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ELISA HELENA DA COSTA MORAIS
DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEQUENCIAL
CAMPINAS 2014
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
ELISA HELENA DA COSTA MORAIS
DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEQUENCIAL
ORIENTADORA: PROFA. DRA. ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP
PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
DOUTORA EM CIÊNCIAS
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR ELISA HELENA DA COSTA MORAIS E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM
_______________________ Assinatura da Orientadora
CAMPINAS 2014
iv
FICHA CATOLOGRÁFICA
v
vii
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência
em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo,
quem busca e vence obstáculos, no mínimo
fará coisas admiráveis.”
(José de Alencar)
ix
AGRADECIMENTOS
Expresso meus agradecimentos a todos aqueles que direta ou indiretamente, contribuíram de forma positiva para a realização deste trabalho.
A Deus, que em todos os momentos me fez sentir a sua presença, e por tudo que Ele tem me proporcionado.
A meus pais, José Maria e Aparecida, que sempre foram presença viva nos momentos felizes e de dificuldades. Obrigada por todo amor e incentivo.
À minha irmã Érika pelos conselhos e amizade.
Ao meu esposo, Paulo Henrique, que em todos os momentos me apoiou e me deu forças para a realização deste trabalho.
À Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, particularmente ao Instituto de Química, pela oportunidade de realizar o doutorado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.
Em especial, à Profª. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, pela oportunidade, incentivo, confiança, pelos ensinamentos transmitidos e pela dedicada orientação.
À Profa. Dra. Carol Hollingworth Collins, pela disponibilidade, contribuições, ensinamentos e importantes sugestões para o desenvolvimento desse trabalho.
A todos colegas do grupo do Laboratório de Pesquisa em Cromatografia Líquida, LABCROM, Cláudio, Cristiane, Elias, Fernanda, Karen, Lucília e Renata Magueta, em especial à Luana e Renata Nome, pelos conselhos, paciência, pelos momentos de diversão, e além de tudo pela verdadeira amizade.
xi
CURRICULUM VITAE
1 FORMAÇÃO ACADÊMICA
Mestrado em Agroquímica
• Instituição: Universidade Federal de Viçosa, UFV, Viçosa, Brasil.
• Título da dissertação: Análise multirresíduo de agrotóxicos em abacaxi por CG/DCE.
• Orientadora: Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz. • Bolsista: CNPq.
• Período: 2008 a 2010.
Graduação em Química (licenciatura e bacharelado)
• Instituição: Universidade Federal de Viçosa, UFV, Viçosa, Brasil.
• Título da monografia: Influência dos componentes do abacaxi na quantificação de agrotóxicos por cromatografia gasosa.
• Orientadora: Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz. • Período: 2004 a 2008 e 2010.
2 EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL
Professora de Química do ensino médio
• Escolas: Escola de Aplicação da UNIPAC, Barbacena, Brasil.
Escola Estadual Henrique Diniz - EEHD, Barbacena, Brasil. Centro Educacional Aprendiz - APRENDIZ, Barbacena, Brasil. • Período: 2010 a 2011.
xii
3 EXPERIÊNCIA ACADÊMICA
Monitora de Química do ensino médio
• Escolas: Colégio de Aplicação - COLUNI, Viçosa, Brasil.
Colégio Ângulo de Viçosa - ANGLO, Viçosa, Brasil. • Período: 2007 a 2008.
Iniciação científica
• Instituição: Universidade Federal de Viçosa, UFV, Viçosa, Brasil. • Período: 2005 a 2008.
4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Trabalhos apresentados em eventos nacionais: 18
Trabalhos apresentados em eventos internacionais: 3
Artigos completos publicados em periódicos: 2
Costa Morais, E. H., Rodrigues, A. A. Z., Queiroz, M. E. L. R., Neves, A. A., Morais, P. H. D. (2014). Determination of thiamethoxam, triadimenol and deltamethrin in pineapple using SLE-LTP extraction and gas chromatography. Food Control, 42, 9–17.
Costa Morais, E. H., Begnini, F. R., Jardim, I. C. S. F. (2013). Técnicas de preparo de amostra empregadas na determinação de agrotóxicos carbamatos em água e solo.
xiii
RESUMO
DESENVOLVIMENTO, VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL. Os pimentões destacam-se no Brasil como uma das hortaliças mais cultivadas. No entanto, de acordo com o Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), eles têm apresentado o maior índice de irregularidades com agrotóxicos não autorizados e/ou autorizados, sendo encontrados em concentrações acima do limite máximo de resíduo (MRL). Neste contexto, métodos utilizando dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) com um sorvente constituído por poli(metiltetradecilsiloxano) imobilizado termicamente sobre sílica aluminizada, Si-Al(PMTDS), ou QuEChERS (tampão citrato), e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) foram desenvolvidos e validados para determinação de 21 agrotóxicos em pimentão verde. Ambos os métodos apresentaram seletividade, limites de quantificação (LOQ) menores que os MRL, linearidade, exatidão (recuperações entre 50 e 120%) e precisão (coeficientes de variação < 20%). Os métodos foram aplicados em amostras de pimentão verde do comércio e pelo menos um dos analitos foi detectado na maioria das amostras. Embora ambos os métodos sejam adequados para o emprego em pimentão verde para determinação destes agrotóxicos, o método QuEChERS-LC-MS/MS proporcionou resultados mais satisfatórios com relação à exatidão, precisão e recuperação, e LOQ mais baixos. Também foi possível transferir o método desenvolvido por HPLC para cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC), demonstrando algumas vantagens desta última técnica como menor tempo de análise, e reduzido volume de amostra, consumo de fase móvel e geração de resíduos, bem como menor efeito matriz e LOQ para a maioria dos analitos.
xv
ABSTRACT
DEVELOPMENT, VALIDATION AND APPLICATION OF METHODS FOR MULTIRESIDUE DETERMINATION OF PESTICIDES IN BELL PEPPER BY LIQUID CHROMATOGRAPHY COUPLED TO TANDEM MASS SPECTROMETRY. Bell peppers stand out in Brazil as one of the most cultivated vegetables. However, according to the Program for the Analysis of Pesticide Residues in Foods (PARA) of the National Health Surveillance Agency (ANVISA), they have shown the highest rate of irregularities with non-approved and/or non-authorized pesticides being found at concentrations above the maximum residue limit (MRL). In this context, methods using either solid phase matrix dispersion (MSPD) with a sorbent consisting of poly (methyltetradecylsiloxane) thermally immobilized on aluminized silica, Si-Al(PMTDS), or QuEChERS (citrate buffer), and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were developed and validated for determination of 21 pesticides in green peppers. Both methods presented selectivity, limits of quantitation (LOQ) smaller than the MRL, linearity, accuracy (recoveries between 50 and 120%) and precision (coefficients of variation <20%). The methods were applied to samples of green peppers from market and at least one of the analytes was detected in the majority of the samples. Although both methods are suitable for employment in green peppers for determination of these pesticides, the QuEChERS-LC-MS/MS method provided more satisfactory results with respect to accuracy, precision and recovery, and a lower LOQ. It was also possible to transfer the developed HPLC method to ultra high performance liquid chromatography (UHPLC), demonstrating some advantages of the latter technique such as shorter analysis time, and reduced sample volume, mobile phase consumption and waste generation, as well as a lower matrix effect and LOQ for most analytes.
xvii
SUMÁRIO
LISTA DE FÓRMULAS, SIGLAS E SÍMBOLOS xxiii
LISTA DE TABELAS xxvii
LISTA DE FIGURAS xxix
CAPÍTULO 1 DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO 1
1.1 O USO INDISCRIMINADO DE AGROTÓXICOS E O AMBIENTE 1
1.2 A ORIGEM E O CONSUMO DE PIMENTÃO 2
1.3 DOENÇAS E DISTÚRBIOS NA CULTURA DO PIMENTÃO 3
1.3.1 Antracnose 3 1.3.2 Mancha-de-alternária 4 1.3.3 Mancha-de-cercóspora 5 1.3.4 Oídio 5 1.3.5 Podridão-cinzenta 6 1.3.6 Dano de ácaro 6 1.3.7 Dano de mosca 7 1.3.8 Dano de tripes 7 1.3.9 Fumagina 8
1.4 AGROTÓXICOS INDICADOS PARA A CULTURA DO PIMENTÃO 9 1.5 TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO DE
AGROTÓXICOS EM ALIMENTOS 9
1.5.1 Técnica de preparo de amostra MSPD 10
1.5.2 Técnica de preparo de amostra QuEChERS 12
1.5.2.1 QuEChERS versão original 12
1.5.2.2 QuEChERS versões tampão acetato e tampão citrato 13 1.6 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS
EM ALIMENTOS 14
1.6.1 Transferência de métodos desenvolvidos por HPLC para UHPLC 17
xviii
1.8 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 19
1.8.1 Seletividade 19
1.8.2 Limite de quantificação 20
1.8.3 Linearidade 20
1.8.4 Exatidão 21
1.8.5 Precisão 21
CAPÍTULO 2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO BASEADO NAS TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRA MSPD E DE ANÁLISE POR LC-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM
PIMENTÃO 23
2.1 OBJETIVOS 23
2.2 PARTE EXPERIMENTAL 23
2.2.1 Escolha dos agrotóxicos 23
2.2.2 Materiais e reagentes 28
2.2.3 Preparo de soluções-padrão 28
2.2.4 Síntese do sorvente Si-Al(PMTDS) 29
2.2.4.1 Preparo do suporte 29
2.2.4.2 Sorção e imobilização térmica do polímero sobre o suporte 30
2.2.5 Equipamentos e instrumentos 31
2.2.6 Condições de análise por LC-MS/MS 32
2.2.6.1 Otimização dos parâmetros de fragmentação e seleção das transições 32 2.2.6.2 Determinação das condições cromatográficas de separação 32 2.2.6.3 Otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas 33 2.2.6.4 Determinação dos tempos de janela e do dwell time 33
2.2.7 Técnica de preparo de amostra MSPD 34
2.2.7.1 Homogeneização e fortificação das amostras de pimentão verde 34 2.2.7.2 Extração dos agrotóxicos e limpeza dos extratos 34 2.2.7.3 Otimização da técnica de preparo de amostra MSPD 35
2.2.7.3.1 Sorvente 36
xix
2.2.7.3.3 Planejamento fatorial 22 37
2.2.8 Avaliação do efeito matriz 37
2.2.9 Validação do método analítico 38
2.2.9.1 Seletividade 38
2.2.9.2 Limite de quantificação 38
2.2.9.3 Linearidade 38
2.2.9.4 Exatidão 39
2.2.9.5 Precisão 39
2.2.10 Análise de amostras de pimentão verde do comércio 39
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 40
2.3.1 Otimização dos parâmetros de fragmentação e seleção das transições 40 2.3.2 Determinação das condições cromatográficas de separação 42 2.3.3 Otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas 44 2.3.4 Determinação dos tempos de janela e do dwell time 45
2.3.5 Técnica de preparo de amostra MSPD 46
2.3.5.1 Otimização da técnica de preparo de amostra MSPD 46 2.3.5.1.1 Avaliação de sorventes da etapa de limpeza 46 2.3.5.1.2 Avaliação de solventes da etapa de extração 48
2.3.5.1.3 Planejamento fatorial 22 50
2.3.6 Avaliação do efeito matriz 55
2.3.7 Validação do método analítico 59
2.3.8 Análise de amostras de pimentão verde do comércio 65
2.4 CONCLUSÃO 65
CAPÍTULO 3 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO BASEADO NAS TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRA QuEChERS E DE ANÁLISE POR
LC-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE
AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO 67
3.1 OBJETIVOS 67
3.2 PARTE EXPERIMENTAL 67
xx
3.2.2 Preparo de soluções-padrão 68
3.2.3 Equipamentos e instrumentos 68
3.2.4 Condições de análise por LC-MS/MS 68
3.2.5 Técnica de preparo de amostra QuEChERS 69
3.2.5.1 Homogeneização e fortificação das amostras de pimentão verde 69 3.2.5.2 Extração dos agrotóxicos e limpeza dos extratos 69 3.2.5.3 Otimização da técnica de preparo de amostra QuEChERS 72
3.2.5.3.1 Solvente 72
3.2.5.3.2 Sorvente 72
3.2.5.3.3 Planejamento fatorial 23 73
3.2.6 Avaliação do efeito matriz 74
3.2.7 Validação do método analítico 74
3.2.8 Análise de amostras de pimentão verde do comércio 75 3.2.9 Aplicação do método em matrizes similares ao pimentão verde 75
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 76
3.3.1 Técnica de preparo de amostra QuEChERS 76
3.3.1.1 Otimização da técnica de preparo de amostra QuEChERS 80 3.3.1.1.1 Avaliação de solventes da etapa de extração 80 3.3.1.1.2 Avaliação de sorvente da etapa de limpeza 83
3.3.1.1.3 Planejamento fatorial 23 85
3.3.1.1.4 Método otimizado 91
3.3.2 Avaliação do efeito matriz 92
3.3.3 Validação do método analítico 96
3.3.4 Análise de amostras de pimentão verde do comércio 101 3.3.5 Aplicação do método em matrizes similares ao pimentão verde 104
3.4 CONCLUSÃO 106
CAPÍTULO 4 TRANSFERÊNCIA DE MÉTODO DESENVOLVIDO POR LC-MS/MS
PARA UHPLC-MS/MS 107
4.1 OBJETIVOS 107
4.2 PARTE EXPERIMENTAL 107
xxi
4.2.2 Preparo de soluções-padrão 108
4.2.3 Equipamentos e instrumentos 108
4.2.4 Condições de análise por UHPLC-MS/MS 109
4.2.4.1 Transferência de método desenvolvido por LC-MS/MS para
UHPLC-MS/MS 109
4.2.4.1.1 Determinação das condições cromatográficas de separação 109 4.2.4.1.2 Determinação dos tempos de janela e do dwell time 109
4.2.5 Avaliação do efeito matriz 109
4.2.6 Limite de quantificação e linearidade 110
4.2.7 Aplicação do método na avaliação de modos de lavagem 110
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 111
4.3.1 Determinação das condições cromatográficas de separação 111 4.3.2 Determinação dos tempos de janela e do dwell time 115
4.3.3 Avaliação do efeito matriz 116
4.3.4 Limite de quantificação e linearidade 118
4.3.5 Aplicação do método na avaliação de modos de lavagem 120
4.4 CONCLUSÃO 122
CONCLUSÕES 125
REFERÊNCIAS 127
APÊNDICES 135
APÊNDICE A DIAGRAMAS DOS EFEITOS DOS FATORES AVALIADOS
NO PLANEJAMENTO FATORIAL 22 135
APÊNDICE B LINEARIDADE DO MÉTODO MSPD-LC-MS/MS 136
APÊNDICE C DIAGRAMAS DOS EFEITOS DOS FATORES AVALIADOS NO
PLANEJAMENTO FATORIAL 23 142
APÊNDICE D LINEARIDADE DO MÉTODO QuEChERS-LC-MS/MS 151
APÊNDICE E EFEITO MATRIZ EM RELAÇÃO AO PIMENTÃO VERMELHO E AO
PIMENTÃO AMARELO 157
APÊNDICE F EFEITO MATRIZ EM RELAÇÃO ÀS ANÁLISES POR UHPLC-MS/MS 163
xxiii
LISTA DE FÓRMULAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
a Coeficiente angular
ACN Acetonitrila
ACT Acetona
AE Acetato de etila
AGROFIT Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários Al(OCH(CH3)2)3 Isopropóxido de alumínio
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AOAC Association of Official Analytical Chemists
b Coeficiente linear
CEN Comité Européen de Normalisation
CH3COOH Ácido acético
CH3COONa Acetato de sódio
C6H6Na2O7.1,5H2O Hidrogenocitrato de sódio sesquiidratado
C6H5Na3O7.2H2O Citrato de sódio diidratado
CV Coeficiente de variação
C8 Octilsilano
C18 Octadecilsilano
D-SPE Extração em fase sólida dispersiva (Dispersive Solid Phase
Extraction)
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EPAMIG Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais ESI Ionização por electrospray (Electrospray Ionization)
EU European Union
F Fator
GARP Associação Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas GC Cromatografia gasosa (Gas Chromatography)
GC-MS Cromatografia gasosa-espectrometria de massas (Gas
xxiv
GC-MS/MS Cromatografia gasosa-espectrometria de massas sequencial (Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry)
GCB Carbono grafitizado (Graphitized Carbon Black)
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid
Chromatography)
IQL Limite de quantificação do instrumento (Instrument Quantification
Limit)
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LABCROM Laboratório de Pesquisa em Cromatografia Líquida
LC-MS Cromatografia líquida-espectrometria de massas (Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry)
LC-MS/MS Cromatografia líquida-espectrometria de massas sequencial (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry)
LOQ Limite de quantificação (Limit of Quantification) log Kow Logaritmo do coeficiente de partição octanol/água
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MIP Polímero de impressão molecular (Molecularly Imprinted
Polymer)
MQL Limite de quantificação do método (Method Quantification Limit) MRL Limite máximo de resíduo (Maximum Residue Limit)
MRM Monitoramento de reações múltiplas (Multiple Reaction Monitoring)
MSPD Dispersão da matriz em fase sólida (Matrix Solid Phase
Dispersion)
MWCNT Nanotubo de carbono de paredes múltiplas (Multi-Walled Carbon
Nanotube)
MgSO4 Sulfato de magnésio
NaCl Cloreto de sódio
PARA Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos pKa Cologaritmo da constante de acidez
xxv
PSA Amina primária-secundária (Primary Secundary Amine) QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe
r Coeficiente de correlação
r2 Coeficiente de determinação
Si-Al(PMTDS) Poli(metiltetradecilsiloxano) imobilizado termicamente sobre sílica aluminizada
SiO2 Sílica
SPE Extração em fase sólida (Solid Phase Extraction)
SRM Monitoramento de reações selecionadas (Selected Reaction
Monitoring)
tR Tempo de retenção
TACO Tabela Brasileira de Composição de Alimentos
UPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência (Ultra Performance
Liquid Chromatography)
UHPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência (Ultra High Performance
Liquid Chromatography)
UHPLC-MS/MS Cromatografia líquida de ultra eficiência-espectrometria de massas sequencial (Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry)
xxvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 – Agrotóxicos indicados para o controle de doenças e distúrbios do pimentão 9 Tabela 2.1 – Estrutura química, classe, grupo químico, log Kow, pKa e MRL dos
agrotóxicos estudados 24
Tabela 2.2 – Parâmetros do espectrômetro de massas otimizados 33 Tabela 2.3 – Planejamento fatorial 22 para avaliação da influência da quantidade do sorvente Si-Al(PMTDS) e da proporção do solvente extrator nas recuperações dos
agrotóxicos, utilizando a técnica MSPD 37
Tabela 2.4 – Condições de fragmentação para análise dos agrotóxicos por LC-MS/MS 40 Tabela 2.5 – Valores ótimos dos parâmetros do espectrômetro de massas 45 Tabela 2.6 – Tempos de retenção dos agrotóxicos, tempos de janela e dwell time 45 Tabela 2.7 – Recuperações dos agrotóxicos e respectivos coeficientes de variação obtidos nos ensaios do planejamento fatorial 22, em que se utilizou a técnica MSPD
50
Tabela 2.8 – Resultados do planejamento fatorial 22 para avaliação simultânea da influência de dois fatores nas recuperações dos agrotóxicos 52 Tabela 2.9 – Figuras de mérito obtidas na validação do método MSPD-LC-MS/MS 63 Tabela 3.1 – Quantidades de amostra e de reagentes utilizadas nas versões original,
tampão acetato e tampão citrato do método QuEChERS 71
Tabela 3.2 – Planejamento fatorial 23 para avaliação da influência do solvente extrator, da utilização de gelo seco e da quantidade de carbono grafitizado nas recuperações dos agrotóxicos, utilizando o método QuEChERS na versão tampão citrato 73 Tabela 3.3 – Composição por 100 g de parte comestível dos alimentos analisados 75
xxviii
Tabela 3.4 – Recuperações dos agrotóxicos e respectivos coeficientes de variação obtidos nos ensaios do planejamento fatorial 23, em que se utilizou o método
QuEChERS na versão tampão citrato 86
Tabela 3.5 – Resultados do planejamento fatorial 23 para avaliação simultânea da influência de três fatores nas recuperações dos agrotóxicos 89 Tabela 3.6 – Figuras de mérito obtidas na validação do método QuEChERS-LC-MS/MS 99 Tabela 3.7 – Concentrações (µg kg-1) dos agrotóxicos encontrados em amostras de pimentão verde adquiridas no comércio da Região Sudeste do Brasil 102 Tabela 4.1 – Dwell time dos métodos LC-MS/MS e UHPLC-MS/MS, tempos de retenção dos agrotóxicos e tempos de janela do método UHPLC-MS/MS 115 Tabela 4.2 – Limites de quantificação e linearidade do método
QuEChERS-UHPLC-MS/MS 118
Tabela 4.3 – Limites de quantificação do instrumento dos métodos
QuEChERS-LC-MS/MS e QuEChERS-UHPLC-QuEChERS-LC-MS/MS 120
Tabela 4.4 – Comparação das técnicas HPLC e UHPLC na análise dos agrotóxicos
xxix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 – Lesões no fruto característico da antracnose 4
Figura 1.2 – Indícios da mancha-de-alternária: (a) Manchas marron-escuras nas folhas
e (b) lesões nos frutos 4
Figura 1.3 – Características da doença oídio: (a) Manchas foliares amareladas e (b)
recobrimento pelo fungo 5
Figura 1.4 – Sintomas da podridão-cinzenta no pimentão: Manchas verde-oliva (a) nas
folhas, (b) no caule e (c) podridão mole no fruto 6
Figura 1.5 – Danos relacionados a ácaros: (a) Deformação nas folhas e (b) brotos não
desenvolvidos 7
Figura 1.6 – Estrias presentes no pimentão devido ao ataque de tripes 8 Figura 1.7 – Pó preto nas folhas típico do distúrbio fumagina 8 Figura 2.1 – Estrutura do poli(metiltetradecilsiloxano) (m = 13 e n: monômeros) 31 Figura 2.2 – Esquema da técnica MSPD empregada no preparo de amostras de
pimentão verde 35
Figura 2.3 – Cromatogramas de solução-padrão dos agrotóxicos, numa concentração de 500 µg L-1, a partir da determinação das condições cromatográficas de separação por LC-MS/MS. Fase móvel A: solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, fase móvel B: metanol; vazão: 0,3 mL min-1; programa de gradiente linear (Fase móvel A:Fase móvel B v/v): 0 min–50:50; 12 min–50:50; 13 min–25:75; 30 min–10:90; 33 min–10:90; 35 min– 50:50; 43 min–50:50. Identificação: (a) metamidofós, (b) acefato, (c) tiametoxam, (d) metomil, (e) imidacloprido, (f) tiacloprido, (g) carbendazim, (h) tiabendazol, (i) carbofurano, (j) carbaril, (k) clomazona, (l) azoxistrobina, (m) metiocarbe, (n) fenarimol, (o) iprodiona, (p) tebuconazol, (q) piraclostrobina, (r) metconazol, (s) difenoconazol, (t)
etiona, (u) piriproxifem 44
Figura 2.4 – Influência dos diferentes sorventes nas recuperações dos agrotóxicos,
xxx
Figura 2.5 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, quando se avaliou o sorvente
empregado no método utilizando a MSPD 47
Figura 2.6 – Influência dos diferentes solventes nas recuperações dos agrotóxicos, empregados no método utilizando a MSPD e o sorvente Si-Al(PMTDS) 48 Figura 2.7 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, quando se avaliou o solvente empregado no método utilizando a MSPD o sorvente Si-Al(PMTDS) 49 Figura 2.8 – Superfície de resposta em relação à iprodiona 54
Figura 2.9 – Superfície de resposta em relação ao tebuconazol 54
Figura 2.10 – Curvas analíticas construídas a partir da análise por LC-MS/MS de soluções-padrão dos agrotóxicos em solvente e em extratos provenientes de amostras
de pimentão verde, em que se aplicou a técnica MSPD 58
Figura 2.11 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos obtidos pela relação entre as respostas decorrentes da injeção e análise de soluções-padrão preparadas em solvente e em extrato da matriz (branco), em que se aplicou a técnica MSPD, e pela relação dos coeficientes angulares provenientes das curvas analíticas 59 Figura 2.12 – Cromatogramas do extrato da matriz isenta dos agrotóxicos (à esquerda) e do extrato da matriz fortificada com estes, numa concentração de 500 µg L-1 (à direita), obtidos a partir da aplicação do método utilizando a MSPD. Identificação: (a) metamidofós, (b) acefato, (c) tiametoxam, (d) metomil, (e) imidacloprido, (f) tiacloprido, (g) carbendazim, (h) tiabendazol, (i) carbofurano, (j) carbaril, (k) clomazona, (l) azoxistrobina, (m) metiocarbe, (n) fenarimol, (o) iprodiona, (p) tebuconazol, (q) piraclostrobina, (r) metconazol, (s) difenoconazol, (t) etiona, (u) piriproxifem 61 Figura 3.1 – Esquema do método QuEChERS empregado no preparo de amostras de
pimentão verde 70
Figura 3.2 – Recuperações dos agrotóxicos obtidas pela aplicação em amostras de pimentão verde do método QuEChERS nas versões original, tampão acetato e tampão
citrato sem a etapa de limpeza 77
Figura 3.3 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, decorrentes do emprego das versões original, tampão acetato e tampão citrato do método QuEChERS sem a etapa
xxxi
Figura 3.4 – Recuperações dos agrotóxicos obtidas pela aplicação em amostras de pimentão verde do método QuEChERS nas versões original, tampão acetato e tampão
citrato com a etapa de limpeza 79
Figura 3.5 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, decorrentes do emprego das versões original, tampão acetato e tampão citrato do método QuEChERS com a etapa
de limpeza 80
Figura 3.6 – Influência de diferentes solventes extratores nas recuperações dos agrotóxicos, empregando o método QuEChERS na versão original 81 Figura 3.7 – Influência de diferentes solventes extratores nas recuperações dos agrotóxicos, empregando o método QuEChERS na versão tampão citrato 81 Figura 3.8 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, quando se avaliou o solvente
empregado no método QuEChERS na versão original 82
Figura 3.9 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, quando se avaliou o solvente empregado no método QuEChERS na versão tampão citrato 83 Figura 3.10 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, quando se avaliou a adição de carbono grafitizado empregado no método QuEChERS na versão original 84 Figura 3.11 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos, quando se avaliou a adição de carbono grafitizado empregado no método QuEChERS na versão tampão citrato 84 Figura 3.12 – Influência da adição de carbono grafitizado nas recuperações dos agrotóxicos, empregando o método QuEChERS nas versões original e tampão citrato
85 Figura 3.13 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes das interações
entre os fatores, em relação ao metamidofós 88
Figura 3.14 – Curvas analíticas construídas a partir da análise por LC-MS/MS de soluções-padrão dos agrotóxicos em solvente e em extratos provenientes de amostras de pimentão verde, em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato
xxxii
Figura 3.15 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos obtidos pela relação entre as respostas decorrentes da injeção e análise de soluções-padrão preparadas em solvente e em extrato da matriz (branco), em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato, e pela relação dos coeficientes angulares provenientes das curvas
analíticas 95
Figura 3.16 – Cromatogramas do extrato da matriz isenta dos agrotóxicos (à esquerda) e do extrato da matriz fortificada com estes, numa concentração de 500 µg L-1 (à direita), obtidos a partir da aplicação do método QuEChERS na versão tampão citrato. Identificação: (a) metamidofós, (b) acefato, (c) tiametoxam, (d) metomil, (e) imidacloprido, (f) tiacloprido, (g) carbendazim, (h) tiabendazol, (i) carbofurano, (j) carbaril, (k) clomazona, (l) azoxistrobina, (m) metiocarbe, (n) fenarimol, (o) iprodiona, (p) tebuconazol, (q) piraclostrobina, (r) metconazol, (s) difenoconazol, (t) etiona, (u)
piriproxifem 98
Figura 3.17 – Recuperações dos agrotóxicos obtidas pela aplicação do método QuEChERS na versão tampão citrato em amostras de pimentão vermelho, pimentão
amarelo, tomate, melão e pepino 104
Figura 3.18 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos obtidos pela relação entre as respostas decorrentes da injeção e análise de soluções-padrão preparadas em solvente e em extrato da matriz (branco), em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão
tampão citrat 105
Figura 4.1 – Janelas do console de cálculo do UPLC ACQUITY utilizado para conversão
do método desenvolvido por HPLC para UHPLC 112
Figura 4.2 – Cromatogramas de solução-padrão dos agrotóxicos, numa concentração de 500 µg L-1, a partir da obtenção das condições cromatográficas de separação por UHPLC-MS/MS. Fase móvel A: solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, fase móvel B: metanol; vazão: 0,087 mL min-1; volume de injeção de amostra: 1,7 µL; programa de gradiente linear (Fase móvel A:Fase móvel B v/v): 0 min–50:50; 4 min–50:50; 4,33 min– 25:75; 10 min–10:90; 11 min–10:90; 11,66 min–50:50; 14,33 min–50:50. Identificação: (a) acefato, (b) metamidofós, (c) carbendazim, (d) tiametoxam, (e) metomil, (f) tiabendazol, (g) imidacloprido, (h) tiacloprido, (i) carbofurano, (j) carbaril, (k) clomazona, (l) azoxistrobina, (m) metiocarbe, (n) fenarimol, (o) iprodiona, (p) tebuconazol, (q) piraclostrobina, (r) metconazol, (s) difenoconazol, (t) etiona, (u) piriproxifem 114 Figura 4.3 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos obtidos pela relação entre as respostas decorrentes da injeção e análise de soluções-padrão preparadas em solvente e em extrato da matriz (branco) por LC-MS/MS e UHPLC-MS/MS 117
xxxiii
Figura 4.4 – Porcentagens de remoção dos agrotóxicos da superfície do pimentão verde
lavada com água e com o auxílio de esponja 121
Figura A.1 – Diagrama para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre os
fatores em relação à iprodiona 135
Figura A.2 – Diagrama para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre os
fatores em relação ao tebuconazol 135
Figura A.3 – Curvas analíticas construídas a partir da análise de extratos por LC-MS/MS, provenientes de amostras de pimentão verde fortificadas com os agrotóxicos,
em que se aplicou a técnica MSPD 138
Figura A.4 – Gráficos de resíduos decorrentes da análise de extratos por LC-MS/MS, provenientes de amostras de pimentão verde fortificadas com os agrotóxicos, em que
se aplicou a técnica MSPD 141
Figura A.5 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao acefato 142
Figura A.6 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao tiametoxam 143
Figura A.7 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao metomil 143
Figura A.8 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao imidacloprido 144
Figura A.9 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao tiacloprido 144
Figura A.10 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao tiabendazol 145
Figura A.11 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao carbofurano 145
Figura A.12 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
xxxiv
Figura A.13 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação à clomazona 146
Figura A.14 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação à azoxistrobina 147
Figura A.15 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao metiocarbe 147
Figura A.16 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao fenarimol 148
Figura A.17 – Diagrama para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação à iprodiona 148
Figura A.18 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao tebuconazol 148
Figura A.19 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação à piraclostrobina 149
Figura A.20 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao metconazol 149
Figura A.21 – Diagrama para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao difenoconazol 150
Figura A.22 – Diagramas para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação à etiona 150
Figura A.23 – Diagrama para interpretação dos efeitos decorrentes da interação entre
os fatores em relação ao piriproxifem 150
Figura A.24 – Curvas analíticas construídas a partir da análise de extratos por LC-MS/MS, provenientes de amostras de pimentão verde fortificadas com os agrotóxicos, em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato 153 Figura A.25 – Gráficos de resíduos decorrentes da análise de extratos por LC-MS/MS, provenientes de amostras de pimentão verde fortificadas com os agrotóxicos, em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato 156 Figura A.26 – Curvas analíticas construídas a partir da análise por LC-MS/MS de soluções-padrão dos agrotóxicos em solvente e em extratos provenientes de amostras de pimentão vermelho (à esquerda) e de pimentão amarelo (à direita), em que se
xxxv
Figura A.27 – Curvas analíticas construídas a partir da análise por UHPLC-MS/MS de soluções-padrão dos agrotóxicos em solvente e em extratos provenientes de amostras de pimentão verde, em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato
1
CAPÍTULO 1
DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO
1.1 O USO INDISCRIMINADO DE AGROTÓXICOS E O AMBIENTE
Na produção em larga escala, a aplicação de agrotóxicos, seguindo as Boas Práticas Agrícolas, nas diversas culturas é inevitável para o controle de doenças, distúrbios e ervas daninhas. No entanto, o uso irregular de agrotóxicos nos alimentos tem sido motivo de preocupação dos órgãos governamentais e consumidores, pois pode provocar a contaminação de alimentos, devido à alta concentração de resíduos de agrotóxicos, e acarretar efeitos adversos à saúde humana (Keikotlhaile et al., 2010; Ahmed et al., 2011). Além disso, pode ocasionar contaminação de águas superficiais, lençóis freáticos e solo, e grande mortalidade de animais.
Com a finalidade de controlar o uso inadequado de agrotóxicos e a concentração de resíduos desses nos alimentos, órgãos nacionais e internacionais têm estabelecido limites máximos de resíduos (Maximum Residue Limit – MRL) permitidos para diversos agrotóxicos em diferentes culturas. O termo MRL é entendido como a concentração máxima de resíduos de agrotóxicos que pode estar presente nos alimentos, consumidos pela população, sem prejudicar a saúde humana. Em âmbito nacional, esses limites são estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) do Ministério da Saúde.
Devido à preocupação crescente com a presença de resíduos de agrotóxicos em alimentos, em 2001, a ANVISA desenvolveu o Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA), envolvendo diversas regiões do país e instituições de pesquisas. Segundo pesquisas realizadas em 2011 através do PARA e divulgado em relatório de atividades, o pimentão foi o alimento que apresentou o maior índice de irregularidades para resíduos de agrotóxicos. Das 213 amostras analisadas, 84%
2
continham resíduos de agrotóxicos não autorizados para a cultura, 0,9% continham resíduos de agrotóxicos acima do limite máximo de resíduos e 4,7% continham, simultaneamente, resíduos de agrotóxicos não autorizados e acima do MRL. Entre os agrotóxicos não autorizados a serem aplicados na cultura de pimentão e encontrados nesta, destacam-se o carbendazim, o metamidofós, o metomil, entre outros. Os agrotóxicos autorizados e encontrados em concentrações acima do MRL foram: deltametrina e tebuconazol (ANVISA, 2011).
Devido às negligências e aos efeitos adversos dos agrotóxicos, aumentou-se o interesse em realizar pesquisas abordando o desenvolvimento e validação de métodos para monitorar a presença multirresíduo de agrotóxicos em matrizes alimentares, como o pimentão.
1.2 A ORIGEM E O CONSUMO DE PIMENTÃO
De acordo com informações obtidas por pesquisadores da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) do projeto Capsicum, explorações arqueológicas em Tehuacán no México indicam que o consumo de espécies pertencentes à família
Solanaceae e ao gênero Capsicum, conhecidas como pimentas, se iniciou a
aproximadamente 9 mil anos. O pimentão, Capsicum annuum L., derivado da pimenta, originário do nordeste do México, é a variedade mais conhecida e difundida no mundo (Buckler IV et al., 1998; EMBRAPA, 2014).
O pimentão destaca-se como uma das hortaliças mais cultivadas e de maior importância econômica no Brasil, com uma produção anual de aproximadamente 350.000 toneladas. O cultivo é realizado em grande parte do país e o sudeste é a principal região produtora (Lopes & Avila, 2003; Pinto et al., 2007).
Os frutos de pimentão podem ser colhidos e comercializados no estádio verde ou maduro, com coloração variando de vermelho, amarelo, laranja, creme ou roxa. No entanto, há maior aceitação dos frutos verdes e vermelhos, mesmo o preço dos de outras colorações terem ficado mais acessíveis recentemente (Pinto et al., 2007).
3
Além do consumo in natura, o pimentão é bastante utilizado no processamento de condimentos, temperos, conservas, molhos, corantes, pastas, sopas de preparo instantâneo e embutidos. Sua ingestão é de suma importância devido a presença de vitaminas C, A, B1 e B2, minerais como ferro e fósforo, (Pinto et al., 2007; UNICAMP, 2011) e de pigmentos naturais chamados carotenoides (Collera-Zúñiga et al., 2005), importantes na prevenção de alguns tipos de câncer (Nishino et al., 2009).
1.3 DOENÇAS E DISTÚRBIOS NA CULTURA DO PIMENTÃO
O pimentão por ter origem tropical se desenvolve bem em regiões de temperaturas elevadas e com altitude inferior a 400 m (Pinto et al., 2007). Esta hortaliça pode ser afetada por doenças de origem bacteriana, fúngica, nematológica e viral, e por artrópodes causadores de distúrbios, que podem ocorrer no campo, pós-colheita, no transporte e no armazenamento. A gravidade de cada doença ou distúrbio depende das condições do solo, do período de plantio, da adubação, do modo de irrigação, da proximidade com outros campos, da variedade plantada, entre outros fatores (EMBRAPA, 2014). Diagnosticar corretamente uma doença ou distúrbio presente em uma cultura é um fator determinante para tomar medidas corretas no controle desses. De acordo com Lopes & Avila (2003) e com o Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários (AGROFIT) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2014), para as condições brasileiras exigem atenção as doenças e os distúrbios descritos a seguir.
1.3.1 Antracnose
Antracnose é uma doença fúngica causada por espécies Colletotrichum que provocam tombamento das mudas, necrose do caule, manchas nas folhas e lesões diretamente no pimentão, em campo ou após a colheita, depreciando e reduzindo drasticamente seu valor comercial.
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Figura 1.1 – Lesões no fruto característico da antracnose Fonte: Lopes & Avila, 2003.
Um dos modos de controle desta doença é a pulverização, desde o início da frutificação, de fungicidas registrados e autorizados para serem aplicados na cultura de pimentão (Lopes & Avila, 2003).
1.3.2 Mancha-de-alternária
Alternaria solani e Alternaria alternata são fungos que causam a doença, não
muito comum na cultura do pimentão, mancha-de-alternária, mais vulgarmente conhecida como pinta-preta-grande. Esses fungos provocam manchas marron nas folhas (Figura 1.2a), podem proliferar sobre o caule, pedúnculos, produzindo lesões, especialmente sobre os frutos, causando podridão (Figura 1.2b) (Lopes & Avila, 2003).
Figura 1.2 – Indícios da mancha-de-alternária: (a) Manchas marron-escuras nas folhas e (b) lesões nos frutos
Fonte: Lopes & Avila, 2003.
5
Ao aparecer os sintomas, deve-se iniciar a aplicação de fungicida apropriado para tal doença (MAPA, 2014).
1.3.3 Mancha-de-cercóspora
O fungo Cercospora capsici, causador da mancha-de-cercóspora ou cercosporiose, ataca as folhas da cultura de pimentão, provocando severas perdas desta hortaliça (MAPA, 2014). Pulverizar a cultura com fungicidas adequados podem prevenir a ocorrência desta doença (Lopes & Avila, 2003).
1.3.4 Oídio
O oídio, doença causada pelo fungo Oidiopsis taurica, até a década de 90 não se destacava entre as doenças do pimentão. Atualmente, essa doença provoca grandes perdas. Manchas foliares, como amarelecimento dos tecidos verdes (Figura 1.3a), e recobrimento pelo fungo, no qual a folha fica esbranquiçada (Figura 1.3b), são sintomas característicos desta doença (Lopes & Avila, 2003).
Figura 1.3 – Características da doença oídio: (a) Manchas foliares amareladas e (b) recobrimento pelo fungo
Fonte: Lopes & Avila, 2003.
Preventivamente ou após início dos primeiros sintomas da doença deve-se iniciar a aplicação foliar do fungicida, respeitando-se o intervalo de carência (MAPA, 2014).
(b) (a)
6
1.3.5 Podridão-cinzenta
O fungo Botrytis cinerea é causador da podridão-cinzenta, também chamada de mofo-cinzento. A doença é caracterizada por manchas verde-oliva nas folhas e caule (Figuras 1.4a e 1.4b) e uma podridão mole do fruto (Figura 1.4c) (Lopes & Avila, 2003).
Figura 1.4 – Sintomas da podridão-cinzenta no pimentão: Manchas verde-oliva (a) nas folhas, (b) no caule e (c) podridão mole no fruto
Fonte: Lopes & Avila, 2003.
Uma das formas de controle é a pulverização do fungicida adequado na cultura, quando a umidade está alta e a temperatura amena, condições estas favoráveis à proliferação do fungo (Lopes & Avila, 2003).
1.3.6 Dano de ácaro
Algumas espécies de ácaros atacam a cultura do pimentão, causando distúrbios nesta hortaliça. Uma das causas da propagação destes insetos é o desequilíbrio ambiental provocado por aplicações excessivas de agrotóxicos (Lopes & Avila, 2003).
As Figuras 1.5a e 1.5b mostram folhas deformadas e enroladas com coloração marron e brotos que não se desenvolveram. Frutos com a superfície corticosa também são sintomas atribuídos ao ácaro branco ou ácaro tropical, Polyphagotarsonemus latus (Lopes & Avila, 2003).
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Figura 1.5 – Danos relacionados a ácaros: (a) Deformação nas folhas e (b) brotos não desenvolvidos
Fonte: Lopes & Avila, 2003.
A aplicação na cultura, no início da infestação, de um acaricida adequado é fundamental para inibir a ação do ácaro.
1.3.7 Dano de mosca
O inseto Bemisia tabaci, vulgarmente chamado de mosca-branca, é uma importante praga, por se tratar de um transmissor de vírus que provoca paralisação do crescimento e queda na produção. Estes insetos causam perdas significativas nas culturas, pela queda das folhas e frutos, e pelo murchamento e amadurecimento irregular dos frutos (MAPA, 2014).
1.3.8 Dano de tripes
Devido à sucção da seiva da planta, pelos tripes, Thrips palmi, há aparecimento de distúrbios na cultura do pimentão, como folhas deformadas com coloração marron, frutos com alteração e estrias corticosas (Figura 1.6) (Lopes & Avila, 2003).
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Figura 1.6 – Estrias presentes no pimentão devido ao ataque de tripes Fonte: Lopes & Avila, 2003.
Devem-se pulverizar inseticidas, assim que se observarem os sintomas iniciais.
1.3.9 Fumagina
Fumagina é um distúrbio que ocorre em diversas plantas, incluindo o pimentão, decorrente da invasão de cochonilhas e pulgões. Estes insetos liberam compostos adocicados que servem de substrato para o desenvolvimento de fungos do gênero
Capnodium sp., ocasionando o aparecimento de pó preto nas folhas (Figura 1.7), ramos
e frutos (Lopes & Avila, 2003).
Figura 1.7 – Pó preto nas folhas típico do distúrbio fumagina Fonte: Lopes & Avila, 2003.
Para o controle de cochonilhas e pulgões, é indicado pulverizar, na cultura de pimentão, inseticidas adequados (Lopes & Avila, 2003).
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1.4 AGROTÓXICOS INDICADOS PARA A CULTURA DO PIMENTÃO
A Tabela 1.1 mostra a relação dos agrotóxicos registrados para o controle químico das principais doenças e distúrbios do pimentão.
Tabela 1.1 – Agrotóxicos indicados para o controle de doenças e distúrbios do pimentão
Doença e distúrbio Agrotóxico
antracnose azoxistrobina, tebuconazol, tiabendazol mancha-de-alternária metconazol
mancha-de-cercóspora difenoconazol
oídio piraclostrobina
podridão-cinzenta iprodiona
dano de mosca imidacloprido, piriproxifem, tiacloprido, tiametoxam dano de tripes carbaril, imidacloprido, tiacloprido
fumagina acefato, etiona, imidacloprido, metamidofós, metiocarbe, tiametoxam
Fonte: Lopes & Avila, 2003; MAPA, 2014.
1.5 TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO
DE AGROTÓXICOS EM ALIMENTOS
Devido à presença de agrotóxicos não autorizados e/ou autorizados em concentrações acima dos MRL nas culturas, é necessário o desenvolvimento de métodos precisos, rápidos, sensíveis e ambientalmente seguros para determinação destes em matrizes complexas, como os alimentos. Entre as etapas para determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos, se destaca o preparo de amostra, que inclui o isolamento e a concentração dos analitos e, muitas das vezes, a limpeza das amostras.
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As limitações e desvantagens de métodos para determinação de agrotóxicos em matrizes alimentares complexas foram minimizadas após o desenvolvimento de técnicas de preparo de amostra que possibilitam a análise de baixa concentração de compostos de diferentes grupos químicos, com recuperações dentro do intervalo aceito pelas agências reguladoras e guias de validação, precisão dos resultados e a redução do consumo de solvente orgânico. Para determinação de agrotóxicos em matrizes sólidas complexas se destacam as técnicas dispersão da matriz em fase sólida (Matrix
Solid Phase Dispersion – MSPD) e QuEChERS, que apesar de apresentarem diferentes
etapas, garantem os requisitos apontados acima, além de requererem pequena manipulação no preparo de amostra pelo analista e materiais e instrumentação de baixo custo.
1.5.1 Técnica de preparo de amostra MSPD
A técnica de preparo de amostra por dispersão da matriz em fase sólida, MSPD, foi patenteada, e introduzida por Barker et al. (1989) para isolar resíduos de medicamentos de tecidos animais. A técnica mostrou-se adequada para a extração de analitos de matrizes sólidas e semi-sólidas, superando limitações de outras técnicas, sendo empregada para análise de agrotóxicos em vegetais a partir de 1996 (Ling & Huang, 1995).
A técnica se baseia na dispersão de pequena quantidade de matriz em um suporte sólido, denominado dispersante, a partir da homogeneização completa entre ambos. A mistura, constituída de matriz e dispersante, é transferida para uma coluna, geralmente de polipropileno, e submetida à eluição com um solvente ou mistura de solventes adequados. Em seguida, o eluato é concentrado e analisado por técnica analítica apropriada. Portanto, a técnica proporciona simultaneamente a extração dos analitos e a limpeza da amostra (Lanças, 2004; García-López et al., 2008).
Na determinação de analitos presentes em amostras sólidas complexas é necessário utilizar dispersante e solvente de eluição apropriados, para minimizar a quantidade de coextrativos da matriz que possam interferir nas análises e danificar o equipamento utilizado, porém, concomitantemente, devem garantir alta recuperação
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dos analitos. Ou seja, o tipo de sorvente (dispersante) e de solvente de eluição utilizados dependem da polaridade dos analitos e da natureza da matriz. As aplicações clássicas da técnica empregam sorventes de fase reversa como octadecilsilano, C18, e octilsilano, C8, para análise de matrizes mais lipofílicas, e sorventes de fase normal como alumina, florisil e sílica, SiO2, para analisar amostras mais hidrofílicas. Os
solventes de menor polaridade, como hexano, são utilizados para extração de analitos apolares, e solventes de maior polaridade, como acetonitrila, acetato de etila e metanol, para compostos mais polares (Lanças, 2004; García-López et al., 2008).
Nos últimos anos, as inovações em relação à técnica têm sido a síntese e o emprego de novos materiais dispersantes. No entanto, o número de trabalhos publicados abordando a utilização destes materiais no preparo de amostra empregando a técnica MSPD é pequeno, se comparado à aplicação de sorventes tradicionais e à técnica de extração em fase sólida (Solid Phase Extraction – SPE) (Capriotti et al., 2013). Neste contexto, há relatos da utilização de sorventes altamente seletivos como polímeros de impressão molecular (Molecularly Imprinted Polymer – MIP) (Chen & Li, 2012) e menos específicos como nanotubos de carbono de paredes múltiplas ( Multi-Walled Carbon Nanotube – MWCNT) (Guan et al. 2011) para determinação de
agrotóxicos em alimentos.
As principais vantagens da técnica MSPD são baixo consumo de amostra, de material dispersante e solvente; utilização de instrumentação simples e de baixo custo, com possibilidade de automação; pequeno tempo de extração; etapa única de extração dos analitos e limpeza da amostra; e possibilidade de concentração da mesma. Além disso, devido à eficiência nos processos de transferência de massa, com reduzido consumo de solvente, observa-se efetividade na extração dos analitos (Lanças, 2004; García-López et al., 2008).
Um número considerável de trabalhos nos quais a técnica por dispersão da matriz em fase sólida é empregada no preparo de amostra para determinação de agrotóxicos em legumes, frutas e outros alimentos tem sido publicado (Rodrigues et al., 2012; Fróes et al., 2013; Radišić et al., 2013). Bogialli & Corcia (2007) apresentaram em um artigo de revisão a aplicação da técnica em alimentos para determinação de contaminantes como agrotóxicos, medicamentos veterinários, entre outros. No entanto,
12
apesar das diversas vantagens, dependendo de alguns fatores como complexidade da matriz e analitos nela presentes que contêm diferentes grupos químicos, a técnica apresenta algumas limitações, principalmente necessidade de etapa adicional de limpeza, baixa recuperação dos compostos de interesse e precisão dos resultados (Wilkowska & Biziuk, 2011).
1.5.2 Técnica de preparo de amostra QuEChERS
A técnica de preparo de amostra QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe), foi introduzida por Anastassiades et al. (2003), com o intuito de superar
as limitações das técnicas tradicionais de extração multirresíduo de agrotóxicos.
O método QuEChERS tem sido muito utilizado na determinação de resíduos de agrotóxicos em diversos alimentos (Lehotay et al., 2010; Wang et al., 2010; Wong et al., 2010; Dong et al., 2012; Rajski et al., 2013), por ser um método rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro. Além disso, a aplicação desse método possibilita a extração de compostos ácidos, básicos e neutros, com exatidão e precisão dos resultados, devido às altas recuperações dos analitos. A principal desvantagem deste método está relacionada com o baixo fator de concentração.
Os extratos obtidos pelo QuEChERS podem ser analisados por cromatografia gasosa ou cromatografia líquida, utilizando diferentes detectores, já que esta técnica possibilita, de forma eficiente, a extração dos analitos com solventes compatíveis aos equipamentos mencionados, a concentração dos mesmos e a limpeza das amostras.
1.5.2.1 QuEChERS versão original
O método QuEChERS na versão original baseia-se na extração dos agrotóxicos com acetonitrila, seguida de uma etapa de partição, decorrente da adição de uma mistura dos sais sulfato de magnésio anidro, MgSO4, e cloreto de sódio, NaCl, e
limpeza da amostra por extração em fase sólida dispersiva (Dispersive Solid Phase
Extraction – D-SPE) com o sal sulfato de magnésio anidro e o sorvente amina
13
A acetonitrila é muito utilizada nas técnicas de preparo de amostra, já que por ser miscível em água, possibilita a extração em fase única, favorecendo a extração de compostos de diferentes polaridades, e, devido à sua seletividade, extrai quantidades mínimas de coextrativos lipofílicos da matriz. Além disso, a acetonitrila é um excelente solvente para os métodos de determinação que utilizam a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry – LC-MS), com ionização por electrospray (Electrospray Ionization – ESI), se comparado à acetona e ao acetato de etila, por permitir melhor ionização dos analitos (Anastassiades et al., 2003; Maštovská & Lehotay, 2004; Lehotay, 2006).
A utilização do sulfato de magnésio anidro induz a separação entre o solvente extrator e a água contida na matriz, possibilitando a remoção do excesso deste último, o que facilita a extração de analitos e a precipitação de coextrativos polares. Além disso, a hidratação desse sal é um processo exotérmico, o que provoca o aquecimento da amostra entre 40 e 45 °C durante a etapa de extração/partição, favorecendo a extração dos compostos, especialmente dos apolares (Anastassiades et al., 2003; Lehotay, 2006). O uso do sal cloreto de sódio promove o efeito salting out, e, consequentemente, uma melhora na extração de analitos polares, uma vez que diminui a solubilidade destes na fase aquosa, devido a saturação da matriz (Anastassiades et al., 2003).
O PSA é um sorvente trocador aniônico, utilizado na limpeza dos extratos, por remover eficientemente componentes polares da matriz, devido à presença em sua estrutura bidentada de grupos amino primário e secundário (Anastassiades et al., 2003). Os extratos a serem analisados devem passar por essa etapa de limpeza, pois o excesso de constituintes da matriz presente nesses pode ocasionar a contaminação do sistema cromatográfico, acarretando em uma diminuição da vida útil de injetores e colunas, e maximizar o efeito matriz.
1.5.2.2 QuEChERS versões tampão acetato e tampão citrato
Alguns compostos são sensíveis a certos parâmetros, como ao pH da matriz em que se encontram. Nesse caso, é necessário tamponar o meio, com a finalidade de promover a estabilidade dos analitos. Lehotay et al. (2005) modificaram as etapas de
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extração e partição do método QuEChERS, através do uso de acetonitrila acidificada com ácido acético, CH3COOH, e pela substituição do cloreto de sódio por acetato de
sódio anidro, CH3COONa, o que acarretou em um meio tamponado, com valor de pH
próximo a 4,8, e altas porcentagens de recuperação dos compostos de interesse. Esse método, denominado como QuEChERS versão tampão acetato, foi adotado nos Estados Unidos como método oficial da AOAC (Association of Official Analytical
Chemists) International (2007) para determinação de resíduos de agrotóxicos em
alimentos, e consequentemente, tem sido muito utilizado na determinação desses analitos em frutas e vegetais, uma vez que algumas dessas matrizes são constituídas por ácido acético e acetato de sódio, evitando que outros reagentes sejam usados e que interferências indesejáveis ocorram.
Anastassiades et al. (2007) utilizaram citrato de sódio diidratado, C6H5Na3O7.2H2O, e hidrogenocitrato de sódio sesquiidratado, C6H6Na2O7.1,5H2O, para
obter um meio tamponante, com pH na faixa entre 5,0 e 5,5. Esse método é conhecido como QuEChERS versão tampão citrato.
Outra modificação bastante relevante foi a adição de carbono grafitizado (Graphitized Carbon Black – GCB) ao PSA (Anastassiades et al., 2007) para promover uma limpeza mais efetiva de algumas matrizes, em especial àquelas que contêm pigmentos, como a clorofila, e a adição de ácido fórmico nos extratos para evitar a degradação de compostos básicos lábeis. O método QuEChERS na versão tampão citrato em combinação com o carbono grafitizado foi oficializado como método referência na União Européia (European Union – EU) e intitulado como “Norma Europeia EN 15662” pela CEN (Comité Européen de Normalisation) (2008).
1.6
TÉCNICAS
ANALÍTICAS
PARA
DETERMINAÇÃO
DE
AGROTÓXICOS EM ALIMENTOS
Nos últimos 40 anos, a cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance
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difundida e empregada em laboratórios de análise de indústrias de alimentos, de cosméticos, de fármacos e de produtos químicos, no monitoramento de matrizes ambientais, em áreas forense e médica, em outros campos da ciência, e até em órgãos governamentais (Maldaner & Jardim, 2009). A grande utilização desta técnica está relacionada à sua facilidade em efetuar as separações e quantificar as espécies presentes em uma amostra (Collins et al., 2006; Braga et al., 2007; Naushad et al., 2014).
O desenvolvimento das técnicas de ionização a pressão atmosférica permitiu o acoplamento da cromatografia líquida de alta eficiência, operada em pressões elevadas, à espectrometria de massas. Entre as interfaces à pressão atmosférica atualmente empregadas na determinação de agrotóxicos em alimentos destaca-se a por ESI. Neste contexto, a LC-MS vem mostrando um grande progresso, tanto em termos de desenvolvimento de tecnologia, quanto de aplicação (Kmellár et al., 2011). Resultados satisfatórios têm sido obtidos quando se utilizam estas técnicas, já que combinam a elevada seletividade e eficiência de separação por cromatografia líquida, com a obtenção de informações de identificação de compostos, alta detectabilidade e aumento da seletividade por espectrometria de massas (Vékey, 2001; Niessen, 2006).
A utilização da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry – LC-MS/MS) proporciona um aumento da seletividade e detectabilidade, o que possibilita a determinação de baixas concentrações de centenas de resíduos de agrotóxicos pertencentes a diferentes grupos químicos em matrizes complexas em uma única análise. O aumento de seletividade ao se empregar a espectrometria de massas sequencial é garantido através de aquisição tanto no modo de monitoramento de reações selecionadas (Selected Reaction Monitoring – SRM), quanto pelo monitoramento de reações múltiplas (Multiple Reaction Monitoring – MRM), utilizado para determinação multirresíduo. Neste caso, é possível quantificar compostos que coeluem através do monitoramento das transições íon precursor – íon produto de cada substância. Assim, a LC-MS/MS assegura a identificação com maior exatidão do que quando ela é realizada somente com base nas características de retenção dos
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compostos, como ocorrem nas outras técnicas de detecção cromatográficas (Vékey, 2001; Niessen et al., 2006).
Na última década, associado ao desenvolvimento da instrumentação e de novas partículas de fases estacionárias que possibilitaram a produção de colunas mais eficientes, estáveis química e mecanicamente, e seletivas, o avanço da HPLC direcionou-se à necessidade de análises mais rápidas, sem o comprometimento do desempenho cromatográfico, pela utilização de partículas de fases estacionárias e de colunas com tamanho reduzido. Por um período, sua utilização ficou limitada devido à elevada pressão, resultante da redução do tamanho de partícula, não compatível com os sistemas cromatográficos de HPLC. Em 2004, a Waters Corporation desenvolveu o primeiro equipamento comercial capaz de operar em pressões acima de 100 MPa (15000 psi), decorrentes da utilização de colunas cromatográficas recheadas com partículas de diâmetro menores que 2 μm, denominado ACQUITY UPLCTM
(Ultra
Performance Liquid Chromatograpy), dando origem à cromatografia líquida de ultra
eficiência (Ultra High Performance Liquid Chromatography – UHPLC) (Naushad et al., 2014).
A técnica UHPLC se baseia nos mesmos princípios da HPLC, mas tem como característica a utilização de colunas recheadas com partículas com diâmetro reduzido (de 3 - 5 para 2 µm), como mencionado acima, e de colunas com menores comprimentos (50 - 100 mm) e diâmetros internos (1 - 2,1 mm) (Naushad et al., 2014).
Baseado em desenvolvimentos recentes, ressalva-se que: as análises realizadas utilizando-se a UHPLC são mais rápidas, na ordem de poucos minutos ou segundos; o consumo de solventes é menor; as eficiências e resoluções são mais elevadas; e, na maioria das vezes, há aumento de detectabilidade, devido a formação de picos mais altos e estreitos e redução do efeito matriz, se comparadas às análises realizadas utilizando-se HPLC (Steene & Lambert, 2008; Naushad et al., 2014).
Vários artigos publicados relatam a utilização da cromatografia líquida de alta eficiência e da cromatografia líquida de ultra eficiência acoplapadas à espectrometria de massas sequencial (Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass