Uma fucana da alga Spatoglossum schröederi ao se ligar a fibronectina, inibe a migração de células endoteliais e impede que essas formem estruturas semelhante a vasos in vitro

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Uma fucana da alga Spatoglossum schröederi ao se ligar a fibronectina, inibe a migração de células endoteliais e impede que essas formem

estruturas semelhante a vasos in vitro

MAÍRA MARIA DE MENEZES

NATAL/RN 2018

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha

NATAL/RN 2018

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas – SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Menezes, Maíra Maria de.

Uma fucana da alga Spatoglossum schröederi ao se ligar a fibronectina, inibe a migração de células endoteliais e impede que essas formem estruturas semelhante a vasos in vitro / Maíra Maria de Menezes. - 2018.

68f.: il.

Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2018.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

1. Fucanas - Dissertação. 2. Spatoglossum schröederi - Dissertação. 3. Células endoteliais - Dissertação. 4. Antiangiogênico - Dissertação. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Título.

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:

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Aprovada em: 23 / 03 / 2018

Banca Examinadora:

Presidente da Banca:

Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha (UFRN)

Membros da Banca

Profa. Dra. Déborah Yara Alves Cursino dos Santos – Membro Externo - USP Profa. Dra. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza – Membro Titular - UFRN

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Dedico esta obra

A Deus, Glórias a ti Senhor! Obrigada por me carregar até aqui. Tu és o meu amparo e o meu refúgio.

Aos meus pais, Um amor incondicional, que não mede esforço algum! Aqueles que de uma forma ou de outra estiveram nessa caminha comigo. Tudo isso para vocês! Obrigada, obrigada, obrigada.

Aos meus irmãos, Um laço de vida que jamais desata. Juntos somos mais!

Ao meu esposo, Por todo amor, paciência, compreensão e dedicação. Essa conquista também é sua.

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vi

Dedico esta obra

A Hugo Rocha, Agradecer-te pela confiança, pelo apoio, pelos ensinamentos. Um verdadeiro professor que se entrega à profissão de maneira exemplar.

Muito obrigada!

A Família BIOPOL, Uma verdadeira família. Ajudar uns aos outros, auxiliar a quem precisar.

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Agradecimentos especiais

À minha família, por TUDO. Ao meu pai Francisco Menezes, aquele me ensinou o valor atribuído ao trabalho duro. A minha mainha Suelly Menezes (sempre presente), mesmo com a sua partida para a morada eterna, deixou-me

ensinamentos de vida que sempre levo comigo; amor que ultrapassa tudo. Minha irmã Maíza, aquela que está sempre ao meu lado escutando minhas angústias e dando-me conselhos. Ao meu irmão Mazurkyevicz, que mesmo

com todo seu silêncio demonstra seu amor por mim.

Aquele que começou como namorado de 10 anos no início do mestrado, foi noivo durante o curso e agora termina como meu marido. Paulo Henrique, você

esteve ao meu lado nos momentos que mais precisei. Obrigada meu amor, sem você eu não teria conseguido.

À família Oliveira da Silva, que Deus colocou em minha vida. Obrigada pela grande ajuda, carinho e cuidado.

Aos meus sobrinhos, Maria Clara, Vanessa, André e Fernanda pelos momentos de alegria e de amor puro.

Aos meus tios, tias, primos. Em especial as primas, vocês são essenciais na minha vida, que propagaram juntas todo o amor cultivado entre nós. Mais um agradecimento ao orientador Hugo Rocha. Obrigada pela confiança e

de proporcionar a minha caminhada pela ciência e pesquisa.

A todos os professores do CCS (UFRN), aos coordenadores do programa de pós-graduação (PPGCSa) e as pessoas que fazem parte da secretaria do

programa.

À UFRN, à Pós-graduação em Ciências da Saúde e ao Departamento de Bioquímica pela oportunidade de concluir esse curso de Pós-graduação, assim

como as agências Financiadoras CAPES e CNPq.

Aos membros da banca de qualificação: Profª Mariana Santos e Profª Silvana

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Agradeço a todos do BIOLPOL, tornam-se nossa família. Ajudar, auxiliar, ensinar, são verbos que não faltam na convivência dos seus membros. As conversas, os debates, os lanches, os momentos de polêmicas e do cafezinho,

todos foram essenciais.

Jailma, Mônica, Raynara e Larisse, aquelas que inicialmente me acolheram com todo carinho e paciência, segurando minha mão e ensinando-me sobre o

início de todo o trabalho que estava por vir.

À amiga Talita, obrigada por todo o companheirismo durante todo esse tempo. Uma amizade que surgiu nas primeiras palavras, sabia que com você poderia

contar no que precisasse, tanto na vida acadêmica como na vida pessoal. Ao amigo Jefferson, Jeeeeeffs. Obrigada pela companhia, pelos papos, pelas

benditas caronas e pelos engarrafamentos para nossa querida zona norte. À inicialmente colega de laboratório e depois professora do departemento de Bioquímica Monique. Obrigada pela grande ajuda durante o estágio a docência

e pelas caronas para nossa querida zona norte.

Agradeço a todos que estiveram comigo durante essa trajetória do mestrado: Moacir, Popó, Dayanne, Marília, Rony, Carla, Lucas, Cynthia, Adriana, Vinícius,

Gabriel, Joanna, Karoline, Raniere, Leornardo Nobre, Pablo, Mariana, Max, Almino, Jéssika, Eder, Cauê, Leandro e Leonardo.

Epero não ter esquecido ninguém! Minha gratidão a todos vocês. As minhas amigas da graduação na UFRN e as do Neves. Compartilharam comigo vários momentos, sempre com a sincera amizade presente no meio de

nós.

Espero não ter esquecido ninguém! Todos vocês são essenciais nessa trajetória.

Por fim, obrigada a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse trabalho.

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“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido e não na vitória propriamente dita”.

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RESUMO

Uma heterofucana de baixo massa molecular (designada fucana B) foi obtida a partir da alga marrom, Spatoglossum schröederi, e sua atividade como inibidor da formação de tubos capilares por células endoteliais (ECs) foi analisada. As análises química, eletroforéticas e de infravermelho confirmaram a identidade da fucana B. Em contraste com outras fucanas de baixo peso, a fucana B (0,012-0,1 mg/mL) inibiu a formação de tubos capilares pelas ECs de forma dose dependente. Além disso, a fucana B (0,01-0,05 mg/mL) não afetou a proliferação das ECs. A fucana B também inibiu a migração das ECs em uma superfície revestida com fibronectina (FN), mas não em superfícies revestidas com laminina ou colágeno. Uma fucana B biotinilada foi utilizada como uma sonda para identificar seu sítio de ligação nas ECs. Experimentos de microscopia confocal revelaram que a fucana biotinilada não se liga à superfície celular, mas apenas à fibronectina. Esses achados sugerem que a fucana B inibe a formação de tubos capilares das ECs, bem como, sua capacidade de migrar sobre FN, ligando-se diretamente essa molécula assim bloqueando os seus sítios de reconhecimento de seus ligantes.

Palavras cheves: Fucanas; Spatoglossum schröederi; Células endoteliais;

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

0 C CHO COL I ERK Graus Celsius

Células de ovário de hamster chinês Colágeno I

Quinase regulada por estímulo extracelular

F 0.5 Fração precipitada com 0.5 volume de acetona

F 1.1 Fração precipitada com 1.1 volumes de acetona

F 1.3 Fração precipitada com 1.3 volumes de acetona

F 2.0 FAK FN

Fração precipitada com 2.0 volumes de acetona Quinase de adesão focal

Fibronectina g Grama h horas HCl Àcido clorídrico kDa LN M Kilodalton Laminina Molar MAP MEK

Proteínas quinases ativadas por mitógenos Quinase regulada por estímulo extracelular

mg Miligrama

min. Minutos

mL Mililitros

NaCl Cloreto de sódio

nm Nanômetros PA PDA pH RAS V VN Para análise 1,3 Diaminopropano acetato Potencial hidrogeniônico Vírus do sarcoma de rato Voltagem

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura proposta por Rocha e colaboradores (2005) para a fucana B da alga S. schröederi...18

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LISTA DE TABELAS

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SUMÁRIO

RESUMO... .. x LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... xi LISTA DE FIGURAS... LISTA DE TABELAS... xii xiii 1. INTRODUÇÃO... 2. JUSTIFICATIVA... 15 20 3. OBJETIVOS... 3.1. OBJETIVO GERAL... 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 4. MÉTODOS... 4.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS... 4.1.1. Alga...

4.2. OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS...

4.2.1. Delipidação... 4.2.2. Proteólise... 4.2.3. Fracionamento com volumes crescentes de acetona.. 4.2.4. Cromatografia em coluna de troca iônica... 4.2.5. Eletroforose em gel de Agarose...

4.3. ANÁLISES QUÍMICAS...

4.3.1. Quantificação de açúcar e proteínas... 4.3.2. Quantificação de sulfato...

4.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS...

5. ARTIGO PRODUZIDO...

5.1. ARTIGO 1...

6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES... 7. REFERÊNCIAS... 8. ANEXOS...

8.1. NORMAS DA REVISTA PARA SUBMISSÃO...

21 21 21 22 22 22 22 22 23 23 23 24 25 25 25 25 26 26 53 54 58 60

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 15

1. INTRODUÇÃO

O termo fucana pode ser atribuído a polissacarídeos que tem 90% ou mais de sua composição monossacarídica formada pela L- fucose, e que pelo menos uma parte desses monossacarídeos são substituídos por grupos sulfato [1]. Aqueles polissacarídeos que possuem fucose na sua constituição, porém em um percentual menor que 90%, podem ser denominados de fucoidan [1]. Apesar de essa ser uma recomendação da “International Union of Pure and Applied Chemistry” (IUPAC), são vários os exemplos na literatura em que esta regra não é seguida e denominações como fucanas sulfatadas [2], heterofucanas e homofucanas [3] bem como, denominações relacionadas como a composição monossacarídica como glucuronogalactofucanas, glucuronofucogalactanas [4] manogalactofucanas [5] e galctofucanas [6] são facilmente encontradas. Diante disso, nessa dissertação, o termo fucana será utilizado tanto para homo como heteropolissacarídoes que possuam na sua composição L- fucose sulfatada.

Apesar dessa definição simples as fucanas não tem uma ampla distribuição e só foram descritas, até o momento, como pertencentes a matriz extracelular de algas marrons [7]; a camada gelatinosa que cobre a ova de ouriços do mar [8]; e a matriz extracelular do tecido muscular de pepinos do mar [9].

A primeira descrição de uma fucana como polissacarídeo foi feita no ínicio do século XX [10,11]. No caso, foram as fucanas extraída das algas

Laminaria digitata (J.V. Lamouroux, 1813), Ascophyllum nodosum (Le Jolis,

1863) e Fucus vesiculosus (C. Linnaeus, 1753). Com relação a esta última alga, a sua fucana inicialmente passou ser conhecida como fucoidin [12] em homenagem ao gênero da alga de onde foi obtida. Com o passar do tempo esse termo foi modificado para fucoidan, denominação que gera alguma confusão, já que a fucana de F. vesiculosus é exemplo de um polissacarídeo que possuem mais 90% de fucose em sua composição [13]. Independente desta problemática, o fucoidan de F. vesiculosus é a fucana mais bem

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 16 estudada dentre todas as já descritas. Sua estrutura foi proposta inicialmente por Percival e Ross [14] e revisada por Patankar e col. [13]. Segundo estes autores o fucoidan possui uma região central constituída de um polímero de fucose com ligações α(1-3), estando os grupos sulfatos na posição C-4 de resíduos de fucoses. Já os pontos de ramificação, que ocorrem ligados no carbono 2 das fucoses, ocorrem a cada dois ou três resíduos de fucose, mas as fucoses nos terminais não redutores não seriam sulfatadas.

A estrutura de várias fucanas já foi proposta e há vários artigos de revisão que fazem uma exemplificação representativa das estruturas propostas [2,15,16,17,18,19,20,21]. Uma avaliação dos dados existentes na literatura leva a observação que as algas das ordens Fucales, Laminariales, Chordariales tendem a sintetizar homofucanas, por outro lado, algas das ordens Ectocarpales, Dictyosiphonales, Seytosiphonales, Desmerestiales e Dictyotales tendem a sintetizar heterofucanas.

Especificamente com relação a ordem Dictyotales, o grupo em que se insere esta dissertação vem trabalhando com fucanas de várias algas dessa classe como Lobophora variegata (E.C. Oliveira, 1977) [22], Padina

gymnospora (Sonder, 1871) [23], Dictyota mertensis (Kutzing, 1859) [24], Dictyopeteris justii (J.V. Lamouroux, 1809) [25], Dictyota menstrualis (Horning

e Weber-Pewket, 1987) [26]. Entretanto é a Dictyotales Spatoglossum

schroederi (Kutzing, 1859) a alga mais estuda por esse grupo.

Esta alga sintetiza três diferentes tipos de fucanas que foram denominadas de fucana A, uma xilofucoglucuronana [27], fucana B [28] e fucana C [29], duas xilogalactofucanas que se diferenciam pelo teor de sulfato, no caso a fucana C é mais sulfatada do que a fucana B.

As estruturas das fucana A e B foram propostas. A fucana A é uma molécula de 21 kDa, formada por um esqueleto de ácido glucurônico unidos por ligações β(1-3), com ramificações em C-4 constituidas por trissacarídeos de fucose unidos por ligações α(1-3). A maioria dos resíduos de fucose geralmente é substituída em C-4 com grupamentos sulfato, e algumas, ainda, são substituídas em C-2 por dissacarídeos de xilose unidos por ligações

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β(1-Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 17 4). 50% das xiloses são sulfatadas [27]. Já a fucana B (21,5 kDa) é formada por uma estruta central composta de galactoses β(1-4) ligadas, um quarto dessas galactoses são substituídas em C-2 por um tetrassacarídeo compostos por fucoses α(1-4) ligadas e xiloses, estas últimas estariam na posição mais externa do tetrassacarídeo [30], os grupos sulfato são encontrados em 50% das galactoses (em C3) e nas fucoses (em C2) como mostrado na figura 1.

Figura 1. Estrutura proposta por Rocha e colaboradores (2005) [17] para a fucana

B da alga S. schröederi.

A fucana B já teve algumas de suas atividades avaliadas. Foi demosntrado que a fucana B era capaz de inibir a adesão de células de ovário de hamster chinês (CHO) sobre vitronectina (VN) e, principalmente sobre fibronectina (FN), porém ela não foi efetiva quando colágeno I (Col I) ou laminina (LN) foram substratos de adesão [31]. Posteriormente, se mostrou que a fucana B também inibia a proliferação das células CHO quando VN ou FN eram substratos, mas quando Col I ou LN eram substratos esse efeito não ocorria [32]. Por isso, foi proposto que a fucana B exibia as atividades antiadesiva e antiproliferativa frente as células CHO porque ela possuía sítios de ligação a VN e, principalmente, a FN, e que ao se ligar a estas moléculas ela exercia sua função. Sugeriu-se que a fucana B se ligava a molécula de matriz e ativava integrinas, principalmente a integrina α5β1, que por sua vez ativava uma via das MAP quinases (FAK/RAS/MEK/ERK), que, por conseguinte, afetava a

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 18 progreção do ciclo celular das células CHO, e consequentemente sua proliferação. Este efeito se mostrou dependente do teor de sulfato da fucana [28].

Em estudos paralelos, foi demonstrado que a fucana B não apresenta atividade coagulante. Contudo, quando administrada in vivo foi capaz de impedir a formação de trombos na veia cava dos animais (ratos). Este contracenso foi melhor entendido por meio de estudos com células endotelias, foi obervado que a fucana B se ligava a fibronectina da matriz extratcelular dessas células e as induzia a sintetizar um proteoglicano de heparan sulfato antitrombótico [32].

Atividade farmacológicas/biológicas não é um previlégio da fucana B. Quase todas as fucanas estudadas até o momento foram indicadas como compostos detentores de propriedades como pode ser visto na tabela 1.

Tabela 1. Exemplos de atividades atribuídas as fucanas de algas marrons.

ATIVIDADE ALGA REFERÊNCIA

Antiadesiva Spatoglossum schröederi Rocha et al., 2001.

Antiadipogênica Sargassum crassifolium Huang et al., 2018

Antiangiogênica Ascophyllum nodosum

Sargassum vulgare Matou et al., 2002. Dore et al., 2013. Anticoagulante Canistrocarpus cervicornis Dictyopteris justii Dictyopteris delicatula Camara et al., 2011. Melo et al., 2012. Magalhães et al., 2011. Anti-inflamatória Sargassum henslowianum Ecklonia cava Laminaria japonica Han et al., 2017. Kang et al., 2011. Li et al., 2011.

Antimetastática Fucus evanescens Alekseyenko et al., 2007.

Antinociceptiva Doctyota menstrualis Albuquerque et al., 2013.

Antioxidante Dictyota cervicornis D. delicatula F.vesiculosus Costa et al., 2010. Magalhães et al. 2010. Ruperez et al., 2002.

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Anticancer Padina boryana

Undaria pinnatifida

Usoltseva et al., 2018. Synytsya et al., 2010.

Antiúlcera Cladosiphon okamuranus Shibata et al., 2003.

Antiviral Sargassum mcclurei Thuy et al., 2015.

Imunomodulatória Saragassum augustifolium Borazjani et al., 2017

Uma das atividades atribuídas as fucanas que está diretamente relacionada com esta dissertação é a atividade antiangiogênica. De forma sucinta, essa denominação é dada a compostos que direta ou indiretamente são capazes de inibir a formação de vasos sanguíneos que surgem a partir de vasos pré-existentes [33]. Pelo menos 11 fucanas já foram descritas como agentes antiangiogênicos e os dados têm levado a sugestão de que esta atividade é dependente da massa molecular das fucanas. As fucanas de baixa massa molecular (<15 kDa) tem atividade proangiogênica, enquanto as de alta massa (>30 kDa) tem atividade antiangiogênica [34]. Com relação a composição monossacarídica, demonstrou-se que uma fucana da alga Laminaria saccharina (J.V.Lamourox), que apresentava ramificações constituída de fucose, possuía atividade antiangiogênica, enquanto, uma fucana, obtida da alga

C. okamuranus (Tokida), com características estruturais semelhantes,

mas que possuía ramificações compostas de ácidos glucurônicos, não possuía atividade [35]. A presença de ácido glucurôncio parace afetar atividade antiangiogênica das fucanas, pois outra fucana de L. saccharina, que tinha esse monossacarídeo em sua constituição, também não apresentou atividade antiangiogênica [36]. Contudo, mais estudos envolvendo a avaliação da estrutura-atividade das fucanas como agentes antiangiogênicos tornam-se necessários para a compreensão dos mecanismos relacionados a essa atividade.

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2. JUSTIFICATIVA

O grupo de pesquisa do Laboratório Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), do Departamento de Bioquímica, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), vem estudando desde a década de 1990, polissacarídeos sulfatados com potenciais farmacológicos, principalmente de macroalgas marinhas da costa potiguar. Durante este período foi demonstrado que a alga marrom Spatoglossum schöederi sintetiza três difentes fucanas, dentre elas a fucana B. Esta molécula se mostrou ativa em diferentes testes in vitro e in vivo. Quando da proposição do seu mecanismo de ação, verificou-se que o seu alvo molecular era a fibronectina. Uma molécula de matriz extraceluar, importante em diversos eventos, inclusive na angiogênesis. Fucanas com atividade antiangiogênica já foram descritas, mas nenhumas delas apresenta seu mecanismo de ação pautado na capacidade de interagir com a fibronectina. Dentro deste contexto, a fucana B surgiu como uma possível molécula para ser estudada como agente antiangiogênico com um mecanismo diferente daquele observado para as outras fucanas. E se caso fosse comprovado sua ação antiangiogênica via FN, a fucana B poderá ser um novo composto para estudos relacionados com angiogênesis e antiangiogênesis, como por exemplo o câncer.

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3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

Avaliar o efeito in vitro da fucana B da alga Spatoglossum schröederi como agente inibidor da formação de estrutas semelhantes a vasos.

3.2. ESPECÍFICOS

• Extrair e purificar a fucana B da alga marinha S. schröederi; • Confirmar a identidade da fucana B obtida;

• Avaliar a o efeito da fucana B na viabilidade, na proliferação e na migração de células endoteliais;

• Avaliar o efeito da fucana B na capacidade de células endoteliais em formarem estruturas semelhantes a vasos;

• Produzir uma sonda a partir da fucana B e identificar nas células endoteliais, o alvo molecular dessa fucana.

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4. MÉTODOS

Serão descritos a seguir apenas os métodos em que se achou necessário um maior detalhamento para sua compreensão, já que os demais métodos se encontram claramente descritos no capítulo 5, que se refere ao artigo publicado.

4.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS

4.1.1 Alga

A alga marinha marrom Spatoglossum Scroederi foi coletada na Praia de Búzios (6°00'22.8"S 35°06'26.9"W), município de Nísia Floresta (litoral sul do Rio Grande do Norte), durante os períodos de marés baixas entre 0,0 a 0,2 metros a uma temperatura situada entre 28-30 °C.

Após ser coletada, a alga foi trazida ao laboratório, onde foi lavada e retirada as epífitas e inclusões calcárias incrustadas na mesma. Em seguida a alga foi seca em estufa a 45 ºC, triturada e guardada em recipiente apropriado.

4.2. OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

4.2.1 Delipidação

As algas trituradas passaram por um processo de despigmentação e delipidação como descrito por Rocha e colaboradores [30]. Para tal, dois volumes de etanol PA foram adicionados a diferentes Beckers contendo as algas trituradas. Estes materiais ficaram em contato com o álcool durante 24 h, à temperatura ambiente. A cada saturação do etanol, identificada visualmente através da mudança de coloração do líquido, realizou-se a renovação do solvente. Após a sexta troca os resíduos foram separados do etanol por filtração e secos a temperatura ambiente em exposição a luz solar. Obtendo-se assim pós de algas delipidados.

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4.2.2. Proteólise

O pó delipidado foi imerso em solução salina contendo NaCl 0,25 M, com pH ajustado para 8,0 e submetido à digestão proteolítica por meio de uma mistura de enzimas denominada prozima, durante 18 h a uma temperatura de 60 ºC. Neste processo, ocorreu a quebra das proteínas contidas nos fragmentos de algas, a liberação e a solubilização dos polissacarídeos na solução salina. A solução de polissacarídeos foi submetida a uma centrifugação a 10.000 x g, durante 15 minutos, a 4 ºC. Após esta etapa, o sobrenadante passou por um processo de filtração. Ao final, o volume deste sobrenadante foi mensurado e reservado para ser utilizado no fracionamento com volumes crescentes de acetona.

4.2.3. Fracionamento com volumes crescentes de acetona

O volume do sobrenadante (solução rica em polissacarídeos) obtido foi fracionado com volumes crescentes de acetona, obtendo-se as frações polissacarídicas. Os valores de acetona adicionados foram determinados pela turvação da solução, que caracteriza a precipitação de polissacarídeos devido à adição desse solvente polar. Adicionou-se um volume de acetona, sob agitação leve, necessário para que se visualizasse uma turvação da solução, essa solução foi mantida em repouso a 4 ºC durante 18 h, o precipitado foi coletado por centrifugação a 8.000 x g por 15 minutos a 4 ºC e seco a pressão reduzida.

Em seguida, esse procedimento foi repetido até que não se visualizasse mais a formação de precipitado. As frações obtidas (frações cetônicas) foram denominadas conforme o volume de acetona no qual foram precipitadas (F0.5, F0.6, F0.7, F0.9, F1.1, F1.3 e F2.0).

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 24 A fração cetônica F0,9 foi submetida à complexação com a resina de troca iônica Lewatite (10 mg de material para cada 1,0 mL de resina) e a eluição foi realizada passo a passo utilizando-se molaridades crescentes de NaCl, como descrito por Rocha e colaboradores [30]. Foram coletadas frações, com volume total de três vezes o volume da resina, para cada molaridade de sal (0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 1,5, 2,0, e 3,0 M), as quais foram separadas pela ausência de positividade para o método de fenol-ácido sulfúrico [37]. O fluxo de coleta foi de 1 mL/min, sendo o volume de eluição igual para todas as molaridades coletadas. A fração eluída com 2.0 M de NaCl foi precipitada com 2 volumes de metanol PA a 4 °C e deixada em repouso por 18 h, sendo posteriormente centrifugadas a 10.000 x g, por 15 minutos e secas a pressão reduzida.

4.2.5. Eletroforese em gel de Agarose

A agarose foi preparada na concentração 0,6% em tampão 1,3 diaminopropano acetato (PDA) e colocado sobre lâminas de vidro medindo 7,5 x 7,5 x 0,1. Cinco microlitros de cada fração na concentração de 10 mg/mL foram aplicados em canaletas no gel e submetidos a corrente contínua de 100V durante uma hora, em cuba resfriada a 4 °C. A origem corresponde ao polo negativamente eletrizado do tampão.

Após a corrida eletroforética, os compostos foram precipitados com cetavlon 0,1% por no mínimo 2 horas, a temperatura ambiente. Para revelação das bandas de migração, o gel foi submetido a uma corrente de ar quente contínua para ser desidratado homogeneamente e posteriormente corado com azul de toluidina 0,1%, numa solução de ácido acético 1% e etanol 50%. O excesso de corante é removido por uma solução de ácido acético 1% em etanol 50% (solução descorante). A revelação das bandas polissacarídicas é realizada devido à capacidade do azul de toluidina interagir com o sulfato presente nos polissacarídeos e os compostos ricos em sulfato desenvolverem uma coloração azul-violácea característica[38].

(26)

Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 25 4.3 ANÁLISES QUÍMICAS

4.3.1. Quantificação de açúcar e proteínas

A quantidade de açucares totais das frações polissacarídicas extraídas foram determinadas pelo método do fenol/ácido sulfúrico [37], empregando-se como padrão fucoempregando-se, empregando-sendo as leituras realizadas a 490 nm. O grau de contaminação proteica foi determinado com o reagente Comassie blue R 250 e a leitura realizada a 595 nm [39].

4.3.2. Quantificação de sulfato

O teor de sulfato total das frações polissacarídicas foi quantificado, após hidrólise ácida (HCl 4 M, 6 horas, 100º C), por turbidimetria pelo método de gelatina-bário [40]. O sulfato de sódio foi empregado como padrão.

4.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Dados em triplicata foram analisados por analise de variância (ANOVA). O teste Student Newman-Keuls (p<0,05) foi utilizado para determinar diferenças significativas entre as amostras testadas usando o programa GraphPadPrism versão 5.0, 2014 (La Jolla, CA, USA).

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5. ARTIGO PRODUZIDO 5.1. Artigo 1 (ACEITO)

A low-molecular-weight galactofucan from the seaweed, Spatoglossum schröederi, binds fibronectin and inhibits capillary-like tube formation in vitro.

Periódico: International Journal of Biological Macromolecules Fator de impacto: 3.671

ISSN: (Printed version) Print ISSN: 0141-8130 ISSN: (Online version) Electronic ISSN: 1879-0003 Qualis: Medicina II – A2

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Accepted Manuscript

Title: A low-molecular-weight galactofucan from the seaweed, Spatoglossum schröederi, binds fibronectin and inhibits

capillary-like tube formation in vitro

Author: Maira Maria Menezes, Leonardo Thiago Duarte Barreto Nobre, Gustavo Rodrigues Rossi, Jailma Almeida-Lima, Raniere Fagundes Melo-Silveira, Celia Regina Cavichiolo Franco, Edvaldo Silva Trindade, Helena Bonciani Nader and Hugo Alexandre Oliveira Rocha

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A low-molecular-weight galactofucan from the seaweed, Spatoglossum

schröederi, binds fibronectin and inhibits capillary-like tube formation in vitro

Maira Maria Menezes1, Leonardo Thiago Duarte Barreto Nobre1,2, Gustavo Rodrigues Rossi3, Jailma Almeida-Lima1, Raniere Fagundes Melo-Silveira1, Celia Regina Cavichiolo Franco3, Edvaldo Silva Trindade3, Helena Bonciani Nader2 and Hugo Alexandre Oliveira Rocha1,*

1 _{Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), Departamento de} Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte- RN, Brazil;

2_{Disciplina de Biologia Molecular, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo-SP,} Brazi;

3_{Departamento de Biologia Celular, Universidade Federal do Paraná, Curitiba-PR,} Brazil;

*Corresponding author:

Hugo Alexandre Oliveira Rocha,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Biociências

Departamento de Bioquímica

Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais-BIOPOL Av. Salgado Filho S/N

Phone-fax: +55(84)32119208 E-mail: hugo@cb.ufrn.br

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ABSTRACT

A low-molecular-weight (LMW) heterofucan (designated fucan B) was obtained from the brown seaweed, Spatoglossum schröederi, and its activity as an inhibitor of capillary-like tube formation by endothelial cells (ECs) was analyzed. Chemical, infrared and electrophoretic analyses confirmed the identity of fucan B. In contrast to other LMW fucans, fucan B (0.012–0.1 mg/mL) inhibited ECs capillary-like tube formation in a concentration-dependent manner. In addition, fucan B (0.01–0.05 mg/mL) did not affect ECs proliferation. Fucan B also inhibited ECs migration on a fibronectin-coated surface, but not on laminin- or collagen-coated surfaces. Biotinylated fucan B was used as a probe to identify its localization. Confocal microscopy

experiments revealed that biotinylated fucan did not bind to the cell surface, but rather only to fibronectin. Our findings suggest that fucan B inhibits ECs capillary-like tube formation and migration by binding directly to fibronectin and blocking fibronectin sites recognized by cell surface ligands. However, further studies are needed to evaluate the

in vivo effects of fucan B.

Keywords: Fucoidan; brown seaweed, endothelial cells; anti-angiogenic.

1. Introduction

Angiogenesis is a complex physiological process that is crucial during embryo development, wound healing, and collateral vessel formation for improved organ perfusion. This process includes protease production, endothelial cells (ECs) migration and proliferation, vascular tube formation, anastomosis of newly formed tubes, and synthesis of a new basement membrane. Angiogenesis is controlled by many types of endogenous biomolecules that can be either pro- or anti-angiogenic [1]. An imbalance of these molecules can cause abnormalities that are usually associated with various disorders, including cancer [2, 3]. Several review articles describe the role of

angiogenesis in cancer development and the use of anti-angiogenic molecules in treating cancer [4].

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 29 Anti-angiogenic or angiogenesis inhibitors can be divided into: (i) direct

inhibitors that target ECs in the growing vasculature, and (ii) indirect inhibitors that target either tumor cells or other tumor-associated stromal cells. Some molecules, such as sulfated polysaccharides, can be included in both groups [5].

Fucans are sulfated L-fucose-rich homo- and heteropolysaccharides that can be extracted from brown seaweeds [6], sea urchin, and sea cucumbers [7]. Frequently, fucans from seaweed are referred to as fucoidans. These sulfated polysaccharides can function as anti-angiogenic or pro-angiogenic agents. Recently, this topic was

thoroughly reviewed by Ustyuzhanina and colleagues [8]. Although the structural features that determine whether fucans function as potent pro- or anti-angiogenic agents remain unknown, the authors indicated that fucan molecular weight is a determining factor. High-molecular-weight (HMW) fucans are anti-angiogenic agents, while low-molecular-weight (LMW) fucans act as pro-angiogenic agents.

Fucans obtained from at least 11 seaweeds have been shown to exhibit anti-angiogenic activities [8]. However, only one anti-anti-angiogenic galactofucan was isolated, specifically from the seaweed, Undaria pinnatifida. This 95.21 kDa galactofucan inhibited human umbilical vascular endothelial cell (HUVEC) proliferation and

migration and decreased tubulogenisis in vitro. However, there are no data regarding its chemical structure [9].

We extracted a galactofucan, designated fucan B, from the seaweed

Spatoglossum schröederi. This 21.5 kDa fucan is composed of galactose, fucose,

xylose, and sulfate (1: 2: 0.5: 2, respectively) and trace amounts of glucuronic acid. We suggest that fucan B contains a central core predominantly formed by 4-linked beta-galactose units that are partially sulfated at C3. Approximately 25% of beta-galactose units contain oligosaccharide side chains (mostly tetrasaccharides) composed of 3-sulfated,

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4-Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 30 linked α-fucose and one or two nonsulfated 4-linked β-xylose units at the reducing and nonreducing ends, respectively [10].

Using wild-type Chinese hamster ovary cells (CHO-K1), we previously showed that fucan B inhibits CHO-K1 cell migration on a fibronectin-coated substrate. Thus, we suggested that fucan B binds to fibronectin and activates integrins, mainly integrin α5β1, to inhibit CHO-K1 migration [11]. Overall, fucan B is a LMW fucan that binds fibronectin, thus inhibiting cell migration. However, the effect of fucan B on EC

migration was not evaluated. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effects of fucan B on ECs migration and capillary-like tube formation in order to

determine whether 21.5 kDa is the molecular weight limit for eliciting pro-angiogenic effects.

2. Materials and methods

2.1. Materials

Matrigel, 1-(3’-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, sulfuric acid, hydrochloric acid, ethylenediamine (1,2-diaminoethane), laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane, type I collagen from rat tail, fibronectin from human plasma, potassium bromide and dextrans of various molecular weights were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Sodium bicarbonate, F12 medium, non-essential amino acids, fetal bovine serum (FBS), sodium pyruvate, and phosphate buffered saline (PBS) were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ham’s Nutrient Mixture F-12 medium (F-12 medium) was purchased from Cultilab (Campinas, São Paulo, Brazil). Goat polyclonal anti-fibronectin IgG (anti-FN) was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Biotin-hydrazide was purchased from Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA). The secondary antibody

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 31 conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) and streptavidin conjugated to Texas Red were purchased from Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts, EUA). Other solvents and chemicals used in this study were of analytical grade.

2.2. Fucan extraction and purification

Seaweeds were collected from the northeastern coast of Brazil (6°00'22.8"S 35°06'26.9"W) and washed in tap water to remove sand, salt, and epiphytes. Seaweeds were dried at 50°C in a ventilated oven, ground in a blender, and incubated with acetone to eliminate lipids and pigments. The powdered seaweeds were suspended with 500 mL of 0.25 M NaCl, and the pH was adjusted to 8.0 with NaOH. Prolav 750 (Prozyn Biosolutions, São Paulo, SP, Brazil), a mixture of alkaline proteases, was added. The seaweed suspensions were incubated for 24 h at 60 °C with agitation and the pH

periodically adjusted to 8.0. Suspensions were filtered through cheesecloth. The filtrate was fractionated by precipitation using crescent volumes of acetone (0.5, 0.6, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, and 2.0 volumes) and stored at 4 °C for 24 h. The precipitate that formed was collected by centrifugation (10,000 × g, 20 min). The fraction that contained fucan B (obtained with 0.9 volumes of acetone) was freeze-dried. Fucan B was isolated by ion exchange chromatography as previously described [10, 11].

2.3. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR)

Fucan B (10 mg) was mixed thoroughly with dry potassium bromide. A pellet was prepared and the infrared spectrum was measured between 500 and 4000 cm−1 on a Thermo-Nicolet Nexus 470 ESP FT-IR spectrometer. Thirty-two scans with a resolution of 4 cm−1 were averaged and referenced against air.

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2.4. Chemical Analysis and Monosaccharide Composition

Fucan B was hydrolyzed with 2 M HCl for 2 at 100 °C and its sugar composition was determined as previously described [10]. In addition, total sugars, sulfate, and protein content were determined as previously described [11].

The molecular weight of fucan B was determined by HPLC in 0.2 M NaCl, 0.5% ethanol, using a GF-250 column (Asahipak GF series, Asahi Chemical Industry Co., Yakoo, Japan). The column was calibrated with standard dextrans, as described previously [10].

2.5. Cell culture

ECs derived from rabbit aorta [12] were used in this study. This cell line has many characteristics of other ECs including blood compatibility and expression of von Willebrand factor (a tissue factor pathway inhibitor) and estrogen receptors. In addition, they produce the anticoagulant, heparan proteoglycan, and fibronectin, and develop capillary-like structures in vitro [13]. ECs were maintained in a humidified atmosphere at 37 °C and 2.5% CO2 in F-12 medium supplemented with 10% FBS and antibiotics.

2.6. BrdU incorporation

ECs (5 x 103 cells/well) were seeded into 96-well plates with 300 μL of fresh medium and incubated for 12 h at 37 °C and 2.5% CO2. The medium was removed, fucan B in F12 medium was added to a final concentration between 0.01 to 0.5 mg/mL, and plates were incubated for 24 h, at 37 °C and 2.5% CO2. After incubation, unbound fucan B were removed by washing the cells twice with 200 μL PBS and BrdU

incorporation was determined according to manufacturer’s instruction (BrdU cell proliferation assay kit - Cell Signaling, Danvers, MA, USA).

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2.7. Annexin V-FITC/PI Double Staining and Analysis by Flow Citometry

To evaluate the effects of fucan B on EC death, a FITC/Annexin V Apoptosis Kit was used, with Dead Cell Annexin FITC and propidium iodide (PI), for Flow Cytometry (Invitrogen, Catalog no. V13242). ECs were grown in 6-well plates until they reached confluence of 2 × 105 cells/mL and were then stimulated to enter G0 in a medium without serum for 24 h. Next, cells were to exit G0 by adding F-12

supplemented with 10% FCS, in the presence of fucan B (0.5 mg/mL). A negative control was prepared without the presence of fucan B. After 24 h, ECs were trypsinized, collected and washed with cold PBS. The supernatant was discarded and cells were resuspended in 200 µL of 1× Binding Buffer. Five microlitres of Annexin V-FITC and 1 µL of PI solution (100 µg/mL) was added in 100 µL of cell suspension. Cells were incubated for 15 min at room temperature and kept under light protection. After the incubation period, 400 µL of binding buffer for annexin V 1× was added and cells were analyzed by flow cytometry (flow cytometer FASCANTO II, BD Biosciences),

measuring fluorescence emission at 530–575 nm for annexin V and 630/22 nm for PI. A total of 10.000 events were acquired. FlowJo software V ×10.0.7 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) was used for data analysis.

2.8. Capillary-like tube formation on reconstituted basement membrane

The tube formation assay was performed as previously described [11]. Matrigels were thawed at 4 °C on ice, plated on 24 well-plates, and incubated at 37 °C for 16 h. F12 medium supplemented with 10% FBS, ECs (1 x 104) and fucan B (0.012, 0.025, 0.50, or 0.1 mg/mL) or PBS (control) were added to wells. Plates were incubated in a humidified atmosphere at 37 °C and 2.5% CO2. After 24 h, three images covering

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 34 different areas of each well were randomly captured using an inverted light microscope at 100x magniﬁcation. Tubes composed of connected cells that formed on matrigels were measured for total segment length (µm) using image analysis software (Image J, version 1.49j; NIH, Bethesda, MD, USA, 2014).

2.9. Biotinylation of fucan B

Fucan B was biotinylated as described previously [14] using biotin-hydrazide. Briefly, 1-(3’-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDAC, 200 mmol) was added to a solution containing 200 moles of biotin-hydrazide and 10 mg of fucan B dissolved in 0.1 M HCl (20 mL). The reaction was maintained at pH 4.8 with 0.01 M HCl. After 1 h, sodium acetate to a final concentration of 0.5 M was added to quench the reaction, and the solution was stirred for an additional 1 h. UV scanning from 190 to 260 nm was performed to determine the amount of biotin bound to fucan B (optimum wavelength = 198 nm). Biotin-hydrazide and non-biotinylated fucan B were used as controls.

2.10. Agarose gel electrophoresis

Agarose gel electrophoresis of fucan B and biotinylated fucan B was performed using a 0.6% agarose gel (7.5 cm × 10 cm × 0.2 cm thick) prepared in 0.05 M 1.3-diaminopropane acetate pH 9.0 as previously described [15]. Polysaccharides

(approximately 50 μg) were also separated by electrophoresis. The gel was fixed with 0.1% cetyltrimethylammonium bromide (CETAVLON) solution for 2 h, dried, and stained for 15 min with 0.1% toluidine blue in 1% acetic acid and 50% ethanol. The gel was destained using the same solution without dye.

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2.11. Blotting assay

Agarose gel electrophoresis of fucan B and biotinylated fucan B was performed as described above. Fucans were transferred to nitrocellulose membrane by diffusion at room temperature for 16 h, and the membrane was blocked with 5% nonfat milk, 0.1 M PBS, pH 7.4 for 2 h with gentle shaking. The membrane was washed three times with PBS and then incubated with streptavidin conjugated to alkaline phosphatase (1:3000 in 1% BSA) for 1 h at room temperature. The membrane was washed five times with PBS and immersed in the optimum buffer for alkaline phosphatase (100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5). The membrane was incubated with alkaline phosphatase substrates (0.165 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate and 0.330 mg/mL of nitroblue tetrazolium; Life Technologies, Rockville, MD, USA) to detect biotinylated fucan B.

2.12. Confocal analysis

ECs were seeded on 12-mm-diameter glass coverslips in 24-well cluster plates. After 3 days in culture, the medium was removed and the cells were washed three time with 0.1 M PBS pH 7.4, and 100 L of fucan B (10 g/mL in PBS) was added to wells. After 30 min, the cells washed with PBS and fixed with 2% formaldehyde for 30 min. Texas red conjugated streptavidin (5 g/mL in PBS) (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA) was used to probe for fucan binding. Cells were also incubated with DAPI (1:2000) (Thermo Scientific) for 2 min. Extracellular membrane was stained using 5 µg/mL Alexa-Fluor 488 Wheat Germ Agglutinin (WGA) (Thermo Scientific). The glass coverslips were mounted in a Fluoromount-G (Thermo Scientific) and images were captured using confocal laser scanning microscope TCS SP8 (Leica, Wetzlar, Germany).

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2.13. Motility assay

The motility assay was conducted as described previously [16]. Briefly, the undersurface of the polycarbonate membranes of transwell motility chambers (8 µm pore size) (Costar Corp.) were coated with fibronectin, collagen, or laminin (10 µg/mL in PBS) for 40 min and blocked with 1% BSA (1 h, 37 °C). ECs (5 x 105_{) in 100 µL of} F-12 medium were added to the upper chambers in the presence or absence (control) of different concentrations of fucan B. The chambers were kept at culture conditions (humid atmosphere at 37 °C and 2.5% CO2) for 5 h. The cells which migrated were fixed with 2% formaldehyde for 10 min and stained with 1% toluidine blue in borax for an additional 10 min. The number of migrated cells was determined using an inverted microscope. Ten fields of cells were counted for each condition and averaged. Inhibition of cell migration was calculated as a percentage using the equation: I% = [1− (the number of migrated cells in the treatment condition/the number of migrated cells in the control condition)] × 100.

2.13. Statistical analysis

All data from the experiments were expressed as mean ± standard deviation (n ≥ 3). Statistical significance (p < 0.05) was calculated by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's test.

3. Results and Discussion

3.1. Purification and characterization of fucan B

Fucan B was purified from the seaweed, S. schröederi, by proteolytic digestion, acetone precipitation, and ion exchange chromatography. Fucan B structural data are shown in Table 1. This polysaccharide is composed of galactose, fucose, xylose, and

(38)

Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 37 trace amounts of glucuronic acid. In addition, fucan B contains 19% sulfate and has a MW of 21.5 kDa.

Table 1. Chemical composition and molecular weight (MW) of Fucan B extracted from

the brown seaweed, S. schröederi.

Sample MW (kDa) Sulfate (%) Protein (%) Molar Ratio

Fucose Galactose Xylose Glucuronic acid

Fucan B 21.5 19.0 - 1.0 2.0 0.5 >0.1

Figure 1 presents the FT-IR spectra of fucan B. The vibrational modes observed at 3447 cm-1_{were attributed to O-H stretching in fucan. It is important to emphasize} that free O-H stretching appears at higher frequencies, because it requires higher energy to vibrate. The presence of sp3 C-H stretches was observed in 2931 cm-1. The band at approximately 1646 cm-1 was caused by the carbonyl groups of monosaccharides, which overlap with H2O deformation signals. The band at approximately 1426 cm-1 was caused by the overlap between symmetric CH2 deformation of galactose and

asymmetric deformation of CH3 from fucose. The presence of sulfate was confirmed by the bands at 1257, 1048, 848, and 583 cm-1, which correspond to the vibrations of asymmetric S=O stretching, symmetric C–O associated with a C–O–SO3 group, C-O-S of sulfate groups at the axial C-4 position, and symmetric O=S=O deformation of sulfates groups, respectively.

The data regarding fucan B presented herein (its chemistry, FT-IR spectrum, and molecular weight) were in agreement with previously reported results [10, 11], thus confirming the identity of the obtained compound as fucan B. Therefore, this compound was used in subsequent experiments.

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Fig. 1. Infrared spectra of fucan B from 4000 to 400 cm-1_.

3.2. Fucan B inhibits capillary-like tube formation of ECs on Matrigel

We evaluated the effect of fucan B using a capillary-like tube formation assay. ECs in reconstituted basement membrane were able to migrate, form intercellular attachments, and form tube-like structures as shown in Figure 2A. Fucan B inhibited the formation of capillary-like tube structures by ECs at all concentrations tested in a dose-dependent manner. Approximately 50% inhibition and modified network formation were observed at the lower concentration of 0.025 mg/mL. Highest inhibition, as well as complete abolishment of network formation, was observed at 0.050 mg/mL.

Ustyuzhanina and colleagues [8] demonstrated that LMW fucans elicit

angiogenic effects, while HMW fucans have anti-angiogenic effects. A 21.5 kDa fucan B is considered an LMW fucan. In contrast to previously reported results [8], fucan B inhibited the formation of tube-like structures by EC. This difference can be explained when considering the molecular weights of pro-angiogenic LMW fucans, which are approximately 8 kDa [17]. These data suggest that the molecular weight limit for a fucan to exhibit pro-angiogenic activity is between 8 and 21 kDa. Further studies should

(40)

Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 39 be conducted to determine the molecular weight limit for a fucan to exhibit pro- or anti-angiogenic activity.

Fig. 2. The inhibitory effect of fucan B on endothelial cell capillary-like tube formation.

A, Control (no treatment); B, Fucan B 0.012 mg/mL; C, Fucan B 0.025 mg/mL; D,

Fucan B 0.05 mg/mL; E, 0.1 mg/mL; F, Quantitative analysis of tube formation. *p < 0.05.

3.3. Fucan B did not inhibit EC proliferation

Many fucans have anti-proliferative activities against different cell types [18, 19]. Therefore, fucan B may inhibit the capillary-like tube formation due to its

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 40 fucan B on ECs proliferation using the BrdU assay. We observed that all concentrations of fucan B that were tested (0.01; 0.02; 0.05; 0.1; and 0.5 mg/mL) did not affect BrdU incorporation by the ECs (Figure 3) since the amount of BrdU in these ECs was similar those found in ECs of control group (ECs not exposed to fucan B). Thus, fucan B did not affect ECs proliferation.

Fig.3. Effect of Fucan B on ECs proliferation. The rate of cell proliferation was

determined using BrdU. The results are expressed as percentage of the control cell normalized one hundred % in the absence of fucan B (mean ± SD of four determination).

In addition, the cells were incubated with fucan B and subsequently analyzed by flow cytometry. Fig. 4 summarizes the data obtained; the cells treated with fucan B (0.5 mg/mL) were not stained with PI or annexin V, i.e., fucan B was not toxic against these cells at the tested concentration. On the other hand, the incubation of cells with cisplatin (positive control) increased the number of cells stained with annexin, without affecting the cell PI staining pattern of cells.

In recent years, fucans from brown seaweeds, such as Fucus vesiculosus, Fucus

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novae-Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 41

caledoniae, Ascophyllun nodosum, Laminaria japonica, Laminaria saccharina,

Laminaria digitate, and Undaria pinnatifida, have been shown to function as a class of

natural anti-angiogenic biopolymers [8]. Among these, only the fucan from U.

pinnatifida is a galactofucan [9]. To our knowledge, no other galactofucan has been

evaluated as an anti-angiogenic or pro-angiogenic agent. The results herein add another galactofucan (fucan B) to the list of anti-angiogenic fucans. The structural

characteristics that confer anti-angiogenic effects across fucans is unclear. However, we postulate that the presence of galactose is not an important factor, since most anti-angiogenic fucans do not have galactose in their composit ion.

Fig.4. Distribution of endothelial cells marked with PI (necrosis) and annexin V

(apoptosis) after incubation with Fuca B for 24 hours. This figure is representative of three separate tests made independently.

3.4. The effect of fucan B on EC migration on laminin, collagen I, and fibronectin

Since fucan B did not affect ECs proliferation, we next evaluated its effect on ECs migration, which is important process for angiogenesis. Figure 5 shows that when

(43)

Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 42 laminin or collagen I was the substrate, fucan B did not affect cell migration at any of the tested concentrations. In contrast, when fibronectin was the substrate, even the lowest tested fucan B concentration (0.01 mg/mL) inhibited cell migration by about 50%. In addition, the anti-migratory effect of fucan was dose-dependent, similar to that observed in the capillary-like tube formation assay.

Fig.5. A – Motility on fibronectin of ECs exposed to fucan B. Cells on the other side of

the membrane were stained with 1% toluidine blue and counted. Results are expressed as mean ± SD of three determinations B - ECs transwell migration on fibronectin in the presence of 0.01 mg/mL; 0.25 mg/mL and 0.5 mg/mL of fucan B. Cells show purple or dark blue color. *p < 0.05. FN - fibronectin

3.5. The characterization of biotinylated fucan B

Data presented thus far suggest that fucan B inhibits capillary-like tube formation by binding fibronectin. To confirm this hypothesis, we generated a

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 43 of the biotinylated fucan B. The number of biotins covalently bound to fucan B was small. Thus, the molecular weight of the two polysaccharides were similar.

Table 2. The chemical composition of fucan B and biotinylated fucan B

Fucans Molecular weight Glucuronic acid (µM) Biotin (µM) Glucuronic acid /biotin Fucan B 21.5 kDa 0.54 nd - Biot-Fucan B 21.8 kDa 0.47 0.01 1/0.02

nd – not detected, Biot. Fucan B - biotinylated fucan B

The electrophoretic behavior of the fucans in an agarose gel can be observed in Figure 6. Both fucans showed similar electrophoretic migration, indicating that the low degree of biotinylation did not affect the structure of fucan B. In addition, the two samples stained similarly with toluidine blue (Figure 6a). The presence of biotin in fucan B was confirmed by blotting. Biotinylated fucan B was transferred from agarose gel to nitrocellulose, and the bands were visualized using streptavidin conjugated to alkaline phosphatase (Figure 6b).

Fig.6. Electrophoretic mobility of unmodified and biotinylated fucan B. A, Agarose gel

electrophoresis of fucans after precipitation with cetavlon and staining with toluidine blue; B, Blot of fucans on nitrocellulose membrane visualized with alkaline phosphatase.

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 44 Fuc B, fucan B; Biot-Fuc B, biotinylated fucan B; GAGS, standard mixture of glycosaminoglycans containing 5 µg of CS (chondroitin sulfate), DS (dermatan sulfate), and HS (heparan sulfate).

3.6. Fucan B binds to the extracellular matrix of ECs

Confocal microscopy revealed that ECs exposed to biotinylated fucan B

exhibited a fiber-like pattern of binding (Figure 7b). ECs immunostained for fibronectin (FN), a characteristic component of extracellular matrices, also exhibited the same fiber-like pattern (Figure 7b). ECs nuclei were stained with DAPI (Figure 7a). When the three images were overlaid, bound fucan B colocalized with the immunostaining for FN (orange) (Figure 7d).

Fig.7. Confocal analysis of endothelial cells (ECs) exposed to biotinylated fucan B. A,

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Anti-Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 45 fibronectin detected with anti-goat IgG-FITC; C, Nuclei stained with DAPI; D, Double-labeling of ECs using biotinylated fucan B. Note that fucan co-localizes with fibronectin in the extracellular matrix (orange fiber-like pattern).

In order to verify if fucan B was indeed binding only to the ECM, the cell cultures were double labeled with biotinylated fucan B and Alexa-Fluor 488 Wheat Germ Agglutinin (WGA). As shown in Figure 8, as expected, the biotinylated fucan B bound to the extracellular matrix (Fig 8b) and the WGA to the cell surface (Fig. 8C). When the images were overlaid (Fig. 8d), it was clear that the cell surface and the extracellular matrix were differentially labeled.

Fig.8. Fucan B binds to the extracellular matrix of endothelial cells. A, Nuclei stained

with DAPI; B, Biotinylated fucan B detected with streptavidin-conjugated to Texas red;

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 46 biotinylated fucan B. Note that fucan B is bound only to the extracellular matrix and the WGA only to the cell surface.

Fucan B inhibited ECs migration only when the plate surface was coated with fibronectin (Figure 2). These data indicate that fucan B functions as an anti-angiogenic agent by interacting with the extracellular matrix, specifically FN, as confirmed by confocal analysis (Figures 7 and 8). Few papers describe fucan binding to extracellular matrix molecules. One article showed that a fucan from Laminaria brasiliensis bound FN, as well as laminin and collagen IV [20]. In contrast, the galactofucan from Dictyota

menstrualis bound only FN [21]. In addition, Liu and colleagues [22] demonstrated that

the fucan/FN interaction occurs on at least four different sites along the fibronectin polypeptide chain, two of which are the heparin-binding sequences recognized by heparan sulfate (HS) proteoglycans.

FN can be a ligand for a dozen cell surface receptors, including the classic FN receptor α5β1 integrin and HS proteoglycans [16]. Therefore, FN mediates a wide selection of cellular interactions with the extracellular matrix and plays important roles in ECs migration [23]. Extensive analyses have narrowed down the regions involved in cell adhesion along the lengthy FN molecule to several minimal cell

receptor-recognition sequences. The best known of these is the RGD tripeptide (arginine-glycine-asparagine) [24].

FN molecules in extracellular matrix form FN fibers, and the biological activity of FN should ultimately result from the molecular conformation of the molecules that constitute FN fibers. Therefore, ligands that affect FN conformation have the ability to affect directly cell behavior, including cell migration [25].

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 47 Based on our data, we suggest that fucan B binds several sites on FN fibers, and this can affect their conformation. We also postulate that owing to its size, fucan B blocks the RGD site and heparin-binding sequences on fibronectin to hinder recognition by integrins and heparan proteoglycans, respectively. These two events can block the ECs binding to fibronectin, thereby inhibiting ECs migration. Future studies may confirm these hypotheses.

4. Conclusion

We extracted a 21.5 kDa galactofucan, fucan B, from the brown seaweed, S.

schröederi. In addition, we tested the effect of fucan B on ECs capillary-like tube

formation. Fucan B inhibited this ECs property in a concentration-dependent manner without affecting ECs proliferation, even at high concentrations. In addition,

biotinylated fucan, visualized in confocal microscopy experiments, did not bind to cell surfaces, but rather only to extracellular matrix. Thus, fucan B inhibits ECs capillary-like tube formation by binding fibronectin and inhibiting ECs migration. Our findings suggest that fucan B inhibits ECs capillary-like tube formation and migration by binding directly to fibronectin and blocking fibronectin sites recognized by cell surface ligands. However, further studies are needed to evaluate the in vivo effects of fucan B.

Acknowledgments

The authors wish to thank Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq (National Council for Scientific and Technological Advancement, in loose translation), Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior CAPES (Higher Level Personal Development Coordination, in loose translation), Programa Nacional de Cooperação Acadêmica (PROCAD), and the Ministerio de Ciência,

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Menezes, M.M. PPGCSA/CCS 48 Tecnologia, Informação e Comércio (MCTIC – the Science and Technology Ministry in Brazil, in loose translation) for the financial support. Helena Nader, Edvaldo Trindade and Hugo Rocha are CNPq fellowship honored researcher. Maira Menezes had MSc scholarship from CAPES. Jailma Almeida-Lima and Leonardo Nobre had a Pos-doctorate scholarship from CAPES. The authors would like to thank the Department of Biochemistry at Universidade Federal do Rio Grande do Norte for letting us to use the cell culture room. This research was presented at Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde at Universidade Federal do Rio Grande do Norte, as part of the MSc thesis of Maira Menezes.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflict of interest.

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