UNIV E R S ID A D E F E D E R A L C E NT R O D E C IÊNC IA S E
P R O G R A MA D E P ÓS
D is s ertaçã o de Mes tra do
Um es tu
do
para titulaçã o q uimilumines c ente em
flux o-batelad a c o m d etec çã o
F lav iano C arv alho L eite
UNIV E R S ID A D E F E D E R A L D A P A R A ÍB A C E NT R O D E C IÊNC IA S E X A T A S E D A NA T UR E Z AD E P A R T A ME NT O D E Q UÍMIC A
P R O G R A MA D E P ÓS -G R A D U A T Ã O E M Q UÍMIC A
D is s ertaçã o de Mes tra do
para titulaçã o q uimilumines c ente em
batelad a c o m d etec çã o po r imag em d i
F lav iano C arv alho L eite
J oã o P es s o a, P B - B ras il A g o s to/2016
D A P A R A ÍB A X A T A S E D A NA T UR E Z A
G R A D U A T Ã O E M Q UÍMIC A
D is s ertaçã o de Mes tra do
para titulaçã o q uimilumines c ente em
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P R O G R A MA D E P ÓS
D is s ertaçã o de Mes tra do
Um es tud o pa
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Orientad or: P ro f. D r. E d v an C irino d a S il v a
* B ols is ta do C o ns elho Nac io nal de D es en v olv imento C ientífic o e T ec nológ ic o
UNIV E R S ID A D E F E D E R A L D A P A R A ÍB A C E NT R O D E C IÊNC IA S E X A T A S E D A NA T UR E Z A
D E P A R T A ME NT O D E Q UÍMIC A
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F lav iano C arv alho L eite
Orientad or: P ro f. D r. E d v an C irino d a S il v a
* B ols is ta do C o ns elho Nac io nal de D es en v olv imento C ientífic o e
J oã o P es s o a, P B - B ras il A g o s to/2016
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F lav iano C arv alho L eite
*
D edic o es s e trabalho ao meu
P ai J oã o e minha mã e Maria que me trouxeram
A g radec imentos
Inic ialmente, agrade ço a D eus por exis tir nes s a vida.
A toda minha família, pela c ons tante pres ença, c arinho e apoio.
A minha es pos a L iana pe la honra de viver ao s eu lado, pela força e apoio.
A o P rofes s or E dvan C irino da S ilva pela orienta çã o, de dicaçã o, c onfiança em minha pes s oa, contribuições ac adê micas , c ientífic as , s uges tões e s eus ens inamentos .
A os P rofes s ores L uc iano F arias , R ic ardo A lexandre e Marcelo B a tis ta, por ac eitar partic ipar da banc a P ré-D efes a e D efes a de dis s ertaçã o e pe las s uges tões que e nriquec eram es te trabalho.
A o profes s or Mário C és ar Ugulino de A raújo pelo acolhimento, por c eder as ins talações do L A QA , pe la oportunidade de trabalho, pe lo aprendiz ado
profis s ional e pelos momentos de de s c ontraçã o.
A todos os profes s ores que c ontribuíram c om meu aprendiz ado des de a gradua çã o até o pres ente momento.
A W ellington da S ilva L yra pe lo c onhec imento e contribuiçã o ne s s e traba lho.
A os amigos R enato A lan, S téfa ni Iury, P edro L emos , pelas contribuições na parte experimenta l, c ientífic as e pela amiz ade.
A os amigos do L A QA , F átima S anc hes , S ofa c les , A line S antos , C leis on E loi, L uc as A lfredo, K ely, D aniel J ac ks on, T aynna K evla, Marc elo S ilva, J ona than P ádua, A mália, Ivs on, Mauríc io Monteiro, W illy C as tro, W elma V ilar, Urijata n, Maria Ivanda, A denilton C amilo, D ayvis on R ibeiro, K arla D aniele, Mayara, J anete C lair, Hebert, F ranc is c o C unha , J ulys P ablo, E duardo L ima, O s mundo,Ina kã B arreto, Márc io R ennan, por toda amiz ade e momentos de des contraçã o. P e la ajuda c om emprés timo de alguns utens ílios de trabalho. A todos os demais membros do L A Q A , pela amiz ade, c onvivê nc ia e bons momentos .
A o P rograma de P ós -G raduaçã o do D Q/C C E N/UF P B .
A Univers idade F ederal da P araíba .
A os func ionários do D Q/C C E N/UF P B .
S umá
rio
L is ta de F ig uras . . . v iii
L is ta de T abelas . . . x
L is ta de S ig las e A breviaturas . . . x i R es umo . . . x ii A bs tract . . . x iii C apítulo 1 . . . 1
1. Introduçã o . . . 1
1.1 C arac teriz açã o da problemátic a e a propos ta de s oluçã o ... 2
1.2 O bjetivo( s ) ... 4
1.2.1 G eral ... 4
1.2.2 E s pec ífic os ... 4
1.3 Q uimilumines c ê nc ia em química analític a ... 5
1.3.2 Us o do luminol, intens ificadores do s inal quimilumines c ente e mec anis mo ... 7 1.3.1 Mec anis mo envolvendo íons halog enetos na reaçã o do luminol/H2O2 ... 11
1.3.3 F undamentos das titulações quimilumines c entes ... 12 1.4 Imag em D ig ital ... 16 1.4.1 Modelo de c or R G B ... 17 1.5 A res pos ta analític a em termos da norma │ │ ʋ│ │ ... 19 1.5.1 Us o de imag em digital em quimilumines c ênc ia ... 19 1.6 S is temas de anális e em fluxo ... 23 1.6.1 O A nalis ador em F luxo-B atelada ... 25
C apítulo 2 . . . 2 7 2. Material e Métodos . . . 2 7
2.6 P roc edimento analític o ... 37 2.7 V alidaçã o da titulaçã o quimilumines c ente propos ta ... 43
C apítulo 3 . . . 4 8 3. R es ultados e D is c us s ã o . . . 4 8
3.1 E s tudo da vaz ã o ... 49 3.2 Inves tig açã o do progres s o do s inal quimilumines c ente ... 50 3.3 P erfil da c urva de titulaçã o quimilumines c ente propos ta ... 51 3.4 T itulaçã o Q L -B ID aplic ada à determinaçã o de F e
2+
em s ulfato ferros o ... 53
C apítulo 4 . . . 5 6 4. C onc lus ã o . . . 5 6
4.1 C onc lus ã o ... 57 4.2 P ropos tas de trabalhos em c ontinuaçã o ... 58
L is ta de F ig uras
F ig ura 1.1 – P ublic ações analític as da reaçã o quimilumines c ente divididas pelas téc nic as utiliz adas des de 1945 até julho de 2016. ... 3
F ig ura 1.2 – R eações quimilumines c entes direta ( i) e indireta ( ii) – ( A ) prec urs or quimilumines c ente e ( B) O xidante. A daptado de: G arc ia, et al., ( 2001). ... 6
F ig ura 1.3 – Mec anís mo propos to por A lbertin e c olaboradores ( 1998) para a reaçã o Q L do luminol\H2O2 em meio alc alino e na pres ença do íon de um metal de trans içã o ( M
n+
) . ... 9
F ig ura 1.4 – D iag rama de energ ia dos es tados do endoperóxido ( a) 3-aminoftalato em ( c), relac ionando a energ ia do s is tema c om o rompimento da lig açã o dos átomos de oxig ê nio no intermediário eletronic amente exc itado ( b) adaptado de: ( F E R R E IR A e R O S S I, 2002) . . 10
F ig ura 1.5 – Mec anis mo do s is tema quimilumines c ente M-L uminol-H2O2-B r
-. A daptado de: C HA NG e P A T T E R S O N, ( 1980) . ... 13
F ig ura 1.6 – P erfis teoric amente es perados para as c urvas de titulaçã o Q L - IQ L( a):
Intens idade quimilumines c ente g erada pelo analito, IQ L( t) : Intens idade quimilumines c ente
g erada pelo titulante e IQ L( p) : Intens idade quimilumines c ente g erada pelo produto. ... 16
F ig ura 1.7– R epres entaçã o g eométric a do modelo R G B . ... 18
F ig ura 1.8 – E s quema de c las s ificaçã o das téc nc ias de anális e em fluxo de ac ordo c om a IUP A C . Inc lus ã o do F B A na c las s ific açã o dos métodos de anális e em fluxo (IUP A C ). A daptado de: D INIZ , P aulo H.G .D . et al., ( 2012). ... 24
F ig ura 2.1 – F otog rafia da dis pos içã o fís ic a dos c omponentes do s istema de titulaçã o Q L -B ID ( a) bomba peris táltic a, (b) mic roc omputador, ( c) válvulas s olenoides , (d) ac ionador de válvulas c om interfac e arduino, ( e) c aixa para is olamento da luz externa, (f) webc am, (g) c â mara de mis tura e ( h) ag itador mag nétic o. ... 30
F ig ura 2.2– Interface do prog rama de c ontrole do s is tema fluxo-batelada quimilumines c ente. ... 31
F ig ura 2.3 – Imag em de uma válvula s olenoide de trê s vias utiliz ada no s is tema automátic o titulométrico Q L propos to. ... 32
F ig ura 2.4 – D iag rama es quemátic o do ac ionador de válvulas s olenoides . C om repres entaçã o dos pinos P 0 – P 6 de s aída da interfac e A rduino e G ND-P 8 é o aterramento do c irc uito. A daptado da dis s ertaçã o de: A NDR A D E , R . A . N. ( 2011) . ... 33
F ig ura 2.5 – W ebc am us ada c omo fotodetec tor do s is tema Q L -BID propos to. ... 33
F ig ura 2.6 – Ilus traçã o das dimens ões da c â mara de mis tura c om 7 c anais para entrada de fluidos e 1 c anal para des c arte. ( E ) entrada e ( D) s aída de fluido. ... 34
F ig ura 2.7 – D iag rama do s is tema fluxo-batelada para titulaçã o Q L -B ID em modo de es pera. (— ) L inhas de fluxo vaz ia ou es tac ionada e ( ▬) preenc hida em fluxo; (- - -) L inha de fluxo alternativa; ( B P ) B omba peris táltic a; ( V n) n-és ima válvula s olenoide; ( C M) C â mara de mistura. ... 38
peris táltic a; ( V n) n-és ima válvula s olenoide; (C M) C â mara de mis tura; ( C 1) c anal da amos tra... 39
F ig ura 2.9 – E tapa de anális e 2-ii do proc edimento de tituçã o Q L : (— ) L inha de fluxo va z ia ou es tac ionada; ( - - -) L inhas de fluxo alternativa e ( ▬) preenc hida em fluxo; ( B P ) B omba peris táltic a; ( V n) n-és ima válvula s olenoide; (C M) C â mara de mis tura; ( C 2) c anal do titulante. ... 39
F ig ura 2.10 – E tapa de anális e 2-iii do proc edimento de tituçã o Q L : ( — ) L inha de fluxo va z ia ou es tac ionada; ( - - -) L inhas de fluxo alternativa e ( ▬) preenc hida em fluxo; ( B P ) B omba peris táltic a; (V n) n-és ima válvula s olenoide; ( C M) C â mara de mis tura; ( C 3) c anal da água. 40
F ig ura 2.11 – E tapa de anális e 2-iv do proc edimento de tituçã o Q L : (— ) L inha de fluxo va z ia ou es tac ionada; ( - - -) L inhas de fluxo alternativa e ( ▬) preenc hida em fluxo; ( B P ) B omba peris táltic a; (V n) n-és ima válvula s olenoide; (C M) C â mara de mis tura; (A M) ag itador mag nétic o; (W C ) webc am; ( B M) barra mag nétic a; (C 4) c anal do luminol + peróxido. ... 41
F ig ura 2.12 – E tapa de anális e 2-v do proc edimento de tituçã o Q L : (— ) L inha de fluxo va z ia ou es tac ionada; ( - - -) L inhas de fluxo alternativa e ( ▬) preenc hida em fluxo; ( B P ) B omba peris táltic a; ( V n) n-és ima válvula s olenoide; (C M) C â mara de mis tura; ( C 5) c anal de retirada dos res íduos . ... 41
F ig ura 2.13 – D iag rama de tempos do analis ador em fluxo para todas medidas . ... 42
F ig ura 3.1 – C urvas do es tudo da vaz ã o para os c anais de bombeamento de c ada válvula s olenoide. ... 49
F ig ura 3.2 – P rog res s o do s inal Q L em termos de ( a) imag ens dig itais c apturadas no s is tema fluxo-batelada e ( b) variaçã o temporal do s inal nos c anais R , G e B . ... 50
L is ta de T abelas
T abela 3.1 – R es ultados das anális es , em triplic ata, de dez amos tras de xarope s ulfato ferros o us ando o método propos to (T itulaçã o Q L -B ID ) e o de referênc ia. ... 54
L is ta de S ig las e A brev iaturas
C C D – C harg e-c oupled de vices (dis pos itivo de c arga ac oplada)
Q L – Quimilumines cê nc ia
Q L -B ID – Q uimilumines c ê nc ia bas eada em imagem digital
C MY K – C iano, Mag enta, Y e llow and B lac k (c iano, magenta, amarelo e preto)
E L IS A – E nz yme-L inked Immunos orbent A s s ay (E ns aio de imunoabs orçã o enz imátic a)
F B A – F low-batc h analyz er (ana lis ador em fluxo-batelada )
F IA – F low injec tion analyze r (ana lis ador por injeçã o em fluxo)
HS L – Hue, S aturation and L uminos ity (matiz , s aturaçã o e luminos idade)
HS V – Hue, S aturation and V alue (matiz , s aturaçã o e valor)
IUP A C – International Union of P ure and A pplied C hemis try ( Uniã o Inte rnac ional de Químic a P ura e A plic ada)
MF A – Multic ommutation in flow analys er (analis ador em fluxo multic omutado)
MS F A – Monos eg mente d flow analys er (analis ador em fluxo monos egmentado)
R B P – R etinol B inding P rote in (P roteínas ligada s ao retinol)
R G B – R ed, G reen and blue (vermelho, verde e az ul)
S F A – S eg mente d flow ana lys er (analis ador em fluxo s egmentado)
R es umo
Um es tudo para titulaçã o quimilumines c ente e m flux o-batelada c om d etec çã o por imag em dig ital
A utor:F laviano C arvalho L eite
O rie ntad or:E dvan C irino da S ilva
A es c as s ez de métodos quimilumines c entes (Q L ) bas eados em imagem digital e analis adores em fluxo é uma motivaçã o para novos es tudos , es pe c ialmente quando nã o é enc ontrado na literatura nenhum artigo envolvendo titulaçã o Q L com imagem digital. Nes te traba lho, des envolveu-s e o es tudo de uma nova metodologia
para titulaçã o quimilumines cente ba s eada em imagem digital (Q L -B ID ) c ujo potenc ial ana lític o foi avaliado na determinaçã o de F e
2+
em xarope de s ulfato ferros o us ando
um analis ador automátic o em fluxo-batelada. D enominada titulaçã o Q L -B ID , es s e método utiliz a o próprio ana lito (F e
2+
) c omo c atalis ador na reaçã o de oxidaçã o do luminol/H2O2 em meio bás ic o na pres ença do intens ific ador brometo. A pós a adiçã o
de c ada inc remento do titulante (K MnO4) à amos tra em meio ác ido, parte do F e 2+
é c onvertido para F e
3+
e o remanes cente c ontribui para o s inal Q L que dec res ce linearmente com a conc entraçã o do F e
2+
. Q uando todo F e
2+
for c onvertido para F e
3+
, o ponto final da titulaçã o é ating ido e o s inal Q L pe rmanec e cons tante ao nível da radiaçã o de fundo c om a adiçã o do titulante em exc es s o. A aquis içã o das imagens foi realiz ada por uma webc am ac oplada s obre a câ mara de mis tura do s is tema fluxo-batelada. D a imagem obtida ante s e após cada adiçã o do titulante foram extraídos os valores de R , G e B us ados para c alc ular a res pos ta analític a, a qual é definida pela norma de um vetor no es paço tridimens ional R G B . O valor da norma varia linearmente c om a conc entraçã o do analito, s endo utiliz ada na c ons truçã o da c urva de titulaçã o em que o ponto fina l é obtido pela extrapolaçã o e inters eçã o dos dois s egmentos de reta. Os res ultados da s titulaçõe s de 10 (dez ) amos tras de xarope foram comparados c om os obtidos pe lo método es pec trofotométrico bas eado em c urva analític a. A plicando-s e o tes te-t emparelhado, nã o s e obs erva nenhuma diferença s is temática, es tatis tic amente s ignificativa, entre ambos os res ultados ao
nível de 95% de c onfiança. O s is tema QL -B ID apres entou uma frequê nc ia analític a de 18 titulações por hora e c ons umiu 0,2 mL de luminol e 2,4 mL de amos tra por
titulaçã o ou anális e. A s s im, s eu de s empenho pode s er melhorado quando implementa da uma otimiz açã o.
A bs trac t
A s tud y for c hemilumines c ent titration in flow -batc h w ith detec tion b y dig ital imag e
A uthor: F laviano C arvalho L eite
S uperv is or: E dvan C irino da S ilva
T he s c arc ity of c hemilumes cent (C L ) methods bas ed on digital image and flow ana lyz ers is motivation for novel s tudies , es pec ially when it is not found in literature any paper involving C L titration with digital image. In this work, it is develope d the s tudy of a novel methodolog y for digital image-bas ed quimilumines c ent (D IB -C L ) titration whos e analytic al potential is evaluated in determination of F e
2+
in ferrous s ulfate s yrupe us ing a flow-batc h automatic analyz er. T ermed D IB -C L titration, this method employs the own analyte (F e
2+
) a s c atalys t of the oxidation reac tion of luminol/H2O2 in alkaline medium and pres enc e of bromide enhanc ement. A fter a
inc rement of titrant (K MnO4) to be added to s ample in ac id medium, a part of F e 2+
is oxidiz ed to F e
3+
and ramaining c ontributes to generate the C L s ignal that de c reas es linearly with the F e
2+
c onc entration. W hen the oxidation of F e
2+
is c ompleted, the endpoint of titration is attained and the C L s igna l remained cons tant at the level of bac kground radiation with the addition of titrant in exc es s . Images ac quis ition is performed by us ing a webc am c oupled to the mixing cha mber of flow-batc h s ys tem. F rom image obtained before and after ea ch addition of titrant were extrac te d the R , G , and B values us ed in order to c alc ulate the ana lytic al repons e, whic h is defined by
vec tor norm in R G B tri-dimentional s pac e. T his norm value s are linearly relate d to the ana lyte c onc entration, being employed for building of titration c urve where the end point is found by inte rs ec tion of the two extrapolated s traight s egments . B y applying the paired t-tes t, titration res ults of ten s amples of s yrupe were c ompa red with thos e
obtaine d by a es pec trophotometric method bas ed on ana lytic al c urve. No s ys tematic s tatis tic differenc e has been obs erved be tween the both res ults at the 95% c onfidenc e level. D IB -C L s ys tem pres ented a analytic al freque nc y of 18 titrations h
-1
and c ons umes 0.2 mL of luminol and 2.4 mL of s ample per titration or analys is . T hus , its pe rformanc e c an be improved by implementing a optimiz ation.
C apítulo 1
1.1 C arac teriz açã o d a problemátic a e a p ropos ta de s o luçã o
A quimilumines cê nc ia (QL ) tem de s pertado, nas últimas década s , um interes s e cada vez maior dos químic os analític os c omo téc nic a es pec troanalític a promis s ora para o des envolvimento de métodos quantitativos (L A R A , F . J . et al., 2016) . E s s a motivaçã o pode s er imputada à s s ua s c aracterís tic as vantajos as , quais s ejam: ampla faixa linea r de res pos ta, alta s ens ibilidade, baixos limites de detec çã o e ins trumentaçã o s imples e de baixo c us to (S K O O G , D . A . et a l., 2009).
A s aplic ações ana lític as da quimilumines c ê nc ia tê m penetrado em outras áreas , tais c omo, ambienta l, medic ina, biologia, farmac olog ia, de ntre outras (B A E Y E NS , W .R .G . et al., 1998) . A lém dis s o, es s a téc nic a pode s er us ada para determinar vários tipos de analitos (inorgâ nic os , orgâ nic os , bioquímic os , etc ) em níveis de traço, s endo a quimilumine s c ê nc ia muito us ada para avaliar a qua lidade da água , alimentos , s uplementos e medic amentos (B OW IE , A . R . et al., 1996). E s s a téc nic a tê m s ido também us ada para o des envolvimento de métodos s ens íveis bas eando-s e na dis tribuiçã o es pac ial da luz emitida a partir de uma amos tra problema (R IC H, E . S . et a l., 1981).
A literatura reporta divers os reagentes quimilumines c entes apropriados para
implementa çã o de métodos de anális e qua ntitativa, porém obs erva-s e o us o predominante do luminol (5-amino2,3-diidroftalaz ina-1,4-diona) : S A NT O S , R .M.S . et al. (1993). E s s e fa to pode s er ates tado na revis ã o de F E R R E IR A e R O S S I (2002), na qual é des tac ado o c res c imento exponenc ial (na déc ada de 1990) do número de traba lhos envolvendo o us o do luminol. D es de entã o, o us o des s e rea gente tem s ido impuls iona do para a anális e quantitativa envolvendo divers as aplicaçõe s analític as (K HA N, P . et al, 2014).
A pe s ar do us o c res cente da quimilumines c ê nc ia para fins ana lític os e do emprego do luminol como s eu reag ente, a literatura reporta pouc os traba lhos s obre métodos ba s eados em titulaçã o como pode s er obs ervado na F ig ura1.1. O gráfic o reflete o res ultado do levantamento bibliográfic o, realiz ado no banc o de dados eletrônic os da W E B OF S C IE NC E , tal c omo realiz ado por F E R R E IR A e R O S S I em 2002. E m ambas as pe s quis as bibliográfc as , nã o foi enc ontrado ne nhum trabalho envolvendo titulaçã o quimilumines c ente e o us o de imagem digital, c omo s is tema de detec çã o.
F ig ura 1.1 – P ublic ações analític as da reaçã o quimilumines c ente divididas pelas téc nicas
utiliz adas des de 1945 até julho de 2016.
No c ontexto da problemátic a ac ima, ins ere-s e também a importâ nc ia datitulaçã o para determinações quimilumines c entes em virtude de s uas vanta gens c omparadas à calibraçã o, es pe c ialmente no toc ante à exatidã o. De fato, a titulaçã o proporc iona c omumente um res ultado melhor devido à es pe c ificidade que pode s er
es ta belec ida na reaçã o entre o analito e titulante (S K O OG , D . A . et al., 2009) . E s s e as pe c to é partic ularmente interes s ante nas dete rminações quilumines c entes , pois os
ins trumentos tipic amente us ados nã o inc orporam s eletor de radiaçã o. A s s im, a medida do s inal Q L do analito torna-s e muito s us c eptível à inte rferê nc ia de radiaçã o
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
t
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envolvendo outra(s ) es péc ie(s ) c onc omitante(s ) na matriz prejudic ando a exatidã o do método.
D iante des s a problemátic a propõe-s e, ne s te trabalho, o us o c ombinado da quimilumines cê nc ia do luminol c om a anális e em fluxo-batelada para realiz açã o de um es tudo objetivando o des envolvimento de uma titulaçã o QL -B ID automatiz ada. P ara avaliar o potenc ial do método propos to, elegeu-s e inic ialmente a determinçã o de F e
2+
em amos tras de xarope de s ulfato ferros o. P ara es s e propós ito, foram es ta belec idos os objetivos des c ritos na S eçã o 1.2 apres entada a s eguir.
1.2 O bjetiv o(s ) 1.2.1 G eral
D es envolver o es tudo de um novo método de titulaçã o quimilumines c ente em fluxo-batelada bas eado em imagem digital c apturada com uma webc am.
1.2.2 E s pec ífic o s
Monta r um s is tema automátic o de anális e em fluxo-bate lada ac oplado a uma webc am pa ra realiz ar as titulações quimilumine s c entes ;
Implementar um programa pa ra c ontrole do s is tema e aquis içã o das imag ens digitais ;
R elac ionar as imag ens c om a c onc entraçã o do analito F e
2+
na amos tra (us ando um mode lo matemático bas eado no s is tema R G B ) c om o intuito de definir e tes tar a res pos ta analític a adotada para c ons truçã o da s c urvas de titulaçã o;
A plicar e avaliar o pote nc ial analític o da titulaçã o Q L -B ID em uma aplic açã o envolvendo a determinaçã o de F e
2+
em amos tras de xarope s ulfato ferros o;
1.3 Q uimilumines c ê nc ia em químic a analític a 1.3.1 F undamentos
S eg undo D OD E IG NE , C . et al. (2000), a lumines cê nc ia é um termo de us o
geral pa ra de s igna r a emis s ã o de radiaçã o eletromagnétic a (R E M) por moléculas de um c ompos to ou um material qua ndo retornam de um es tado eletrônic o exc itado para o fundamental. A s eg uir enc ontram-s e c itados divers os tipos de lumines c ê nc ia.
V F otolumines cê nc ia ( F luores c ê nc ia e F os fores c ê nc ia); V R adiolumines c ê nc ia;
V T ribolumines c ê nc ia; V T ermolumines cê nc ia; V E letrolumines cê nc ia; V Magnetolumines cê nc ia; V S onolumines c ê nc ia; V B iolumines c ê nc ia; V Q uimilumine s cê nc ia.
Q uimilumine s cê nc ia é um tipo de lumines c ê nc ia em que o fenômeno de emis s ã o de R E M origina-s e de reações químic as nã o acompa nhadas pela emis s ã o de c alor, as quais podem oc orrer em s is temas s ólido, líquido ou gas os o. A radiaçã o quimilumines cente (Q L ) abrange a faixa do es pe c tro eletromagnético que s e es tende do ultravioleta ao infravermelho (A L B E R T IN et al., 1998) .
A s reações QL podem oc orrer s egundo dois mecanis mos bás icos : (i) reaçã o direta e (ii) rea çã o indireta, c onforme es quematiz ado na F ig ura 1.2. No mec anis mo direto (i) a R E M é emitida diretamente pelo produto exc itado P * formado pela reaçã o
F ig ura 1.2– R eações quimilumines c entes direta ( i) e indireta ( ii) – ( A ) prec urs or quimilumines c ente e ( B) O xidante. A daptado de: G arc ia, et al., ( 2001).
A inte ns idade de radiaçã o Q L , IQ L (fótons emitidos por s eg undo), depende da
efic iê nc ia quâ ntica de quimilumines cê nc ia, ΦQ L (fótons emitidos por moléc ula que
reagiu) , e da veloc idade da reaçã o químic a (dC /dT ). O termo ΦQL é res ultado do
produto da eficiê nc ia quâ ntica de exc itaçã o, ΦE X (es tado exc itado por moléc ulas que
reagiram) pela efic iê nc ia quâ ntic a de emis s ã o, ΦE M (fótons por moléc ulas levadas ao
es ta do exc itado). E s s as relações podem s er repres entadas , matematicamente, pela
E quaçã o (1.1). E m geral, os s is temas quimilumines c ente s que apres entam valores de ΦQ L c ompreendidos entre 0,01 e 0,2 s ã o os mais úteis em anális es qua ntitativas
(S K O O G , D . A . et a l., 2009).
IQ L=ΦQ L dC /dt =ΦE X ΦE M dC /dt (1.1)
E m a nális es quimilumines c entes , divers os fatores experimentais influenc iam o fenômeno e a magnitude do s ina l (IQ L), entre os quais des ta c am-s e (S K O O G , D . A .
áC onc entraçã o dos rea gentes - o s inal Q L apres enta, geralmente, uma relaçã o
linear para uma ampla faixa de c onc entraçã o do analito, podendo alc ançar várias déc adas ou ordens de magnitude;
ápH do meio reac ional - o pH do meio reac ional influenc ia s ignific ativamente na
intens idade da emis s ã o de luz em reações ba s eadas no s is tema luminol/H2O2.
S eg undo a literatura (C HA NG e P A T T E R S O N, 1980), es s as reaçõe s reque rem um meio alc alino c om pH us ualmente na faixa de 10,1 a 11,1, para gerar o â nion peróxido res pons ável por oxida r a molécula do luminol;
áV olume de amos tra - a quantidade de fótons emitidos no fenômeno depende
também do volume de amos tra us ada pa ra as medida s do s inal Q L . D es de que a quantidade do luminol dis ponível s eja es tequiometric amente s ufic iente para reaçã o, a intens ida de é diretamente proporc iona l ao volume da amos tra s e os demais fatores forem mantidos c ons tantes ;
áV eloc ida de de reaçã o - a reaçã o pode s e mos trar rápida ou lenta, dependendo do
ana lito, tipo de moléc ula emis s ora e das condições em que es s as reações oc orrem. P ara reduz ir o tempo das anális es químic as , deve-s e bus car a implementaçã o de reaçõe s de c inétic a rápida;
áHomog ene izaçã o - a homog ene iz açã o dos c ompone ntes (reagentes , amos tra,
titulante, etc ) de vem s er reprodutíveis pa ra toda s as medidas do s inal Q L .
A c or e a intens idade de radiaçã o QL s ã o também influenc iada s pela veloc idade de adiçã o dos reag entes , ordem de entrada, es tabilidade dos reagentes polaridade do s olvente, temperatura e por outros proc es s os fís ic os s ec undários .
S e todos os fatores mais relevante s forem controlados e mantidos c ons tante s ,
a intens idade do s inal Q L pode rá s er relac ionada linearmente c om a conc entraçã o do analito proporc ionando a bas e para anális e qua ntitativa.
1.3.2 Us o do luminol, intens ific ad ores do s inal quimilumines c ente e mec a nis mo
dec orrer do s éc ulo X X divers os autores propus eram outros c aminhos mec anís tic os para a oxidaçã o do luminol. T odavia, ainda nã o foi reportado na literatura um mec anis mo que c ompreenda os mes mos intermediários e etapas da reaçã o bas eada no s is tema luminol/H2O2. Na última déc ada , os as pe ctos termodinâ mic os e
c inéticos des s a rea çã o ainda tê m s ido es tudados com expans ã o para outros s is temas Q L . (F E R R E IR A e R O S S I, 2002) .
A propos ta mec anís tic a de A L B E R T IN F ig ura 1.3, o luminol (a) em meio alc alino (O H
-) forma a diaz oquinona (b-) na pres ença do c atalis ador redox M
n+
. A diaz oquinona (b) reage c om o â nion de H2O2 para formar o intermediário
NH NH NH 2 O O
+ 2OH
-
+ 2M
n+ N N NH 2 O O
+ 2M
(n-1)+
+ 2H
2 O H 2 O 2
+ OH
-H
2
O + O OH
-N N NH 2 O O
+
O OH- N N NH 2 O -O -O O N 2 H + NH 2 O O O -O
-*
NH 2 O O O -O -hv N N NH 2 O O+
O OH- N N NH 2 O -O -O O N 2 H + NH 2 O O O -O
-(b) (c ) (e)
(b) (c) (d) (e)
(b) (a)
F ig ura 1.3 – Mec anís mo propos to por A lbertin e c olaboradores ( 1998) para a reaçã o Q L do luminol\H2O2 em meio alc alino e na pres ença do íon de um metal de trans içã o ( M
n+
) .
produto exc itado. P ara oc orrê nc ia do produto exc itado, provavelmente, nã o haveria tempo o s ufic iente pa ra os e létrons s e dis tribuírem entre os novos orbitais , mantendo o novo orbital L UMO ainda preenc hido. B as eado ne s s a ideia, s upõe-s e que es s as rotas de formaçã o do produto exc itado e nã o exc itado pode alcançar, em algum ins tante, ene rgias s emelhantes . Nes s a ocas iã o haveria um “cruz amento” entre es s es c aminhos , levando à formaçã o do produto exc itado, c onforme ilus trado no diag rama da F ig ura 1.4.
N H 2 O O O -O -N N N H 2 O -O -O O
*
NH 2 O O O -O -hv E n e r g i a Interconversã o de estados (i) (ii) (iii)Distâ ncia entre os átomos na ligaçã o O O
E ntre os reag entes quimilumines c entes mais es tuda dos , o luminol é utiliz ado na maioria das aplicaçõe s anailític as (F E R R E IR A e R O S S I, 2002). O us o de s s e reagente é preponderante nas determinaçõe s de cátions de metais de trans içã o, ta is c omo F e
2+
, C r
3+
, A l
3+
, C o
2+
, P b
2+
, C e
4+
, Ni
2+
, Mn
2+
, C u
2+
, C d
2+
, entre outros (R OB A R D S , et al 1992) . E s s es íons proporc ionam uma expres s iva açã o c atalític a c ontribuindo pa ra aumentar a veloc idade da reaçã o para baixos níveis de c onc entrações des s es c átions , as s im c omo para elevar a s ens ibilidade das medidas . No c ontexto da quimilumines cênc ia, um reag ente intens ificador pode s er definido c omo uma es péc ie reagente que contribui para aumentar a magnitude do s inal Q L . A lite ratura reporta o us o de B r
-, C l
-, F
e S O4
2-, s endo o íon brometo o reagente que mais c ontribui para aumentar a inte ns idade do s inal (B A US E , D .E . e P A T T E R S O N, H. H., 1979) . E s s es autores obs ervaram que as s oluções c onc entradas de s ais inorgâ nic os , em partic ular os íons halogenetos , podem c aus ar um aumento da intens ida de. Um tes te mos trou que a conc entraçã o de 0,5 mol L
-1
de uma s oluçã o de B r
origina um aumento de oito vez es na intens idade do s inal para o C r
3+
, em relaçã o ao s ina l s em a pres ença do brometo. Nes s es es tudos obs ervou-s e que o s inal QL manteve-s e proporc ional à conc entraçã o do C r
3+
, qua ndo a mes ma quantidade de B r
era adic ionada à s s oluções de calibraçã o.
A literatura reporta ainda es tudos mais apurados c om os íons halogenetos , em es pec ial com o B r
e C l
-, qua ndo us ados c omo intens ificadores do s inal QL para vários íons metálicos . C HA NG e P A T T E R S O N (1980) es tudaram a influê nc ia de B r
-e C l
na intens ificaçã o promovida por traços de íons de metais c atalis adores da reaçã o do luminol/H2O2. O s íons metálic os inves tigados foram: C r
3+
, F e
2+
e C o
2+
. O s
res ultados mos traram que na pres ença de 0,3 mol L
-1
de B r
-, teve aumento na intens idade do s inal de: 6,2 vez es para o C r
3+
, 3,5 para F e
2+
e 2, 5 para C o
2+
c om o pH optimiz ado para anális e.
1.3.1 Mec anis mo e nv olv en do íons halog enetos na reaçã o do luminol/H2O2
Na F ig ura 1.5 é es quematiz ado o mec anis mo envolvendo íons halogenetos , propos to por C HA NG e P A T T E R S O N em 1980, para as reações quimilumines c entes bas eada s no s is tema luminol/H2O2. D e ac ordo c om es s e mecanis mo, o íon brometo
C HA NG e P A T T E R S O N (1980) de c laram que exis tem pelo menos duas vias nes s e mec anis mo, quais s ejam: uma nã o quimilumines cente (a) e a outra quimilumines cente (b). O s íons halogene tos aumentam a efic iê nc ia quâ ntic a mediante aumento da c ons tante (K2) para a via Q L . A c liva gem c ata lític a de um
c omplexo molecular ativado, que produz íons aminoftalato exc itados , é propos to c omo pas s o fundamental do mec anis mo. O s íons aminoftalato mais es timulados s ã o produz idos por unidade de tempo na pres ença dos íons haletos para obter um s inal Q L reforçado. A propos ta de mec anis mo é apres entada na F ig ura 1.5.
A lém do reforço na intens idade da radiaçã o Q L , a manutençã o da relaçã o linear entre o s ina l e a c onc entraçã o do íon de vários metais "c atalis adores " torna o us o do intens ific ador útil nas determinaçõe s ou es pec iações em níveis de traço de divers os íons metálicos no meio ambiente.
1.3.3 F undame ntos das titulaçõ es quimilumines c e ntes
A titulaçã o é um proces s o de anális e químic a qua ntitativa que s e bas eia na reaçã o entre o analito e um reag ente padroniz ado (o titulante), o qua l é adic ionado até que a c ondiçã o de equivalê nc ia químic a s eja alcançada. C om o intuito de enc ontrar o ponto final da titulaçã o, as s oc iado ao ponto de equivalê nc ia químic a, utiliz a-s e um meio de dete c çã o apropriado.
Na titulaçã o c lás s ic a (volumétric a ou gravimétrica) , a che gada ao ponto final é as s ina lada pela mudança de c or de uma s ubs tâ nc ia indic adora adic ionada à
amos tra (S K O O G , D . A . et al., 2014). P or outro lado, nas titulações ins trumenta is o us o de indic ador é normalmente dis pens ado. Nes te c as o, o ponto final é obtido por
N -NH N H 2 O O N H 2 O O O -O
-+
+
N NM + H
2
O
2
M H
2
O
2 M O2
H O H -M O -O
M O
2
L uminol C omplexo
K
1
O H
-D ecompos içã o
N N N H 2 O -O -O O Br -K 2
*
NH 2 O O O -O -hv i) F ormaçã o do c omplexo Metal-peróxidoii) F ormaçã o do c omplexo Metal-O
2
-L uminol
iii) V ia de de compos içã o (a) e via de formaçã o de íons aminoftalatos exc itados ( b)
A tuaçã o do íon Haleto
M O
2
L uminol C omplexo
+
L uminol O H -M O
2
H
( b )
( a)
F ig ura 1.5 – Mec anis mo do s is tema quimilumines c ente M-L uminol-H2O2-B r
D e ac ordo c om o tipo de reaçã o envolvida, as titulações podem s er c las s ific adas em: titulações de ne utraliz açã o, prec ipitaçã o, oxidaçã o-reduçã o ou de c omplexaçã o. No c ontexto da anális e ins trumental, as titulaçõe s também podem s er c las s ific adas conforme a téc nica utiliz ada, ou s eja, em quimilumines c entes , es pe c trofotométric as , potenc iométric as , coulométricas , etc . P ara s ervir c omo princ ípio de uma titulaçã o (clás s ic a ou ins trumental), a reaçã o nec es s ita s atis faz er os requis itos bás ic os :
á es tequiometria de finida e c onhe c ida (es s enc ial para a equivalê nc ia químic a e realiz açã o do cálc ulo es tequiométric o da c onc entraçã o do ana lito);
á meio apropriado para detec çã o do ponto fina l (indic ador nas titulações c lás s ic as e uma c urva bas eada no s inal analític o medido nas titulaçõe s ins trumentais );
á completa (titulaçã o c lás s ic a ou ins trumental em s is temas e m batelada );
á s eletividade , ou s eja, reaçã o es pe cífic a entre o titulante e o a nalito.
No c as o das titulações químilumines c entes , as medidas podem s er us adas
para c ons truir uma c urva de titulaçã o relac ionando o s inal Q L vers us volume do titulante adic ionado. P ara is s o, faz -s e nec es s ário que determinada e s péc ie envolvida na reaçã o de titulaçã o direta ou indireta (ver es quema da F ig ura 1.2) promova a emis s ã o ou inibiçã o de radiaçã o Q L . A lternativamente, pode -s e us ar um indic ador que promova variações na emis s ã o de luz , pos s ibilitando as s im a geraçã o de um s inal Q L que poderá s er us ado para a c ons truçã o da c urva de titulaçã o (S K O O G , D . A . et al., 2009).
E m tes e, as curvas de titulaçã o quimilumines c ente devem c ompreende r dua s regiõe s linea res c om inc linações dis tintas , s endo uma antes e a outra após do ponto final. A extrapolaçã o dos dois s egmentos de reta fornec e, na abs c is s a c orres pondente ao ponto de inters eçã o, o volume do ponto final (Vp.f.) da titulaçã o.
A F ig ura 1.6 mos tra os pos s íveis perfis que , teoric amente, as curvas de titulaçã o Q L podem as s umir:
(i) ne s s a c urva, o ana lito(a) e o titulante(t) emitem radiaçã o Q L . O ana lito pos s ui intens idade de emis s ã o (IQ L) s upe rior ao do titulante em exc es s o a pós o ponto
no gráfic o. No ponto de equivalê nc ia temos o c ons umo por completo do ana lito e do titulante , forma-s e o produto(p) da reaçã o que nã o emitem radiaçã o Q L .
(ii) Nes s e gráfic o o analito(a) produz a radiaçã o Q L obs ervada, enquanto que o produto(p) e titulante(t) nã o gera nenhuma luz . No de c orrer do cons umo do ana lito( a) teremos a inibiçã o da radiaçã o Q L até o s eu des aparec imento.
(iii) Nes s e gráfic o de titulaçã o temos uma reta linea r c res c ente antes do ponto final, derivado do s inal Q L gerado a partir da formaçã o de um produto que gera luz . D epois do ponto final, tem-s e uma reta c ons ta nte devido ao produto da reaçã o permanecer c ons tante ao adic iona r mais titulante, pois todo o ana lito já foi cons umido. O analito e o titulante nã o emitem radiaçã o.
(iv) O produto(p) c oncebe radiaçã o Q L maior que a radiaçã o gerada pelo o titulante( t), enqua nto que o analito( a) nã o contribui pa ra formaçã o de luz .
(v) O titulante(t) s e apres enta c om intens idade Q L maior do que a inte ns idade gerada pelo produto(p), des te modo, é evidenc iado pelas diferentes inc linações das retas no gráfic o. O analito( a) nã o emite radiaçã o Q L .
(vi) Nes s a c urva de titulaçã o, analito( a) e produto(p) nã o emitem radiaçã o QL , s omente o exc es s o de titulante( t) c ontribui para o fenômeno, c omo é mos trado após o ponto de equivalê nc ia.
D epe ndendo da reaçã o da titulaçã o, o s egmento de reta antes ou de pois do ponto final pode s er as c endente ou des cendente. Nes te tarbalho, o s is tema de res pos ta quimilumines c ente previs to é o perfil de c urva (ii) que depende, as s im c omo todos os outros , dos fatores que afetam a IQ L vis tos na s eçã o 1.3.1 e dos
F ig ura 1.6 – P erfis teoric amente es perados para as c urvas de titulaçã o Q L - IQ L( a) :
Intens idade quimilumines c ente g erada pelo analito, IQ L( t) : Intens idade quimilumines c ente
g erada pelo titulante e IQ L( p) : Intens idade quimilumines c ente g erada pelo produto.
1.4 Ima g em D ig ital
Imag em é a reproduçã o de um objeto real ou c ena pres ervada em um meio (G E L A D I e G R A HN, 1996). Nes te â mbito s ã o exemplos de imagens : uma pintura, es c ultura, uma fotografia, etc . Na c iê nc ia, as imagens s ã o produz idas objetivando expres s ar algumas propriedades objetivas do objeto ou c ena de interes s e (G E L A D I e G R A HN, 1996).
P ara que as imag ens analóg ic as pos s am s er utiliz adas em dis pos itivos eletrônic os , é prec is o que as mes mas s ejam trans formadas de uma imagem c ontínua para uma es trutura quadric ulada. C ada quadrado des ta es trutura rec ebe o nome de pixel. A imgem res ultante de s te proc es s o é chamado entã o de imagem
digital e podem ter duas ou trê s dimens õe s (2D ou 3D ).
O número de pixels de que é formada a imagem digital define a s ua res oluçã o
pixel numa imagem digital podem ter vários valores dependendo da área de
aplic açã o. P or exemplo: para imagens fotográfic as s ã o utiliz ados valores inteiros de 0 a 255.
P ara a utiliz açã o de imag ens digitais em problemas analític os , o valor de intens idade do pixel deve es tar relac ionado c om algum modelo de c or. T odo modelo c or de cor tem como finalidade princ ipal es pec ificar as c ores de algum modo padroniz ado e de aceitaçã o geral. E m linha s gerais , um modelo de c or é uma es pe c ific açã o de um s is tema de c oorde nada s tridimens ionais e um s ubes paço dentro des s e s is tema onde cada c or é repres entada por um único ponto (G O NZ A L E S e W OO DS , 2000).
Na atualidade a maioria dos modelos de cor es tã o orientados à hardwares (monitores c oloridos e impres s oras ) ou aplicaçã o na manipulaçã o de c ores (c riaçã o de gráfic os de c ores para animaçã o).
P ara hardwares os mais us ados s ã o o R G B (para monitores c oloridos e c â meras de vídeo a c ores ), o C MY (para impres s oras c oloridas ) e o Y IQ (para trans mis s ã o de T V c olorida) .
Na manipulaçã o de imagens c oloridas os mode los mais utiliz ados s ã o o HS I e o HS V . J á pa ra o proc es s amento de imagens s ã o o R G B , o Y IQ e o HS I (G O NZ A L E S e W OO DS , 2000).
1.4.1 Modelo de c or R G B
O princ ípio de perc epçã o de cores pelo olho humano é a bas e do mode lo de
c or R G B . O método de interpretaçã o da cor us ado pelos dis pos itivos é bas eado diretamente na res pos ta do olho humano aos es tímulos das luz es vermelha, verde e az ul. E s te modelo de c or é us ado pelos fa bric antes de es c â ne res a cores e monitores .
A mis tura das c ores dominantes (primárias ), em diferente s c ombinações e níveis variados de intens idade pode s imular todas as c ores exis te ntes no es pec tro da regiã o do vis ível. S e a luz refletida c ontém a máxima intens idade das luz es vermelha , verde e az ul, o olho perc ebe o branc o, e s e nã o exis te luz , é pe rcebido o preto (B E R NS , 2000) .
F ig ura 1.7– R epres entaçã o g eométric a do modelo R G B .
Nes te c ubo, c ada eixo repres enta a c ontribuiçã o de uma c or primária c om intens idades variando na faixa 0 – 255 (8 bits ) na formaçã o das demais c ores , ou s eja, c om 256 níveis de intens idade totaliz ando 16,7 milhões de c ores . C ada par de eixos gera um plano em que s ã o repres entada s as cores s ec undárias (c ontribuiçã o eqüitativa de dua s c ores primárias ) no vértic e de c ada plano. A inters eçã o dos trê s planos define a c or preta (nã o há c ontribuiçã o de nenhuma das cores primárias ), já a c or branc a fic a no vertic e opos to a origem do c ubo (mis tura eqüitativa das trê s c ores primárias c om a intens idade máxima) . A diagonal princ ipal des te c ubo repres enta a es c ala de c inz a.
1.5 A res pos ta analític a em termos da norma │ │ ʋ│ │
E m algebra linea r a dis tâ nc ia euc lidiana é a dis tâ nc ia entre dois pontos e pode s er des c rita c omo um vetor no es paço tridimens ional. O comprimento des s e vetor é c hamado de norma. No es paço vetorial R G B pode mos des c rever c ada c or por meio de um vetor pos içã o, cuja norma pode s er c alc ulada pela dis tâ nc ia euc lidiana no es paço cúbic o pela E qua çã o 1.2.
││ʋ││=√ + + (1.2)
P ortanto, podemos expres s ar um valor extraído matemátic amente a pa rtir de uma área s elec ionada na imag em digital em termos da norma do vetor │ │ ʋ│ │ e que pode s er us ado para gerar a c urva analític a e titulaçã o, onde as s ume uma relaçã o linear entre a res pos ta analític a e a c onc entraçã o do analito pa ra es timar a c onc entraçã o do ana lito em amos tras de interes s e ( L Y R A , W .S . et al., 2011) .
││ʋ││= + C (1.3)
A E quaçã o 1.3 des c reve uma relaçã o linear entre a norma do vetor e a c onc entraçã o do analito nas s oluções e amos tras . O nde K é o c oefic iente de proporc ionalidade que de pende do número de fótons que c hega ao de tec tor, da efic iê nc ia quâ ntica de quimilumines cê nc ia, da velocidade da reaçã o químic a e
demais fatores que afe tam a intens idade QL.. A norma do vetor V , ││ʋ││, é o valor
adotado c omo res pos ta analític a empregada para a c ons truçã o das curvas de titulaçã o Q L , abordado ne s te trabalho.
1.5.1 Us o de imag em dig ital em quimilumines c ê nc ia
K A I, Mas aaki et al. (1999) des envolveram um novo método de c alibraçã o univariada e quimilumines cente pa ra quantific açã o de ác idos nuc léic os e ác ido des oxiguanilic o em membrana de nylon, utiliz ando imagem digital. Nes s e s is tema, o
s inal quimilumines cente foi intens ific ado aumentando a c onc entraçã o de ác ido des oxiguanilic o na moléc ula do analito.
enz imátic a, E L IS A (do ing lê s : enz yme-linked immunosorbent as s ay) foi de s enhado
c om ba s e nos antic orpos anti-R B P imobiliz ada por ads orçã o fís ic a s obre a s uperfic ie da s ílica dos c apilares de vidro pré tratados c om s ílic a c oloidal. O R B P ligado ao antic orpo (anti-R B P ) foi de tec tado us ando o anti-R B P -peroxidas e de rába no (anti-R B P -H(anti-R P )/(hors e-radis h peroxidas e, H(anti-R P ). O s is tema reac iona l que originou o s inal Q L foi o HR P -H2O2-luminol-4, iodofenol. A radiaçã o Q L originada a pa rtir dos
c apilares de vidro foi c apturada por uma c â mera digital c om s ens or C C D. E s s e es tudo tem aplic ações na quantificaçã o de R B P na urina, s oro e outros fluidos biológic os pa ra diagnós tic o c línic o.
MA R C H, C armen et al. (2005) es tudaram uma nova forma de c onta gem rápida de bac térias lac ta s deteriorantes da c erveja us ando ens aio imunoenz imático e quimilumines cê nc ia. O s pontos emis s ores de luz das c olônias de bac térias foram detectados e contadas us ando uma câ mera digital c om s ens or C C D. A quantific açã o foi realiz ada via re gres s ã o linear entre pontos QL e o número de mic roc olônias .
L UO , L irong et al. (2005) propus eram um método de c alibraçã o s imples , bas eado em imagem digital e quimilumines c ê nc ia, c om alta s ens ibilida de, pa ra determinaçã o do fator α rec ombinante de ne c ros e tumoral humana , us ando uma c â mera digital c om s ens or C C D. A s vantagens de s s e método s ã o: es pec ific idade
dos ens aios de imunoabs orçã o enz imática (E L IS A ), s ens ibilidade aumentada e de alto rendimento quâ ntic o.
R O D A , A ldo et al. (2005) c ombinaram bio e quimilumines c ê nc ia c om téc nic as de imagem para des envolver um método de calibraçã o c om alta s ens ibilidade us ando a c apa c idade dos dis pos itivos atua is de captura de imag em. F oram rea liz adas aplic açõe s na biotecnologia por imagem, para ens aios quimilumines centes in vitro e in vivo, c ontribuindo c om avanços na medic ina, na indús tria farmac ê utica e na biotec nologia. P or exemplo, a des coberta de novas prote ínas biolumines cente s para monitorar em tempo real, proces s os biológic os , patológ ic os e infe c ções .
apres entou vantagens c omo s ens ibilidade, es pe c ificidade dos ens aios de imunoa bs orçã o enz imátic a (E L IS A ) e us o do luminol como reagente quimilumines cente. S ob c ondiçõe s controlada s o aumento da inte ns idade Q L é proporc ional à c onc entraçã o de S E C 1 na faixa line ar de 8,0-125,0 ng mL
-1
c om limite de detec çã o de 0,5 ng mL
-1
. O método foi aplic ado, c om s uc es s o, à determinaçã o de S E C 1 em matriz es de leite e água.
K A NG , J ong hoon et al. (2006) us aram uma c â mera digital c om s ens or C C D para c apturar imag ens Q L -E MS A (do inglê s : elec trophoretic mobility s hift as s ay) pa ra c ons truir uma c urva analític a c om faixa de conc entraçã o 8-72 (fmol L
-1
), de modo a obter um modelo linear por regres s ã o pelo método dos minimos quadrados e quantific ar hepa rina biotinilada em amos tras biológ ic as .
C HO UHA N, R . S . et al. (2006) abordaram uma metodologia bas ea da na téc nic a de imunoquimilumines c ê nc ia e imag em digital para dete rminaçã o do pes tic ida metil paration via c urva ana lític a, c om L O Q até 10 ppt. O reag ente K3F e(C N)6 foi empregado c omo um intens ific ador do s inal quimilumines cente pa ra
obter as imagens . F oram otimiz ados diferente s parâ metros , ta is c omo, a c onc entraçã o de K3F e(C N)6, luminol, ureia, H2O2, o anticorpo, a s equê nc ia de
entrada dos rea gentes e tempo de reaçã o, a fim de obte r melhores s inais Q L .
L UO , L irong et al. (2007) imobiliz aram a proteína recombinante humana interleuc ina-6 (rHu IL -6, rec ombinant human interleukin-6) , em nanopartíc ulas de ouro pa ra c ons ervar s ua bioatividade. D epois quantific aram-na via c urva analític a
us ando a quimilumines c ê nc ia e de tec çã o us ando c â mera digital c om s ens or C C D . F oram examinados os efeitos da s c onc entrações de luminol, p-iodophenol (P IP ) ,
hemoglobina (Hb) e da s oluçã o tampã o no s ina l Q L . O método foi aplic ado, s atis fatoriamente, à determinaçã o de rHu IL -6 no s oro humano e a prec is ã o foi avaliada pelo tes te de rec uperaçã o.
W A NG , L i e Z HA NG , Z hujun propus eram, em 2007, um método de c alibraçã o quimilumines c ente s ens ível, rápido e de baixo c us to, c om ba s e em imagem digital, us ando a produçã o de mic roe s feras s intetiz adas por prec ipitaçã o polimérica, para qua ntificaçã o do trans res veratrol. A radiaçã o Q L produz ido foi detectada us ando uma c â mera digital c om s ens or C C D de alta res oluçã o.
X U, Hao et al. (2010) determinaram C o
2+
off-res s onâ nc ia, mis turada s na s oluçã o. E les c ompararam vários s is temas Q L , o luminol-H2O2, luminol-H2O2 + fluores c eína e luminol-H2O2+ fluores ceína + D B S pa ra
determinar C o
2+
. C ons tataram para c ada tipo de mis tura, a pres ença de intens idades e pic os de emis s õe s diferentes . Um es pe c tro tridimens ional é obtido a pa rtir de um s ens or linear C C D e us ado pa ra c ontruir as curvas a nalític as .
R O D A , A ldo et al. (2011) de s envolveram um dis pos itivo de anális e s imples e vers átil ba s eado em quimilumines c enc ia c om detec çã o por s ens or C C D . F oi aplic ado pa ra dete rminaçã o s imultâ nea de peroxida s e de rábano, fos fata s e alc alina e pa rvovírus B 19, via c urva analític a. O mes mo pode s er us ado pa ra diagnós tic o s imultâ ne o de diferentes tipos de marc adores biológic os , mes mo de naturez a diferente (enz imas e s ubs tratos , antigénos , anticorpos e ác idos nuc leic os ).
D ÍA Z , A urora N. et al. (2012) fiz eram us o da detec çã o quimilumines c ente bas eada em imagem digital para determinaçã o de triclopyr por c alibraçã o, empregando o método E L IS A (do ing lê s : E nz yme-L inked Immunos orbent A s s ay).
MIR A S O L I, Mara et al. (2012) projetaram um dis pos itivo portátil pa ra medidas no c ampo, alimentado c om bateria e equipado c om uma c â mera C C D pa ra obtençã o das imagens no método quimilumine s cente imunoens aio. O método faz us o de enz imas c omo agente cata lis ador no s is tema quimilumine s c ente L uminol-peróxido. F oi aplic ado pa ra quantific ar 2,4,6-trinitrotolueno (T NT ) em amos tras via c urva analític a. O btiveram um limite de detecçã o de 0,2 μg mL
−1
e rec uperações que variam de 97% a 111% na anális e de T NT em amos tras reais . S uas aplic açõe s
inc luem as área s de s eg urança, forens e e também pode s er us ado para obter os primeiros s inais de poluiçã o ambiental.
R O D A , A ldo et al. (2014) relata ram pela primeira vez o us o de um s martphone para anális e quimilumine s cente de fluidos biológic os envolvendo
reaçõe s enz imátic as es pe c ífic as . O ins trumento adaptado pa ra a anális e, pos s ui s ens or C MO S (s emic ondutor de óxido metálico c omplementar) e c aptura a s imagens digitais Q L c om res oluçã o de 8 megapixels ( 8MP ). A s imag ens foram proces s adas us ando o s oftware Imag eJ . O s dados res ultante s do tratamento foram us ados para gerar uma c urva analític a us ada para quantific ar o ana lito na amos tra. E les us aram dois s is temas : um biolumines c ente (3α -hidroxi es teróides de hidrogena s e c o-imobiliz adas c om luc iferas e bac teriana) para dete rminaçã o de ác idos biliares totais e outro quimilumines c ente (luminol-H2O2–peroxidas e de rábano) para determinar
D O NG G U, H. et al. ( 2015) us aram um método imunoe nsaio bas eado em quimilumines cê nc ia para detec çã o attomolar (10
-18
molar) de inte rleuc inas . E mpregou-s e um s ens or C MOS para detec çã o da radiaçã o quimilumine s cente por imagem digital. O método propos to apres entou um limite de detec çã o de 0,074 fg/mL e faixa dinâ mica de 1 fg/mL - 20 ng/mL para qua ntific açã o de interleuc ina-5 por c urva analític a. O mes mo foi aplic ado c om ê xito para de tec çã o s imultâ nea de quatro tipos diferentes de c itoc inas (inte rleuc ina-2, inte rleuc ina-4, interleuc ina-5 e interleuc ina-6) us ando o mes mo s is tema.
Z A NG HE R I, M. et al. (2015) des envolveram um bios s ens or bas eado no método imunoens aio pa ra analis e de c ortis ol s alivar, utiliz ando-s e um s martphone para aquis içã o e tratamento dos dados . A c â mara do s martphone é us ada c omo detector de luz , ou s eja, da c aptura das imagens . A quimilumines c ê nc ia é gerada us ando o c onjugado peroxidas e de c ortis ol pela adiçã o do s ubs trato luminol/pe róxido e qua ntific ada por c urva ana litic a. O método é s imples e rápido, c om limite de detec çã o de 0, 3 ng/mL e faixa linea r de 0,3-60 ng /mL .
Z E NG , Z . et al. (2016) des envolveram um protótipo de analis ador digital c ompac to c ontrolado por um s martphone para anális e mic rofluídic a. F oi des envolvido um aplic ativo (D IY -built) para c aptura e tratamento das imagens digitais c om c onfiguraçã o pe rs ona liz ada. A c â mara do s martphone é us ada c omo detector da radiaçã o quimilumine s cente. A c urva analític a s e mos trou linea r pa ra quantific açã o de H2O2 na faixa de 1 a 20 mM, us ando o s is tema quimilumines cente
luminol-peróxido- HR P .
1.6 S is temas d e anális e em flux o
E mbora s e tenha implementado muitas melhorias e modificaçõe s nos ana lis adores em fluxo, um des envolvimento c ons iderado muito promis s or tem s ido demons trado pelo analis ador em fluxo batelada (F B A ) por: D INIZ , P a ulo H.G .D . et al., (2012). A s ua evoluçã o tem s ido promovida , s obretudo, pelo us o de uma c â mara de mis tura que pos s ibilita, por exemplo, a implementaçã o de divers os proc edimentos ana lític os s em a neces s ida de de alteraçã o s ignific ativa na montagem do s is tema.
D e ac ordo c om publicaçã o mais rec ente da IUP A C , os ana lis adores em fluxo mais c onhec idos podem s er c las s ific ados c onfome es quema apres entado na F ig ura 1.8 reportado na referê nc ia (D INIZ , P aulo H.G .D . et al., 2012). C omo s e pode obs ervar, adotou-s e c omo c ritério princ ipal o tipo de amos tragem (contínua ou intermitente ) pa ra abrir a árvore de c las s ificaçã o da s anális es em fluxo. D e ac ordo c om es s e es quema, os analis adores em fluxo batelada (F B A ) s e c arac teriz am por apres entar amos trag em intermitente c om comutaçã o direta de amos tras . E s s as c arac te rís itc as motivaram o emprego des s e analis ador para implementa r o método de titulaçã o quimilumines c ente propos ta nes te trabalho.
1.6.1 O A nalis ador em F lux o -B atelad a
O primeiro ana lis ador des envolvido c om a denominaçã o F low-B atch A na lys er (F B A ) foi propos to em 1999 por HO NO R A T O e c olaboradores , c omo
alternativa aos métodos automátic os já exis te ntes . O F B A nes s e trabalho, foi aplic ado para implementa r uma titulaçã o ác ido-bas e automatiz ada para determinaçã o de ac idez de vinhos (HO NO R A T O , R .S . et al. 1999). A pós es s a aplic açã o, perc ebeu-se que es s e s is tema poderia s er us ado para por exemplo: pré-tratamento da amos tra, adiçã o de padrã o, anális e s c reening , extraçã o líquido-líquido, turbidimétria, anális e nefelométrica, quimilumines cente, fluores cente e fotométric a (D INIZ , P aulo H.G .D . et al., 2012) .
O us o do F B A tem permitido a implementaçã o de procedimentos analític os rápidos e prec is os , com menor quantidade de reag entes e amos tras , as s im como baixa geraçã o de res íduos . A demais , s ua utiliz açã o tem pos s ibilitado a manipulaçã o de s oluções tóxicas , ins táveis , etc , com mínima intervençã o do analis ta (A ND R A D E , S . I. E ., 2012).
A s eguir, s ã o apres entada s as princ ipais carac terís tic as dos analis adores em fluxo-batelada, MOR E IR A , P . N. T . (2009):
1. Us a-s e uma c â mara (para mis turas e/ou c omo reator pa ra reaçõe s químicas ) e válvulas s olenoides de trê s vias (para c omuta r os fluidos pa ra o interior da câ mara);
2. A s amos tras s ã o proc es s adas na c â mara de forma dis c reta, c arac terís tic a dos s is te mas e m batelada . A s s im, as medidas do s inal pode m s er realiz ada s c om alta s ens ibilidade. Is to oc orre de vido aos equilíbrios fís icos e químic os inerentes ao proc es s o analític o que podem s er
ating idos c om ou s em dis pers ã o e/ou diluiçã o da amos tra; 3. O s inal ana lítico pode s er medido em fluxo c ontínuo ou
em fluxo interrompido, na própria c â mara ou fora de la; 4. A c â mara pos s ibilita a imple mentaçã o de divers os
5. O s fluidos podem s er adic ionados na c â mara de mins tura de forma s imultâ ne a e/ou s equenc ial de ac ordo c om o proc edimento analítico. E x.: s oluçõe s de c alibraçã o, reag entes , amos tras , diluentes , tampõe s , etc ;
6. A pres enta g rande vers atilida de na implementaçã o de diferentes proces s os analíticos c om minima alteraçã o na c onfiguraçã o fís ica do s is tema. E s s as carac terís tic as c onferem um c aráter multitarefa ao s is tema, nec es s itando apena s de mudar ou adapatar o s oftware de c ontrole; 7. A lta flexibilidade na adaptaçã o de divers as metodolog ias ,
as quais podem s er modific adas de forma c onveniente para um de terminado tipo de anális e e/ou amos tra. P or exemplo, pode-s e trabalhar em uma fa ixa ampla de c onc entraçã o, muda ndo ape nas os pa râ metros ope rac iona is por meio do s eu s oftware de controle;
8. O c omputador c ontrola todo o s is te ma via s oftwares e drivers de c orrente elétrica que garantem uma prec is ã o dos tempos de ac ionamentos das válvulas s olenoide s . C ons equentemente, a adiçã o de volumes prec is os dos fuidos adic ionados na c â mara;
9. O ferec e fac ilida de para automatiz açã o de métodos c lás s ic os be m es tabelec idos quando c ompa rado a outros ana lis adores em fluxo;
10. P ode-s e aplicar c om/ou nenhum problema s ig nificativo na veloc idade analític a, proc edimentos que envolvam
reaçõe s de c inética lenta. A s s im c omo, os que s ã o feitos em analis adores monos eg mentados , que podem res idir
as reações químic as , por long os períodos de tempo. 11. O s analis adores fluxo-batelada reúnem as vantag ens
C apítulo 2
2. Material e
2.1 R eag entes , s oluções e amos tras
Inic ialmente, as vidrarias e rec ipiente s foram limpos empregando uma s oluçã o c om 10% de HNO3. T odas as s oluções para as anális es foram preparadas us ando
reagentes de grau analític o (P .A .) e ág ua s empre rec ém-des tilada e deioniz ada. P ara deioniz açã o, utiliz ou-s e um s is tema Milli-Q P lus ® (Millipore, B edford, MA ) para purificar a água c om res is tividade es pe c ífic a de 18,2 MΩ c m a 25 º C .
P repa rou-s e uma s oluçã o c om 1,0 x 10
-3
mol L
-1
de luminol em meio alc alino (5-amino-2,3-dihidroftalaz ina-1,4-diona, S igma 97% P .A .). A mes ma, foi preparada pela dis s oluçã o de 0,018 g do reagente em s oluçã o com 0,1 mol L
-1
de Hidróxido de s ódio (NaO H, S ynth 97% P .A .), à qual adicionou-s e 100 µ L de H2O2 (Merc k 30%
m/v) s endo o volume aferido para 100 mL . A s oluçã o res ultante foi mantida s ob refrigeraçã o a 5°C . D e ac ordo c om MO R E IR A , 2009, a s oluçã o de luminol deve s er prepa rada com antec edê nc ia mínima de 48 h para adquirir es tabilida de químic a.
Uma s oluçã o es toque c om 125 mg L
-1
de s ulfato ferros o (F eS O4.7H2O , V e tec
99% P .A .) foi preparada a partir da dis s oluçã o de 0,1558 g do s al em 2, 5 mL de H2S O4 para um volume de 250 mL ág ua deioniz ada. P artindo des s a s oluçã o,
prepa rou-s e as s oluções de c alibraçã o 2,0 ; 4,0 ; 6,0 ; 8,0 e 10,0 mg L
-1
de F e
2+
para o método de referê nc ia.
F oi preparada uma s oluçã o es toque com 1,0 x 10
-3
mol L
-1
de pe rmang anato de potás s io (K MnO4, V etec 99% P .A .) dis s olvendo 0,016 g des s e reag ente em água
deioniz ada e depois padroniz ado com oxalato de s ódio em s oluçã o ác ida de ac ordo
c om o manua l de s oluções (MOR IT A , et al, 2007) . A soluçã o res ultante foi diluída de modo a obter as c onc entrações de 1, 1 x 10
-5
mol L
-1
e 1, 6 x 10
-6
mol L
-1
em meio
ác ido.
P repa rou-s e uma s oluçã o 0,1 mol L
-1
de K B r, dis s olvendo-s e 12,0 g do reagente em ág ua deioniz ada até aferiçã o em balã o volumétric o de 1,0 L . A mes ma é us ada pa ra fa z er as diluições de toda s as amos tras de xarope.
Uma s oluçã o de hidróxido de s ódio 0,1 mol L
-1
foi preparada a partir da dis s oluçã o de 4,1 g de NaO H (S ynth 97% P .A .) em 1,0 L de água deioniz ada.
T ampã o us ado no método es pec trofotométric o UV -V IS . D is s olveu-s e 27, 22 g de acetato de s ódio (C H3C O O Na) em ág ua deioniz ada e o volume da s oluçã o foi
