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HUGO FERNANDO MAIA MILAN
COMPARAÇÃO DE MODELOS PARA ESTIMATIVA DA MÁXIMA VARIAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO TRANSMEMBRANA INDUZIDA POR CAMPOS ELÉTRICOS EXTERNOS EM CARDIOMIÓCITOS ISOLADOS DE RATOS DE DIFERENTES IDADES
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação
HUGO FERNANDO MAIA MILAN
COMPARAÇÃO DE MODELOS PARA ESTIMATIVA DA MÁXIMA VARIAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO TRANSMEMBRANA INDUZIDA POR CAMPOS ELÉTRICOS EXTERNOS EM CARDIOMIÓCITOS ISOLADOS DE RATOS DE DIFERENTES IDADES
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Elétrica, na área de concentração em Engenharia Biomédica
Orientador: Prof. Dr. José Wilson Magalhães Bassani Coorientadora: Profa. Dra. Rosana Almada Bassani
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO HUGO FERNANDO MAIA MILAN E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ WILSON MAGALHÃES BASSANI E COORIENTADA PELA PROFA. DRA. ROSANA ALMADA BASSANI
__________________________________________
CAMPINAS 2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Milan, Hugo Fernando Maia,
M589c MilComparação de modelos para estimativa da máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campos elétricos externos em cardiomiócitos isolados de ratos de diferentes idades / Hugo Fernando Maia Milan. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
MilOrientador: José Wilson Magalhães Bassani. MilCoorientador: Rosana Almada Bassani.
MilDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação.
Mil1. Miócitos cardíacos. 2. Método dos elementos finitos. 3. Campos
eletromagnéticos - Modelos matemáticos. 4. Estimulação elétrica. I. Bassani, José Wilson Magalhães,1953-. II. Bassani, Rosana Almada. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Comparison of models to estimate the maximal transmembrane
electrical potential variation induced by electrical fields in isolated cardiomyocytes of rats of different ages
Palavras-chave em inglês:
Cardiac myocytes Finite element method
Electromagnetic fields - Mathematical models Electrical stimulation
Área de concentração: Engenharia Biomédica Titulação: Mestre em Engenharia Elétrica Banca examinadora:
José Wilson Magalhães Bassani [Orientador] Airton Ramos
Eduardo Tavares Costa
Data de defesa: 27-01-2015
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Elétrica
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vii RESUMO
Tendo em vista que a estimulação com campos elétricos externos (E) é utilizada na prática clínica para tratamento de arritmias cardíacas, é necessário um melhor entendimento do fenômeno de polarização da membrana plasmática de cardiomiócitos por E. O disparo de potencial de ação, e subsequente contração celular, induzido por E em cardiomiócitos depende da indução de variação do potencial elétrico transmembrana (Vm) que leve este potencial ao valor limiar. Devido às limitações dos métodos
atualmente disponíveis para medir Vm e seu valor máximo, ΔVmax, os modelos eletromagnéticos
representam uma importante ferramenta para sua estimativa. Porém, os valores calculados dependem de como o fenômeno de polarização da membrana é modelado. Os modelos eletromagnéticos encontrados na literatura aproximam a forma irregular do cardiomiócito a formas geométricas regulares. Entretanto, até o momento, não se sabe qual destes modelos é o mais adequado para se estimar ΔVmax. As células
miocárdicas apresentam irregularidades em sua forma e, tanto a forma quanto as dimensões das células alteram-se com o desenvolvimento pós-natal. Neste trabalho, foi desenvolvido um modelo numérico tridimensional (MN3D) da forma irregular da célula, e comparou-se as estimativas de Vmax induzida
por E limiar (VL) feitas com este modelo e com modelos simplificados, entre estes o modelo numérico
bidimensional (MN2D) e os modelos analíticos para cilindro (MACil), esfera (MAEsf), esferóide prolato (MAEsPr) e elipsóide (MAElip). Para estimar VL, E limiar e as dimensões celulares foram medidos em
células cardíacas isoladas de ratos neonatos (5-7 dias), infantes (28-32 dias) e adultos (4-6 meses), em 6 faixas de ângulos entre a direção de aplicação do campo e o eixo maior da célula. Os modelos foram calibrados do ponto de vista eletromagnético, o que mostrou que, MN2D e MACil são inadequados para estimar Vmax. Enquanto as estimativas de VL com MN3D e MAEsPr não variaram com o ângulo, mas
sim com a idade, o oposto ocorreu com as estimativas feitas com o MAElip. Dentro de certas condições, as estimativas de VL feitas com MAEsPr foram as mais próximas daquelas feitas com MN3D.
Conclui-se que o MAEsPr, menos complexo tecnicamente, pode fornecer estimativas confiáveis de VL, desde
que o ângulo de aplicação de E seja pequeno (até 30º).
Palavras-chave: cardiomiócitos, método dos elementos finitos, modelos eletromagnéticos, potencial elétrico transmembrana.
ix ABSTRACT
Considering that stimulation with external electrical fields (E) is clinically used for arrhythmia treatment, it is important to understand the phenomenon of membrane polarization by E. Action potential and contraction triggering by E in cardiomyocytes depends on the induction of a transmembrane potential variation (Vm) sufficient for the attainment of the excitation threshold. Due to the limitations of the
methods currently available for measurement of ΔVm and its maximum value, ΔVmax, electromagnetic
models represent an important tool for this purpose. However, the calculated values depend on how the membrane polarization phenomenon is modeled. The electromagnetic models available in the literature approximate the cardiomyocyte irregular shape to regular geometries. Nevertheless, it has not been ascertained yet which model is the most appropriated to estimate ΔVmax in these cells, of which both
dimensions and shape vary markedly during postnatal development, and often present geometric irregularities. Thus, approximation of the cell shape to regular geometries may result in a considerable error in the ΔVm estimation. The aim of this study was to develop a three-dimensional numerical model
(MN3D) based on the irregular cell shape and to compare the values of Vmax induced by the threshold E (VL) estimated with this model with those calculated with simplified models, such as the
two-dimensional numerical model (MN2D) and the analytical models for cylinder (MACil), sphere (MAEsf), prolate spheroid (MAEsPr), and ellipsoid (MAElip). To estimate VL, the threshold E and cell
dimensions were measured in cardiomyocytes isolated from neonatal (5-7 days), weaning (28-32 days) and adult (4-6 months) rats, for 6 ranges of the angle between the directions of E and the cell major axis. Electromagnetic calibration of the models showed that MN2D and MACil were not suitable for Vmax
estimation in these cells. While VL estimated with MN3D and MAEsPr were angle-independent, but
dependent on the animal´s age, the opposite was observed regarding the estimates made with MAElip. Under certain conditions, VL values estimated with MAEsPr were the closest to those obtained with
MN3D. It is concluded that MAEsPr, a less technically complex model, can provide reliable VL
estimates provided that the angle between the directions of E and the cell major axis is small (up to 30º). Keywords: cardiomyocytes, finite element method, electromagnetic models, transmembrane electrical potential.
xi SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS... xv
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xxiii
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. OBJETIVOS ... 5
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 6
3.1. ANIMAIS E PREPARAÇÃO BIOLÓGICA ... 6
3.2. EQUIPAMENTOS ... 7
3.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 8
3.4. MODELOS ELETROMAGNÉTICOS PARA ESTIMATIVA DA MÁXIMA VARIAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO TRANSMEMBRANA INDUZIDA POR CAMPO ELÉTRICO EXTERNO ... 9
3.4.1. Modelos numéricos ... 10
3.4.2. Modelos analíticos ... 11
3.5. CALIBRAÇÃO DOS MODELOS NUMÉRICOS ... 14
3.6. ANÁLISE DE SENSIBILIDADE DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS ... 15
3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 16
4. RESULTADOS ... 18
4.1. DIMENSÕES CELULARES E CAMPO ELÉTRICO EXTERNO LIMIAR ... 18
4.2. CALIBRAÇÃO DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS ... 18
4.3. ANÁLISE DE SENSIBILIDADE DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS ... 21
4.4. ESTIMATIVA DA MÁXIMA VARIAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO TRANSMEMBRANA INDUZIDA POR CAMPO ELÉTRICO EXTERNO LIMIAR... 25
5. DISCUSSÃO ... 28
5.1. DIMENSÕES CELULARES E CAMPO ELÉTRICO EXTERNO LIMIAR ... 28
5.2. CALIBRAÇÃO DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS ... 28
5.3. ANÁLISE DE SENSIBILIDADE DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS ... 30
5.4. ESTIMATIVA DA MÁXIMA VARIAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO TRANSMEMBRANA INDUZIDA PELO CAMPO ELÉTRICO EXTERNO LIMIAR ... 31
5.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 35
6. CONCLUSÕES ... 37
7. REFERÊNCIAS ... 38
APÊNDICE A. ELETRODOS ... 45
A1. INTRODUÇÃO ... 45
xii
A3. RESULTADOS ... 47
A4. CONCLUSÃO ... 48
A5. REFERÊNCIAS ... 48
APÊNDICE B. PUBLICAÇÕES ... 50
xiii DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu filho, Carlos, e à minha esposa, Kalilpe.
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço, aos meus familiares por todo apoio, paciência e compreensão, em especial aos meus pais, Suelene Soares Maia e Geninho Rodrigues Milan, e aos meus tios Armando Soares Dias e Alex Sandro Campos Maia.
aos meus orientadores, Prof. Dr. José Wilson Magalhães Bassani e Profa. Dra. Rosana Almada Bassani, em primeiro lugar pela oportunidade, e pela paciência e dedicação.
aos funcionários do Centro de Engenharia Biomédica (CEB) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) por todo suporte técnico, em especial a Elizângela Souto de Oliveira e a Renato da Silva Moura.
ao Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP, por ter fornecido os animais que foram utilizados neste trabalho.
ao Prof. Dr. Antônio-Carlos Guimarães de Almeida, pelo apoio para a obtenção de imagens em três dimensões de cardiomiócitos com microscopia confocal.
ao Centro Nacional de Processamento de Alto Desempenho em São Paulo (CENAPAD-SP), por me permitir utilizar seus recursos computacionais.
ao Instituto Nacional de C&T em Biofabricação (INCT-BIOFABRIS), pela impressão em três dimensões de modelos de formas reais de cardiomiócitos.
ao Centro para Manutenção de Equipamentos (CEMEQ) da UNICAMP, por permitir utilizar a máquina de jato de areia.
à Área de Odontologia do Centro de Saúde da Comunidade (CECOM) da UNICAMP, por permitir utilizar a máquina de jato de bicarbonato.
ao companheiro Jair Trapé Goulart, pela ajuda com os experimentos e as atividades relacionadas ao Programa de Pós-Graduação.
à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Proc. 2013/05441-5), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; Proc. 302996/2011-7), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Serviço de Apoio ao Estudante (SAE) da UNICAMP pelo apoio financeiro.
xvii
“Engineers when analyzing, designing, calculating, simulating etc. always use models. A model is the mathematical abstraction of a physical problem. The crucial point here is to choose the right model for the physical process, device or phenomena under consideration.” Sevgi (2014).
xix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Variação do potencial elétrico transmembrana induzida por um campo elétrico externo (E) com intensidade de 1 V/cm, aplicado no sentido longitudinal ao eixo maior de um cardiomiócito isolado de rato adulto (comprimento ~130 µm) reconstruído tridimensionalmente a partir de imagens de microscopia confocal (Milan HFM, Bassani JWM, Bassani RA, Almeida ACG, dados não publicados). O detalhe mostra o efeito da aplicação de E de mesmo valor no sentido transversal. Note que o valor da maior intensidade do potencial induzido por E neste caso é reduzido em ~3x. No processo de estimulação por voltage-clamp, a variação do potencial elétrico transmembrana induzida pelos pulsos de tensão seria espacialmente homogênea, o que corresponderia, na figura acima, a uma única cor em toda a extensão da membrana plasmática. A seta indica o sentido do E (anodo para catodo). ... 2 Figura 2: Miócitos ventriculares isolados de ratos em diferentes idades: (A) neonato (5-7 dias, escala de
20 μm), (B) infante (28-32 dias, escala de 50 μm) e (C) adulto (4-6 meses, escala de 50 μm). ... 4 Figura 3: Desenho esquemático da câmara de estimulação. Para maiores detalhes, por favor, veja o texto. ... 8 Figura 4: Elemento triângulo e seus nós (A) e elemento tetraedro e seus nós (B). O elemento triângulo
foi utilizado para fazer a representação espacial das malhas do modelo numérico bidimensional. O elemento tetraedro foi utilizado para fazer a representação espacial das malhas do modelo numérico tridimensional... 10 Figura 5: Modelo numérico tridimensional (MN3D) do cardiomiócito de rato adulto mostrado na Figura
2C. Vistas nos eixos x e y (A), x e z (B), e y e z (C). O MN3D foi construído a partir de uma expansão da superfície do modelo numérico bidimensional, que é igual à superfície mostrada em (A). As linhas representam o contorno do modelo. O gradiente cinza representa a sombra causada por uma fonte de luz posicionada num plano paralelo ao plano apresentado em cada figura. ... 11 Figura 6: Condições de contorno utilizadas no modelo numérico bidimensional para aplicar um campo
elétrico externo no sentido longitudinal. As condições de potencial elétrico fixo nas extremidades do modelo correspondem às condições de contorno de Dirichlet. As condições de contorno que fixam o fluxo de potencial elétrico correspondem às condições de contorno de Neumann. ... 12 Figura 7: Modelo numérico tridimensional (MN3D) da forma celular mostrada na Figura 5 com bordas
suavizadas (A, B e C) ou chanfradas (D, E e F). Vistas nos eixos x e y (A e D), x e z (B e E), e y e z (C e F). As linhas representam o contorno do modelo. O gradiente cinza representa a sombra causada por uma fonte de luz posicionada num plano paralelo ao plano apresentado em cada figura. ... 15 Figura 8: Esferóide prolato com túbulos T, representados como orifícios distribuídos regularmente sobre
ambas faces da célula, com o detalhe da construção dos tútulobs T no modelo (para maiores detalhes, veja o texto). ... 17 Figura 9: Comprimento dos semi-eixos maior (c, painel A) e menor (a, painel B) de miócitos
ventriculares de ratos de diferentes idades. Dados expressos como média ± erro padrão. * p< 0,05 vs. o valor do grupo de 4-6 meses, teste de Bonferroni. N = 48 células para cada idade. ... 18 Figura 10: Campo elétrico externo limiar (EL) determinado experimentalmente em miócitos
ventriculares de ratos de diferentes idades. EL foi aplicado em diferentes ângulos com relação ao
eixo maior da célula. * p< 0,05 vs. a mesma faixa de ângulos no grupo adulto; # p< 0,05 vs. 0º-15º na mesma idade, teste de Bonferroni. Dados expressos como média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular (48 células em cada idade). ... 18 Figura 11: Erro percentual da estimativa da máxima variação do potencial elétrico transmenbrana
induzida por campo elétrico externo feita com o modelo numérico tridimensional (MN3D) com relação ao valor estimado com os modelos analíticos para as formas de esfera, esferóide prolato
xx
(ESPROL) e elipsóide (ELIP). LONG: Campo elétrico aplicado longitudinalmente à forma geométrica; TRANS: Campo elétrico aplicado transversalmente à forma geométrica. ... 19 Figura 12: Erro percentual no cálculo da máxima variação do potencial elétrico transmenbrana induzida
por campo elétrico externo usando-se o modelo numérico tridimensional e o modelo analítico para a forma geométrica cilíndrica. N: cilindro com comprimento = 120 μm e diâmetro = 30 μm; L: cilindro com comprimento = 1200 μm e diâmetro = 30 μm. LONG: Campo elétrico aplicado longitudinalmente à forma geométrica; TRANS: Campo elétrico aplicado transversalmente à forma geométrica. ... 20 Figura 13: Erro no cálculo da máxima variação do potencial elétrico transmenbrana induzida por campo
elétrico externo estimada com o modelo numérico bidimensional e os modelos analíticos para as formas de esfera, esferóide prolato (ESFPROL), cilindro e elipsóide (ELIP). LONG: Campo elétrico aplicado longitudinalmente à forma geométrica; TRANS: Campo elétrico aplicado transversalmente à forma geométrica. ... 21 Figura 14: Relação entre a máxima variação do potencial elétrico transmembrana estimado para a forma
geométrica com alterações (Vmax_Alt) e o valor da máxima variação do potencial elétrico
transmembrana estimado com o modelo numérico tridimensional (Vmax_MN3D) para as células de
animais neonatos (A), infantes (B) e adultos (C). As linhas tracejadas (de cima para baixo) representam as posições no eixo y onde o valor de Vmax_Alt/Vmax_MN3D é 1,05, 1,0 ou 0,95. Isolante:
forma geométrica utilizada no modelo numérico tridimensional (MN3D, Figura 5A-C) com uma camada isolante; Suave: forma geométrica utilizada no MN3D com as superfícies suavizadas (Figura 7A-C); Chanfro: forma geométrica utilizada no MN3D com as superfícies chanfradas (Figura 7D-F); Suave + Isolante: forma geométrica utilizada no modelo Suave com uma camada isolante; Chanfro + Isolante: forma geométrica utilizada no modelo Chanfro com uma camada isolante. Veja secção 3.6 para mais detalhes. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada idade e cada faixa angular. As mesmas células foram modeladas em todas as variações apresentadas. ... 23 Figura 15: Relação entre a máxima variação do potencial elétrico transmembrana estimado para a forma
geométrica com alterações (Vmax_Alt) e o valor da máxima variação do potencial elétrico
transmembrana estimado com o modelo analítico para a forma geométrica elipsóide (Vmax_MAElip)
para as células de animais neonatos (A), infantes (B) e adultos (C). As linhas tracejadas (de cima para baixo) representam as posições no eixo y onde Vmax_Alt /Vmax_ MAElip é 1,05, 1,0 ou 0,95. As
porcentagens representam o valor do comprimento do semi-eixo z (b) utilizado no modelo com a forma geométrica alterada em relação ao valor de b utilizado com o modelo analítico para a forma geométrica elipsóide. Veja a secção 3.6 para mais detalhes. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada idade e cada faixa angular. As mesmas células foram modeladas em todas as variações apresentadas. ... 24 Figura 16: Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo
de valor limiar (VL) estimada com o modelo para a forma geométrica esfera para o caso das células
de animais neonatos. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular. ... 25 Figura 17: Máxima variação do potencial elétrico trasmembrana induzida por campo elétrico externo de
valor limiar (VL) estimada com o modelo numérico tridimensional (A) e com os modelos analíticos
para a forma geométrica esferóide prolato (B) e elipsóide (C). * p< 0,05 vs. o valor calculado para a mesma faixa angular do grupo adulto; # p< 0,05 vs. valor calculado para a faixa de 0º-15º do mesmo grupo etário; u p< 0,05 vs. valor calculado para a faixa de 15º-30º do mesmo grupo etário; teste de Bonferroni. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular (48 células em cada idade). ... 26 Figura 18: Diferença percentual entre os valores estimados da máxima variação do potencial elétrico
xxi
tridimensional e os modelos analíticos para as formas geométricas esfera (MAEsf), esferóide prolato (MAEsPr) e elipsóide (MAElip) para as células de animais neonatos (A) infantes (B) e adultos (C). * p< 0,05 vs. o valor calculado para a mesma faixa angular para o grupo MAEsPr, teste de Bonferroni. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular (48 células em cada idade). ... 27 Figura 19: Diferença percentual entre os valores estimados da máxima variação do potencial elétrico
transmembrana induzida por campo elétrico externo de valor limiar (VL) com o modelo numérico
tridimensional e os modelos analíticos para as formas geométricas esferóide prolato (MAEsPr), esfera (MAEsf) e esferóide prolato ajustado (MAEsPrA) para as células de animais neonatos. * p< 0,05 vs. o valor calculado para a mesma faixa angular do grupo MAEsPrA, teste de Bonferroni. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular. ... 33 Figura 20: Máxima variação do potencial elétrico trasmembrana induzida por campo elétrico externo de
valor limiar (VL) estimada com os modelos analíticos para a forma geométrica esferóide prolato
(MAEsPr), esfera (MAEsf) e esferóide prolato ajustado (MAEsPrA) e com o modelo numérico tridimensional (MN3D) para as células de animais neonatos. * p< 0,05 vs. o valor calculado para a mesma faixa angular do grupo MN3D, teste de Bonferroni. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular. ... 33
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 2a Comprimento do eixo maior do miócito cardíaco
2b Comprimento do eixo z (profundidade) do miócito cardíaco 2c Comprimento do eixo menor do miócito cardíaco
E Campo elétrico externo
EL Campo elétrico externo limiar para excitação
ELong Campo elétrico externo aplicado no sentido longitudinal ao eixo maior da célula ETrans Campo elétrico externo aplicado no sentido transversal ao eixo menor da célula g Condutância elétrica por unidade de área da membrana plasmática
σ Condutividade elétrica do meio
σe Condutividade elétrica do meio extracelular σi Condutividade elétrica do meio intracelular
MACil Modelo analítico para a forma geométrica de cilindro MAElip Modelo analítico para a forma geométrica de elipsóide MAEsf Modelo analítico para a forma geométrica de esfera
MAEsPr Modelo analítico para a forma geométrica de esferóide prolato
MAEsPrA Modelo analítico para a forma geométrica de esferóide prolato ajustado MDF Método das diferenças finitas
MEF Método dos elementos finitos MN2D Modelo numérico bidimensional MN3D Modelo numérico tridimensional
PA Potencial de ação
Vm Potencial elétrico transmembrana
Vm
Variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo
Vmax
Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo
VL
Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo limiar
Vmax_MN3D
Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo estimada com o modelo numérico tridimensional
Vmax_MAElip
Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo estimada com o modelo analítico a forma geométrica elipsóide Vmax_Alt
Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo para a forma geométrica com alterações
1 1. INTRODUÇÃO
O modelamento da interação do campo eletromagnético com tecidos biológicos tem ajudado a entender diversos fenômenos biológicos, como o fenômeno da excitação celular induzida por campos elétricos externos (E) (Tung & Borderies, 1992; Ying et al., 2006; Ying & Henriquez, 2007). Quando o potencial elétrico transmembrana (Vm) da célula muscular cardíaca (tipicamente
– 80 mV, negativo dentro com relação ao meio extracelular) atinge um valor denominado de limiar, menos negativo que o valor de repouso, é disparada uma variação não-linear do Vm denominada de
potencial de ação (PA), o qual é um processo complexo que inclui a abertura de canais iônicos da membrana plasmática, e inicia o processo do acoplamento excitação-contração (Bers, 2001).
Além deste ser um importante fenômeno fisiológico, o conhecimento da interação do E com cardiomiócitos tem diversas aplicações na área da saúde (Webster, 2010). Por exemplo, E são utilizados em aparelhos marca-passos cardíacos com o objetivo de induzir, nas células musculares cardíacas, uma variação do Vm (ΔVm) suficientemente alta para causar excitação, assim controlando
a ritmicidade cardíaca (Murray, 2006). Ademais, a aplicação de E de alta intensidade por aparelhos desfibriladores ou cardioversores no coração é a única intervenção médica conhecida para tratar arritmias graves, como a fibrilação ventricular, na qual a contração dos cardiomiócitos encontra-se dessincronizada (Roth, 2006). Neste caso, o efeito esperado do E de alta intensidade é a indução de ΔVm supralimiar em uma massa crítica de células cardíacas, causando excitação generalizada,
para que o miocárdio possa recuperar o sincronismo elétrico e mecânico. Logo, um melhor conhecimento da interação de E com o miocárdio pode ser relevante para a aplicação médica da estimulação elétrica do coração.
Sabe-se que a estimulação transmembrana de cardiomiócitos produz efeitos fisiológicos diferentes daqueles produzidos pela estimulação com E (Tung & Borderies, 1992; Sharma & Tung, 2002). Foi demonstrado que, diferentemente do que ocorre durante a aplicação transmembrana de pulsos de corrente elétrica utilizando a técnica de current-clamp (no qual se assume uniformidade espacial da aplicação do estímulo), a aplicação de E induz uma polarização espacialmente heterogênea, porém simétrica, com regiões de hiperpolarização, onde a excitação é dificultada, e regiões de despolarização, onde a excitação é favorecida (Figura 1). No caso desta, o valor de maior amplitude de ΔVm (ΔVmax) foi produzido nas extremidades da célula. No caso particular da
2
estimulação com intensidade limiar de E, o valor de ΔVmax será denominado ΔVL no presente
trabalho.
Figura 1: Variação do potencial elétrico transmembrana induzida por um campo elétrico externo (E) com intensidade de 1 V/cm, aplicado no sentido longitudinal ao eixo maior de um cardiomiócito isolado de rato adulto (comprimento ~130 µm) reconstruído tridimensionalmente a partir de imagens de microscopia confocal (Milan HFM, Bassani JWM, Bassani RA, Almeida ACG, dados não publicados). O detalhe mostra o efeito da aplicação de
E de mesmo valor no sentido transversal. Note que o valor da maior intensidade do potencial induzido por E neste
caso é reduzido em ~3x. No processo de estimulação por voltage-clamp, a variação do potencial elétrico transmembrana induzida pelos pulsos de tensão seria espacialmente homogênea, o que corresponderia, na figura acima, a uma única cor em toda a extensão da membrana plasmática. A seta indica o sentido do E (anodo para catodo).
Três técnicas podem ser utilizadas para quantificar a polarização da membrana induzida por E: medição de Vm com eletrodos intracelulares, medição do sinal de fluorescência emitida por
indicadores potenciométricos e estimativa de ΔVm com modelos eletromagnéticos. A primeira
3
médio ao longo de toda a membrana e não permite discriminar suas variações espaciais durante a estimulação com E.
Apesar da medição do Vm por meio da fluorescência emitida por indicadores potenciométricos
permitir estimar a ΔVm induzida por E, estes indicadores tipicamente têm uma faixa dinâmica
estreita (variação de apenas 6% na fluorescência emitida para uma variação de Vm de cerca de 100
mV, no caso do indicador Di-8-ANEPPS, Pucihar et al., 2006). Isto, além das incertezas da calibração do indicador, prejudica a confiabilidade das medições. Como esses indicadores não são raciométricos, a emissão pode ainda ser afetada por artefatos de movimento e perda do indicador ao longo do experimento, o que contribui para a não adequação do seu uso para este fim.
Por outro lado, modelos eletromagnéticos podem ser usados para estimar ΔVm, porém os
valores calculados dependerão de como o fenômeno de polarização da membrana é modelado. Muitos são os modelos eletromagnéticos que podem ser usados para se estimar a indução da ΔVm
por E em células cardíacas. Neles, a forma geométrica dos cardiomiócitos é aproximada por um cilindro (Leon & Roberge, 1993; Ranjan & Thakor, 1993a; Krassowska & Neu, 1994; Ranjan & Thakor, 1995; Pham et al., 2000) ou esferóide prolato (Tung & Borderies, 1992; Fishler et al., 1995; Gomes et al., 2001; Bassani et al., 2006; Oliveira et al., 2008; Goulart et al., 2012), ou então é reduzida para superfícies em modelos numéricos bidimensionas (Ranjan & Thakor, 1993a,b, 1995).
Entretanto, as dimensões e a forma geométrica dos miócitos cardíacos sofrem modificações durante o desenvolvimento pós-natal: seu tamanho aumenta e sua forma se modifica da geometria esferóide que ocorre frequentemente em neonatos para a forma de um paralelepípedo, típica na idade adulta (Figura 2). Além disso, mesmo em animais de uma dada faixa etária, a forma dos miócitos apresenta irregularidades num padrão altamente variável de célula para célula. A forma geométrica utilizada para representar os cardiomiócitos nos modelos eletromagnéticos é um fator importante pois a representação inadequada da forma geométrica irregular de células pode gerar erros consideráveis na estimativa de ΔVmax induzida por E (Miller & Henriquez, 1988; Fear &
Stuchly, 1998a) e estes erros são ainda influenciados pelo ângulo de aplicação de E (Fear & Stuchly, 1998b; Pucihar et al., 2006).
O modelamento eletromagnético da interação do E com células que possuem forma geométrica irregular só é possível com a utilização de modelos numéricos (Ramos et al., 2003). Os métodos numéricos mais utilizados para cálculo de ΔVm são o método dos elementos finitos (MEF, Miller
4
& Henriquez, 1988; Ranjan & Thakor, 1995; Pucihar et al., 2006; Ying et al., 2006; Meny et al., 2007; Ying & Henriquez, 2007) e o método das diferenças finitas (MDF, Klee & Plonsey, 1972; Kotnik & Pucihar, 2010). Entre estes, o MEF é preferível devido à possibilidade de modelar contornos e geometrias irregulares mais facilmente (Kotnik & Pucihar, 2010).
(A) (B) (C)
Figura 2: Miócitos ventriculares isolados de ratos em diferentes idades: (A) neonato (5-7 dias, escala de 20 μm), (B) infante (28-32 dias, escala de 50 μm) e (C) adulto (4-6 meses, escala de 50 μm).
Portanto, neste trabalho, ΔVL foi estimado a partir da determinação experimental da
intensidade limiar de E (EL) em miócitos ventriculares de ratos de diferentes idades, utilizando
modelos eletromagnéticos numéricos bidimensional e tridimensional resolvidos com o MEF. Foram utilizados ainda, para o mesmo fim, modelos analíticos para as formas geométricas de esfera, cilindro, esferóide prolato e elipsóide. A influência da idade sobre ΔVL, e da direção de
aplicação do E sobre ΔVL foram estudadas com cada modelo e as estimativas foram comparadas
5 2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi identificar o modelo analítico mais adequado para estimar ΔVmax induzida por E no caso particular do miócito cardíaco. Para isto, foram definidos os seguintes
objetivos específicos:
a. Medir EL em miócitos ventriculares isolados de ratos Wistar com idades de 5-7 dias
(neonatos), 28-32 dias (infantes) e 4-6 meses (adultos). b. Estimar ΔVL com modelos eletromagnéticos.
6 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS E PREPARAÇÃO BIOLÓGICA
Foram utilizados ratos Wistar provenientes do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e mantidos no biotério do Centro de Engenharia Biomédica (CEB) da UNICAMP. O protocolo para cuidado e uso dos animais (veja o Anexo) foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UNICAMP com os números de processo 2941-1D e 3281-1D para os animais neonatos (ambos os sexos), e 3009-1A e 2942-1K para os animais infantes e adultos (machos), respectivamente. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas em ambiente climatizado com fotoperíodo de 12 h, recebendo água e ração ad libitum. Os animais neonatos permaneceram com as mães até o dia de sua utilização. Os animais foram manipulados somente para a limpeza das gaiolas.
O isolamento de miócitos do ventrículo esquerdo de ratos infantes e adultos foi realizado de acordo com Penna & Bassani (2010).O animal foi sacrificado por exsanguinação sob anestesia profunda com isoflurano (adultos), ou após concussão cerebral (infantes). O coração foi removido, a aorta foi canulada e o coração perfundido por 4-5 min com solução de Krebs-Henseleit modificada sem CaCl2 a 37 ºC (composição em mM: 115 NaCl; 4,6 KCl; 1,2 KH2PO4; 25 NaHCO3; 2,4 MgSO4; 11,1 glicose). Em seguida, foi adicionada colagenase tipo I (0,4-0,5 mg/ml; Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, EUA) a esta solução, com a qual o coração foi perfundido por 10-25 min. Para interromper a digestão, o coração foi perfundido com solução de Tyrode modificada (composição em mM: 140 NaCl; 6 KCl; 2,5 MgCl2; 10 de ácido N-2 hidroxietilpiperazina-N”-2 etano-sulfônico (HEPES); 11 glicose; pH ajustado com NaOH para 7,4) contendo albumina sérica bovina (0,5 mg/ml; Calbiochem, San Diego, CA, EUA) por 5-8 min. Por fim, o ventrículo esquerdo foi dissecado e agitado em solução cardioplégica para dissociação das células.
Para isolamento de miócitos do coração de ratos neonatos, foi seguido o procedimento descrito por Bassani & Bassani (2002), com algumas modificações. Os animais foram sacrificados por decapitação, a aorta foi canulada e o coração foi perfundido com solução de Tyrode modificada sem CaCl2 em todas as etapas de lavagem e digestão. Esta solução também foi o meio onde foi feita a dissociação das células de ambos os ventrículos.
7 3.2. EQUIPAMENTOS
A montagem experimental foi desenvolvida em trabalhos anteriores realizados no Laboratório de Pesquisa Cardiovascular do CEB/UNICAMP (Ricardo et al., 2006; Oliveira et al., 2008), onde os presentes experimentos foram realizados.
A câmara de perfusão das células isoladas foi acoplada ao sistema de microscopia que permite ampliar a imagem em até 2800 vezes. A iluminação foi feita com um diodo emissor de luz (LED) vermelha de alta intensidade (Super Bright LED, Jumbo, 5000 mcd, 1,85 V, 20 mA, fabr. Archer, N. Cat. 276 – 086). A imagem, ampliada por uma objetiva (mod. Plan 32, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha; ou mod. EA100, Olympus, Shinjuku, Japão), foi capturada por uma câmera CCD (Charge Coupled Device, mod. ICD-31 Ikegami Tsushinki Co., Tóquio, Japão) e simultaneamente transmitida para um monitor de vídeo (mod. KBM 1200S, Kodo, Ilhéus, BA) e para uma placa de aquisição de vídeo (mod. Dazzle Digital Video Creator 150, Pinnacle Systems, North Canton, OH, EUA) conectada a um microcomputador (Pentium Dual Core, 2,8 GHz, 2 GB de RAM, 230 GB) onde eram armazenados os arquivos de vídeo. As dimensões das células na imagem de vídeo foram estimadas a partir de calibração com uma gratícula micrométrica padrão (resolução de 10 μm, Carl Zeiss, Göttingen, Alemanha).
Foram utilizados dois estimuladores elétricos de tensão desenvolvidos no CEB/UNICAMP, que geravam pulsos retangulares bipolares simétricos de tensão com amplitude de 0-25 V ou 0-40 V, configurados para fornecerem pulsos com duração total de 10 ms na frequência de 0,5 Hz. A saída dos estimuladores era conectada a um par de eletrodos cilíndricos de platina (diâmetro de 0,5 mm) dispostos ao longo das paredes laterais da câmara e longitudinalmente ao fluxo de solução. O E gerado por estes eletrodos na câmara foi aproximado como aquele em um capacitor de placas paralelas com distância de 0,75 cm entre as placas (Oliveira et al., 2008), calculado como mostra a Eq.[1]. A Figura 3 mostra o desenho esquemático da câmara de estimulação.
E=
d [1]
Para os experimentos com células de animais neonatos, foram utilizados, além dos eletrodos cilíndricos com diâmetro de 0,5 mm, eletrodos com maior área de superfície, como eletrodos
8
cilíndricos de platina com diâmetro de 2 mm e uma chapa de platina com 30 mm de comprimento, 5 mm de altura e 0,1 mm de espessura, polidos com jato de areia ou bicarbonato (veja o Apêndice A). Nestes casos, o potencial elétrico foi medido próximo à célula em estudo com eletrodos de Ag/AgCl inseridos na câmara de perfusão. A medição foi feita em diversos pontos que estavam em uma linha perpendicular ao sentido do fluxo da solução fisiológica. Os valores medidos foram utilizados para calcular E, que foi calculado como a diferença do potencial elétrico medido entre dois pontos dividida pela distância entre eles. As medições de tensão e potencial elétrico foram feitas com um osciloscópio digital (mod. TDS-360, Tektronix Inc., Beaverton, OR, EUA).
Figura 3: Desenho esquemático da câmara de estimulação. Para maiores detalhes, por favor, veja o texto.
3.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
O fundo da câmara de perfusão, formado por uma lamínula, foi tratado com colágeno para adesão das células. Após a secagem do colágeno (10 min), as células foram depositadas sobre a lamínula, e um período de 20 min foi aguardado para sua aderência. A preparação foi perfundida com solução de Tyrode modificada (composição em mM: 140 NaCl; 6 KCl; 1,5 MgCl2; 5 HEPES; 1 CaCl2; 11 glicose; pH ajustado com NaOH para 7,4) a 23 ºC à taxa de 2 a 3 ml/min.
Para medir EL, a menor intensidade do E capaz de evocar uma contração, a preparação foi
perfundida por 1 min sem estimulação elétrica e então estimulada eletricamente por 1 min com pulsos de amplitude supralimiar. A seguir, a amplitude do pulso elétrico estimulatório foi diminuída gradualmente até não ser mais observada resposta contrátil à estimulação, e sucessivamente aumentada e diminuída em pequenos passos, até a determinação de EL. O valor de
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EL, foi a média de 1-5 determinações feitas em cada célula. As células foram distribuídas em 6
grupos de 8 células cada, em cada idade (n = 48 células para cada idade), de acordo com o ângulo entre o eixo maior da célula e a direção de aplicação de E: 0º-15º, 15º-30º, 30º-45º, 45º-60º, 60º-75º e 60º-75º-90º.
3.4. MODELOS ELETROMAGNÉTICOS PARA ESTIMATIVA DA MÁXIMA
VARIAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO TRANSMEMBRANA INDUZIDA POR CAMPO ELÉTRICO EXTERNO
Para valores de Vm próximos ao valor limiar, o comportamento elétrico da membrana celular
pode ser simplificado como a resposta de um circuito RC em paralelo (Malmivuo & Plonsey, 1995; Pham et al., 2000; Plonsey & Barr, 2007). Como a constante de tempo deste circuito equivalente é da ordem de microssegundos (Valic et al., 2003; Kotnik & Pucihar, 2010), pode-se desconsiderar o efeito capacitivo na estimativa de Vmax induzida ao final da aplicação de E com uma forma de
onda retangular bipolar simétrica com duração total de 10 ms (Klee & Plonsey, 1976; Kotnik & Pucihar, 2010). Assim, as equações de Maxwell podem ser reduzidas para a formulação de campos quase-estacionários e, portanto, só é preciso solucionar a equação da continuidade (Ranjan & Thakor, 1995; Kotnik & Miklavcic, 2000):
∇ ∙ ( ∇ ) = 0 [2]
onde σ é a condutividade elétrica do meio (S/m). Foram assumidos os valores 0,8 e 1,4 S/m para a condutividade elétrica dos meios intracelular (σi) e extracelular (σe), respectivamente, e 1,4925
S/m2 para a condutância elétrica por unidade de área da membrana celular (g; Coocklin et al., 1997; Gomes et al., 2001; Fry et al., 2012). Apesar de ter sido demonstrado que, para o modelo do esferóide prolato, o valor estimado de Vmax não difere muito se quando g/σ ≤ 100 m-1
(assumindo-se σ = σi = σe) for considerado g = 0 S/m2 (Klee & Plonsey, 1976), não se sabe se isto também se
aplica a uma forma geométrica irregular modelada numericamente. Por isto, VL foi estimado
considerando-se g = 0 ou 1,4925 S/m2. Foi encontrada uma diferença média menor que 0,01% entre as estimativas de VL feitas assumindo-se g = 0 S/m2 ou 1,4925 S/m2. Dessa forma, os modelos
eletromagnéticos utilizados neste trabalho assumiram que a célula era uma casca dielétrica com g = 1,4925 S/m2 e desconsideraram as alterações na resistência elétrica da membrana causadas por mudanças na dinâmica dos canais iônicos em resposta à polarização da membrana.
10
As dimensões do semi-eixo menor (a; largura; eixo y) e do semi-eixo maior (c; comprimento; eixo x) das células foram medidas a partir da imagem de vídeo com o software Autodesk Inventor (Autodesk Inc., San Rafael, CA, EUA). Assumimos que o comprimento do semi-eixo z (b; espessura) era igual a a para as células de ratos neonatos, e igual a 6,5 e 7 μm para as células de ratos infantes e adultos, respectivamente (Satoh et al., 1996).
3.4.1. Modelos numéricos
Foi utilizado o MEF por permitir modelar mais facilmente os contornos e geometrias irregulares (Kotnik & Pucihar, 2010). O MEF segmenta o volume condutor em pequenos elementos geométricos que representam área ou volume nos modelos numérico bidimensional (MN2D) e tridimensional (MN3D), respectivamente. Os elementos bidimensionais e tridimensionais utilizados foram o triângulo e o tetraedro, respectivamente (veja Figura 4). Os elementos são ligados entre si por unidades chamadas de nós, e o conjunto dos elementos e dos nós é chamado de malha. O potencial elétrico dos nós é encontrado resolvendo-se a equação matricial que relaciona este potencial com as condições de contorno. As malhas do MN3D foram criadas com, em média, 194 mil nós e 1,12 milhão de elementos.
Figura 4: Elemento triângulo e seus nós (A) e elemento tetraedro e seus nós (B). O elemento triângulo foi utilizado para fazer a representação espacial das malhas do modelo numérico bidimensional. O elemento tetraedro foi utilizado para fazer a representação espacial das malhas do modelo numérico tridimensional.
No MN2D, assumimos que o meio extracelular era um quadrado com a célula no centro, a qual foi modelada como a superfície do cardiomiócito observada no microscópio. No MN3D, assumimos que o meio extracelular era um cubo com a célula no centro, sendo esta modelada como a expansão da superfície do modelo bidimensional ao longo do eixo z (Figura 5). Os modelos
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numéricos foram construídos no programa Autodesk Inventor Professional 2013, e a malha foi criada no software Gmsh (versão 2.6.2 ou posterior para Windows 64 bits; Geuzaine & Remacle, 2009). A simulação foi realizada com o programa ElmerGui (7.0 Rev. 5817 ou posterior para Windows 64 bits; CSC – IT Center for Science Ltd., Espoo, Finlândia), e o pós-processamento foi feito com o MATLAB (MathWorks Inc., Natick, MA, EUA).
Figura 5: Modelo numérico tridimensional (MN3D) do cardiomiócito de rato adulto mostrado na Figura 2C. Vistas nos eixos x e y (A), x e z (B), e y e z (C). O MN3D foi construído a partir de uma expansão da superfície do modelo numérico bidimensional, que é igual à superfície mostrada em (A). As linhas representam o contorno do modelo. O gradiente cinza representa a sombra causada por uma fonte de luz posicionada num plano paralelo ao plano apresentado em cada figura.
As faces do cubo (ou lados do quadrado) por onde ocorre o fluxo elétrico estabelecido pelo E foram modeladas como condição de contorno de Dirichlet, ou seja, potencial elétrico fixo. A membrana celular foi modelada como condição de fronteira de Neumman entre os meios intra e extracelular (Pucihar et al., 2006), a qual assume densidade de corrente igual a gVm. As demais
fronteiras foram modeladas com a condição de contorno de Neumann com densidade de corrente nula. A Figura 6 mostra, como exemplo, o modelo bidimensional e as condições de contorno para aplicar E no sentido longitudinal.
3.4.2. Modelos analíticos
Para estimar VL e calibrar o modelo numérico (veja secção 3.5), foram utilizados os modelos
analíticos desenvolvidos por Gimsa & Wachner (2001) para as formas geométricas esfera (MAEsf), elipsóide (MAElip), esferóide prolato (MAEsPr) e cilindro (MACil). O MAEsf foi exclusivamente utilizado para estimar VL no caso particular das células de animais neonatos, pois,
para esta faixa etária, c ≈ a (Gomes et al., 2001; dados deste trabalho, veja a secção 4.1); o raio do MAEsf foi assumido ser 0,5×(c + a). Os valores estimados de VL com o MAElip, por sua vez,
foram idênticos aos estimados com o MAEsPr para o caso das células de animais neonatos, uma vez que, de acordo com o nosso conhecimento, não há na literatura relatos do valor de b de
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cardiomiócitos de ratos neonatos e, dessa forma, foi assumido b = a, que corresponde ao MAEsPr (caso particular do MAElip). Os demais modelos foram utilizados nas três faixas etárias em estudo. As equações dos modelos analíticos foram programadas no MATLAB e as integrais foram resolvidas com o método trapezoidal (Dunn et al., 2006).
Figura 6: Condições de contorno utilizadas no modelo numérico bidimensional para aplicar um campo elétrico externo no sentido longitudinal. As condições de potencial elétrico fixo nas extremidades do modelo correspondem às condições de contorno de Dirichlet. As condições de contorno que fixam o fluxo de potencial elétrico correspondem às condições de contorno de Neumann.
Sendo (Px, Py) um ponto na membrana, o valor de Vm calculado com o modelo de Gimsa &
Wachner (2001) pode ser descrito como:
∆ = 1
1 + cg 1 + c − c c
cos + 1
1 + ag 1 + a − a a
sen [3]
onde cinfl e ainfl são parâmetros geométricos e θ é o ângulo entre E e c. Segundo este modelo, Vm
depende da intensidade do E, do comprimento e da largura da célula e do ângulo θ. O modelo também mostra que quanto maiores forem os valores de σi e σe, ou menor for o valor de g, maior
será a amplitude de Vm, atingindo um valor máximo quando g = 0 S/m2 ou σi e σe tenderem ao
13
variáveis, E no sentido longitudinal (ELong; caracterizado como o primeiro termo do lado direito da
Eq. [3]) e E no sentido transversal (ETrans; caracterizado como o segundo termo do lado direito da
Eq. [3]), sendo que a influência de ELong e ETrans sobre Vm dependerá de θ e de (Px, Py). Dessa
maneira, pode-se escrever Vm (ELong, ETrans).
Os parâmetros ainfl e cinfl podem ser calculados por:
= 1
1 − a [4]
= 1
1 − c [5]
onde e são denominados fatores de despolarização que dependem da forma geométrica. Para um elipsóide, os fatores de despolarização são calculados por:
= √1 − (1 − ) ( , ) − ( , ) [6] = − + √1 − ( − ) ( , ) − − [7] onde = a/c [8] = /c [9] = 1 − 1 − [10] = cos [11] ( , ) = 1 √1 − sin [12] ( , ) = 1 − sin [13]
Para o esferóide prolato, que é um caso particular do elipsóide quando b = a, sendo = 1 − ( ⁄ ) , e os fatores de despolarização são calculados por:
14 =1 − 2 ln 1 + 1 − − 2 [14] = 1 − 2 [15]
Para o cilindro, assumido como um caso particular do esferóide prolato quando c >> a, os fatores de despolarização são = 0 e = 0,5. Por fim, para uma esfera, = = 1/3.
3.5. CALIBRAÇÃO DOS MODELOS NUMÉRICOS
Antes que os modelos eletromagnéticos pudessem ser utilizados para estimar VL com um
mínimo de confiabilidade, foi necessário calibrá-los para saber se o fenômeno físico foi representado adequadamente quando se utilizaram formas geométricas simples e conhecidas. A calibração de um modelo eletromagnético numérico é definida na norma IEEE Std 1597.2-2010 como o processo de ajuste dos parâmetros numéricos e do sistema modelado com o objetivo de obter resultados próximos aos observados experimentalmente. A calibração de modelos eletromagnéticos numéricos geralmente é feita comparando-se os valores estimados com esses modelos e com modelos analíticos (Sevgi, 2014). Na calibração do MN3D e do MN2D, os modelos analíticos foram tomados como referência, e a estimativa obtida com estes modelos foi comparada com aquelas obtidas com os modelos analíticos.
Portanto, formas geométricas simples foram modeladas com MN2D e MN3D e com os modelos analíticos. As formas geométricas utilizadas foram: esfera (raio = 10 μm), esferóide prolato (c = 60 μm; a = 15 μm), cilindro (c = 60 μm; a = 15 μm) e elipsóide (c = 60 μm; a = 15 μm; b = 7 μm).
Na secção 3.4.2 foi mostrado que a função dos modelos analíticos que estima Vmax pode ser
caracterizada como dependente de ELong e ETrans. Dessa forma, pode-se inferir que se as estimativas
de Vmax com os modelos numéricos quando forem simulados ELong e ETrans fossem similares às
estimativas feitas com os modelos analíticos para as mesmas direções, então os modelos numéricos seriam adequados para estimar Vmax independente da direção de aplicação de E. Assim, utilizamos ELong e ETrans para estimar Vmax nas formas geométricas supracitadas, exceto para a esfera que
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3.6. ANÁLISE DE SENSIBILIDADE DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS
Na análise de sensibilidade, a forma geométrica do sólido foi variada e o impacto desta variação sobre Vmax foi investigado. Neste caso, o ângulo do E foi variado, em pequenos passos,
de 0º a 90º e a relação dos valores de Vmax estimado para a forma geométrica com alterações
(Vmax_Alt) e com o modelo de referência foi calculada para cada faixa angular utilizada nos
experimentos com células isoladas (veja secção 3.3).
Com o MN3D, a forma geométrica da célula foi aproximada como mostrado na Figura 5, e a posição espacial da célula foi assumida ser no centro de um volume condutor. Apesar da aproximação geométrica ser razoável, era possível que formas geométricas diferentes da modelada alterassem consideravelmente o valor de Vmax estimado. Por isso, alterou-se a forma geométrica
do modelo de algumas células, suavizando (Figura 7A-C) ou chanfrando as bordas do sólido (Figura 7D-E), e as estimativas de Vmax da forma geométrica com ou sem alterações foram
comparadas. Apesar das alterações geométricas, a vista da face superior do modelo foi mantida (Figura 2C e Figura 7A e D).
Figura 7: Modelo numérico tridimensional (MN3D) da forma celular mostrada na Figura 5 com bordas suavizadas (A, B e C) ou chanfradas (D, E e F). Vistas nos eixos x e y (A e D), x e z (B e E), e y e z (C e F). As linhas representam o contorno do modelo. O gradiente cinza representa a sombra causada por uma fonte de luz posicionada num plano paralelo ao plano apresentado em cada figura.
Nos experimentos fisiológicos, as células podem ficar aderidas ao colágeno ou à lamínula. Como estes materiais são isolantes (Marianiová & Lapcík Jr, 1993, Sadiku, 2004), a aproximação dos modelos eletromagnéticos de se considerar os sólidos no centro de um volume condutor poderia não ser realista neste caso. Por isso, considerou-se uma superfície isolante aderida à face inferior
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do sólido e analisou-se o impacto desta alteração sobre as estimativas de Vmax calculado com o
MN3D.
No caso do MN3D e do MAElip, o valor de b dos cardiomiócitos modelados foi assumido ser igual a a (neonatos), 6,5 µm (infantes) ou 7 µm (adultos). Apesar da premissa da igualdade de b e a ser razoável para as células de animais neonatos (que possuem forma geométrica esferoidal), e os valores de b assumidos para as células de animais infantes e adultos serem próximos do valor medido com microscopia confocal (Satoh et al., 1996), era importante saber o quanto erros nos valores assumidos de b poderiam afetar as estimativas de Vmax com estes modelos. Por isso, Vmax
foi estimado com MAElip considerando b igual a 50%, 60%, 80%, 90%, 110%, 120%, 140% ou 150% do valor assumido, e comparado com a estimativa com o mesmo modelo, usando o valor assumido desta variável para cada uma das faixas etárias estudadas.
O sistema de túbulos T em miócitos ventriculares de mamíferos está virtualmente ausente no neonato e só completa seu desenvolvimento cerca de 3 semanas após o nascimento (Brette & Orchard, 2003). Sendo assim, era possível que esta diferença entre miócitos de ratos neonatos vs. infantes e adultos pudesse exercer influência sobre a estimativa de Vmax. Logo, foram inseridos
túbulos transversais à superfície de um esferóide prolato para simular o sistema T em um miócito (Figura 8) para comparação dos valores de Vmax estimados na presença e ausência dos túbulos. Os
túbulos foram considerados perpendiculares à superfície superior e inferior da forma geométrica e só foram inseridos em locais onde a espessura em z era superior à 5,65 µm. Os túbulos da superfície superior não eram conectados com os túbulos da superfície inferior. Neste caso, assumiu-se que a = 60 µm e c = 15 µm para o esferóide prolato. Para os túbulos T, assumiu-se que raio = 0,25 µm, profundidade = 5,65 µm, e distância entre túbulos de 1,7 e 1,5 µm nos eixos x e y, respectivamente (Soeller & Cannell, 1999; Jayasinghe et al., 2011; Han et al., 2013).
3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores de a e c foram comparados entre as idades com a análise de variância monofatorial. Análise de variância bifatorial foi utilizada para investigar a influência da idade e do ângulo de aplicação de E sobre o valor de EL, VL, e Vmax_Alt/Vmax. Esta análise também foi usada para
determinar os efeitos do ângulo e do modelo sobre a diferença percentual entre os valores estimados de VL quando utilizou-se o MN3D e os modelos analíticos. A influência do ângulo sobre as
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estimativas de VL feitas com o MAEsf para o caso das células de animais neonatos foi estudada
com a análise de variância monofatorial. Utilizou-se o pós-teste de Bonferroni para comparação de médias, caso houvesse significância estatística detectada na análise de variância. O limite de significância estatística de p foi considerado ser 0,05.
Figura 8: Esferóide prolato com túbulos T, representados como orifícios distribuídos regularmente sobre ambas faces da célula, com o detalhe da construção dos tútulobs T no modelo (para maiores detalhes, veja o texto).
18 4. RESULTADOS
4.1. DIMENSÕES CELULARES E CAMPO ELÉTRICO EXTERNO LIMIAR
A análise de variância monofatorial indicou influência estatística significativa (p< 0,001) da idade sobre os valores de a e c, que aumentaram com a idade (Figura 9).
Os valores de EL (Figura 10) foram reduzidos com a idade (p< 0,001), e, de um modo geral,
tenderam a ser maiores para maiores ângulos entre a direção de aplicação do campo e o eixo maior da célula (p< 0,001).
Figura 10: Campo elétrico externo limiar (EL) determinado experimentalmente em miócitos ventriculares de ratos de diferentes idades. EL foi aplicado em diferentes ângulos com relação ao eixo maior da célula. * p< 0,05 vs. a mesma faixa de ângulos no grupo adulto; # p< 0,05 vs. 0º-15º na mesma idade, teste de Bonferroni. Dados expressos como média ± erro padrão. N = 8 células para cada faixa angular (48 células em cada idade).
4.2. CALIBRAÇÃO DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS
A Figura 11 mostra a diferença na estimativa de Vmax feita com MN3D e os modelos
analíticos para geometrias regulares. Como o erro na estimativa desta variável foi menor que 1%
Figura 9: Comprimento dos semi-eixos maior (c, painel A) e menor (a, painel B) de miócitos ventriculares de ratos de diferentes idades. Dados expressos como média ± erro padrão. * p< 0,05 vs. o valor do grupo de 4-6 meses,teste de Bonferroni. N = 48 células para cada idade.
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em média, pode-se concluir que: (1) MN3D representa o mesmo fenômeno eletromagnético que o representado pelos modelos analíticos; e, (2) erros de modelamento, programação ou de transferência de informação entre os programas não exerceram influência significativa sobre a estimativa de Vmax nas condições estudadas. Como os menores erros foram observados quando o
comprimento da aresta do cubo que representa o meio extracelular no MN3D foi igual a 5c, e considerando que outros trabalhos (Miller & Henriquez, 1988; Pham et al., 2000; Pucihar et al., 2006; Ranjan & Thakor, 1995) utilizaram esta representação, optou-se usar o valor de 5c para o comprimento da aresta deste cubo.
Figura 11: Erro percentual da estimativa da máxima variação do potencial elétrico transmenbrana induzida por campo elétrico externo feita com o modelo numérico tridimensional (MN3D) com relação ao valor estimado com os modelos analíticos para as formas de esfera, esferóide prolato (ESPROL) e elipsóide (ELIP). LONG: Campo elétrico aplicado longitudinalmente à forma geométrica; TRANS: Campo elétrico aplicado transversalmente à forma geométrica.
Na Figura 12, é mostrada a comparação entre os valores de Vmax obtidos com MN3D e
MACil. Atribuindo-se ao cilindro dimensões próximas às de uma célula cardíaca (comprimento = 120 μm e diâmetro = 30 μm), o valor de Vmax calculado com MN3D foi cerca de 20% maior do
que o valor estimado com MACil, enquanto que, quando se considerou comprimento = 1200 μm e diâmetro = 30 μm, a diferença entre as estimativas dos modelos foi menor que 4%. Portanto, os valores de a e c de cardiomiócitos isolados de rato não atenderam a condição c >> a, a qual foi assumida na dedução do MACil (veja secção 4.2).
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Figura 12: Erro percentual no cálculo da máxima variação do potencial elétrico transmenbrana induzida por campo elétrico externo usando-se o modelo numérico tridimensional e o modelo analítico para a forma geométrica cilíndrica. N: cilindro comcomprimento = 120 μm e diâmetro = 30 μm; L: cilindro comcomprimento = 1200 μm e diâmetro = 30 μm. LONG: Campo elétrico aplicado longitudinalmente à forma geométrica; TRANS: Campo elétrico aplicado transversalmente à forma geométrica.
Notamos diferenças maiores que 150% ou 20%, dependendo da direção, quando a estimativa de Vmax com o MN2D foi comparada com as estimativas dos modelos analíticos para as formas
geométricas de esfera e esferóide prolato (Figura 13). A forma geométrica modelada com o MN2D para uma esfera era igual a um círculo. Quando a estimativa de Vmax do MN2D para esta forma
geométrica foi comparada com a estimativa de Vmax do MACil com ETrans (o que fez com que a
seção transversal paralela ao sentido do E fosse um círculo) e c → ∞, o erro foi menor que 3,5%. De modo similar, a forma geométrica modelada com o MN2D para um esferóide prolato era igual à seção transversal de um elipsóide. Quando a estimativa de Vmax do MN2D para esta forma foi
comparada com a estimativa de Vmax do MAElip (onde foi assumido comprimento no eixo z
tendendo ao infinito; b = 0,5×106 μm), as diferenças entre os modelos ficaram menores que 2,5%. Portanto, para que o MN2D seja válido, é necessário que a forma geométrica modelada não possua variações consideráveis no eixo z, que não é o caso de cardiomiócitos isolados de ratos (veja secção 5.2).
Como não foram pressupostas condições sobre os valores de a, b ou c nas deduções matemáticas de MAEsf, MAEsPr e MAElip, e a Vmax estimada com o MN3D apresentou valores
baixos de erro, os modelos utilizados para calcular VL neste estudo foram o MN3D, MAEsf,
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Figura 13: Erro no cálculo da máxima variação do potencial elétrico transmenbrana induzida por campo elétrico externo estimada com o modelo numérico bidimensional e os modelos analíticos para as formas de esfera, esferóide prolato (ESFPROL), cilindro e elipsóide (ELIP). LONG: Campo elétrico aplicado longitudinalmente à forma geométrica; TRANS: Campo elétrico aplicado transversalmente à forma geométrica.
4.3. ANÁLISE DE SENSIBILIDADE DOS MODELOS ELETROMAGNÉTICOS
A Figura 14 mostra o resultado da análise de sensibilidade feita para descobrir a influência de pequenas variações geométricas no sólido modelado com o MN3D (i.e., chanfradura ou suavização da superfície) e/ou da introdução de uma camada isolante (simulando o fundo da câmara ou a camada de colágeno que o revestia) sobre Vmax estimado. O resultado da análise de variância
bifatorial indicou influência estatística significativa (p< 0,001) do ângulo, da modificação feita no modelo e interação entre estes fatores para os valores estimados em células de animais infantes e adultos. Em células de neonato, no entanto, a influência do ângulo não foi significativa (p> 0,37).
A introdução da superfície isolante levou a um aumento da relação entre Vmax_Alt e o valor de
Vmax estimado com o MN3D (Vmax_MN3D), e ainda apresentou relação positiva com o ângulo. A
suavização e a chanfradura da superfície, por sua vez, levaram à diminuição de Vmax_Alt/Vmax_MN3D, e apresentaram relação negativa com o ângulo. Quando a suavização ou a
chanfradura da superfície foram combinadas com a introdução da superfície isolante, estas alterações levaram ao aumento de Vmax_Alt/Vmax_MN3D, com relação positiva com o ângulo.
Em todos os casos, os valores da Vmax_Alt/Vmax_MN3D foram mais próximos de 1,00 para faixa
de 0º-15º (o maior valor foi 1,085 para a introdução da superfície isolante no caso das células de animais neonatos) e os mais distantes foram para a faixa de 75º-90º (o maior valor foi 1,262 para a
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introdução da superfície isolante no caso das células de animais infantes). Considerando os casos com chanfradura ou suavização, ambos com a introdução da superfície isolante, o maior valor de Vmax_Alt/Vmax_MN3D foi 1,066 para a faixa de 0º-75º, e 1,14 para a faixa de 75º-90º.
A Figura 15 mostra o resultado da análise de sensibilidade para investigar o quanto variações do comprimento celular no eixo z (b, que foi variado entre 50% a 150% do valor assumido para cada idade) podem afetar a estimativa de Vmax feita com MAElip. A análise de variância bifatorial
mostrou que houve influência significativa do valor de b (p< 0,001), mas não do ângulo (p> 0,80) e interação destes dois fatores (p< 0,001), exceto para o grupo neonato (p = 1,00), na relação entre Vmax_Alt e o valor de Vmax estimado com o MAElip (Vmax_MAElip).
Máxima variação do potencial elétrico transmembrana induzida por campo elétrico externo estimada com o modelo analítico a forma geométrica elipsóido
Como pode ser notado na Figura 15, variações no valor de b entre 80-120% do valor utilizado fizeram Vmax_Alt/Vmax_MAElip ficar entre 0,95 a 1,05. Entretanto, para os demais valores,
Vmax_Alt/Vmax_MAElip foi >0,88 e <1,10 e, portanto, pode-se esperar um erro médio de no máximo
12%.
O resultado da análise de sensibilidade para avaliar o quanto a simulação de um sistema de túbulos T afeta a estimativa dos valores Vmax foi que, no conjunto de ângulos estudados, a presença
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Figura 14: Relação entre a máxima variação do potencial elétrico transmembrana estimado para a forma geométrica com alterações (Vmax_Alt) e o valor da máxima variação do potencial elétrico transmembrana estimado com o modelo numérico tridimensional (Vmax_MN3D) para as células de animais neonatos (A), infantes (B) e adultos (C). As linhas tracejadas (de cima para baixo) representam as posições no eixo y onde o valor de Vmax_Alt/Vmax_MN3D é 1,05, 1,0 ou 0,95. Isolante: forma geométrica utilizada no modelo numérico tridimensional (MN3D, Figura 5A-C) com uma camada isolante; Suave: forma geométrica utilizada no MN3D com as superfícies suavizadas (Figura 7A-C); Chanfro: forma geométrica utilizada no MN3D com as superfícies chanfradas (Figura 7D-F); Suave + Isolante: forma geométrica utilizada no modelo Suave com uma camada isolante; Chanfro + Isolante: forma geométrica utilizada no modelo Chanfro com uma camada isolante. Veja secção 3.6 para mais detalhes. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada idade e cada faixa angular. As mesmas células foram modeladas em todas as variações apresentadas.
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Figura 15: Relação entre a máxima variação do potencial elétrico transmembrana estimado para a forma geométrica com alterações (Vmax_Alt) e o valor da máxima variação do potencial elétrico transmembrana estimado com o modelo analítico para a forma geométrica elipsóide (Vmax_MAElip) para as células de animais neonatos (A), infantes (B) e adultos (C). As linhas tracejadas (de cima para baixo) representam as posições no eixo y onde Vmax_Alt /Vmax_ MAElip é 1,05, 1,0 ou 0,95. As porcentagens representam o valor do comprimento do semi-eixo z (b) utilizado no modelo com a forma geométrica alterada em relação ao valor de b utilizado com o modelo analítico para a forma geométrica elipsóide. Veja a secção 3.6 para mais detalhes. Dados expressos em média ± erro padrão. N = 8 células para cada idade e cada faixa angular. As mesmas células foram modeladas em todas as variações apresentadas.
