- + TICO INVERSÃO DO FLUXO ELETROSMÓTICO TICO sinal. tempo EXEMPLO EXEMPLO
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Texto
(2) .
(3) . INVERSÃO DO FLUXO ELETROSMÓ ELETROSMÓTICO. INVERSÃO DO FLUXO ELETROSMÓ ELETROSMÓTICO. -----------------------------------+. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. cátodo ânodo +. +. +. +. -. +. -. +. +. -. -. -. -. -. -. +. +. -. -. -. +. +. -. -. -. -. +. +. +. -. -. -. +. -. -. -. + -. H 3C. H (1) FORMIATO. (2) ACETATO. (3) PROPANOATO. (4) BUTANOATE. plano de. -. cisalhamento. EOF -. sinal. camada móvel. -. -. +. +camada fixa. cátodo ânodo. + neutros. (5) PENTANOATO. tempo.
(4) EXEMPLO. (6) HEXANOATO.
(5) EXEMPLO.
(6) .
(7) . EXEMPLO. EXEMPLO. 16.
(8)
(9) .
(10) . -. Cromatografia Eletrociné Eletrocinética Micelar (MECC). -. -. -. 9modo que permite a separação de espécies NEUTRAS. -. -. -. -. -. micela. -. -. -. -. -. -. Concentração do surfactante > cmc. Surfactante aniônico: SDS. cmc SDS = 8 mmol L-1. +. AN: 62.
(11) .
(12) . Cromatografia Eletrociné Eletrocinética Micelar (MECC). Cromatografia Eletrociné Eletrocinética Micelar (MECC). janela de detecção. Mecanismo de separação:. tmicela. sinal. Â partição dos analitos entre a fase pseudoestacionária (micela) e a solução. to. tempo.
(13) . . EXEMPLO. . ¾ Inúmeros métodos de detecção podem ser usados em combinação. com CE, tais como: 9 UV-Vis 9 Fluorescência 9 Espectrometria de Massas. Feixe de luz. capilar. 9 Métodos eletroquímicos. de tec. eletrólito. amostra. to r. eletrólito. ânodo. +. Fonte de alta tensão. cátodo. -. 17.
(14) . . . . •Volume da cela de detecção pequeno. • Pequena (mínima) contribuição para o alargamento de pico. • Faixa dinâmica de resposta ampla. • Fator de resposta rápido. • Inerte à mudança de temperatuta. • Detecção tanto seletiva quanto universal.. Em resumo: Quase impossível encontrar um sistema com todos esses requisitos..
(15) % &. 8 ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO. MEDIDAS DE INTENSIDADE DE RADIAÇÃO EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ESPÉCIES DE INTERESSE (ATÔMICAS OU MOLECULARES). ESPECTROMETRIA. Frequência, Hz. Raios X. Microondas. Visível. Raios Gama. Infravermelho. UV. Rádio. Comprimento de Onda, m. - Sensível ao Olho Humano. λ 9: ;:<-. ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO E FLUORESCÊNCIA MOLECULAR NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA E VISÍVEL. 400. 500. 600. 700 nm. - Minúscula Quando Comparada a Outras Regiões. . . 8 . 8 . ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO DIAGRAMA DE NÍVEIS DE ENERGIA. ABSORÇÃO MOLECULAR. Estado Excitado Estado Excitado. AMOSTRA Radiação Incidente. P0. Radiação Transmitida. P. Estado Fundamental. ESPECTRO: Medida da Radiação Absorvida em Função do Comprimento de Onda. RAIOS γ. RAIOS X. UV. VIS. Frequência, Hz INFRAVERMELHO. MICROONDAS RÁDIO. Comprimento de Onda, m. 18.
(16) . 8 . 8 . Absorbância, A. Absorbância, A. . Comprimento de Onda, nm. D2 – 160 a 380 nm W – 350 a 2500 nm. Comprimento de Onda, nm. . ESPECTROFOTÔMETRO UV/VIS DE FEIXE SIMPLES. 8 . Absorbância, A. 8 . D2 – 160 a 380 nm W – 350 a 2500 nm. Absorbância, A. Comprimento de Onda, nm. Comprimento de Onda, nm. D2 – 160 a 380 nm W – 350 a 2500 nm. ESPECTROFOTÔMETRO UV/VIS DE FEIXE DUPLO. 8 . 8 INSTRUMENTOS EQUIPADOS COM DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS. Espectrofotômetro Spectronic 20. Espectrofotômetro Varian Cary 4000. 19.
(17) 8 . 8 . LEI DE LAMBERT-BEER. LEI DE LAMBERT-BEER. A = ε .b .C. P . 100% T = Po A = log. Po = ε .b .C P. A = Absorbância da amostra [u.a.]. ε = Absortividade Molar [L.mol-1.cm-1] b = Caminho Óptico [cm] C = Concentração [mol.L-1]. 0 ppm. 4,0 ppm. 8,0 ppm 12,0 ppm 16,0 ppm 20,0 ppm. 8 . . . CE – UV-Vis – problemas com a sensibilidade Lei de Lambert-Beer:. A=εbC. Em CE: Qual é o caminho ótico? capilar. Detector. Fonte de Luz. 50µm. Â CE: b = 50 µm. 20.
(18) LEI DE LAMBERT-BEER ELETROFORESE CAPILAR. A = ε .b .C.
(19) $ ABSORÇÃO MOLECULAR. capilar. Detector. Fonte de Luz. b = 50 µm. 50µm. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA. FLUORESCÊNCIA MOLECULAR. b = 0,5 cm = 5000 µm.
(20) $ 8 .
(21) $.
(22) $ . .
(23) . 9 Eletroforese Capilar de Zona (CZE) Métodos em Solução. 9 Isotacoforese Capilar (CITP) 9 Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF). 9 Eletroforese Capilar em Gel (CGE) 9 Eletroforese Capilar com Polímeros Enovelados (CEPS). Métodos Cromatográficos. Métodos em Meio Polimérico. MÉTODOS EM SOLUÇÃO. 9 Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF). 9 Cromatografia Eletrocinética Micelar (MECC). 9 Eletrocromatografia Capilar (CEC). 21.
(24)
(25) .
(26) " Mistuta de compostos anfotéricos. pI = valor de pH em que a carga líquida do composto é zero.. ALANINA pI = 6. +. NaOH (20 mM). H3PO4 (20 mM). -. 3. ANÓLITO. CATÓLITO. ÂNODO (+) pH < 6. CÁTODO (-). pH > 6.
(27) " .
(28) " . Mistura de Anfólitos contida em pH = 8. ALANINA pI = 6. + 3. Mistuta de compostos anfotéricos. pH < 6 H3PO4 (20 mM). NaOH (20 mM) ANÓLITO. CATÓLITO. pH = 1 -. ÂNODO (+). pH = 12 H3PO4 (20 mM). CÁTODO (-). NaOH (20 mM). ANÓLITO. CATÓLITO. ÂNODO (+). CÁTODO (-). pH > 6. . Focalizaç Focalização Isoelé Isoelétrica Capilar (CIEF). Focalizaç Focalização Isoelé Isoelétrica Capilar (CIEF) 9 Largamente aplicado para análise de proteínas, as quais são separadas de acordo com seus valores de pI. H2N. H. O. C. C. R1. O. C. C. H. R2. H. O. N. C. C. H. R3. H. O. N. C. C. H. R4. H. O. N. C. C. H. R5. H. O. N. C. C. H. R6. OH. Â considerando que pI desta proteína é 5,80. ??? pI: Ponto isoelétrico – valor de pH no qual a carga líquida de uma proteína (peptídeo, aminoácido) é nula. H N. 9 se pH = 3. + H3 N. H. O. C. C. R1. 9 se pH = 8. H2N. H. O. C. C. R1. 9 se pH = 5,80. + H3 N. H. O. C. C. R1. H. O. N. C. C. H. R2. H. O. N. C. C. H. R2. H. O. N. C. C. H. R2. H. O. N. C. C. H. R3. H. O. N. C. C. H. R3. H. O. N. C. C. H. R3. H. O. N. C. C. H. R4. H. O. N. C. C. H. R4. H. O. N. C. C. H. R4. H. O. N. C. C. H. R5. H. O. N. C. C. H. R5. H. O. N. C. C. H. R5. H. O. N. C. C. H. R6. H. O. N. C. C. H. R6. H. O. N. C. C. H. R6. OH. O-. O-. 22.
(29) . . Focalizaç Focalização Isoelé Isoelétrica Capilar (CIEF). Focalizaç Focalização Isoelé Isoelétrica Capilar (CIEF). 9 a amostra é adicionada juntamente com o tampão, que contém os anfólitos que geram um gradiente de pH. gradiente de pH. 3. gradiente de pH. 3. 10. detecção. +. 10. -. detecção. +. -. + H3 N. 9 pI = 5,80. H. O. C. C. R1. H. O. N. C. C. H. R2. H. O. N. C. C. H. R3. H. O. N. C. C. H. R4. H. O. N. C. C. H. R5. H. O. N. C. C. H. R6. O-. 9 Em CIEF, comumente deve-se eliminar o EOF. .
(30) " %
(31) & APLICAÇ APLICAÇÕES. Focalizaç Focalização Isoelé Isoelétrica Capilar (CIEF) detecção. +. sinal. pressão. Gráfico de calibração pI. •. tempo. •. •. •. •. Tempo de migração.
(32) " %
(33) &. Eletroforese Capilar. Modos de Separação. APLICAÇ APLICAÇÕES. MÉTODOS EM MEIO POLIMÉRICO. 9 Eletroforese Capilar em Gel (CGE). 23.
(34) Eletroforese Capilar. Modos de Separação – CGE. Métodos em Meio Polimérico:. Eletroforese Capilar. Modos de Separação – CGE. Métodos em Meio Polimérico:. Eletroforese Capilar em Gel (CGE) 9 Método aplicado a separação de compostos que apresentam a mesma relação CARGA / TAMANHO (ex.: DNA e proteínas desnaturadas com SDS) 9 Seletividade baseada no TAMANHO µ ∝. 1 dos compostos MW detecção. Eletroforese Capilar em Gel (CGE) carga +++ tamanho. =. carga ++ tamanho. +. +++. 9o gel é quimicamente ligado a superfície do capilar. Â poliacrilamida entrecruzada com bis-acrilamida. sinal. Â poliacrilamida. 1 +++ tamanho. <. 1 ++ tamanho. <. 1 + tamanho. detecção. +++ + ++. ++. + Preenchimento do capilar com um gel. =. carga + tamanho. + ++. ++. ++. -. +. +++. tempo. Â agarose. Eletroforese Capilar. Modos de Separação – CGE. PROTEÍNAS DESNATURADAS COM SDS. Eletroforese Capilar em Gel (CGE) carga --tamanho. =. carga -tamanho. =. carga tamanho. 1 --tamanho. <. 1 -tamanho. <. 1 tamanho. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL. detecção. ---. ---. -. --. -- - -. --. +-. -. 2D-PAGE 2D-Poliacrylamide Gel Electrophoresis. -. sinal. -. --. ---. tempo. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL. 24.
(35) PRIMEIRA DIMENSÃO: SEPARAÇÃO POR pI. FITAS COM GRADIENTE DE pH IMOBILIZADO. FITAS COM GRADIENTE DE pH IMOBILIZADO. Sua fabricação envolve uma reação de copolimerização fazendo uso dos monômeros de acrilamida (CH2=CH-CH-CO-NH2), acrilamida modificada (CH2=CH-CH-CO-NHR), e bis-acrimalida Os monômeros de acrilamida modificados possuem em suas estruturas grupamentos R, os quais podem ser ácidos ou bases fracas com valores de pKa bastante estabelecidos. A combinação desses vários monômeros em concentrações adequadas define o intervalo e a forma desse gradiente de pH. SEGUNDA DIMENSÃO: SEPARAÇÃO POR TAMANHO. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL. APLICAÇÃO DA AMOSTRA. HIDRATAÇÃO. SEPARAÇÃO. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL. INSTRUMENTAÇÃO. POSICIONAMENTO NO GEL (HORIZONTAL) POSICIONAMENTO NO GEL (VERTICAL). 25.
(36) ANÁLISE DOS GÉIS. ANÁLISE PROTEÔMICA. BIOMARCADORES. BIOMARCADORES. BIOMARCADORES. BIOMARCADORES. 26.
(37) BIOMARCADORES.
(38) . MÉTODOS EM CROMATOGRÁFICOS. 9 Eletrocromatografia Capilar (CEC).
(39) %& 9 Uso de coluna capilares (típicas de CE) preenchidas (empacotadas) com fases estacionárias de HPLC (C-18).
(40) Cromatografia Eletrociné Eletrocinética Micelar (MECC). CAPILAR DE SÍLICA FUNDIDA. 50 – 100 µm ID. 9 “união” das melhores vantagens de CE e HPLC poliimida. perfil planar de pressão 365 µm. (alta eficiência). seletividade da fase reversa. 9 Faz-se uso de fases móveis tamponadas 9 O EOF é responsável pelo bombeamento da fase móvel (não é necessário o uso de bombas) 9 Mecanismo de separação essencialmente cromatográfico (fase reversa).
(41) %& APLICAÇ APLICAÇÕES. BIOANALÍTICA. ELETROFORESE. 27.
(42) MICRODIÁLISE “IN VIVO”. MICRODIÁLISE “IN VIVO”. MICRODIÁLISE “IN VIVO”. MICRODIÁLISE “IN VIVO”. MICRODIÁLISE “IN VIVO”. BIOMARCADORES. 28.
(43) CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA. (OHWURIRUHVHHP0LFURFKLSV. % ! & '. Eletroforese capilar (CE) - principal técnica desenvolvida em microdispositivos – simplicidade instrumentação. Microchips: Aspectos Gerais. - Tradicional capilar de sílica fundida:. 2.5. poliimida. VIDRO Fotolitografia. cm. L = 20 a 80 cm. Materiais. Microcanais dispostos em cruz e fabricados em uma superfície planar.. 50 – 100 µm ID. PDMS. 365 µm. Moldagem. - Microcanais fabricados em vidro ou polímeros:. PMMA. 30 - 200 µm. PC. 10 - 50 µm. 4 - 8 cm. 30 - 100 µm largura 15 - 40 µm profundidade. Hot Embossing Laser Ablation. 1 - 3 cm. CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA. CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA. ELETROFORESE EM MICRODISPOSITIVOS. +. Fonte Alta Tensão. VANTAGENS NA MINIATURIZAÇÃO DE SISTEMAS ANALÍTICOS. -. • Oferece análises mais rápidas, devido ao tamanho reduzido • Emprego de quantidades muito pequenas de reagentes e amostras (ordem de pL). ↓ Resíduos. Tampão. • Potencial para desenvolvimento de instrumentos portáteis Injeção. LARGURA E PROFUNDIDADE. +. Amostra Tampão. 10 - 200 µm. Tampão. Separação. Fonte Alta Tensão. COMPRIMENTO. 3 - 10 cm. • Integração das principais etapas de uma análise química em um único dispositivo: - Amostragem - Preparo da amostra - Separação - Detecção. -. • Baixo custo dos procedimentos de microfabricação OBJETIVO FINAL Laboratórios convencionais repletos de equipamentos e com vários técnicos especializados. .=.4>?, Tampão. CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA MICRODISPOSITIVO CAPAZ DE INTEGRAR TODAS AS ETAPAS DE UMA ANÁLISE GENÉTICA (6 × 8,5 cm) 6 × 8,5 cm. (A). (B). d. e. CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA ELETROFORESE EM MICRODISPOSITIVOS – PRINCÍPIOS DA CE CONVENCIONAL. Mobilidade Eletroforética (µ µ EP).
(44)
(45) ! "
(46). 2. f. Pequenos dispositivos portáteis movidos à bateria que permitam a execução de análises químicas complexas por qualquer pessoa em sua própria casa. # $
(47) %&' ! "
(48) & . µEP ∝ carga. tamanho. # () "
(49). g. 9 viscosidade 9 cte. dielétrica 9 força iônica 9 pH 9 temperatura.
(50) * & ! "
(51). b 3 4. 1. c. (C). Fluxo Eletrosmótico (EOF). a 1 ȝL de sangue. Â A solução tampão move-se através do capilar em direção ao polo de carga negativa (cátodo) h. 10 mm. perfil genético em menos de 30 min. EASLEY, C. J.; LANDERS, J. P.; et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 132, 19272, 2006.. 29.
(52) CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA. CAPÍTULO I – MINIATURIZAÇÃO EM QUÍMICA ANALÍTICA DETECÇÃO EM ELETROFORESE EM MICRODISPOSITIVOS. APLICAÇÕES DA ELETROFORESE EM MICRODISPOSITIVOS. Todas as usadas em CE convencional. • LIF • Todas as aplicações da Eletroforese Capilar convencional:. • Eletroquímica. - Separação de cátions e ânions inorgânicos, açúcares, fármacos, aditivos alimentares, pesticidas, explosivos e várias outras classes de compostos - Separação de biomoléculas: proteínas, peptídeos e aminoácidos. Compatível à Miniaturização. • MS. • Quimioluminescência • UV / vis. Poucos Trabalhos. • Raman. - Seqüenciamento de DNA. Mais usada e bastante sensível. • Índice de refração. - Imunoensaios. %()* )+,+ + -. ',%/.. 'HWHFo 'HWHFomRHPPLFURFKLSV. Miniaturização. & Muito Obrigado!!!. C. Henry. Fonte Alta Tensão. µChip ‘PalmSens’. PC. 30.
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