Figura 3: Distribuição de epítopos definidos pelos monoclonais 4B5, 4D9 e 3B9 em amastigotas extracelulares de T. dionisii. Parasitas isolados foram submetidos a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.1). (A, C, E) contraste interferencial de Nomarski (DIC). (B) 4B5: marcação pontual nos pólos (setas). (D) 4D9: marcação superficial (setas) e marcação na bolsa flagelar (cabeça de seta). (F) 3B9: marcação superficial (setas) e parasitas não marcados (cabeças de seta). Anticorpos monoclonais em ciano e DNA de núcleos e cinetoplastos em vermelho (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barras de aumento: 10 µm.
Figura 4: Distribuição de epítopos definidos pelos monoclonais 4B5, 4D9 e 3B9 em epimastigotas de T. dionisii. Parasitas isolados foram submetidos a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.1). (A, C, E) contraste interferencial de Nomarski (DIC). (B) 4B5: parasitas com marcação pontual próxima ao cinetoplasto (setas) e parasitas não marcados (cabeças de seta). (D) 4D9: forte marcação superficial (setas) e formas em transição também com marcação superficial (cabeças de seta). (F) 3B9: marcação superficial evidenciando o contorno dos parasitas e em alguns casos pontual na região do cinetoplasto (setas). Parasitas não marcados (cabeças de seta). Anticorpos monoclonais em ciano e DNA de núcleos e cinetoplastos em vermelho (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barras de aumento: 10 µm.
Figura 5: Distribuição de epítopos definidos pelos monoclonais 3B9 e 4D9 em tripomastigotas metacíclicos de T. dionisii. Parasitas isolados foram submetidos a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.1). (A, C, E) contraste interferencial de Nomarski (DIC). (B) 3B9: parasita com marcação superficial (seta). (D) 3B9: forma em transição com marcação superficial (seta) e parasita não marcado (cabeça de seta). (F) 4D9: marcação superficial na região de contato do flagelo com o corpo celular (seta). Anticorpos monoclonais em ciano e DNA de núcleos e cinetoplastos em vermelho (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barras de aumento: 10 µm.
4.2 Duplas marcações com anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepas G e CL
Células COS-7 infectadas com T. dionisii, apresentando ninhos de amastigotas, foram submetidas ao protocolo de imunofluorescência (item 3.4.2) e analisadas em microscopia de imunofluorescência convencional e microscopia confocal.
A dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B5 e 4B9 mostra parasitas marcados apenas com o epítopo definido pelo monoclonal 4B5 (marcação característica pontual nos pólos, em vermelho) e alguns marcados com ambos os monoclonais (4B5 pontual nos pólos em vermelho e 4B9 marcação de superfície, em verde - figura 6).
Na dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B5 e 3B9 nota-se a grande semelhança, já mostrada nas marcações isoladas, existente na distribuição dos epítopos 4B9 e 3B9 evidenciando a superfície dos parasitas. Verifica-se um ninho de amastigotas marcados com ambos os epítopos (4B5 e 3B9) com o mesmo padrão de distribuição vista na dupla marcação anterior (figura 7).
A dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B9 e 3B9 revelou parasitas (amastigotas) apresentando apenas o epítopo marcado pelo monoclonal 3B9 e alguns parasitas marcados pelos dois anticorpos, evidenciando co-localização dos epítopos (figuras 8 e 8D). Esta dupla marcação revelou ninhos de TCT em que praticamente todos os parasitas estão marcados com os dois anticorpos (co-localização) (resultado não mostrado).
A dupla marcação com os anticorpos monoclonais 2B6 e 3B9 mostrou parasitas marcados apenas com o monoclonal 2B6 e outros marcados com ambos os anticorpos, porém evidenciando maior abundância do epítopo definido pelo monoclonal 3B9. A marcação por 3B9 predomina na superfície dos amastigotas; porém, 2B6 revela uma marcação fraca com distribuição predominantemente intracelular e pontual do epítopo (figura 9).
A dupla marcação com os anticorpos monoclonais 2B6 e 4B9 evidenciou o mesmo padrão de distribuição de epítopos revelado no experimento anterior (figura 9), ou seja, marcação pontual intracelular do 2B6 e superfícial do 4B9. Verificou-se parasitas marcados apenas com o monoclonal 2B6 e parasitas marcados com ambos os anticorpos, evidenciando predomínio do epítopo 4B9 (resultado não mostrado).
Figura 6: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B5 e 4B9. Células COS-7 96hs após infecção com formas tripomastigotas metacíclicas, foram submetidas a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.2) (A) contraste de fase. (B) parasitas marcados apenas com o monoclonal 4B9 (evidencia a marcação de superfície). (C) parasitas marcados apenas com o monoclonal 4B5 (evidencia a marcação pontual nos pólos). (D) parasitas apenas com marcação pontual nos pólos (4B5, em vermelho) (cabeças de seta) e parasitas marcados com ambos os monoclonais (4B9, em verde e 4B5, em vermelho, setas); DNA de núcleos e cinetoplastos marcado em azul (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barra de aumento: 10 µm.
Figura 7: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B5 e 3B9. Células COS-7 96hs após infecção com formas tripomastigotas metacíclicas, foram submetidas a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.2) (A) contraste de fase. (B) parasitas marcados apenas com o monoclonal 3B9 (evidencia a marcação de superfície). (C) parasitas marcados apenas com o monoclonal 4B5 (evidencia a marcação pontual nos pólos). (D) parasitas marcados apenas com o 3B9 (cabeças de seta), e parasitas marcados com ambos os monoclonais (3B9 em verde, e 4B5 em vermelho, setas); DNA de núcleos e cinetoplastos em azul (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barra de aumento: 10 µm.
Figura 8: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B9 e 3B9. Células COS-7 96hs após infecção com formas tripomastigotas metacíclicas, foram submetidas a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.2). (A) contraste de fase (B) parasitas marcados apenas com o monoclonal 4B9 (evidencia a marcação de superfície). (C) parasitas marcados apenas com o monoclonal 3B9 (evidencia a marcação de superfície). (D) parasitas marcados apenas com 3B9 (em vermelho, cabeças de seta) e parasitas apresentando co-expressão dos epítopos em amarelo (4B9 em vermelho e 3B9 em verde, setas); DNA de núcleos e cinetoplastos marcado em azul (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barra de aumento: 10 µm.
Figura 9: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 2B6 e 3B9. Células COS-7 96hs após infecção com formas tripomastigotas metacíclicas, foram submetidas a protocolo de imunofluorescência (item 3.4.2). (A) contraste de fase; (B) parasitas marcados apenas com o monoclonal 3B9 (evidencia marcação superficial e também difusa no citoplasma). (C) parasitas marcados apenas com o monoclonal 2B6 (evidencia marcação pontual intracelular). (D) parasitas marcados apenas com o 2B6 (em vermelho, cabeças de seta) e parasitas marcados com ambos os monoclonais (2B6 em vermelho e 3B9 em verde, setas); DNA de núcleos e cinetoplastos marcado em azul (DAPI). Imagens adquiridas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1). Barra de aumento: 10 µm.
A Tabela 1 sumariza a expressão e distribuição relativa dos epítopos reconhecidos pelos monoclonais anti-T. cruzi testados neste trabalho e revela diferenças e semelhanças existentes na sua distribuição nas espécies T. cruzi e T. dionisii.
Tabela 1: Caracterização da reação dos anticorpos monoclonais anti-T. cruzi com epítopos de T. cruzi e T. dionisii.
Anticorpos monoclonais Distribuição da marcação em T. cruzi Distribuição da marcação em T. dionisii 1D9
(anti-T. cruzi cepa G) Superficie interno de amastigotas e pontual Nenhuma marcação 3B9
(anti-T. cruzi cepa G) Superfície de alguns amastigotas Superfície de alguns amastigotas e TCT 4B9
(anti-T. cruzi cepa G) Superfície de alguns amastigotas Superfície de alguns amastigotas e TCT 4B5
(anti-T. cruzi cepa G) Bolsa superfície flagelar de e
amastigotas e tripomastigotas Bolsa flagelar e superfície de amastigotas e tripomastigotas 4D9
(anti-T. cruzi cepa G) Região de contato do flagelo com o corpo celular de TCT
Região de contato do flagelo com o corpo celular de todas as formas evolutivas
3B2
(anti-T. cruzi cepa G) Superfície de TCT Superfície de TCT
2B6
(anti-T. cruzi cepa CL) Pontual amastigotas interno de Pontual amastigotas interno de 2G5
4.3 Processo de invasão celular do T. dionisii em células COS-7
Trypanosoma dionisii recrutou lisossomos da célula hospedeira durante seu processo de invasão, que culminou com a formação de vacúolos parasitóforos marcados para LAMP-1 (glicoproteína presente nos lisossomos).
Com 15 min de infecção observaram-se parasitas internalizados, com lisossomos muito próximos, o que sugere recrutamento lisosomal após invasão (figura 10A), além de parasitas no interior de vacúolos LAMP-1 positivos (figura 10B). Com 1 h de infecção verificou-se que 50% dos parasitas encontravam-se dentro de vacúolos parasitóforos (LAMP-1 positivos), proporção que se manteve de duas até seis horas de infecção. Com 12 hs praticamente todos os parasitas ainda encontravam-se dentro de vacúolos LAMP-1 positivos (figura 10C) e, finalmente, após 24hs de infecção, verificou-se que apenas 30% dos parasitas (tripomastigotas metacíclicos) mantiveram-se em vacúolos LAMP-1 positivos, indicando que a maioria já havia escapado ao citoplasma. A partir de 24 hs notou-se que uma porcentagem razoável destes tripomastigotas metacíclicos transformou-se em amastigotas (30%), e 8% destes amastigotas ainda permaneceu dentro destes vacúolos por até 96 horas (figura 11). Estes vacúolos LAMP-1 positivos das formas amastigotas foram visivelmente maiores do que os vacúolos LAMP-1 positivos das formas tripomastigotas metacíclicas de T. dionisii. Estes dados foram representados graficamente ilustrando a cinética de formação de vacúolos parasitóforos LAMP-1 positivos durante o processo de invasão por T. dionisii (figuras 12A e B), bem como o aparecimento de amastigotas dentro e fora destes vacúolos parasitóforos.
