DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO
1.5 TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ALIMENTOS
Devido à presença de agrotóxicos não autorizados e/ou autorizados em concentrações acima dos MRL nas culturas, é necessário o desenvolvimento de métodos precisos, rápidos, sensíveis e ambientalmente seguros para determinação destes em matrizes complexas, como os alimentos. Entre as etapas para determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos, se destaca o preparo de amostra, que inclui o isolamento e a concentração dos analitos e, muitas das vezes, a limpeza das amostras.
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As limitações e desvantagens de métodos para determinação de agrotóxicos em matrizes alimentares complexas foram minimizadas após o desenvolvimento de técnicas de preparo de amostra que possibilitam a análise de baixa concentração de compostos de diferentes grupos químicos, com recuperações dentro do intervalo aceito pelas agências reguladoras e guias de validação, precisão dos resultados e a redução do consumo de solvente orgânico. Para determinação de agrotóxicos em matrizes sólidas complexas se destacam as técnicas dispersão da matriz em fase sólida (Matrix
Solid Phase Dispersion – MSPD) e QuEChERS, que apesar de apresentarem diferentes
etapas, garantem os requisitos apontados acima, além de requererem pequena manipulação no preparo de amostra pelo analista e materiais e instrumentação de baixo custo.
1.5.1 Técnica de preparo de amostra MSPD
A técnica de preparo de amostra por dispersão da matriz em fase sólida, MSPD, foi patenteada, e introduzida por Barker et al. (1989) para isolar resíduos de medicamentos de tecidos animais. A técnica mostrou-se adequada para a extração de analitos de matrizes sólidas e semi-sólidas, superando limitações de outras técnicas, sendo empregada para análise de agrotóxicos em vegetais a partir de 1996 (Ling & Huang, 1995).
A técnica se baseia na dispersão de pequena quantidade de matriz em um suporte sólido, denominado dispersante, a partir da homogeneização completa entre ambos. A mistura, constituída de matriz e dispersante, é transferida para uma coluna, geralmente de polipropileno, e submetida à eluição com um solvente ou mistura de solventes adequados. Em seguida, o eluato é concentrado e analisado por técnica analítica apropriada. Portanto, a técnica proporciona simultaneamente a extração dos analitos e a limpeza da amostra (Lanças, 2004; García-López et al., 2008).
Na determinação de analitos presentes em amostras sólidas complexas é necessário utilizar dispersante e solvente de eluição apropriados, para minimizar a quantidade de coextrativos da matriz que possam interferir nas análises e danificar o equipamento utilizado, porém, concomitantemente, devem garantir alta recuperação
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dos analitos. Ou seja, o tipo de sorvente (dispersante) e de solvente de eluição utilizados dependem da polaridade dos analitos e da natureza da matriz. As aplicações clássicas da técnica empregam sorventes de fase reversa como octadecilsilano, C18, e octilsilano, C8, para análise de matrizes mais lipofílicas, e sorventes de fase normal como alumina, florisil e sílica, SiO2, para analisar amostras mais hidrofílicas. Os
solventes de menor polaridade, como hexano, são utilizados para extração de analitos apolares, e solventes de maior polaridade, como acetonitrila, acetato de etila e metanol, para compostos mais polares (Lanças, 2004; García-López et al., 2008).
Nos últimos anos, as inovações em relação à técnica têm sido a síntese e o emprego de novos materiais dispersantes. No entanto, o número de trabalhos publicados abordando a utilização destes materiais no preparo de amostra empregando a técnica MSPD é pequeno, se comparado à aplicação de sorventes tradicionais e à técnica de extração em fase sólida (Solid Phase Extraction – SPE) (Capriotti et al., 2013). Neste contexto, há relatos da utilização de sorventes altamente seletivos como polímeros de impressão molecular (Molecularly Imprinted Polymer – MIP) (Chen & Li, 2012) e menos específicos como nanotubos de carbono de paredes múltiplas (Multi- Walled Carbon Nanotube – MWCNT) (Guan et al. 2011) para determinação de
agrotóxicos em alimentos.
As principais vantagens da técnica MSPD são baixo consumo de amostra, de material dispersante e solvente; utilização de instrumentação simples e de baixo custo, com possibilidade de automação; pequeno tempo de extração; etapa única de extração dos analitos e limpeza da amostra; e possibilidade de concentração da mesma. Além disso, devido à eficiência nos processos de transferência de massa, com reduzido consumo de solvente, observa-se efetividade na extração dos analitos (Lanças, 2004; García-López et al., 2008).
Um número considerável de trabalhos nos quais a técnica por dispersão da matriz em fase sólida é empregada no preparo de amostra para determinação de agrotóxicos em legumes, frutas e outros alimentos tem sido publicado (Rodrigues et al., 2012; Fróes et al., 2013; Radišić et al., 2013). Bogialli & Corcia (2007) apresentaram em um artigo de revisão a aplicação da técnica em alimentos para determinação de contaminantes como agrotóxicos, medicamentos veterinários, entre outros. No entanto,
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apesar das diversas vantagens, dependendo de alguns fatores como complexidade da matriz e analitos nela presentes que contêm diferentes grupos químicos, a técnica apresenta algumas limitações, principalmente necessidade de etapa adicional de limpeza, baixa recuperação dos compostos de interesse e precisão dos resultados (Wilkowska & Biziuk, 2011).
1.5.2 Técnica de preparo de amostra QuEChERS
A técnica de preparo de amostra QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe), foi introduzida por Anastassiades et al. (2003), com o intuito de superar
as limitações das técnicas tradicionais de extração multirresíduo de agrotóxicos.
O método QuEChERS tem sido muito utilizado na determinação de resíduos de agrotóxicos em diversos alimentos (Lehotay et al., 2010; Wang et al., 2010; Wong et al., 2010; Dong et al., 2012; Rajski et al., 2013), por ser um método rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro. Além disso, a aplicação desse método possibilita a extração de compostos ácidos, básicos e neutros, com exatidão e precisão dos resultados, devido às altas recuperações dos analitos. A principal desvantagem deste método está relacionada com o baixo fator de concentração.
Os extratos obtidos pelo QuEChERS podem ser analisados por cromatografia gasosa ou cromatografia líquida, utilizando diferentes detectores, já que esta técnica possibilita, de forma eficiente, a extração dos analitos com solventes compatíveis aos equipamentos mencionados, a concentração dos mesmos e a limpeza das amostras.
1.5.2.1 QuEChERS versão original
O método QuEChERS na versão original baseia-se na extração dos agrotóxicos com acetonitrila, seguida de uma etapa de partição, decorrente da adição de uma mistura dos sais sulfato de magnésio anidro, MgSO4, e cloreto de sódio, NaCl, e
limpeza da amostra por extração em fase sólida dispersiva (Dispersive Solid Phase
Extraction – D-SPE) com o sal sulfato de magnésio anidro e o sorvente amina primária-
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A acetonitrila é muito utilizada nas técnicas de preparo de amostra, já que por ser miscível em água, possibilita a extração em fase única, favorecendo a extração de compostos de diferentes polaridades, e, devido à sua seletividade, extrai quantidades mínimas de coextrativos lipofílicos da matriz. Além disso, a acetonitrila é um excelente solvente para os métodos de determinação que utilizam a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry – LC-MS), com ionização por electrospray (Electrospray Ionization – ESI), se comparado à acetona e ao acetato de etila, por permitir melhor ionização dos analitos (Anastassiades et al., 2003; Maštovská & Lehotay, 2004; Lehotay, 2006).
A utilização do sulfato de magnésio anidro induz a separação entre o solvente extrator e a água contida na matriz, possibilitando a remoção do excesso deste último, o que facilita a extração de analitos e a precipitação de coextrativos polares. Além disso, a hidratação desse sal é um processo exotérmico, o que provoca o aquecimento da amostra entre 40 e 45 °C durante a etapa de extração/partição, favorecendo a extração dos compostos, especialmente dos apolares (Anastassiades et al., 2003; Lehotay, 2006). O uso do sal cloreto de sódio promove o efeito salting out, e, consequentemente, uma melhora na extração de analitos polares, uma vez que diminui a solubilidade destes na fase aquosa, devido a saturação da matriz (Anastassiades et al., 2003).
O PSA é um sorvente trocador aniônico, utilizado na limpeza dos extratos, por remover eficientemente componentes polares da matriz, devido à presença em sua estrutura bidentada de grupos amino primário e secundário (Anastassiades et al., 2003). Os extratos a serem analisados devem passar por essa etapa de limpeza, pois o excesso de constituintes da matriz presente nesses pode ocasionar a contaminação do sistema cromatográfico, acarretando em uma diminuição da vida útil de injetores e colunas, e maximizar o efeito matriz.
1.5.2.2 QuEChERS versões tampão acetato e tampão citrato
Alguns compostos são sensíveis a certos parâmetros, como ao pH da matriz em que se encontram. Nesse caso, é necessário tamponar o meio, com a finalidade de promover a estabilidade dos analitos. Lehotay et al. (2005) modificaram as etapas de
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extração e partição do método QuEChERS, através do uso de acetonitrila acidificada com ácido acético, CH3COOH, e pela substituição do cloreto de sódio por acetato de
sódio anidro, CH3COONa, o que acarretou em um meio tamponado, com valor de pH
próximo a 4,8, e altas porcentagens de recuperação dos compostos de interesse. Esse método, denominado como QuEChERS versão tampão acetato, foi adotado nos Estados Unidos como método oficial da AOAC (Association of Official Analytical
Chemists) International (2007) para determinação de resíduos de agrotóxicos em
alimentos, e consequentemente, tem sido muito utilizado na determinação desses analitos em frutas e vegetais, uma vez que algumas dessas matrizes são constituídas por ácido acético e acetato de sódio, evitando que outros reagentes sejam usados e que interferências indesejáveis ocorram.
Anastassiades et al. (2007) utilizaram citrato de sódio diidratado, C6H5Na3O7.2H2O, e hidrogenocitrato de sódio sesquiidratado, C6H6Na2O7.1,5H2O, para
obter um meio tamponante, com pH na faixa entre 5,0 e 5,5. Esse método é conhecido como QuEChERS versão tampão citrato.
Outra modificação bastante relevante foi a adição de carbono grafitizado (Graphitized Carbon Black – GCB) ao PSA (Anastassiades et al., 2007) para promover uma limpeza mais efetiva de algumas matrizes, em especial àquelas que contêm pigmentos, como a clorofila, e a adição de ácido fórmico nos extratos para evitar a degradação de compostos básicos lábeis. O método QuEChERS na versão tampão citrato em combinação com o carbono grafitizado foi oficializado como método referência na União Européia (European Union – EU) e intitulado como “Norma Europeia EN 15662” pela CEN (Comité Européen de Normalisation) (2008).