-colporado, ovário unilocular, 3-4-carpelar; óvulos numerosos, placentação parietal, estiletes 3-4; fruto uma baga, raramente cápsula deiscente; sementes comprimidas, reticuladas, pontuadas ou transversalmente alveoladas, envolvidas por um arilo mucilaginoso (Masters 1871; 1872; Killip 1938; Cervi 1997; Stevens 2001; Ulmer & MacDougal 2004).

Duas tribos são reconhecidas dentro de Passifloraceae s.s.: a tribo Paropsieae DC., considerada por Harms (1893), Engler (1921) e Sleumer (1954) como uma tribo de Flacourtiaceae, devido à presença do hábito arborescente x trepadeiras, e através de

uma corona, além de dados anatômicos e palinológicos, esta tribo foi incluída em Passifloraceae (Wilde 1971). Caracteriza-se por apresentar: hábito arborescente a lianas, com gavinhas ausentes e está representada por seis gêneros presentes no Velho Mundo, África e Madagascar: Androsiphonia Stapf (1 espécie), Viridiva J.H.Hemsl. (1),

Smeathamnnia Sol. ex R.Br. (2), Barteria Hook.f. (5), Paropsiopsis Engl. (7) e Paropsia Noronha (10).

A tribo Passifloreae DC. é monofilética (Wilde 1971), evidenciada por seu hábito trepador, gavinhas axilares e flores especializadas e está representada por 13 gêneros: Crossostemma Planch. ex Benth. (1), Schlechterina Harms (1), Tetrapathea (DC.) Richb. (2), Hollrungia K.Schum. (1), Efulensia C.H.Wright (1), Deidamia Noronha ex Thou. (8), Thryphostemma Harv. (44), Passiflora L. (incluindo Tetrastylis Barb. Rodr., ca. 450), Ancistrotryrsus Harms (2), Mitostemma Mast. (3), Dilkea Mast. (6), Basananthe Peyr (38) e Adenia Forsk. (200 spp), encontradas no Novo Mundo, África, Madagascar, Nova Zelândia, Nova Guiné e Ásia (Wilde 1971; Escobar 1988).

Passiflora é o mais representativo da tribo Passifloreae possuindo ca. 450

espécies, predominantemente na região neotropical, com apenas uma espécie P.

tetrandra Banks & Sol. ex DC., encontrada na Nova Zelândia (Killip 1938).

Caracteriza-se por apresentar espécies de lianas, trepadeiras herbáceas ou lenhosas, arbustos, subarbustos e arvoretas, com gavinhas, estípulas foliares, nectários extra-florais, flores solitárias ou inflorescências cimosas, com receptáculo desenvolvido em hipanto e apêndices acessórios na forma de corona, opérculo e/ou androginóforo e fruto tipo baga ou cápsula, com sementes ariladas (Brizyck 1961). Está subdividido em quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast., Deidamioides (Harms) Killip, Decaloba (DC.) Rchb. e Passiflora L. (Feuillet & MacDougal 2003).

Passiflora subg. Astrophea possui 57 espécies, distribuídas em duas

superseções, cinco seções e duas séries (Feuillet & MacDougal 2003). Está distribuída na América do Sul (a maioria no Brasil) e apenas duas espécies na América Central. Caracteriza-se por apresentar espécies lianas lenhosas, algumas árvores, folhas inteiras, duas glândulas peciolares próximo ao ápice do pecíolo, sésseis ou em forma de cicatriz, pedúnculos com 1-5-flores, estas raramente nascidas sobre uma gavinha, brácteas pequenas, flores rosa a púrpuras, vermelhas a alaranjadas, corona amarela com um tubo floral proeminente, opérculo ereto ou expandido, não plicado, os frutos são usualmente amarelos, esverdeados com manchas avermelhadas (MacDougal & Feuillet apud Ulmer & MacDougal 2004).

Passiflora subg. Decaloba possui 214 espécies, distribuídas em oito superseções

e cinco seções, encontradas no Novo Mundo, Sudeste da Ásia, Oceania e Austrália (Feuillet & MacDougal 2003). Caracteriza-se por apresentar: trepadeiras herbáceas, plantas glabras a pubescentes, caule cilíndrico, 3–5 angulado, folhas geralmente 3-lobadas, raramente inteiras ou 5-3-lobadas, glândulas peciolares presentes, 2 ou até 4, lâmina foliar com ocelo próximos a nervura principal, pedúnculos 1 a 20 flores, flores nascidas sobre uma gavinha, pequenas, amarelo-esverdeadas, brancas ou avermelhadas, corona em 1-3 séries de filamentos, opérculo plicado, estiletes delgados, frutos pequenos, púrpureos ou negros, algumas vezes deiscentes, sementes reticuladas ou transversalmente sulcadas.

O subgênero Passiflora, o maior em número de espécies, possui 236 espécies,

divididas em seis superseções, 24 seções e três séries. Apresenta distribuição no Sudeste dos Estados Unidos, América Central e América do Sul, encontradas tanto nas altas temperaturas do Amazonas como em baixas temperaturas nos Andes, em altitudes de 0-2.500 m s.n.mn (Ulmer & MacDougal 2004). Caracteriza-se por apresentar lianas com flores grandes e coloridas, às vezes com corona ou algumas vezes com um longo tubo floral (superseção Tacsonia (Juss.) Feuillet & MacDougal), plantas glabras a pubescentes, caule circular, estriado, denteado ou quase angulado, estípulas inconspícuas, lanceoladas ou ovadas, folhas 3-lobadas, inteiras ou até 7-lobadas, com 3 nervuras principais, glândulas peciolares 2-6, raramente mais que 6 ou ausentes, lâmina com ou sem nectários, pedúnculos unifloros, as flores nascidas sobre uma gavinha, brácteas 3, geralmente conspícuas, flores grandes, purpúreas, brancas, azuis, violetas, vermelhas e variações destas, tubo floral às vezes conspícuo, corona em (1-)3-20 séries de filamentos, opérculo não plicado, às vezes filamentosos, frutos esverdeados, amarelos a alaranjados ou avermelhadas, sementes reticuladas, com ornamentação. Por apresentar flores vistosas e coloridas e com odor forte, as espécies são muito utilizadas na obtenção de híbridos para cultivo ou como ornamentais (Ulmer & MacDougal 2004). O subgênero Deidamioides ocorre na América do Sul e América Central, do

México até a região sudeste do Brasil (em áreas de mata atlântica), em altitudes variando de 0-2.500 m s.n.m. Desde a sua delimitação apresenta um histórico bem controverso:

De Candolle (1828) reconheceu oito seções para Passiflora: Astrophea DC.,

Tetrapathea DC. (incluindo P. tetrandra Banks & Sol. ex DC., espécie endêmica da

Nova Zelândia), Cieca Medic., Decaloba DC., Granadilla DC., Tacsonioides DC. e

Dysosmia DC. (Em destaque as seções que pertencem atualmente à delimitação de Passiflora subgênero Deidamioides).

O termo Deidamioides, foi proposto pela primeira vez por Harms (1923), como seção Decaloba DC. subseção Deidamioides Harms, incluindo as espécies: P.

cirrhiflora, P. jenmanii Mast. e P. deidamioides.

Harms (1925) no tratamento taxonômico para a família, reconheceu três seções e três subseções: seção Decaloba subseção Polyanthea Mast. com as espécies: P.

multiflora L., P. holosericea, P. sexflora, P. sodiroi Harms, P. moluccana, P. horsfieldii

Blume, P. cupiformis Mast., P. eberhardtii Gagnep., P. siamica Craib. e P. ligulifolia Mast.; Subseção Cirrhiflora com as espécies: P. cirrhiflora e P. jenmanii; Subseção

Deidamioides com uma única espécie: P. deidamioides; Seção Tryphostemmatoides

Harms, com a espécie P. tryphostemmatoides Harms. e a seção Tetrastylis (Barb. Rodr.) Harms, com uma espécie T. montana Barb. Rodr.

Killip (1938) revisou a família para o Novo Mundo, reconhecendo 355 espécies para a América do Sul, e agrupou estas espécies em quatro gêneros: Tetrastylis (duas espécies), Mitostemma Mast. (3), Dilkea Mast. (5) e Passiflora (355) e subdividiu o gênero Passiflora em 22 subgêneros: Apodogyne Killip, Astephia Killip,

Tryphostemmatoides (Harms) Killip, Deidamioides (Harms) Killip, Plectostemma

Mast., Chloropathanthus (Harms) Killip, Murucuja (Medic.) Mast., Pseudomurucuja (Harms) Killip, Psilanthus (DC.) Killip, Adenosepala Killip, Tacsoniopsis (Triana & Planch.) Killip, Rathea (Karst.) Killip, Tacsonia (Juss.) Triana & Planch.,

Granadillastrum (Triana & Planch.) Killip, Distephana (Juss.) Killip, Calopathanths

(Harms) Killip, Tacsonioides (DC.) Killip, Granadilla (Medic.) Mast., Dysosmia (DC.) Killip, Dysosmioides Killip, Polyanthea (DC.) Killip e Astrophea (DC.) Mast. (Em negrito os subgêneros que foram agrupados em Deidamioides). Neste trabalho, o autor propôs uma nova delimitação para o subgênero Deidamioides, restrito a apenas uma espécie: P. deidamioides, que inclui: trepadeiras herbáceas, pecíolos com 2-4(-6) glândulas, folhas trifolioladas, pedúnculos bi-floros, terminando em uma gavinha e opérculo plicado.

Feuillet & MacDougal (2003) fizeram uma revisão para o gênero Passiflora e reduziram os 22 subgêneros propostos por Killip (1938), para apenas quatro subgêneros, reconhecendo dentro destes a categoria “Superseção” ao invés do termo subseção. Esta

categoria, apesar de utilizada por Feuillet & MacDougal (2003), no intuito de reduzir o número de novos nomes e/ou categorias subgenéricas, não é reconhecida pelo Código Internacional de Nomenclatura Botânica (Mcneill et al. 2006). Os subgêneros reconhecidos pelos autores foram: Astrophea (DC.) Mast. (57 espécies), Decaloba (DC.) Richb. (214), Passiflora L. (236) e Deidamioides (Harms) Killip (13).

Dentro da delimitação proposta por Feuillet & MacDougal (2003), para

Passiflora, o subgênero Deidamioides é o que apresenta até o momento uma

delimitação não muito clara, e um histórico taxonômico bem controverso (ver sinopse na Tabela 1).

Feuillet & MacDougal (2003) reconheceram seis seções para o subgênero:

Polyanthea DC. (uma espécie); Deidamioides (Harms) Feuillet & MacDougal (1); Tetrastylis (Barb. Rodr.) Harms (2, com a inclusão de P. contracta Vitta); Mayapathanthus Killip ex MacDougal & Feuillet (2), Tryphostemmatoides Harms (5) e Tetrapathea DC. (1).

Segundo Ulmer & MacDougal (2004) o subgênero Deidamioides caracteriza-se por apresentar, estípulas delgadas, glândulas peciolares próximas à junção da lâmina foliar, folhas inteiras a 3-9-folioladas, com margem inteira, brácteas pequenas, pedúnculo terminando em uma gavinha, uma flor com articulação próxima ou bem abaixo da base da flor e opérculo plicado. As plantas jovens apresentam discos adesivos nas gavinhas que permitem o hábito trepador das mesmas em florestas facilitando o alcance do dossel das matas. O subgênero tem distribuição na América do Sul e América Central.

A Seção Polyanthea representada por uma única espécie encontrada nas Guianas caracteriza-se por apresentar, folhas compostas 5-9-folioladas, as flores nascidas sobre uma gavinha e a corona amarelo-alaranjada, em várias séries (P. cirrhiflora). Master (1871) considerou esta seção como uma série da seção Decaloba (série Polyanthea). Killip (1938) considerou-a como um subgênero à parte com uma única seção (subgenêro Polyanthea seção Polyanthea) e apenas uma espécie. Segundo este mesmo autor, a espécie possui uma combinação de caracteres diagnósticos distinta de outras seções e subgêneros, como opérculo plicado (subgênero Passiflora), ovário truncado com estiletes projetando-se do ângulo ao topo, filamentos da corona verrucosos (subgênero Astrophea) e estigmas largos (subgênero Passiflora), o que deixaria dúvidas quanto ao seu posicionamento taxonômico.

A composição de espécies da seção variou bastante. De Candolle (1828) incluiu na seção Polyanthea: Passiflora septenata [sinônimo de P. cirrhiflora segundo Killip (1938)], P. geminiflora [sinônimo de P. vespertilio segundo Killip (1938)], P.

moluccana, P. holosericea e P. sexflora [transferidas para o subgênero Decaloba por

Master (1871)]. Master (1871) adicionou P. multiflora à seção Polyanthea. Killip (1938) considerou que P. multiflora, P. holosericea e P. sexflora têm pouco em comum com P. cirrhiflora e efetuou sua transferência para o subgênero Decaloba. Feuillet & MacDougal (2003) consideraram apenas P. cirrhiflora como pertencente a uma seção do subgênero Deidamioides com base na presença de pedúnculos bifloros, terminando em uma gavinha e opérculo plicado, e as demais como pertencentes ao subgênero

Decaloba.

Segundo a delimitação de Feuillet & MacDougal (2003), a Seção Deidamioides representada por uma única espécie (P. deidamioides) caracteriza-se por apresentar folhas trifolioladas, flores que são nascidas sobre uma gavinha, e uma corona branca em várias séries. Esta seção foi proposta primeiramente por Harms (1923) como uma subseção da seção Decaloba, incluindo apenas uma espécie (P. deidamioides). Killip (1938) elevou esta seção à categoria de subgênero com apenas esta espécie, com base nos caracteres propostos por Harms (acima citados). Feuillet & MacDougal (2003) consideraram como uma seção dentro de uma delimitação mais ampla para o subgênero

Deidamioides. Esta seção também seria monoespecífica, incluindo apenas Passiflora deidamioides.

A seção Tetrastylis representada por P. ovalis Vell. ex M.Roemer, caracteriza-se por apresentar inflorescência racemosa, flores levemente zigomorfas, com quatro estigmas. Foi originalmente descrita como o gênero Tetrastylis por Barbosa Rodrigues (1882), com uma única espécie brasileira: T. montana. Harms (1923) considerou

Tetrastylis como uma seção pertencente ao gênero Passiflora. Killip (1926)

restabeleceu o gênero Tetrastylis e o diferenciou de Passiflora pela presença de quatro estiletes (vs. três estiletes em Passiflora), ginóforo curvo (vs. reto), filetes unidos na base do ginóforo com extremidades livres (vs. filetes livres do ginóforo até sua extremidade) e quatro placentas (vs. três placentas). Vitta & Bernacci (2004) dividiram

P. ovalis em duas espécies, com base em caracteres morfológicos: Passiflora contracta

descrita por Vitta (2003) foi separada de P. ovalis com base nos caracteres florais, como tipo e tamanho da inflorescência, tamanho do pedúnculo e pubescência, tamanho das sépalas e do ginóforo. P. ovalis é encontrada do Rio de Janeiro a São Paulo e P.

contracta encontrada de Pernambuco ao Espírito Santo, ambas ocorrendo em áreas de

mata atlântica.

Cervi (2005) sinonimizou P. contracta em P. ovalis salientando que as características diferenciais como tamanho da inflorescência e de pedúnculo, pubescência do hipanto, tamanho das sépalas e do ginóforo não seriam caracteres suficientes para a separação das mesmas. Porém, tal posicionamento foi baseado apenas em análise da morfologia externa. Observações preliminares dos espécimes destes dois táxons encontrados em herbários mostram que estas espécies apresentam sobreposição em vários caracteres morfológicos, causando dificuldades na delimitação específica através da taxonomia tradicional. Sendo assim, estas duas espécies estão aqui sendo consideradas como complexo Passiflora ovalis, e estudos biossistemáticos e micromorfológicos serão utilizados no intuito de delimitar taxonomicamente as mesmas, assim como a utilização de caracteres macromorfológicos.

. Alguns trabalhos filogenéticos com base em dados moleculares, recentemente publicados, reforçam a inclusão de Tetrastylis dentro do gênero Passiflora (Muschner et

al. 2003; Hansen et al. 2006, Zamberlan 2007), porém o seu posicionamento dentro do

gênero ainda não está claramente definido. Segundo Muschner et al. (2003), P. ovalis pertence ao clado que inclui o subgênero Passiflora (com dados de ITS – 97% valor de bootstrap). Na análise com dados de trnL-F, P. ovalis também está incluso no clado do subgênero Passiflora (75% valor de bootstrap). No estudo de Hansen et al. (2006) P.

ovalis aparece como grupo basal em relação ao subgênero Decaloba com forte

sustentação (85% bootstrap), formando o subgênero Deidamioides, juntamente com as espécies P. deidamioides e P. cirrhiflora. Zamberlan (2007) apresenta o subgênero

Deidamioides como polifilético, sendo necessária a exclusão de P. ovalis do grupo para

que este se torne monofilético.

A Seção Mayapathanthus apresenta espécies trepadeiras lenhosas sob o dossel, seus brotos assemelham-se com as espécies da seção Tryphostemmatoides e também apresentam gavinhas com discos adesivos, além das glândulas que às vezes podem ser encontradas sobre a base das sépalas. Esta seção inclui as espécies Passiflora obovata Killip e P. macdougaliana Knapp & Mallet. Esta seção foi proposta por Killip (1938) como pertencente ao subgênero Plectostemma Mast., com apenas uma espécie: P.

obovata, descrita por Killip (1936). Feuillet & MacDougal (2003), na redelimitação dos

subgênero Deidamioides e não ao subgênero Plectostemma, devido à presença de discos adesivos nas gavinhas e de um opérculo plicado.

A seção Tryphostemmatoides foi publicada por Harms (1925) com base no hipanto cupuliforme, flores pequenas, nascidas sobre uma gavinha, e folhas pequenas transversalmente elípticas. Killip (1938) elevou esta seção à categoria de subgênero, considerando os caracteres: pecíolo sem glândulas; pedúnculos bifloros terminando em uma gavinha; cálice (hipanto) campanulado e opérculo não plicado. Estes por si só, seriam caracteres suficientes para justificar a separação até em um novo gênero. Feuillet & MacDougal (2003) redelimitaram este grupo, considerando-o como uma seção do sugênero Deidamioides, com base nos mesmos caracteres propostos por Killip (1938).

A Seção Tryphostemmatoides é a maior seção em número de espécies do subgênero (cinco espécies). Estas espécies são caracterizadas por um crescimento delicado e folhas pequenas. Apresenta flores pequenas, que nascem aos pares sobre as gavinhas (caráter não encontrado em P. discophora Jørgensen & Lawesson). Entretanto, as gavinhas são 3-5-partidas, às vezes desenvolvem pequenos discos sobre as gavinhas que auxiliam no hábito trepador (Ulmer & MacDougal 2004).

Tetrapathea foi proposta por De Candolle (1828), como uma seção do gênero Passiflora, com distribuição restrita à Nova Zelândia. Harms (1894) elevou a seção à

categoria de gênero, considerando apenas uma espécie: T. australis Raoul, espécie atualmente sinonimizada para P. tetranda (Green 1972).

Allan (1961) manteve Tetrapathea como um gênero monoespecífico, ressaltando que os caracteres de dióicia e flores tetrâmeras seriam suficientes para considerar esta delimitação a nível genérico. Hutchinson (1967) considerou Tetrapathea como subgênero de Passiflora com base nos mesmos caracteres propostos por Allan (1961), acima citados.

Green (1972) fez a seguinte consideração em relação ao posicionamento de

Tetrapathea: “Apesar de ser mantida como um gênero monotípico, por Allan (1961),

uma separação genérica parece ser escassamente justificada para esta espécie. Esta diferenciação tem sido baseada nos caracteres: planta dióica e flores tetrâmeras, nenhum dos quais é único: flores tetrâmeras são encontradas em Passiflora octandra Gagnep, da Indo-China, enquanto na Flora da Nova Zelândia, as flores são notadas por serem dióicas. Há muito tempo atrás Thomson (1881) calculou que 46% das espécies nativas da Nova Zelândia nasceram com flores unissexuais e Heine (1937) remarca que “muitas espécies e gêneros os quais são hermafroditas em outras partes do mundo são

unissexuais na Nova Zelândia”; bons exemplos são encontrados em Clematis L.,

Melicope J.R.Forst. & G.Forst., Rubus L., Leptospermum J.R.Forst. & G.Forst. e Pimelia Link. A única espécie pertencente a esta seção, P. tetrandra, apresenta flores

masculinas com um ovário abortado, e os estames femininos estéreis, pode apresentar flores completamente similares às flores hermafroditas dos trópicos em Passiflora”.

Feuillet & MacDougal (2003) analisando todas as espécies de Passiflora, consideraram Tetrapathea como subgênero Deidamioides seção Tetrapathea. Ulmer & MacDougal (2004) apresentaram um checklist da classificação proposta por Feuillet & MacDougal (2003), onde são consideradas apenas cinco seções para o subgênero e, a seção Tetrapathea é novamente considerada como um gênero monoespecífico.

A seção Tetrapathea caracteriza-se por incluir lianas ca. 20 m alt.,

completamente glabras, lâmina foliar inteira, nunca lobada, glândulas ausentes ou um par na base da lâmina foliar, flores unissexuais, com estames remanescentes do ovário, hipanto estreito, sépalas e pétalas 4, livres, ca. 5-7 mm, corona de filamentos consistindo de 2 ou 3 series de filamentos, androginóforo 0,5 mm, estames 4, livres, anteras basifixas ou subdorsifixas, mais ou menos versáteis, ginóforo 0,5-2,5 mm, estiletes 4, livres ou parcialmente conadas; estigmas subgloboso, papiloso, discos nectaríferos ausentes.

O subgênero caracteriza-se por apresentar lianas a trepadeiras herbáceas, com gavinhas inteiras ou divididas no ápice, com um disco apical em algumas espécies, folhas inteiras ou 3-9-lobadas, com margem inteira, lâminas nunca variegadas, estípulas delgadas, glândulas peciolares próximas à junção da lâmina foliar, brácteas pequenas, flores pediceladas, opérculo plicado, os frutos são esverdeados, amarelos ou alaranjados e as sementes reticuladas. Todas as flores são nascidas sobre uma gavinha, ou um pedúnculo modificado em gavinha, um fenômeno que parece ser muito raro em Passiflora (Ulmer & MacDougal 2004).

Os objetivos deste estudo são: 1) realizar um estudo filogenético utilizando-se dados moleculares, visando esclarecer os relacionamentos dentro do grupo, e do grupo com os demais subgêneros de Passiflora; 2) realizar estudos biossistemáticos no complexo

Passiflora ovalis, um grupo de difícil delimitação com base nos métodos da taxonomia

clássica, utilizando ferramentas como: morfometria geométrica, morfometria tradicional e marcadores moleculares de ISSR; 3) realizar um estudo morfológico palinológico das espécies de Passiflora subgênero Deidamioides, visando auxiliar ou não os resultados

Passiflora subgênero Deidamioides, revendo as delimitações das seções e a inclusão das

espécies nas mesmas, com base no posicionamento taxonômico das espécies e nos caracteres morfológicos.

Esta tese está sendo apresentada em formato tradicional. Encontra-se dividida em cinco capítulos, sendo que todos eles apresentam uma nota introdutória sobre o tema abordado, bem como uma descrição da metodologia utilizada, resultados e discussões. As conclusões gerais são apresentadas ao final da tese, assim como toda a referência bibliográfica utilizada. Os capítulos apresentados nesta tese não estão sendo considerados como publicações válidas, e serão posteriormente formatados e encaminhados para revistas especializadas para efetiva publicação, bem como a descrição das novas espécies, segundo as normas do Código Internacional de Nomenclatura Botânica (Mcneill et al. 2006).

Tabela 01 – Sinopse das classificações anteriores para as espécies de Passiflora subgênero Deidamioides sensu Feuillet & MacDougal (2003).

Espécies De Candolle (1828) Harms (1925) Killip (1938) Feuillet & MacDougal (2003) 1 Passiflora arbelaezii L. Uribe

Subgênero Deidamioides seção Tryphostemmatoides 2 P. cirrhiflora A.Juss. Seção Polyanthea

Seção Decaloba Subseção

Cirrhiflora Subgênero Polyanthea Seção Polyanthea Subgênero Deidamioides seção Polyanthea 3 P. deidamioides Harms Subseção Deidamioides Subgênero Deidamioides Subgênero Deidamioides seção Deidamioides 4 P. discophora P. Jørg. & Lawesson

5 P. gracillima Killip

Subgênero Tryphostemmatoides

Subgênero Deidamioides seção Tryphostemmatoides

6 P. macdougaliana S. Knapp & Mallet

Subgênero Deidamioides seção Mayapathanthus 7 P. obovata Killip

Subgênero Plectostemma seção Mayapathanthus

Subgênero Deidamioides seção Mayapathanthus

8 P. ovalis Vell. ex M.Roemer Passiflora seção Tetrastylis Gênero Tetrastylis Subgênero Deidamioides seção Tetrastylis 9 P. pacifica L.A. Escobar

Subgênero Deidamioides seção Tryphostemmatoides 10 P. tetrandra Banks & Sol. ex DC.

Passiflora seção

Tetrapathea Gênero Tetrapathea Gênero Tetrapathea Subgênero Deidamioides seção Tetrapathea 11 P. tryphostemmatoides Harms Seção Tryphostemmatoides Subgênero Tryphostemmatoides

Subgênero Deidamioides seção Tryphostemmatoides

Capítulo I

Estudos filogenéticos moleculares em Passiflora L. subgênero

Deidamioides (Harms) Killip (Passifloraceae)

Estudos filogenéticos moleculares em Passiflora L. subgênero

Deidamioides (Harms) Killip (Passifloraceae)

O uso de marcadores moleculares, entre eles o espaçador interno transcrito do DNA ribossomal nuclear (ITS) (Baldwin et al. 1995; Muschner et al. 2003; Krosnick et al. 2006; Zamberlan 2007) e dos marcadores plastidiais trnL-F (Reeves & Olmstead 1998; Fay et al. 2000; Richardson et al. 2000; Seahan & Chase 2000; Krosnick & Freudenstein 2005; Krosnick et al. 2006) tem sido aplicado com sucesso nas inferências filogenéticas inter e intragenéricas e interespecíficas em vários grupos de fanerógamas.

Durante muito tempo, a delimitação de Passifloraceae foi sustentada morfologicamente pela presença da corona de filamentos e de um androginóforo (Killip, 1938; Wilde 1971; Judd et al. 1999; Ulmer & MacDougal 2004). Porém, na delimitação proposta pelo APG II (2003), com base em dados moleculares, Passifloraceae aparece como monofilética com a inclusão de Malesherbiaceae e Turneraceae. Nesta delimitação

sensu lato a família possui ca. 800 espécies e 28 gêneros, apresentando como grupos

irmãos as famílias Euphorbiaceae, Malpighiaceae e Flacourtiaceae. Este clado é sustentado pela presença de glicosídeo cianogênico, folhas denteadas, glândulas foliares, cálice e corola formando um tubo, corona extra-estaminal, presença de hipanto e exotegma paliçado (Stevens 2001).

Até o momento nenhum estudo filogenético para Passifloraceae abordando todos os gêneros da família foi realizado, visando esclarecer os relacionamentos em níveis genéricos, porém, alguns estudos já foram realizados enfocando principalmente o gênero

Passiflora (Sanchez et al. 1999; Muschner et al. 2003; Yockteng & Nadot 2004a, 2004b;

Krosnick & Freudenstein 2005; Krosnick et al. 2006; Hansen et al. 2006 e Zamberlan 2007).

Passiflora L. é o maior gênero de Passifloraceae, com ca. 450 espécies de

distribuição predominantemente Neotropical, e com algumas espécies restritas ao Velho Mundo, nas regiões tropicais e subtropicais da Ásia, Austrália e Nova Zelândia. As espécies deste gênero apresentam morfologia diversa em estrutura floral e foliar.

Sánchez et al. (1999) publicaram o primeiro estudo filogenético em Passiflora, utilizando DNA de cloroplasto (cpDNA). Neste trabalho, os autores utilizaram 35 espécimes de 12 espécies cultivadas do gênero, sendo obtidos cinco fragmentos clonados de cpDNA (Mb1, Mb2, Mb3, Mb8 e Mb10), que foram utilizados como marcadores

filogenéticos. Os resultados levaram os autores a reconhecer três subgêneros: Decaloba,

Tacsonia e Passiflora, confirmando, segundo a taxonomia vigente no período, três seções

de Passiflora: Incarnatae, Tiliaefoliae e Lobatae (Killip 1938). O subgênero Tacsonia e as seções foram incluídas no subgênero Passiflora sensu Feuillet & MacDougal (2003). Nenhuma espécie do subgênero Deidamioides foi utilizada neste estudo.

Muschner et al. (2003) publicaram um estudo filogenético de Passiflora, utilizando

o espaçador interno transcrito do DNA ribossomal nuclear (ITS) e os marcadores plastidiais trnL-F e rps4. Como resultado os autores apresentaram três clados maiores com alto valor de bootstrap (BS), correspondendo aos subgêneros Passiflora (97%), Decaloba (99%) e Astrophea (97%). O subgênero Deidamioides foi representado pelas espécies

Passiflora lancetillensis MacDougal & Meerman e Tetrastylis ovalis Vell. (=Passiflora ovalis Vell. ex M.Roemer), porém P. lancetillensis, pertence ao subgênero Decaloba seção Plectostemma (Ulmer & MacDougal 2004), e foi classificada erroneamente como

pertencente ao subgênero Deidamioides. A única espécie de Deidamioides utilizada nesta análise foi T. ovalis, esta aparece relacionada ao clado que reúne as espécies do subgênero

Passiflora, com 100% (BS), na análise de máxima verossimilhança com os dados

combinados de ITS e trnL-F. Na topologia obtida com os dados de rps4, esta espécie aparece como grupo irmão dos outros subgêneros de Passiflora, porém, apresentando baixo valor de sustentação (>50% BS). O monofiletismo do subgênero Deidamioides ficou indefinido, segundo os resultados apresentados.

Yockteng & Nadot (2004a) realizaram uma análise filogenética com as espécies de

Passiflora utilizando as regiões cytGS e matK (cloroplasto), além de ncpGS (nuclear), que

exibem, segundo os autores, um grande potencial para investigar a história evolutiva de espécies próximas. Os resultados mostraram que as regiões são filogeneticamente informativas para o gênero, porém, os autores só utilizaram espécies do subgênero

Decaloba, não realizando nenhuma inferência sobre a classificação deste grupo.

Yockteng & Nadot (2004b) publicaram um trabalho filogenético para Passiflora usando o gene nuclear (ncpGS), incluindo 17 subgêneros dos 23 reconhecidos por Killip (1938), totalizando 91 espécies. Como resultado, os autores reconheceram três clados: Clado 1: incluiu basicamente o subgênero Astrophea com 88% (BS), tendo como espécie relacionada P. tryphostemmatoides Harms, a qual segundo a classificação proposta por Feuillet & MacDougal (2003) pertenceria ao subgênero Deidamioides seção

Tryphostemmatoides. O clado 2 apresenta um alto valor de sustentação (87% BS), e incluiu

(Killip 1938). Neste clado, a maioria das espécies pertence ao subgênero Decaloba seção

Plectostemma, segundo a delimitação proposta por Feuillet & MacDougal (2003). O clado

3 fortemente sustentado, com 100% (BS), incluiu as espécies dos subgêneros

Calopathanthus, Granadilla, Distephana, Manicata, Psilanthus, Tacsonia e Tacsonioides

(Killip 1938) e apresenta como grupo irmão o subgênero Dysosmia. Este clado corresponde a Passiflora subgênero Passiflora segundo Feuillet & MacDougal (2003).

Nesta análise, os autores incluíram a espécie P. cirrhiflora A.Juss. (Deidamioides seção Polyanthea DC. sensu Feuillet & MacDougal 2003), que aparece isolada como o grupo mais basal dentro do gênero, tendo como grupo mais próximo o subgênero

Astrophea. P. lancetillensis (tratada no artigo como pertencente ao subgênero Deidamioides, mas, que como já foi dito anteriormente, pertence ao subgênero Decaloba

seção Plectostemma), aparece agrupada com as espécies do subgênero Plectostemma, com 87% (BS). Assim, a única espécie do subgênero Deidamioides não aparece correlacionada, sendo o subgênero classificado como parafilético pelos autores.

Krosnick & Freudenstein (2005) realizaram um estudo filogenético com dados moleculares com o espaçado nuclear ITS, e o espaçador plastidial trnL-F, para algumas espécies de Passiflora do Velho Mundo e inferiram dados de caracteres florais. Foram utilizadas espécies de Decaloba superseção Disemma (21 espécies), e espécies dos outros subgêneros propostos por Feuillet & MacDougal (2003) como grupo externo: Astrophea (duas espécies) e Deidamioides (P. arbelaezii L.Uribe). A análise combinada entre as duas regiões utilizadas apresentou como resultado o monofiletismo dos subgêneros Passiflora (97% valor de Jackknife), Astrophea (100%) e Decaloba (78%). A única espécie tratada do subgênero Deidamioides apareceu como grupo irmão de Astrophea com um valor de sustentação de 74% (Jackknife).

Krosnick et al. (2006) fizeram uma análise filogenética com o subgênero Decaloba

superseção Disemma, utilizando os espaçadores ITS e trnL-F, na tentativa de elucidar a diferença na morfologia floral, considerada anômala, em algumas espécies do subgênero

Decaloba. Os autores inferiram dados morfológicos, e compararam com as espécies da

superseção Multiflora, baseando-se no padrão geral do gênero. Neste estudo foram utilizadas espécies dos subgêneros Decaloba (26) e P. arbelaezii (subgênero

Deidamioides), não sendo possível fazer qualquer inferência sobre a classificação

infragenérica.

cromossômico. Neste estudo foram tratadas 61 espécies pertencentes a 16 subgêneros propostos por Killip (1938), e quatro outros gêneros considerados como grupo externo (incluindo Tetrastylis ovalis = Passiflora ovalis). Como resultados os autores apresentam três grupos: grupo n=6, grupo n=9 e grupo n=12. O grupo n=6 (100% BS) equivale ao subgênero Decaloba proposto por Feuillet & MacDougal (2003). O grupo n=9 também se apresentou como um grupo monofilético (99-100% BS) e corresponde ao subgênero

Passiflora proposto por Feuillet & MacDougal (2003). O grupo n=12 apresentou espécies

dos subgêneros Deidamioides e Astrophea, sendo o subgênero Deidamioides representado por três espécies: P. deidamioides, P. cirrhiflora e T. ovalis.Os resultados obtidos com os marcadores moleculares sustentaram o monofiletismo dos subgêneros estudados.

Zamberlan (2007) realizou um estudo filogenético para Passiflora, utilizando três regiões: os genes plastidiais rpoC1, nad1 e espaçador nuclear ITS, com 121 espécies do gênero. Neste estudo foi confirmado o monofiletismo dos subgêneros Passiflora (100% BS, 0.99 probabilidade posterior da bayesiana (pp), Astrophea (100% BS, 1.00 pp) e

Decaloba (100% BS, 1.00 pp). O subgênero Deidamioides na análise de ITS (representado

pelas espécies: P. arbelaezii, P. cirrhiflora, P. deidamioides, P. discophora e T. ovalis) apareceu como monofilético (0.99 pp) com a exclusão de T. ovalis. Na análise com rpoC1 utilizando as espécies P. cirrhiflora, P. deidamioides e T. ovalis, o subgênero aparece como monofilético com a exclusão de T. ovalis, mas com baixo valor de suporte (0.59 pp). Com dados de nad1 com as espécies P. cirrhiflora, P. deidamioides e T. ovalis, o subgênero também foi considerado como monofilético com 73% (BS). A autora considerou o subgênero polifilético e sugeriu a possível existência de um quinto subgênero: Tryphostemmatoides representado pelas espécies P. arbelaezii e P. discophora. Porém, ressaltou a necessidade de um estudo com um número maior de espécies para elucidar esta questão, e não reconheceu as superseções e seções propostas por Feuillet & MacDougal (2003) como monofiléticas.

Com base nestes estudos realizados basicamente com o gênero Passiflora, que apresentam uma baixa amostragem do subgênero Deidamioides, e devido a toda a problemática correlacionada à delimitação do subgênero (apresentada na introdução e no capítulo cinco desta tese), fica clara a necessidade de um estudo filogenético incluindo mais espécies deste subgênero, devidamente identificadas, visando elucidar seu posicionamento em relação aos demais subgêneros de Passiflora, e seus relacionamentos interespecíficos. Sendo assim, esse capítulo teve como objetivo realizar um estudo filogenético do subgênero Deidamioides, para comprovar ou não o seu monofiletismo, bem

como verificar a delimitação das possíveis seções e enquadramento das espécies dentro das mesmas, utilizando-se dados de ITS e trnL-F e comparar este resultados com os dados morfológicos.

Material e métodos Amostragem

Foram analisadas 66 espécies, das quais 63 formaram o grupo interno pertencentes aos subgêneros de Passiflora: sendo do subgênero Deidamioides (11 espécies), Astrophea (3), Decaloba (31), Passiflora (18), e três corresponderam ao grupo externo, incluindo as espécies Mitostemma glaziovii Mast. (Passifloraceae), Malesherbia lanceolata Ricardi e M.

weberbaueri Gilg. (Malesherbiaceae, considerada pelo APG II (2003), como pertencente a

Passifloraceae), para a região de ITS. Para a análise do espaçador plastidial trnL-F foram analisadas 21 espécies: subgênero Deidamioides (6), Decaloba (6), Passiflora (8) e M.

glaziovii como grupo externo (Tabela 02).

O DNA foi extraído de material fresco coletado diretamente do campo e preservado em sílica-gel ou de material de herbário (com a devida autorização dos herbários de origem), quando não foi possível coletá-los em campo. Não foi possível obter amostragem completa de todas as espécies do subgênero Deidamioides para as duas regiões analisadas devido à dificuldade em amplificar e seqüenciar algumas amostras.

Foram obtidos acessos genômicos para os subgêneros Passiflora, Decaloba e

Astrophea através do GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov – Tabela 02). As espécies do grupo externo foram utilizadas com o objetivo de forçar um enraizamento das árvores obtidas, e foram escolhidas por já terem sido referenciadas em trabalhos anteriores como espécies próximas ao grupo em questão (Muschner et al. 2003; Krosnick & Freudenstein 2005; Hansen et al. 2006).

Seleção de regiões informativas

Para o desenvolvimento deste trabalho foram testadas várias regiões moleculares a fim de encontrar aquelas que apresentassem uma maior variação entre as espécies utilizadas, com o intuito de responder à questão principal. As regiões testadas foram: espaçador nuclear: ITS, espaçadores de plastídio: trnS-trnG, psbA-trnH, rpoB-trnC,

trnD-T, trnL-F. Dentre estas, as regiões de ITS e trnL-F, se mostraram mais informativas, e

Tabela 02 - Lista de espécies de Passiflora e grupo externo usado neste estudo

(classificação proposta por Feuillet & MacDougal (2003)), número de acessos, regiões sequenciadas e origem dos dados, utilizados na análise de ITS e trnL-F

Gênero/ Subgênero

Espécie Coletor + No. Região Origem

Mitostemma Mitostemma glaziovii T.S.Nunes 1813 ITS

trnL-F

Espírito Santo: Linhares

Malesherbia Malesherbia lanceolata AY636103 ITS GENBANK

M. werberberi AY632697 ITS GENBANK

Astrophea Passiflora candida DQ521279 ITS GENBANK

P. citrifolia AY632707 ITS GENBANK

P. haematostigma AY032835 ITS GENBANK

Decaloba P. adenopoda AY632702 ITS GENBANK

P. aurantia DQ521280 ITS GENBANK

P. auriculata DQ284532 ITS GENBANK

P. biflora AY632705 ITS GENBANK

P. cinnabarina AY632706 ITS GENBANK

P. coriacea AF454807 ITS GENBANK

P. cupiformis AY632708 ITS GENBANK

P. filipes AY632709 ITS GENBANK

P. guatemalensis DQ087419 ITS GENBANK

P. henryii AY632710 ITS GENBANK

P. herbertiana AY632711 ITS GENBANK

P. holosericea DQ087417 ITS GENBANK

P. jugorum AY632712 ITS GENBANK

P. lobata AF454808 ITS GENBANK

P. lutea DQ006022 ITS GENBANK

P. membranacea AY632701 ITS GENBANK

P. mexicana AY632713 ITS GENBANK

P. misera T.S.Nunes 1373 trnL-F GENBANK

P. moluccana DQ284536

ITS Bahia: Porto Seguro

P. monadelpha DQ087418 ITS GENBANK

P. morifolia AY032842 ITS GENBANK

P. multiflora AY632715 ITS GENBANK

P. murucuja AY648559 ITS GENBANK

P. perakensis DQ087422 ITS GENBANK

P. pohlii T.S.Nunes 1724

trnL-F E. Santo: Santa

P. rubra AY632716 ITS GENBANK

P. siamica AY632717 ITS GENBANK

P. suberosa AY632718 ITS GENBANK

P. suberosa T.S.Nunes 1825

trnL-F E. Santo: Vargem

Alta

P. talamancensis AF454809 ITS GENBANK

P. tenuiloba AY632719 ITS GENBANK

P. tonkinensis DQ087424 ITS GENBANK

P. wilsonii DQ087425 ITS GENBANK

Passiflora P. alata AF454800 ITS GENBANK

P. alata T.S.Nunes 1797 trnL-F Bahia: Igrapiúna

P. ambigua AF454801 ITS GENBANK

P. ampullacea AY632720 ITS GENBANK

P. caerulea AY032824 ITS GENBANK

P. cincinnata AY102383 ITS GENBANK

P. cincinnata T.S.Nunes 1861

trnL-F Minas Gerais:

Itaobim

P. clathrata J.F.Pastore 2331 trnL-F Goiás: Goiânia

P. edmundoi AY102351 ITS GENBANK

P. edmundoi V.Barreto 238

trnL-F Bahia: Campo

Formoso

P. edulis AF454803 ITS GENBANK

P. foetida DQ499117 ITS GENBANK

P. galbana AY032843 ITS GENBANK

P. galbana A.P.L.Couto 39

trnL-F Bahia: Feira de

Santana

P. luetzelburgii D.Cardoso 866 trnL-F Bahia: Casa Nova

P. menispermifolia AF454795 ITS GENBANK

P. miersii T.S.Nunes 1813A

ITS Espírito Santo: Linhares

P. montana Glaziou 12741 trnL-F GENBANK

P. mucronata AY210932 ITS GENBANK

P. oerstedii AF454797 ITS GENBANK

P. quadrangularis AY032827 ITS GENBANK

P. recurva AY102349 ITS GENBANK

P. serrato-digitata AY210935 ITS GENBANK

P. setacea

R.M.Harley 54513

trnL-F Bahia: Nova

Redenção

P. tetrandra DQ499118 ITS GENBANK ITS GENBANK

Deidamioides P. arbelaezii DQ521278.1 ITS GENBANK

P. cirrhiflora

L.A.Escobar 9870

ITS Guiana Francesa: Cayenne

P. contracta T.S.Nunes 1789 ITS

trnL-F

Bahia: Ilhéus

P. deidamioides Marquete 3060 ITS

trnL-F Minas Gerais: Lima Duarte P. discophora L.B.J 240 ITS trnL-F Equador P. gracillima L.A.Escobar 6845 ITS Colômbia: Guatupé

P. macdougaliana S.Knapp 5278 ITS

trnL-F

Panamá:Colón

P. ovalis AY210955 ITS GENBANK

P. ovalis T.S.Nunes 1837 trnL-F Rio da Janeiro: Parati P. timboënsis A.M.Amorim 7027

ITS Bahia: Amargosa

P. tryphostemmatoides Asplund 19605

ITS Equador: Napo-Pastaza

Tabela 03 – Caracteres morfológicos para as seções de Deidamioides sensu Feuillet & MacDougal (2003).

Caráter Polyanthea Deidamioides Tetrastylis Mayapathanthus Tryphostemmatoides Tetrapathea

Desenvolvimento do xilema secundário Lenhoso ou herbáceo Herbáceo ou lenhoso Lenhoso Herbáceo ou Lenhoso Herbáceo Lenhoso

Inflorescência Biflora Biflora Racemosa Uni ou biflora Biflora Racemosa

Número de flores por inflorescência 2 2 Várias 1-2 2 (2-)3-4 flores

Divisão foliar 5-7-9-lobadas 3-lobadas Inteiras Inteiras Inteiras Inteiras

Indumento do caule Viloso Glabro Glabro ou viloso Glabro Glabro Glabro

Crescimento Escandente Escandente Ereto Ereto Escandente Ereto

No. de glândula no pecíolo 2 (2-)4-6 2 2 6-8 Ausentes

Divisão da gavinha Ausente Ausente Ausente Ausente Presente Ausente

Presença de discos adesivos na gavinha Ausente Ausente Presente Ausente/Presente Presente Ausente

Formato da bráctea Linear-subulada Linear-lanceolada Linear-lanceolada a triangular Linear-deltóide a triangular Linear-deltóide Bractéola subulada-filiforme

Presença de glândula na bráctea Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente

Cor da corola Amarela Branca Branca-esverdeada ou amarronzada Branca Verde a verde-amarelada Amarelo-esverdeada

Glândulas nas Sépalas Ausentes Ausentes Presente Presente Ausentes Ausentes

Glândulas nas Pétalas Ausentes Ausentes Ausentes Ausentes Ausentes Presentes

Hipanto

Curto-campanulado a

infundibuliforme Campanulado Curto-campanulado Curto-campanulado Curto-campanulado Ausente

Cor dos filamentos da corona Amarelo-alaranjada Branca Branca Branca Branca Branca

Filamentos da corona 3 3-5 2 4-10 2 Várias séries

Formato do opérculo Plicado Plicado Inteiro ou plicado Plicado Não plicado Ausente

Número de Estiletes 3 3 4 3 3 2-3

Estames 5 5 5 5 5 4

Fruto

Baga oboval-globosa a

elíptica Baga elíptica Baga elíptica a globosa Baga globosa Baga 6-angulada Baga subglobosa

Cor do fruto maduro Amarelo Amarelo a laranja Amarelos a laranja com manchas alvas Verdes Alaranjado Alaranjado

Fornato das sementes

Ovais a obovais, 5-6 sulcadas

Elípticas a ovais, oblongas,

Reticuladas Reticuladas ou foveoladas Onduladas a reticuladas

Reticuladas

Achatadas

Número cromossômico 12 12 12

Extração de DNA

A extração do DNA foi feita seguindo o protocolo de Doyle & Doyle (1987), com adaptações feitas de acordo com os resultados preliminares obtidos. O DNA total foi extraído de ca. 20mg de folha desidratada em sílica-gel, com protocolo de CTAB (cetyltrimetil ammonium bromide), triturado com auxílio de areia lavada ou nitrogênio líquido. Esta solução foi colocada em banho-maria por 20 minutos com a temperatura entre 60-70ºC, após esse período, foi acrescentado 800µl de clorofórmio e homogeneizado em agitador por 240 minutos. Com a ajuda da pipeta foi retirado o sobrenadante, transportado para outro tubo e adicionado isopropanol (2-propanol), deixado no freezer por 24 horas. Em seguida foi centrifugado e sobrenadante foi descartado, o pellet formado foi lavado com etanol a 70% por 2 ou 3 vezes até que o DNA ficasse claro a olho nu. Acrescentado o tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH8,0; EDTA 1 mM), o DNA ficou ressuspendendo por até uma semana, em temperatura ambiente.

Amplificação, seqüenciamento e alinhamento

A amplificação do DNA total foi realizada através do protocolo específico para cada primer, através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

ITS: incluindo ITS-1, 5.8S e ITS 2, foram utilizados os primers 75 (5’ TAT

GCT TAA ACT CAG CGG G 3’) e 92 (5’ AAG GTT TCC GTA GGT GAA C 3’) (Desfeaux et al. 1996), foi amplificado com um volume final de 50µl, contendo 5µl de tampão (500 mM KCL, 100 mM, Tris-HCl pH8,4, 1% Triton X-100 – Phoneutria Biotec. Ser. Ltda.) (10x); 2,0µl de MgCl, 1,0µl de dNTPs, 0,5µl de cada primer, 1,0µl de BSA (albumina bovina sérica), 0,25µl de Taq DNA polimerase (Phoneutria Biotec. Ser. Ltda) e 1,5µl de DNA genômico, 10µl de Betaína e 1,5µl de DMSO (dimethyl

sulfoxide), sendo adicionado H20 (água ultra-pura) para completar o volume final. O

programa de amplificação utilizado foi: pré-aquecimento de 94ºC por 3min, denaturação de 94ºC por 45 seg, 40 ciclos de 52ºC por 1,5 min (anelamento) e 72ºC por 1,30 min (extensão) e extensão final de 72ºC por 10min.

trnL-F: foi amplificado com o auxílio dos primers C (5’CGA AAT CGG TAG

ACG CTA CG 3”) e F (5’ GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC 3’) (Taberlet et al. 1991), com um volume final de 50µl, contendo 5,0µl de tampão 10x; 3,0µl de MgCl, 1,0µl de dNTPs, 0,5µl de cada primer, 0,5µl de BSA, 0,25µl de Taq DNA polimerase e 2µl de DNA genômico, sendo o mix completado com H20 para completar o volume