PARA DETERMINAÇÃO MULTIRRESÍDUO DE AGROTÓXICOS EM PIMENTÃO
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1.1.4 Método otimizado
Propõe-se como método otimizado: extração dos agrotóxicos estudados de 10,00000 g de pimentão verde triturado com 10 mL de acetonitrila, sob agitação em vórtex por um minuto, seguida de etapa de partição pela adição de 4,00000 g de MgSO4, 1,00000 g de NaCl, 1,00000 g de C6H5Na3O7.2H2O e 0,50000 g de
C6H6Na2O7.1,5H2O, agitação em vórtex por um mintuto, e centrifugação por cinco
minutos, a 5000 rpm. Posteriormente, a 7 mL do extrato adicionam-se 0,99750 g de MgSO4, 0,17500 g de PSA e 0,05250 g de GCB. Após agitação em vórtex por 30
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segundos e centrifugação por um minuto, a 6000 rpm, à 5 mL do sobrenadante são adicionados 50 L de solução de ácido fórmico 5% v/v em acetonitrila, sendo posteriormente mantido sob fluxo de gás nitrogênio até a secura, ressuspendido em 1 mL de metanol e armazenado em frasco de vidro no freezer, até o momento da análise.
3.3.2 Avaliação do efeito matriz
A influência dos componentes do pimentão verde na quantificação dos agrotóxicos estudados pode ser avaliada analisando a Figura 3.14.
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Figura 3.14 – Curvas analíticas construídas a partir da análise por LC-MS/MS de soluções-padrão dos agrotóxicos em solvente e em extratos provenientes de amostras de pimentão verde, em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato.
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Analisando as curvas analíticas apresentadas observa-se efeito matriz para todos os agrotóxicos, exceto para o tebuconazol, uma vez que há diferença de inclinação entre as curvas obtidas com fortificação no solvente e no extrato da matriz (branco). As respostas cromatográficas referentes à maioria dos agrotóxicos, provenientes da injeção de soluções-padrão em extrato da matriz são menores que as provenientes da injeção de soluções-padrão em solvente. Isto comprova a influência dos coextrativos, no que diz respeito à supressão de sinal dos analitos. Observa-se também que o efeito matriz é mais acentuado para os compostos mais polares metamidofós, acefato, tiametoxam, metomil e imidacloprido (log Kow < 1). Segundo
Bonfiglio et al. (1999), a eficiência de ionização dos compostos polares é mais influenciada pela presença de coeluatos provenientes da matriz quando comparada aos compostos apolares, principalmente porque a maior parte dos coextrativos da matriz são polares e eluem no início da corrida cromatográfica.
A Figura 3.15 apresenta o efeito matriz em função das Equações 2.4 e 2.5 (Capítulo 2).
Figura 3.15 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos obtidos pela relação entre as respostas decorrentes da injeção e análise de soluções-padrão preparadas em solvente e em extrato da matriz (branco), em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato, e pela relação dos coeficientes angulares provenientes das curvas analíticas.
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Analogamente às conclusões obtidas analisando a Figura 3.14, observa-se que os coextrativos da matriz influenciam na supressão da ionização das moléculas da maior parte dos analitos, evidenciada pelos efeitos matriz bem menores que zero, e que os agrotóxicos mais hidrofílicos são os mais afetados na supressão.
Portanto, devem-se utilizar curvas analíticas provenientes da injeção de soluções-padrão dos agrotóxicos preparadas em extrato da matriz isenta dos mesmos, na quantificação.
3.3.3 Validação do método analítico
A Figura 3.16 mostra os cromatogramas do extrato da matriz isenta dos agrotóxicos estudados e do extrato da matriz fortificada com estes.
(b) (c) (d) (e) (f) (a)
97 (h) (i) (j) (k) (l) (m) (n) (o) (p) (q) (r) (g)
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Figura 3.16 – Cromatogramas do extrato da matriz isenta dos agrotóxicos (à esquerda) e do extrato da matriz fortificada com estes, numa concentração de 500 µg L-1 (à direita), obtidos a partir da aplicação do método QuEChERS na versão tampão citrato. Identificação: (a) metamidofós, (b) acefato, (c) tiametoxam, (d) metomil, (e) imidacloprido, (f) tiacloprido, (g) carbendazim, (h) tiabendazol, (i) carbofurano, (j) carbaril, (k) clomazona, (l) azoxistrobina, (m) metiocarbe, (n) fenarimol, (o) iprodiona, (p) tebuconazol, (q) piraclostrobina, (r) metconazol, (s) difenoconazol, (t) etiona, (u) piriproxifem.
Pode-se observar que não existem picos cromatográficos nos mesmos tempos de retenção dos analitos comprovando que o método é seletivo.
A Tabela 3.6 apresenta os resultados da validação do método desenvolvido. O método pode ser aplicado em amostras de pimentão verde para quantificação dos agrotóxicos estudados em concentrações iguais ou inferiores aos limites máximos de resíduo, MRL, estabelecidos pela ANVISA (2013), uma vez que os limites de quantificação considerados foram menores que o MRL de cada composto.
Curvas analíticas construídas a partir da injeção de extratos obtidos de amostras fortificadas em sete níveis de concentração dos analitos entre 1 e 4800 µg kg-1, (Figura A.24 – Apêndice D), foram utilizadas para avaliar a linearidade. Coeficientes de correlação maiores que 0,9917, caracterizando um bom ajuste do modelo às respostas observadas, e distribuição aleatória dos resíduos deixados pelo ajuste do modelo linear, com desvio na faixa entre ± 20% (Figura A.25 – Apêndice D), evidenciam a linearidade do método para os analitos, nos intervalos de concentrações considerados.
Recuperações satisfatórias, na faixa de 70 a 117%, e coeficientes de variação menores que 20%, para todos os analitos, indicam respectivamente a exatidão e a precisão do método.
(s)
(t)
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Tabela 3.6 – Figuras de mérito obtidas na validação do método QuEChERS-LC-MS/MS
Agrotóxico MRL (µg kg-1) IQL (µg L-1) MQL (µg kg-1) Faixa de trabalho (µg kg-1) Linearidade (r)
Exatidão Repetitividade Precisão intermediária Recuperação (%) Coeficiente de variação (%) MQL 6 x MQL MQL 6 x MQL MQL 6 x MQL metamidofós 412 100 100-1200 0,9933 77 72 11 4 9 6 acefato 1000 516 100 100-1200 0,9927 79 70 10 10 10 9 tiametoxam 200 132 20 20-240 0,9917 74 76 4 13 20 15 metomil 45 10 10-120 0,9978 88 87 10 7 10 6 imidacloprido 500 300 50 50-600 0,9979 88 78 19 14 20 14 tiacloprido 200 11 20 20-240 0,9941 95 89 7 6 8 5 carbendazim 6 2 2-24 0,9971 112 111 12 6 16 13 tiabendazol 2000 21 200 200-2400 0,9954 71 107 11 3 9 9 carbofurano 5 1 1-12 0,9995 99 99 5 4 8 4 carbaril 42 10 10-120 0,9995 117 98 8 4 11 5 clomazona 50 4 5 5-60 0,9928 92 95 6 4 7 6 azoxistrobina 500 2 50 50-600 0,9946 95 106 9 4 8 3 metiocarbe 50 5 5 5-60 0,9929 100 89 6 7 12 10 fenarimol 8 2 2-24 0,9981 99 95 6 3 8 6 iprodiona 4000 245 400 400-4800 0,9963 117 80 7 6 13 19 continua
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Tabela 3.6 – Figuras de mérito obtidas na validação do método QuEChERS-LC-MS/MS
Agrotóxico MRL (µg kg-1) IQL (µg L-1) MQL (µg kg-1) Faixa de trabalho (µg kg-1) Linearidade (r)
Exatidão Repetitividade Precisão intermediária Recuperação (%) Coeficiente de variação (%) MQL 6 x MQL MQL 6 x MQL MQL 6 x MQL tebuconazol 100 1 10 10-120 0,9933 88 95 5 4 16 8 piraclostrobina 1000 3 100 100-1200 0,9937 103 105 7 4 11 7 metconazol 100 1 10 10-120 0,9958 113 105 7 8 12 8 difenoconazol 500 2 50 50-600 0,9952 91 96 10 8 8 7 etiona 1000 9 100 100-1200 0,9982 100 106 8 13 11 12 piriproxifem 500 2 50 50-600 0,9982 85 102 6 3 11 5
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3.3.4 Análise de amostras de pimentão verde do comércio
O método foi aplicado em amostras de pimentão verde adquiridas no comércio dos quatro estados da Região Sudeste do Brasil (Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo), sendo que na maioria das amostras analisadas foi detectado pelo menos um dos agrotóxicos estudados, como mostrado na Tabela 3.7. Vale destacar a presença de agrotóxicos em amostras de origem orgânica (incluindo compostos não autorizados), do agrotóxico acefato em concentração igual a 1237 µg kg-1, acima do limite máximo de resíduo, e dos agrotóxicos não permitidos, metamidofós, carbendazim, carbofurano e fenarimol. Em suma, das 16 amostras analisadas, oito apresentaram agrotóxicos não autorizados e/ou em concentrações acima do MRL.
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Tabela 3.7 – Concentrações (µg kg-1) dos agrotóxicos encontrados em amostras de pimentão verde adquiridas no comércio da Região Sudeste do Brasil
Agrotóxico Concentração (µg kg-1) (Coeficiente de variação) (%) Amostras Espírito Santo (ES) Minas Gerais (MG) Rio de Janeiro (RJ) São Paulo (SP) 1 2 3 1a 2 3 1a 2 3 1a 2a 3a 4 5 6 metamidofós – – – – – 248 b (8%) – 690b (10%) < MQL – – – – – 377b (15%) acefato – – – – – 420 (6%) – 1237c (9%) < MQL – – – – – 718 (12%) tiametoxam – – – – – – – – – – 41 (8%) – – – – imidacloprido – – – – – – – – – – < MQL – – – – carbendazim – – 3 b (10%) – – – – – 16b (7%) – 5b (3%) – 20b (3%) – – carbofurano – – – – – – 1 b (11%) – – – – – – – – azoxistrobina – < MQL < MQL – – < MQL – < MQL – – < MQL – – – < MQL fenarimol – – – – – – – 15 b (8%) – – – – – – – continua
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Tabela 3.7 – Concentrações (µg kg-1) dos agrotóxicos encontrados em amostras de pimentão verde adquiridas no comércio da Região Sudeste do Brasil
Agrotóxico Concentração (µg kg-1) (Coeficiente de variação) (%) Amostras Espírito Santo (ES) Minas Gerais (MG) Rio de Janeiro (RJ) São Paulo (SP) 1 2 3 1a 2 3 1a 2 3 1a 2a 3a 4 5 6 tebuconazol – – – – – – 15 (1%) – < MQL – < MQL – – – < MQL piraclostrobina < MQL – – – – – < MQL – – – < MQL < MQL < MQL difenoconazol – – – – – – < MQL < MQL – – < MQL – – – < MQL a
Amostras orgânicas. conclusão
b
Em negrito: concentrações dos agrotóxicos não autorizadas.
c
Em negrito: concentração acima do limite máximo de resíduo. – : não detectado.
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3.3.5 Aplicação do método em matrizes similares ao pimentão verde
A Figura 3.17 apresenta as recuperações obtidas pela análise de extratos provenientes de amostras de pimentão vermelho, pimentão amarelo, tomate, melão e pepino verde fortificadas com os agrotóxicos estudados, nas quais foi aplicada a versão tampão citrato do método QuEChERS, no preparo de amostra.
Figura 3.17 – Recuperações dos agrotóxicos obtidas pela aplicação do método QuEChERS na versão tampão citrato em amostras de pimentão vermelho, pimentão amarelo, tomate, melão e pepino.
O emprego da técnica de preparo de amostra QuEChERS na versão tampão citrato nessas matrizes proporcionou recuperações entre 50 e 120%, aceitáveis para amostras complexas, e coeficientes de variação ≤ 20 , para todos os a rotóxicos estudados, como mostrado na Figura 3.17.
Em relação à influência dos componentes do pimentão vermelho e do pimentão amarelo na quantificação dos agrotóxicos estudados, avaliada pela análise das curvas analíticas apresentadas na Figura A.26 no Apêndice E, observa-se efeito matriz para a maior parte dos analitos, uma vez que há diferença de inclinação entre as curvas analíticas obtidas com fortificação no solvente e no extrato da matriz (branco). De forma
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semelhante ao observado para o pimentão verde, os coextrativos influenciam na quantificação dos analitos, no que diz respeito à supressão de sinal dos mesmos. Observa-se também que o efeito matriz é mais acentuado para os compostos mais polares metamidofós, acefato, tiametoxam, metomil e imidacloprido.
Avaliando o efeito matriz em função da Equação 2.4 (Capítulo 2), como mostrado na Figura 3.18, observa-se que os coextrativos da matriz, de maneira geral, influenciam na supressão da ionização das moléculas dos analitos, evidenciada pelos efeitos matriz bem menores que zero, e que os agrotóxicos que possuem os menores valores de log Kow (analitos mais hidrofílicos) são mais afetados na supressão.
Figura 3.18 – Efeitos matriz em relação aos agrotóxicos obtidos pela relação entre as respostas decorrentes da injeção e análise de soluções-padrão preparadas em solvente e em extrato da matriz (branco), em que se aplicou a técnica QuEChERS na versão tampão citrato.
Portanto, considerando que foram obtidos recuperações e coeficientes de variação aceitáveis, e que os efeitos matriz para o pimentão vermelho, pimentão amarelo, tomate, melão e pepino foram próximos aos do pimentão verde, há possibilidade de utilizar o método desenvolvido nessas matrizes para determinação dos agrotóxicos estudados. No entanto, devem-se utilizar curvas analíticas provenientes da
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injeção de soluções-padrão dos agrotóxicos preparadas em extrato da matriz isenta dos mesmos na quantificação, para compensar o efeito matriz.
3.4 CONCLUSÃO
As técnicas de preparo de amostra QuEChERS na versão tampão citrato e de determinação por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial para análise multirresíduo de agrotóxicos em pimentão verde, resultaram em um método rápido, efetivo e seguro, com geração de pequena quantidade de resíduos. Outra vantagem do método está relacionada às altas recuperações dos agrotóxicos, de 70 a 117 , e precisão dos resultados, verificada pelos coeficientes de variação ≤ 20 , valores recomendados na literatura.
Apesar de o método desenvolvido apresentar efeito matriz significativo para a maioria dos analitos, o mesmo foi aplicado, de forma confiável, em amostras de pimentão verde para determinação dos agrotóxicos estudados, uma vez que é seletivo, apresentou linearidade de resposta, exatidão e precisão dos resultados e limites de quantificação menores que o limite máximo de resíduos de cada agrotóxico estudado. Na maioria das amostras de pimentão verde analisadas foi detectado pelo menos um dos analitos, sendo que em aproximadamente 53% das amostras foram encontrados agrotóxicos não autorizados e/ou em concentrações acima do limite máximo de resíduo permitido.
Além disso, constatou-se que é possível aplicar o método QuEChERS-LC- MS/MS em pimentão vermelho, pimentão amarelo, tomate, melão e pepino, para determinação dos agrotóxicos estudados, uma vez que proporcionou recuperações e coeficientes de variação aceitáveis para análise de matrizes complexas e efeitos matriz semelhantes aos obtidos para amostras de pimentão verde em relação aos analitos.
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