Condições de análise por LC-MS/MS

2.2.6.1 Otimização dos parâmetros de fragmentação e seleção das

transições

A infusão, via seringa, diretamente no espectrômetro de massas, de soluções de 1 mg L-1 de cada agrotóxico estudado em solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (fase móvel A):metanol (fase móvel B) 50:50 v/v, a uma vazão de 0,1 mL min-1, foi realizada com a finalidade de otimizar a voltagem do cone e as energias de colisão e selecionar as transições MRM. A vazão de bombeamento das soluções foi de 20 L min-1. Para cada analito foram selecionadas duas transições características. A mais intensa (mais estável) foi escolhida para quantificação e a segunda mais intensa para confirmação.

2.2.6.2 Determinação das condições cromatográficas de separação

Após a otimização dos parâmetros de fragmentação, foi realizado o acoplamento do cromatógrafo a líquido ao espectrômetro de massas, para otimizar a separação cromatográfica dos agrotóxicos estudados, através da análise dos cromatogramas obtidos após a injeção de 17 L de solução-padrão contendo os analitos em metanol, em uma concentração de 500 µg L-1, à temperatura de (25 ± 2) °C e vazão de 0,3 mL

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min-1, avaliando-se os modos de eluição: isocrático - composições de fases móveis (A:B) 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 e 50:50 v/v; gradiente - fases móveis A e B, cuja composição foi modificada, conforme programação de gradientes lineares.

2.2.6.3 Otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas

Na otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas, foram realizadas injeções de solução-padrão dos analitos, nas melhores condições cromatográficas de separação, alterando-se os valores dos parâmetros mostrados na Tabela 2.2.

Tabela 2.2 – Parâmetros do espectrômetro de massas otimizados

Voltagem Temperatura Vazão

Capilar (kV) Cone extrator (V) RF lens (V) Fonte (ºC) Gás de dessolvatação (ºC) Gás de dessolvatação (L h-1) Gás do cone (L h-1) 2 0 0 80 150 200 50 2,5 1 0,1 100 250 350 60 3 2 0,2 120 350 500 70 3,5 3 0,3 140 400 650 80 4 4 0,4 150 450 800 90 4,5 5 0,5  500 900 100

De acordo com os valores mostrados na Tabela 2.2, determinou-se a voltagem do capilar que fornecesse a maior área para maioria dos agrotóxicos, principalmente para aqueles de menor detectabilidade. Adotando esta voltagem, realizou-se a otimização univariada e em sequência de cada parâmetro.

2.2.6.4 Determinação dos tempos de janela e do dwell time

Após o estabelecimento das melhores condições cromatográficas de separação e do espectrômetro de massas, foram determinados os intervalos de tempo das janelas,

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nas quais foram monitorados os íons dos analitos com tempos de retenção próximos e os valores de dwell time, considerando um mínimo de 15 pontos por pico.

2.2.7 Técnica de preparo de amostra MSPD

2.2.7.1 Homogeneização e fortificação das amostras de pimentão

verde

Na otimização da técnica de preparo de amostra MSPD foram utilizados pimentões verdes orgânicos, obtidos na região de Campinas. Foram preparados extratos das amostras de pimentão verde orgânico, para confirmar a ausência dos agrotóxicos estudados.

Inicialmente, o preparo de amostra utilizando a técnica por dispersão da matriz em fase sólida foi conduzido de acordo com estudo realizado por Rodrigues et al. (2012) para amostras de cebola. O pimentão verde, sem lavagem prévia, foi picado em pedaços e triturado em um multiprocessador doméstico até total homogeneização. Em um recipiente, foram adicionados 0,50000 g de pimentão e realizada a fortificação com 100 µL de solução-padrão contendo os agrotóxicos estudados, de modo que a concentração final de cada analito na amostra foi igual ao limite de quantificação do método (Method Quantification Limit – MQL). Logo em seguida, a amostra foi deixada em repouso por 30 minutos e submetida à técnica MSPD.

2.2.7.2 Extração dos agrotóxicos e limpeza dos extratos

Em recipiente, contendo a amostra de pimentão triturada e fortificada, foram acrescentados 1,00000 g de sorvente. Em seguida, macerou-se a mistura até completa dispersão da amostra (aproximadamente cinco minutos). A mistura foi transferida para um cartucho de polietileno de 6 mL de capacidade e adicionaram-se 10 mL de solvente ou mistura extratora, em porções de 5 mL, sendo que a eluição, com o auxílio de um sistema de vácuo, ocorreu a uma vazão de aproximadamente 1 mL min-1. Adicionaram- se ao extrato 50 L de solução de ácido fórmico 5% v/v em acetonitrila, evaporou-se o

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solvente sob fluxo de gás nitrogênio e o mesmo foi ressuspendido em 0,5 mL de metanol, filtrado e armazenado em vial no freezer, até o momento da análise por LC- MS/MS. Os ensaios e as injeções foram realizados em triplicata. A Figura 2.2 mostra um esquema da técnica MSPD aplicada em pimentão verde.

Figura 2.2 – Esquema da técnica MSPD empregada no preparo de amostras de pimentão verde

Fonte: Adaptada de Liu et al., 2011.

2.2.7.3 Otimização da técnica de preparo de amostra MSPD

Pelo fato do pimentão verde ter constituintes que poderiam interferir na determinação dos analitos foi utilizado o método de quantificação baseado na superposição de matriz, no qual soluções-padrão foram preparadas em extrato da matriz isenta dos compostos estudados.

Durante a otimização da técnica de preparo de amostra por dispersão da matriz em fase sólida foram avaliados fatores que influenciam na extração dos analitos e que acarretam condições ideais de análise. Neste contexto, foram considerados como melhores condições as que proporcionaram maiores recuperações para a maior parte

pimentão triturado e fortificado sorvente maceração mistura solvente extrator ou mistura extratora extrato com 50 µL de solução de ácido formico 5% v/v em acetonitrila análise por LC-MS/MS evaporação reconstituição em 0,5 mL de metanol

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dos agrotóxicos estudados, com coeficientes de variação menores que 20%, valores estes recomendados na literatura (Ribani et al., 2004; EU, 2013), e minimização da influência dos componentes da matriz na ionização dos analitos, ou seja, redução do efeito matriz. As recuperações foram obtidas a partir da análise de extratos provenientes de amostras de pimentão verde fortificadas com os agrotóxicos estudados (numerador da Equação 2.3) e de soluções-padrão preparadas em extrato da matriz isenta dos analitos (denominador da Equação 2.3). Para o cálculo do efeito matriz foi considerada a Equação 2.4, modificação da equação descrita por Buhrman et al. (1996).

Recuperação ( ) área do pico referente ao analito adicionado antes da extração

área do pico referente ao analito adicionado depois da extração 100 (2.3)

Efeito matriz ( ) área do pico referente ao analito em extrato da matriz

área do pico referente ao analito em solvente 1 100 (2.4)

Se o efeito matriz < 0, há supressão em relação ao sinal do analito, se > 0, há aumento em relação ao sinal do mesmo.

Os fatores considerados na otimização da técnica são apresentados a seguir.

2.2.7.3.1 Sorvente

Octadecilsilano, sílica e poli(metiltetradecilsiloxano) imobilizado termicamente sobre sílica aluminizada foram utilizados como sorvente na técnica MSPD, como descrito no Item 2.2.7.2, para avaliar suas seletividades e eficiências nas recuperações dos analitos.

2.2.7.3.2 Solvente

Os solventes acetonitrila e acetato de etila e a mistura deles foram utilizados como extratores na técnica MSPD. Ao avaliar a influência da mistura extratora, os

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solventes acetonitrila e acetato de etila foram adicionados consecutivamente em porções de 5 mL.

2.2.7.3.3 Planejamento fatorial 2

A técnica MSPD foi otimizada por meio de um planejamento fatorial 22, para avaliar a influência dos fatores: (1) quantidade do sorvente Si-Al(PMTDS) e (2) proporção do solvente extrator. Como o experimento envolve dois fatores com dois níveis cada um, a execução do planejamento foi realizada em quatro ensaios, com todas as possíveis combinações dos níveis (-) e (+) (Tabela 2.3). Os ensaios foram realizados em duplicata, as injeções em triplicata e as porcentagens de recuperação dos agrotóxicos obtidas nos experimentos foram utilizadas para avaliar os efeitos de cada fator.

Tabela 2.3 – Planejamento fatorial 22 para avaliação da influência da quantidade do sorvente Si-Al(PMTDS) e da proporção do solvente extrator nas recuperações dos agrotóxicos, utilizando a técnica MSPD

Ensaio Fa(1) F (2) Si-Al(PMTDS) (g) (1) Solventes extratores (2) 1 - - 0,75000 5 mL de ACNb/5 mL de AEc 2 + - 1,00000 5 mL de ACN/5 mL de AE 3 - + 0,75000 3 mL de ACN/7 mL de AE 4 + + 1,00000 3 mL de ACN/7 mL de AE a F: fator. b ACN: acetonitrila. c

AE: acetato de etila.