DE LEITÕES COM DIARRÉIA NO SUDOESTE DO PARANÁ
PRODUCTION OF THERMOSTABLE ENTEROTOXIN, HEMOLISINS, COLICIN
AND FIMBRIAE IN STRAINS OF Escherichia coli ISOLATES OF PIGLETS WITH
DIARRHEA OF SOUTHWEST PARANA
Benito Guimarães de BRITO
1*Kelly Cristina TAGLIARI
2Milene Martins BERBEL
3Roberta Lemos FREIRE
4RESUMO
A E. coli é o principal agente infeccioso envolvido nas diarréias dos leitões. A patogenicidade deste microrganismo é determinada por diversos fatores de virulência, entre os quais destacam-se a presença dos fatores de colonização e toxinas. Nesta pesquisa foram avaliadas 140 cepas de E. coli isoladas de 82 leitões lactentes e 58 recém-desmamados com diarréia em granjas do Sudoeste do Paraná. A detecção da enterotoxina termoestável foi realizada em camundongos neonatos e a colicina verificada em ensaio em ágar com crescimento cruzado em meio semi sólido. Os fatores de colonização foram avaliados através da técnica de microhemaglutinação frente a eritrócitos de diferentes espécies animais. Em 37 (26,4%) e 26 (18,6%) amostras foram verificadas atividade hemolítica e colicinogênica respectivamente. A toxina termoestável foi sintetizada por apenas 17 (12,1%) amostras. A presença de fatores de colonização manose resistente foi observada em 87 (62,1%) amostras analisadas e 41 (29,3%) amostras expressaram fímbria tipo 1.
Palavras-chave: Escherichia coli, leitões, diarréia, patogenicidade.
ABSTRACT
Escherichia coli is the most prevalent infectious agent in cases of diarrhoea in piglets. The virulence of this microrganism is determined by several determinants, specially fimbriae and toxins. In the present work, we analized 140 E. coli strains obtained from 82 suckling piglets and from 58 piglets with post-wening diarrhoea in farms located in the southwestern region of the State of Paraná, Brazil. The detection of the thermostable toxin was performed through the infant mouse test and colicin detection using the agar overlay method. The colonization factors were assayed through the microagglutination test, using different sources of red blood cells. In 37 (26,4%) and 26 (18,6%) of the samples, the presence of hemolisin and colicinogenic activity were detected, respectively. Thermostable enterotoxin was produced by 17 (12,1%) of the samples. Mannose resistant fimbriae was detected in 87 (62,1%) of the samples and 41 (29,3%) of the samples expressed type 1 fimbriae.
Key-words: Escherichia coli, piglets, diarrhoea, pathogenicity.
1Med. Vet., Dr. - Pesquisador doDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina, Caixa postal 6001, CEP: 86.051-970, Londrina - PR, Brasil. E-mail: bgbrito@zipmail.com.br *Autor para correspondência;
2Bióloga, Dra. – Pesquisadora do Laboratório Ecolvet – Análises Microbiológicas, Ambientais e Veterinárias. Rua Quatá, 78, 86.062580. Londrina -PR, Brasil;
3Estagiária de Iniciação Científica - Acadêmica do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Londrina, Caixa postal 6001, CEP: 86.051-970, Londrina - PR, Brasil;
4Med. Vet., Dra. – Docente do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina, Caixa postal 6001, CEP: 86.051-970, Londrina - PR, Brasil.
INTRODUÇÃO
A colibacilose é uma das principais causas de diarréia dos leitões em granjas do Sudoeste do Paraná (BRITO et al., 1995). A patogenicidade da E. coli está relacionada à sua capacidade de colonizar o epitélio intestinal, através de antígenos de superfície, de es-trutura protéica, denominados fímbrias.
A expressão de determinadas fímbrias é influ-enciada pelas condições do crescimento “ in vitro” como o pH, a osmolaridade do meio, a aeração e a temperatura de cultivo (GAASTRA e GRAAF, 1982; ARCHER, 1996). Na detecção de fímbrias tem sido utilizados testes que avaliam a expressão fenotípica: hemaglutinação, hidrofobicidade, adesão celular, sorológicos (DE GRAFF e MOOI, 1986; VAN LOOSDRECHT et al, 1987; QADRI et al., 1994) e características genotípicas: hibridização de colônias com sondas e PCR (DAIGLE et al., 1994; SHIN et al., 1994). O teste de hemaglutinação tem sido utilizado como método de triagem de expressão de fímbrias (EVANS et al., 1979; BRITO et al., 2000).
Baseado na atividade hemaglutinante, as fím-brias de E. coli foram classificadas em três categori-as: fímbrias não hemaglutinantes, como exemplo a fímbria 987P; fímbrias que têm a sua aglutinação com eritrócitos inibida pela D-manose, designadas manose-sensíveis (HAMS) ou fímbrias tipo 1 e as fím-brias que não tem a hemaglutinação inibida pela manose, chamadas manose-resistente (HAMR) (MORRIS, 1983).
As fímbrias HAMR compreendem um grupo heterogêneo de estruturas bacterianas que se ligam a carbohidratos, com exceção a D-manose, presen-tes nos receptores dos eritrócitos de diferenpresen-tes espé-cies animais (MORRIS, 1983; QADRI et al., 1994). As cepas produtoras de fímbrias manose resistente a 37
°
C, deixam de expressar esta característica quan-do são cultivadas a 18°
C (JONES e RUTTER, 1974). Em suínos as fímbrias F4, F5, F6, F18a,b, F18a,c, F41, F42 e F165 estão relacionadas a distúrbios entéricos (POST et al., 2000).Outros fatores de virulência importantes na patogenia das enfermidades são as toxinas de E.coli, as quais classificam-se em endotoxinas e exotoxinas, e têm papel importante nas diarréias dos suínos (GYLES, 1992). Smith e Halls (1967) foram os pri-meiros a identificar uma proteína secretada pela bac-téria, responsável pelo acúmulo de líquido em testes realizados em alças de intestino de coelho e suíno. Além disso, demonstraram que esta toxina mantinha sua atividade após aquecimento a 100 ºC durante 30 minutos, denominada de toxina termoestável (STa).
A hemolisina é freqüente em amostras de E. coli uropatogênicas (UPEC) e enterohemorrágicas (EHEC) isoladas de infecções urinárias e patologias entéricas dos suínos (BRITO et al., 1999; KUHNERT et al., 2000). A E. coli pode produzir quatro tipos dis-tintos de hemolisinas, as quais são classificadas con-forme a fase de crescimento em que sintetizam a
hemolisina e o tipo de eritrócito que lisam. A alfa-hemolisina é produzida na fase logarítima, a beta-hemolisina, gama-hemolisina e enterohemolisina são produzidas na fase estacionária. A beta-hemolisina provoca a hemólise de eritrócitos de cavalo, coelho e ovelha, enquanto que a gama-hemolisina e a enterohemolisina lisam eritrócitos de cavalo-ovelha e ovelha-coelho, respectivamente (LUDWIG e GOEBEL, 1997).
Bacteriocinas são toxinas protéicas que têm ação letal sobre espécies de bactérias sensíveis. As bacteriocinas produzidas pela E. coli são denomina-das de colicinas, a produção de colicina V mediada pelo plasmidio Col V é uma característica associada com a invasão e patogenicidade da E. coli (VIDOTTO et al., 1990).
Com base na literatura, este trabalho teve por objetivo determinar a ocorrência de fímbrias hemaglutinantes, produção de colicina, hemolisinas e enterotoxina termoestável em amostras de E. coli isoladas de leitões com diarréia.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas 140 cepas de E. coli, sendo isoladas 82 amostras das fezes de leitões lactentes e 58 amostras de leitões recém-desmamados com di-arréia, em vinte e uma granjas de ciclo completo, cri-ados em sistema confinado, que não utilizavam me-dicamentos na ração contra diarréia e localizadas na região Sudoeste do Paraná.
O isolamento das cepas de E. coli foi realizado em placas de ágar sangue ovino a 5% e ágar Mac Conkey, após incubação durante 24 horas a 37°C. Foram utilizadas as placas que tiveram apenas cres-cimento de colônias com características de E. coli. Estas colônias foram submetidas à coloração de Gram, identificadas, segundo as recomendações de Edward e Ewing (1972), e estocadas em meio Dorset à temperatura ambiente, por no máximo seis meses, até a realização das demais análises.
A produção de STa foi obtida conforme descri-to por Dean et al. (1972). Cepas de E. coli foram semeadas em meio Caye e incubadas durante 18 horas a 37 °C sob agitação constante. A extração foi realizada pela centrifugação do meio de cultivo a 6000 x g, durante 30 minutos. O sobrenadante obtido foi inoculado por via intragástrica em camundongos neonatos. Os animais foram mantidos numa estufa a 35 °C por 3 horas, e após os animais foram sacrifica-dos com éter sulfúrico, necropsiasacrifica-dos e os intestinos e carcaças pesados separadamente para determina-ção da reladetermina-ção peso dos intestinos / peso das carca-ças. Os valores iguais ou superiores a 0,085 foram considerados como positivos para STa (GIANELLA, 1976).
A produção de colicina pelas cepas foi avalia-da conforme descrito por Vidotto et al. (1990). As amostras de E. coli foram inicialmente cultivadas em meio Caldo Soja Tripticaseína (TSB) a 37 °C durante
18 horas e posteriormente semeadas em vários pon-tos de uma placa contendo meio Agar Soja Tripticaseína (TSA) e incubadas nas mesmas condi-ções. Após o período de incubação, as placas foram invertidas e 1 ml de clorofórmio foi adicionado nas respectivas tampas. Estas foram mantidas fechadas por aproximadamente 30 minutos, resultando em morte das bactérias. Decorrido este período, as pla-cas foram mantidas entreabertas a 37 °C durante 60 minutos para evaporação do clorofórmio residual. Em cada uma das placas foram vertidos 3 ml de TSA semi-sólido a aproximadamente 45 °C, adicionado de 100 µl da amostra indicadora de E. coli 2280 (linhagem padrão sensível à colicina), a qual foi cultivada previ-amente em meio TSB durante 18 horas a 37 °C. As placas foram incubadas a 37 °C durante 18 horas e a produção de bacteriocina visualizada pela presença de halo de inibição de crescimento da bactéria indicadora.
As fímbrias foram pesquisadas através da téc-nica de microhemaglutinação, com suspensões a 1% de hemácias de suíno, galinha e cavalo em presença de D-manose 1%. As suspensões de hemácias foram obtidas de sangue fresco, após coleta em solução anticoagulante de Alsever e lavagens em solução de PBS, pH 7,3. As culturas bacterianas foram cresci-das em meio CFA, meio mínimo sólido, ágar glicosado tamponado e meio Minca a 37 °C durante 24 horas.
O teste foi realizado em microplaca de base em “U” de 96 escavações, em triplicata para cada cepa e du-rante todo o procedimento a placa permaneceu em banho de gelo. Foram realizadas diluições seriadas em PBS a partir de 1:2 até 1:256, em volumes de 50µl, da suspensão bacteriana padronizada na esca-la 4 de McFaresca-land. Nas cepas cultivadas em meio CFA, meio mínimo sólido, ágar glicosado tamponado e meio Minca, foram adicionados 50µL das suspen-sões de hemácias a 1% de suíno, galinha e cavalo respectivamente. O resultado foi observado pela hemaglutinação após 2 horas sob refrigeração. As seguintes cepas padrões foram utilizadas como con-troles positivo para cada fímbria : BK95 (K88), BK99 (K99), 567/7 (F42) e BK99 (fímbria tipo 1); e a amos-tra K12-711 foi utilizada como controle negativo dos testes (Tabela 1). As cepas com título igual ou superi-or a 1:4 fsuperi-oram consideradas hemaglutinantes (BRITO et al., 2000).
A atividade hemolítica foi verificada conforme descrito por Ludwig e Goebel (1997). As amostras foram cultivadas em ágar sangue com suplementação de 10% de sangue de cavalo, ovelha, coelho e incu-badas a 37ºC por 24 horas. Cinco horas após o início da incubação foi realizada uma leitura inicial, com reavaliações após 24 e 48 horas do início da incuba-ção. Foram consideradas positivas as amostras ca-pazes de induzir halo de hemólise.
TABELA 1 – Meios de cultivo, hemácias e cepas padrões usadas nos testes de microhemaglutinação.
Meio de cultivo Hemácias Cepa padrão positiva Cepa padrão negativa Caldo Soja Tripticaseína Cobaia BK99 (fímbria tipo 1)2 K12-7111
Ágar glicosado tamponado Ovino BK95 (K88)3 K12-7111
Meio mínimo sólido Galinha 567/7 (F42)4 K12-7111
Meio Minca Eqüino BK99 (K99)2 K12-7111
1BRITO et al. (1999); 2BRITO et al. (2001b); 3BRITO et al. (2001a); 4LEITE et al. (1988).
A análise estatística dos resultados de ocor-rência de enterotoxina termoestável, colicina, colicina V e hemolisinas, nas amostras de E. coli isoladas de leitões na fase de amamentação e após desmama-dos, foi realizada através do teste de c2, teste exato
de Fisher, com nível de significância de P£0.01 e ra-zão de chances (Odds ration - OR), através do Pro-grama Estatístico EpiInfo, Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, EUA.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados de hemaglutinação em presença e ausência de D-manose estão apresentados na Tabe-la 2. Das 140 cepas de E. coli estudadas, 42 (30%) não apresentaram atividade hemaglutinante. Dados similares foram encontrados por Ueti (1997) que ob-servou que 32,2% das cepas de E. coli isoladas de
leitões com diarréia, não hemaglutinaram hemácias humanas, bovinas, ovinas, suínas, de galinha e de cobaia.
A presença de fímbria tipo 1 foi detectada em 41 (29,3%) das cepas de E. coli, sendo que 18 (12,9%) expressaram apenas este tipo de fímbria. Estes re-sultados estão de acordo com os obtidos por Martins et al. (2000) e demonstram que a fímbria tipo 1 é relativamente freqüente na população de cepas de E. coli que causam diarréia em leitões.
Oitenta e sete (62,1%) cepas aglutinaram hemácias de diversas espécies em presença de D-manose. Estes resultados assemelham-se aos encon-trados por Brito et al. (2000) que detectaram em 67,3% das cepas de E. coli de leitões diarréicos de granjas do Paraná, atividade HAMR às hemácias de ovino, cobaia, eqüino e galinha. A freqüência de HAMR en-tre as cepas estudadas neste trabalho, na presença de hemácias de ovino, cobaia, eqüino e galinha, foi de 58,8%; 32,3%; 5,6% e 4,9% respectivamente.
A presença de fímbria tipo 1 e a atividade HAMR foi verificada em 23 (16,4%) cepas, sendo 21 (15%) para hemácias de ovino, 1 (0,7%) para hemácias de eqüino e 1 (0,7%) para a associação de ovino e galinha.
A enterotoxina termoestável foi sintetizada por 17 (12,1%) amostras, resultados são similares aos obtidos por Abuxapqui et al. (1997) e Martins et al.
(2000) que verificaram a presença desta toxina em 11,76% e 14,28% das amostras estudadas, respecti-vamente. A produção de colicina foi observada em 26 (18,6%) das amostras e apenas em 6 (3,6%) amos-tras verificou-se produção de colicina V, resultados diversos daqueles obtidos por Martins et al. (2000) que verificaram a produção de colicinas e colicina V em 54,28% e 24,2% respectivamente.
TABELA 2 – Atividade hemaglutinante de cepas de E. coli isoladas de leitões com diarréia em granjas do Sudoeste do Paraná.
Perfil de hemaglutinação Número de amostras Percentagem
Não hemaglutinantes 42 30,0 Hemaglutinação manose-sensível 41 29,3 Hemaglutinação manose-resistente 87 62,1 Ovino 46 32,9 Ovino.galinha 3 2,1 Galinha 2 1,4 Cobaia.ovino 15 21,0 Cobaia.ovino.galinha 2 1,4 Cobaia 9 6,4 Eqüino.ovino 1 0,7 Eqüino 2 1,4 Eqüino.cobaia 4 2,8 Eqüino.cobaia.ovino 1 0,7
Das 140 amostras de E. coli estudadas 37 (26,4%) sintetizaram alfa-hemolisina, sendo 7 (8,5%) amostras provenientes de leitões lactentes e 30 (51,7%) de animais recém-desmamados, conforme exposto na Tabela 3. Nenhuma amostra analisada produziu beta, gama e enterohemolisina. A partir da análise de OR verificou-se que as amostras de E. coli isoladas de leitões desmamados apresentaram 11,48 vezes mais chances de terem atividade hemolítica do que as amostras de E. coli isoladas de leitões lactentes. A presença deste fenótipo como marcador de clones virulentos tem sido utilizada por vários
au-tores como indicador de patogenicidade (VAN DEN BOSCH et al., 1982; BEUTIN, 1991), entretanto os resultados obtidos neste trabalho indicam que esta característica de virulência somente pode ser consi-derada nas amostras originárias de leitões desma-mados, uma vez que é baixa a ocorrência desta ca-racterística nas amostras de E. coli isoladas de lei-tões lactentes. Baseado nestes resultados pode-se concluir que a produção ou não de hemolisinas, não representa, quando isolado, critério seguro na seleção de cepas virulentas de E. coli, causadoras de diarréia entre leitões lactentes.
TABELA 3 – Percentagem de amostras de E. coli isoladas de leitões lactentes e desmamados com diarréia que apresentaram atividade hemolítica, colicinogênica e produção de enterotoxina temoestável.
Fase de criação Hemolisina Colicina Colicina V Enterotoxina
Termoestável Lactentes 7/82 (8,5%)a 17/82 (20,7%) a 4/82 (4,9%)a 10/82 (12,2%) a Desmamados 30/58 (51,7%)b* 9/58 (15,5%) a 2/58 (2,4%) a 7/58 (12,1%) a Total 37/140 (26,4%) 26/140 (18,6%) 6/140 (4,3%) 17/140 (12,1%)
1Valores com letras diferentes na mesma coluna, diferem (P<0,01), no teste de χ2.
CONCLUSÕES
A maioria das cepas estudadas neste trabalho apresentam atividade hemaglutinante, demonstran-do que este teste pode ser utilizademonstran-do como métodemonstran-do de triagem de patogenicidade microbiana.
Nas cepas avaliadas neste estudo, observa-se alto percentual hemaglutinante a diversos eritrócitos em presença de D-manose, sendo que o eritrócito de ovino promoveu maior hemaglutinação.
A produção de hemolisina foi mais freqüente em amostras de E. coli isoladas de leitões desmama-dos.
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Recebido em 12/12/2001 Aceito em 10/12/2003 VAN DEN BOSCH, J.F.; EMÖDY, L. KÉTYI, I. Virulence of haemolytic strains of Escherichia coli in various annimal models. FEMS Microbiology Letter, v.13, p.427-430, 1982.
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