iv
“O essencial é invisível aos olhos...”
Antoine de Saint-Exupéry
“Cada segundo é tempo para mudar tudo para sempre...”
Charles Chaplin
v
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente à Professora Dra. Maricilda pela confiança e pela oportunidade de desenvolver um projeto que para mim foi muito desafiador, e que me proporcionou um grande aprendizado. Não só acadêmico, mas sim um aprendizado de vida, trazido pela convivência com um ser humano tão bom e exemplar quanto a Professora!
À Professora Dra. Edi Sartorato, por ter me acolhido no Laboratório de Genética Humana e proporcionado toda a base de meus conhecimentos.
Ao Professor Dr. Celso Benedetti, por aceitar a co-orientação, pelas diversas dicas e conselhos valiosos para o andamento e conclusão do projeto. Agradeço também por ceder gentilmente a estrutura de seu laboratório no LNLS (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron) para a realização de diversos procedimentos.
À minha co-orientadora, Dra. Fernanda Caroline Soardi, ou simplesmente Fer II... foi com você que aprendi praticamente TUDO o que era necessário para realizar o projeto. Muito obrigado pela paciência, pelas cobranças na hora certa, pelo incentivo e por ser a profissional exemplar que você é!
Ao Renan, que em sua iniciação científica ajudou muito a concluir uma das etapas do projeto. Muito obrigado pelo companheirismo nos diversos problemas enfrentados! Desejo muito sucesso em sua nova jornada!
Aos amigos moradores e ex-moradores da Gloriosa República Subako de Kobra, por todos os momentos inesquecíveis desde 2003: Roger (Skol), Marcos (Borghe), Luís (Wando), Arian (Lemão), Pedro (Pepa), Gustavo (Amizade), Maurício (Cabelo), Portuga, Emerson (Creyto), Marcos (Toty), Guilherme (Kbça),Tiago (Padre), Marco Antônio (Remédio),
vi
Edson (Menga), Erich (Erich), Augusto (Kid), Norivaldo (Nori), Diogo (Revertério), Tiago (Banana), Adriano (Mandrake), Benito (Azeite), Lucas, Subakinho e Gorda.
Aos meus bons e velhos amigos de Sampa, cuja amizade de longa data faz muito parte de tudo o que sou hoje em dia: Daniel, Virgínia, Pablo, Paola, Rachel, Cláudio, Zahi-êni, Paolo, Luís e Bruno (in memorian).
À Dani... uma pessoa muito especial! Obrigado primeiramente pelo auxílio com a modelagem da proteína. Mas agradeço principalmente por ter me tornado uma pessoa melhor... e por ser tudo o que você é!
Aos meus primos, primas, tios e tias, espalhados por aí, obrigado por tantos momentos maravilhosos que só os momentos em família podem proporcionar.
Aos amigos e colegas da turma de Biologia 02N. Cada um tomou seus rumos, vejo alguns ainda de vez em quando, mas nunca vão deixar de ser especiais e parte das lembranças da melhor época de minha vida! Desejo muito sucesso pra todos vocês!
A todos os meus professores do curso de biologia e do mestrado, por terem construído os meus conhecimentos e minha paixão pela mais perfeita das ciências.
Às secretárias do CBMEG, as super-competentes e charmosas Sandra e Tânia! Obrigado pela ajuda em todos esses anos!
Aos demais funcionários do CBMEG, que estão ou já passaram por lá: Andressa, Andreza, Cidinha... e todos os outros!
Aos professores participantes da qualificação, pré-banca e banca, pela grande contribuição. Aos enfermeiros, médicos e estudantes envolvidos nesta pesquisa.
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Aos pacientes e famílias, sem os quais esse trabalho não poderia ser realizado. Permanece a esperança que um dia possamos fornecer-lhes respostas e soluções que amenizem as dificuldades que enfrentam.
Aos colegas e professores do CBMEG, muito obrigado pela amizade e “empréstimos”! Ao pessoal do Laboratório da Dra. Anete (Marcelo, Dilaine, Adriano, etc.), muito obrigado também pelas diversas dicas!
À impagável Madá... que tanta falta faz...
“Escolhe um trabalho de que gostes, e não terás que trabalhar nem um dia na tua vida.”, frase do pensador chinês Confúcio. Agradeço aos amigos que estão ou já passaram pelo Laboratório de Genética Humana, e tornaram esses anos de trabalho tão especiais, as tristezas e decepções menos amargas e as alegrias e realizações mais doces: primeiramente aos Bazukas (Paulo, Creito, Diego); Flávia Elfo, Ana Letícia, Flávia Flor, Daiane, Xuxa, Denise, Carol-PR, Priscila, Nathy Graviola, Mari Codorna, Carolzinha, Prizinha, Creuza, Creidy, Milena, Bruna, Vanzuda, Suelosa, Paula, Jéssica, Frau, Gilmar, Reginaldo, Renan, Victor, Rodrigo, Luiz Eduardo (Wando), Tércio, Eduardo (Fido), DaniBoy, Rock, FerI, Fer II, Fer III, Fer IV, Mara Guaraná, Luli, Débora, Helena, Cíntia, Ju Magal, Pri II, Renata, Vanessinha, Gleice, Carol Lincoln, Rose, Renata, Regiane, Dra. Juliana, Mariana, Thalita, Uiara, Marcinha, Fran, Carlinha, Tammy, Carla, Camila, Lucy... Provavelmente estou esquecendo alguns nomes, mas muito obrigado a todos pelos bons momentos e pela amizade!
Às agencias financiadoras CNPq e FAPESP.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento desta Tese.
viii
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus pais, José e Ana...
Por me darem a vida... me ensinarem a vivê-la com dignidade... iluminarem os
meus caminhos... pelo inexplicável amor!
Aos meus queridos avós, Irene e José Pereira (in memorian), e à
Tatá...
Pelo carinho e amor incondicionais... pelo grande exemplo que sempre foram
para mim... muito do que tem de bom em mim veio de vocês!
À Rachel...
ix
x
LISTA DE TABELAS ... XIII
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS ... XV
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ... XIX
RESUMO ... XXIII
ABSTRACT ... XXV
INTRODUÇÃO ... 27
1.DETERMINAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO SEXUAL ... 28
2.O GENE E A PROTEÍNA SRY ... 33
3.SRY E A COMPLEXIDADE DA DETERMINAÇÃO SEXUAL ... 37
4. DISGENESIA GONADAL 46,XY E SRY ... 42
5.REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE SRY ... 44
6.O FATOR DE TRANSCRIÇÃO SP1 ... 46
OBJETIVOS ... 49
1.OBJETIVOS GERAIS ... 50CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 51
1. CASUÍSTICA ... 52 2. MÉTODOS ... 562.1 Sequenciamento Do Gene SRY ... 56
2.1.1 Reação de Sequenciamento ... 56
2.1.2 Purificação da reação de sequenciamento ... 57
2.1.3 Sequenciamento da reação purificada ... 57
2.2 Expressão De Proteína Sry Mutante E Verificação De Sua Interação Com Dna Por Ensaio De Emsa ... 58
2.2.1 Amplificação e purificação dos genes SRY controle e mutante ... 58
2.2.2 Clonagem pGEM-T Easy ... 59
2.2.3 Preparo de células competentes DH5α para transformação química (PEG) ... 59
xi
2.2.5 Isolamento das colônias recombinantes e confirmação da clonagem dos insertos
... 62
2.2.6 Minipreparação dos plasmídios pGEM-T Easy recombinantes ... 63
2.2.7 Sequenciamento dos plasmídios extraídos ... 64
2.2.8 Digestão e subclonagem no vetor pET28a ... 65
2.2.9 Transformação da ligação fragmento SRY+ pET28a ... 67
2.2.10 Isolamento das colônias recombinantes e confirmação da clonagem dos insertos ... 67
2.2.11 Minipreparação dos plasmídios pET28a recombinantes e sequenciamento dos plasmídios extraídos ... 67
2.2.12 Transformação vetor pET28a recombinante na linhagem BL21DE3 ... 67
2.2.13 Isolamento das colônias recombinantes e confirmação dos insertos ... 68
2.2.14 Teste de expressão em pequena escala ... 68
2.2.15 Preparo das amostras e eletroforese SDS-PAGE ... 68
2.2.16 Teste de solubilidade da proteína SRY... 69
2.2.17 Extração da proteína SRY em larga escala ... 70
2.2.18 Purificação proteína SRY ... 71
2.2.19 Ensaio de EMSA ... 72
2.3 Estudo In Silico Da Proteína Sry Mutante E89k ... 75
2.4 Ensaio De Emsa Com Fator De Expressão Sp1 ... 76
2.4.1 Síntese dos oligonucleotídeos ... 76
2.4.2 Ligação das Sondas ... 77
2.4.3 Marcação das Sondas... 77
2.4.4 Purificação das sondas ... 78
2.4.5 Preparação do gel... 78
2.4.6 Reação de Ligação (Reação Shift)... 78
2.4.7 Eletroforese ... 79
2.4.8 Pós-eletroforese ... 79
2.5 Avaliação De Expressão Com Gene Repórter - Região Promotora Sry ... 79
2.5.1 Amplificação do promotor do gene SRY ... 80
2.5.2 Clonagem no vetor pGEM-T Easy ... 81
2.5.3 Digestão e sub-clonagem nos vetores de expressão pGL3 ... 82
2.5.4 Obtenção das construções para transfecção... 84
2.5.5 Cultivo Celular e Transfecção das células Hela ... 84
2.5.6 Quantificação da expressão e atividade da luciferase ... 86
RESULTADOS ... 87
1. SEQUENCIAMENTO DO GENE SRY EM NOVOS PACIENTES COM DG ... 88
2. EXPRESSÃO DE PROTEÍNA SRY E89K MUTANTE E VERIFICAÇÃO DE SUA INTERAÇÃO COM DNA POR ENSAIO DE EMSA ... 89
2.1 Expressão E Purificação Da Proteína Sry Normal E Mutante ... 90
2.2 Ensaio De Emsa Com As Proteínas Sry Normal E Mutante ... 95
xii
4. ENSAIO DE EMSA - FATOR SP1 ... 100
5. ENSAIO DE EXPRESSÃO COM GENE REPÓRTER ... 105
DISCUSSÃO ... 109
1. SEQUENCIAMENTO DO GENE SRY EM NOVOS PACIENTES COM DISGENESIA GONADAL... 110
2. EXPRESSÃO DE PROTEÍNA SRY E89K MUTANTE E VERIFICAÇÃO DE SUA INTERAÇÃO COM DNA POR ENSAIO DE EMSA ... 110
3. ANÁLISE IN SILICO DA PROTEÍNA SRY MUTANTE E89K ... 112
4. ENSAIO DE EMSA - FATOR SP1 ... 114
5. ENSAIO DE EXPRESSÃO COM GENE REPÓRTER ... 116
CONCLUSÕES ... 118
REFERÊNCIAS ... 121
xiii
xiv
Tabela 1. Descrição clínica dos indivíduos analisados no projeto ... 555 Tabela 2. Resumo dos diagnósticos clínicos e dos achados moleculares no gene SRY... 889 Tabela 3. Resultados das médias dos experimentos de transfecção transiente em células HeLa. ... 105
xv
xvi
Figura 1. Visão geral da diferenciação gonadal.. ... 29
Figura 2. Formação dos genitais internos, à partir da diferenciação gonadal. ... 30
Figura 3. Formação dos genitais externos, à partir da diferenciação gonadal. ... 31
Figura 4. Quadro síntese da diferenciação sexual masculina, desencadeada pelos hormônios testiculares. ... 32
Figura 5. Abordagem computacional da proteína SRY ligada ao DNA. ... 34
Figura 6. Modelo da estrutura resolvida por RMN da HMG-Box de SRY ligada ao DNA. 35 Figura 7. Modelo simplificado da “cascata” de genes envolvidos na determinação do sexo, e patologias decorrentes de distúrbios no processo de determinação e diferenciação gonadal. ... 42
Figura 8. Diagrama esquemático de um zinc-finger do tipo C2H2.. ... 46
Figura 9. Representação de um complexo entre o fator Sp1 e o DNA, contendo os 3 domínios zinc-finger.. ... 47
Figura 10. Heredograma da paciente com disgenesial gonadal completa 46,XY. ... 52
Figura 11. Alinhamento da região promotora do gene SRY .. ... 53
Figura 12. Ilustração do sequenciamento automático evidenciando a mutação e a troca de aminoácidos, assim como a localização da mutação na proteína SRY. ... 54
Figura 13. Construções I e II.. ... 83
Figura 14. Construções III e IV. ... 83
Figura 15. Vetor de expressão pGL3-Control, utilizado como controle positivo. ... 85
Figura 16. Vetor de expressão pGL3-Basic, utilizado como controle negativo. ... 85
Figura 17. Vetor de expressão RL-TK, utilizado como controle interno do experimento de transfecção.. ... 86
Figura 18. Comparação da seqüência com a mutação Glu89Lys com a seqüência normal presente nos familiares e nos pacientes analisados.. ... 88
Figura 19. Gel de acrilamida 13,5% contendo amostras de proteína expressas por células E. coli BL21DE3 transformadas com o vetor de expressão pET28a (Teste tempo de indução).. ... 90
xvii
Figura 20. Gel de acrilamida 13,5% contendo amostras de proteína expressas por células
E. coli BL21DE3 transformadas com o vetor de expressão pET28a (Teste concentração de
IPTG.. ... 91
Figura 21. Gel de acrilamida 13,5% contendo amostras de proteína expressas por células E. coli BL21DE3 transformadas com o vetor de expressão pET28a (Teste de Solubilidade). ... 92
Figura 22. Gel de acrilamida 13,5% contendo amostras de proteína expressas por células E. coli BL21DE3 transformadas com o vetor de expressão pET28a (Teste purificação).. .. 93
Figura 23. Gel de acrilamida 13,5% contendo amostras de proteína expressas por células E. coli BL21DE3 transformadas com o vetor de expressão pET28a (Purificação em larga escala) ... 94
Figura 24. Ensaio de EMSA, testando a capacidade de ligação das proteínas SRY selvagem e mutante ao DNA.. ... 95
Figura 25. Modelo da HMG-Box de SRY complexada com o DNA ... 96
Figura 26. Modelo 1J46.pdb, representando a HMG-Box da proteína SRY selvagem, alinhado com a modelo gerado da proteína SRY mutante E89K.. ... 97
Figura 27. Gráfico de contatos internos perdidos ou estabelecidos pelas trocas de aminoácidos (fornecido pelo programa STING). ... 98
Figura 28. Gráfico de contatos internos (fornecido pelo programa STING) verificando o efeito da nova interação estabelecida entre o aminoácido mutante lisina (K) na posição 89 e o aminoácido asparagina (N) na posição 87. ... 99
Figura 29. Análise de conservação do aminoácido ácido glutâmico (K) na posição 89 da proteína SRY. ... 100
Figura 30. Ensaio de EMSA com o fator Sp1 ... 101
Figura 31. Ensaio de EMSA com o fator Sp1 ... 102
Figura 32. Ensaio de EMSA com o fator Sp1 ... 103
Figura 33. Ensaio de EMSA com o fator Sp1 ... 104
Figura 34. Atividade da luciferase apresentada pelas construções gênicas e controles em células HeLa. ... 106
Figura 35. Atividade relativa da luciferase apresentada pelas contruções gênicas e controles em células HeLa. ... 107
xviii
Figura 36. Relação Firefly/Renilla, normalizando a média dos dados obtidos com os vetores experimentais pGL3 com a média dos dados obtidos com vetor controle pRL-TK ... 108 Figura 37. Resíduo de isoleucina (branco) na posição 90, formando complexo na junção das α-hélices 1 e 2... 113
xix
xx
BSA albumina sérica bovina
-gal -galactosidase
CBMEG Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
CO2 dióxido de carbono
Control controle
DG disgenesia gonadal
DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTP desoxirribonuleotídeo trifosfatado
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etileno diamono tetracético
EMSA electrophoresis mobility shift assay
FSH hormônio folículo estimulante
Glu aminoácido ácido glutâmico ºC graus Celsius
HAM hormônio anti-Mulleriano
HCl ácido clorídrico
HeLa linhagem de células imortal, derivada de células de um câncer cervical da
paciente Henrietta Lacks
HSSP homology-derived secondary structure of proteins database
IPTG isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
KCM tampão cloreto de potássio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio
KTS domínio do fator de transcrição WT1, formado pelos resíduos lisina (K),
treonina (T) e serina (S) LH hormônio luteinizante LB Meio Luria-Bertani Lys aminoácido lisina
g micrograma μL microlitro
xxi M micromolar M molar MgCl2 cloreto de magnésio mL Mililitro mM Milimolar mUI/mL miliunidades/militro N Normal
NaCl cloreto de sódio
NaOH hidróxido de sódio
ng Nanograma
NR normal range
NT2-D1 linhagem celular Ntera2/clone D1, derivada de uma carcinoma testicular
embrionário
OD optical density
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
ORF Open Reading Frame
pb pares de base
PBS solução tampão fosfato
PCR Polymerase Chain Reaction
PDB protein data bank
PEG polietilenoglicol
pM picomolar K+ potássio
RNA ácido ribonucléico
RPM rotações por minuto
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis
SF1 steroidogenic factor-1
SOX9 SRY (sex determining region Y) - box 9
xxii
SRY sex determining region Y
STING Sequence To and withIN Graphics
SV40 promotor do Simian virus 40
Taq Thermus aquaticus (enzima polimerase)
TBE Tris - Borato – EDTA
TDF Testis Determining Factor
TE Tris - EDTA
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
U Unidade
ULR Unidade Relativa de Luz
WT1 Wilms' tumor suppressor gene
xxiii
xxiv
A expressão do gene SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) é responsável por desencadear a determinação testicular durante o desenvolvimento embrionário, a partir das gônadas ainda indiferenciadas. Mutações nesse gene são encontradas em muitos casos de anomalias do desenvolvimento gonadal. O projeto teve por objetivo principal a análise funcional do efeito de uma mutação na região promotora do gene SRY, sendo que essa mutação consiste em uma deleção de 3 pares de base em um dos sítios consenso de ligação do fator de transcrição Sp1 ao promotor do gene. O portador dessa mutação é um indivíduo com disgenesia gonadal pura 46,XY, sendo que outros membros da família apresentavam ambiguidade genital e o pai, também portador da mutação, possuía grave hipospadia ao nascimento.
Para tentar esclarecer os efeitos desta mutação nos mecanismos moleculares de regulação da expressão do gene SRY, este trabalho primeiramente analisou a interação da proteína Sp1 com os sítios localizados na região promotora de SRY e o efeito da mutação nesta interação, através de ensaios de EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Concluiu-se que os sítios Sp1A e Sp1B se ligam a duas moléculas de Sp1 e que a mutação no Sp1A praticamente abole esta ligação. Possivelmente a ausência dessa ligação impediu a formação de um complexo de transcrição, causando uma diminuição na expressão do gene SRY e levando à ausência de formação dos testículos e reversão sexual completa na paciente. Complementando, foi analisado o efeito dessa mutação na expressão através de ensaio de expressão com gene repórter, no qual o promotor normal se mostrou em média duas vezes mais eficiente na ativação da expressão da luciferase que o promotor mutante. Entretanto, mais experimentos de transfecção, inclusive com outras linhagens celulares, devem ser realizados para confirmação desse resultado.
Além disso, foi analisado o efeito de uma nova mutação (localizada na região codificante do gene SRY) na ligação da proteína SRY com o DNA, através de ensaios de EMSA. Concluiu-se que a mutação E89K, associada com disgenesia gonadal pura 46,XY, reduziu em alto nível a atividade de ligação in vitro da proteína SRY mutante ao DNA, o que representa um forte indício de que atividade reduzida da proteína mutante não foi suficiente para desencadear o processo de determinação testicular. Paralelamente, foi feito o rastreamento de mutações no gene SRY e sua região promotora em novos casos de disgenesia gonadal, não tendo sido encontradas, porém, alterações nos pacientes analisados.
xxv
xxvi
The SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) gene expression is responsible for testicular determination during embrionary development. Mutations in SRY are found in many cases of anomalies of gonadal development. This project analyzed the functional effect of a mutation in SRY promoter region; the mutation is a 3-bp deletion in a consensus binding site for Sp1 transcription factor. The patient presented 46,XY pure gonadal dysgenesis, and a family history of relatives with different levels of genital ambiguity. Her father shares the same mutation in the SRY promoter region.
In order to investigate the effects of the mutation upon the molecular mechanisms that regulate SRY gene expression, the interaction of the Sp1 transcription factor with normal and mutant binding sites was analyzed by EMSA (Electrophoretic Mobility Shift
Assay). Each of Sp1A and Sp1B normal sites binds to a single Sp1 molecule, whereas the
3-bp deletion in Sp1A abolishs the binding to this site. Probably, the lack of Sp1 binding to the Sp1A site prevented the formation of a stable transcription complex, reducing the level of SRY expression and leading to the absence of testicles and complete sex reversal in the patient. Parallely, the effect of the mutation was analyzed by a reporter gene assay, indicating that the normal promoter is almost two times more efficient than the mutant promoter in the activation of luciferase gene expression using HeLa cells. However, further transfection experiments with other cell lineages must be performed to confirm this result.
In addition, the effect of a new mutation (E89K, located in the SRY gene coding region) was analyzed by testing the ability of the SRY mutant protein to bind its DNA consensus sequence. EMSA assays revealed that the E89K mutation, which is associated with 46,XY pure gonadal dysgenesis, strongtly reduced the SRY protein binding activity in
vitro. This result is a strong evidence that the reduced activity of SRY mutant protein was
not sufficient to trigger the testicular determination in the patient, leading to the pure gonadal dysgenesis phenotype.
Screening of mutations in the SRY gene coding and promoter regions was also performed in six diferent patients with 46,XY gonadal dysgenesis. However, other mutations have not been identified.
27
INTRODUÇÃO
28
1. DETERMINAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO SEXUAL
Nos mamíferos a determinação do sexo é estabelecida no momento da fertilização através da herança de um cromossomo X ou Y paterno. O cariótipo 46,XY corresponde ao sexo masculino, enquanto o cariótipo 46,XX corresponde ao sexo feminino. Apesar do sexo cromossômico já estar definido no zigoto, o dimorfismo sexual não é observado em embriões humanos com menos de 7 semanas. A partir daí, as gônadas diferenciam-se em testículos nos embriões portadores do cromossomo Y ou em ovários na ausência deste (Jost
et al., 1973).
O evento principal na determinação sexual é a especialização das gônadas, sendo que as demais diferenças entre os sexos são efeitos secundários devidos a hormônios produzidos por elas. Sendo assim, a expressão “determinação sexual” é utilizada para definir a soma dos processos de determinação do sexo genético e diferenciação das gônadas, enquanto que “diferenciação sexual” refere-se às ações hormonais específicas subsequentes à determinação que levam ao fenótipo sexual de cada indivíduo (Goodfellow & Darling, 1988), contribuindo para o desenvolvimento dos genitais externos e internos e para o amadurecimento sexual na puberdade. No modelo clássico da determinação sexual, é afirmado que no primeiro estágio do desenvolvimento sexual (determinação sexual primária), o sexo é definido pela presença (nos homens) ou ausência (nas mulheres) de um fator genético presente no cromossomo Y, denominado TDF (Testis Determining Factor), que atuando na gônada indiferenciada leva ao seu desenvolvimento em testículo (Jost et al., 1973). Após quase duas décadas de estudo e contínuos refinamentos no mapeamento do cromossomo Y em pacientes com reversão sexual (homens XX ou mulheres XY), chegou-se ao resultado de que o TDF chegou-seria o gene SRY (Sex determining Region on the Y
chromosome) (Berta et al., 1990; Sinclair et al., 1990).
A função principal da proteína SRY é acionar na gônada primordial a diferenciação das células de Sertoli, que é um dos primeiros indícios morfológicos da diferenciação sexual masculina (Figura 1).
29
Figura 1. Visão geral da diferenciação gonadal. As gônadas se desenvolvem à partir de estruturas embrionárias denominadas cristas urogenitais. Sob a influência de SRY, as cristas urogenitais masculinas se diferenciam em testículos, que contém cordões transversais constituídos por diferentes tipos celulares, incluindo as células de Sertoli, células germinativas e células mióides peritubulares. Entre esses cordões, no interstício, outros tipos celulares, como as células de Leydig, são encontrados. Se o SRY não está presente, ou não atua corretamente, as cristas urogenitais começam a se diferenciar em ovários, nos quais as células germinativas são rodeadas por células da granulosa para formar os folículos, que são rodeados por células intersticiais, como as células da teca. Modificado de Koopman, 2009.
As células de Sertoli produzem o hormônio anti-mulleriano (HAM), que induz a regressão dos dutos de Muller (dutos femininos). Por sua vez, as células de Leydig (que aparecem após uma semana do início da determinação) produzem a testosterona, que induz
30
a estabilização dos dutos de Wolff (dutos masculinos), que dão origem à maior parte da genitália masculina interna (epidídimo, canal deferente, vesícula seminal e duto ejaculatório) (Figura 2).
Figura 2. Formação dos genitais internos, à partir da diferenciação gonadal. Modificado do site www.uh.edu/~tgill2
A testosterona é subsequentemente convertida em diidrotestosterona, forma mais potente que viriliza os genitais externos (pênis e bolsa escrotal) (Figura 3).
31
Figura 3. Formação dos genitais externos, à partir da diferenciação gonadal. Modificado do site www.uh.edu/~tgill2
Portanto, a diferenciação sexual masculina propriamente dita, isto é, a masculinização dos primórdios dos genitais internos e externos, tem início a partir da produção de hormônios androgênicos pelas células de Leydig entre a oitava e a nona semana de gestação (Figura 4); segundo este modelo, na ausência dos hormônios testiculares desenvolve-se o fenótipo feminino (Moore, 1978; Grumbach, 1960; Josso, 1992).
32
Figura 4. Quadro síntese da diferenciação sexual masculina, desencadeada pelos hormônios testiculares.
Atualmente vêm sendo propostos novos modelos para a determinação e diferenciação sexual. Num modelo proposto por Blecher & Erickson (2007), há vários pontos divergentes do modelo original. Inicialmente, eles afirmam que o dimorfismo sexual ocorre antes do que o previamente estipulado, e precede o desenvolvimento das gônadas. Esse dado é apoiado por diversos trabalhos, que encontraram padrões de expressão gênica muito diferentes entre gônadas ainda indiferenciadas de embriões de camundongos machos e fêmeas (Beverdam & Coopman 2005). Além disso, é refutado o conceito de que os fatores de determinação sexual estão envolvidos somente no destino da gônada, sendo proposta uma influência sobre a diferenciação sexual secundária, inclusive em órgãos não-sexuais (Blecher & Erickson, 2007).
O principal ponto de divergência entre o modelo original de Jost e o novo modelo proposto por Blecher & Erickson, é que o modelo atual refuta o conceito do
33
desenvolvimento feminino ocorrer by default, e afirma que devem haver mecanismos masculinos (ligados ao cromossomo Y) e femininos (ligados aos dois cromossomo X) de determinação sexual. Cederroth e colaboradores (2007) afirmam que é evidente que o desenvolvimento ovariano é um processo ativo, que envolve a interação de múltiplas cascatas de sinalização. Foram identificados alguns genes ligados ao desenvolvimento dos ovários, como o Wnt4 e o Foxl2, mas ainda há divergências sobre qual seria o determinante feminino. A inativação dos genes Wnt4 e Foxl2 produz diferenciação testicular em camundongos XX, o que sugere que esses genes são requeridos para iniciar ou manter os aspectos principais da diferenciação sexual feminina (Ottolenghi et al., 2007). Desse modo, eles constituem fortes candidatos a fatores da determinação sexual feminina, assim como o
SRY é o fator preponderante da masculina.
2. O GENE E A PROTEÍNA SRY
O gene SRY, localizado no braço curto do cromossomo Y (Vergnaud et al., 1986; Berta et al., 1990; Koopman et al., 1991), é o responsável pelo desencadeamento do desenvolvimento testicular (Berta et al., 1990). A proteína codificada pelo SRY exibe alta similaridade com a proteína Mc, necessária para a fissão de leveduras, e com proteínas nucleares não histônicas HMG1 e HMG2 (High Mobility Group 1 e 2) que, ligando-se ao DNA, atuam como fatores de regulação da transcrição (Sinclair et al., 1990). O gene consiste de um único éxon e codifica uma proteína de 204 aminoácidos, sendo que 79 resíduos formam o domínio altamente conservado HMG-Box, que caracteriza a proteína SRY como um fator de transcrição, com capacidade de ligação (Figura 5) ao DNA (Behlke
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Figura 5. Abordagem computacional da proteína SRY ligada ao DNA. As regiões amino-terminal (cinza escuro), HMG-Box (cinza claro) e carboxi-amino-terminal (cinza médio) são observadas. As regiões carboxi-terminal e HMG-Box interagem com a estrutura de uma molécula de DNA (seta branca) (Sánchez-Moreno et al., 2009)
Um estudo recente propõe uma hipótese para a origem do gene SRY humano. Segundo esta hipótese, o SRY seria um gene híbrido, gerado pela inserção de uma parte do gene DGCR8 upstream ao HMG-Box do gene SOX3. Essa sequência inserida teria constituído um elemento regulador e também complementado a sequência codificante, formando assim o gene SRY humano. A evolução e especialização do gene SRY humano como gene da determinação sexual foi dessa forma alcançada por um ganho de função, desenvolvido pela mudança das sequências-alvo e da afinidade de ligação ao DNA da proteína SRY (Sato et al., 2009).
Algumas mutações dentro do domínio HMG-Box estão associadas com reversão do sexo fenotípico em indivíduos 46,XY e diminuem a capacidade de ligação da proteína SRY ao DNA (Harley et al., 1992; Assumpção et al., 2002). Com a intensificação dos estudos,
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descobriu-se que este domínio não somente permite a ligação ao DNA, mas também induz neste um dobramento (Ferrari et al., 1992; Giese et al., 1992) (Figura 6). Isto sugere que esta proteína possa atuar influenciando a estrutura da cromatina e regulando a expressão gênica através da justaposição de sítios distantes na hélice de DNA. A importância desse dobramento para a função da SRY foi comprovada pelo achado de mutações que não afetam a capacidade de ligação da proteína ao DNA, mas alteram o ângulo de dobramento que ela induz (Pontiggia et al., 1994).
Figura 6. Modelo da estrutura resolvida por RMN da HMG-Box de SRY ligada ao DNA. A estrutura mostra as 3 α-hélices do domínio HMG e sua conformação em L, se ligando ao sulco menor do DNA, causando dobramento e relaxamento da cadeia. (Harley et al., 2003)
É mais provável que os eventos de ligação e dobramento do DNA ocorram em duas etapas separadas. A deformação do DNA parece ter também um papel importante na especificidade da ligação da proteína SRY ao DNA alvo, já que a deformação que ocorre
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no DNA nos primeiros estágios da aproximação da proteína é uma maneira ideal de indiretamente testar a sequência de bases da sequência-alvo no DNA (Bouvier & Lavery, 2009).
Além das sequências de ligação há dois sítios de sinalização nuclear independentes nas extremidades do HMG-Box (Poulat et al., 1995; Sudbeck & Scherer, 1997). Mutações na porção C-terminal do domínio HMG comprovadamente afetam a localização nuclear da proteína SRY, apesar de não alterarem sua capacidade de se ligar ao DNA e/ou dobrá-lo (Li
et al., 2001). Entretanto, foi afirmado por Sánchez-Moreno e colaboradores (2008) que a
proteína SRY inteira é necessária para a ligação completa ao DNA e, que os domínios N e C-terminal são essenciais, sendo que, inclusive, apresentam capacidade de ligação ao DNA mesmo sem o domínio HMG-Box. Em recente trabalho (Sánchez-Moreno et al., 2009), o mesmo grupo de pesquisa demonstra, através de análises funcionais e in silico de uma mutação no domínio C-terminal na proteína SRY, que a região carboxi-terminal da proteína é importante para a atividade de ligação e também interage com o DNA.
As modificações pós-traducionais são importantes para a função da proteína SRY, já que a fosforilação dos fatores de transcrição em geral pode afetar sua localização nuclear, sua capacidade de ligação ao DNA ou sua capacidade de trans-ativação. Na porção N-terminal da proteína SRY estão localizados resíduos de serina que são fosforilados por quinases dependentes de c-AMP e, esse processo aumenta a atividade de ligação da proteína ao DNA (Desclozeaux et al., 1998b). Um estudo recente utilizando inibidores de metiltransferases indica que a metilação do DNA é necessária para a formação das células de Sertoli (Mikuzami et al., 2008). A acetilação é outro exemplo de modificação para regular a atividade gênica. A proteína SRY interage com a p300 acetilase tanto in vitro quanto in vivo. Esta interação leva à acetilação de uma Lisina (K136), o que modifica a sublocalização nuclear da proteína (Thevenet et al., 2004).
O balanço fino entre importação e exportação nuclear determina os níveis de SRY transcricionalmente ativo no núcleo; recentemente, evidenciou-se que modificações pós-traducionais na proteína SRY interferem na sua capacidade de transporte nuclear, o que leva a crer que muitas mutações nesse gene em pacientes com desordens do desenvolvimento sexual podem estar afetando sítios desconhecidos de ubiquitinação,
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acetilação, metilação, fosforilação e outras modificações essenciais para o transporte e função da proteína (Sim et al., 2008). Uma mutação que levou à uma troca de aminoácidos no sítio de localização nuclear da proteína SRY foi encontrada em uma paciente com disgenesia gonadal completa 46,XY. Estudos funcionais revelaram que a mutação reduziu em 50% a quantidade de proteína SRY no núcleo das células (Hersmus et al., 2009).
Sugere-se que a SRY, como qualquer proteína do tipo HMG, deva regular a expressão através de efeitos na arquitetura do DNA, favorecendo a formação de complexos regulatórios e propiciando a manutenção da estabilidade cinética de tais complexos (Pontiggia et al., 1994; Ukiyama et al., 2001).
Além dessa função principal na determinação sexual, vários outros papéis estão sendo propostos para a proteína SRY. Há muitas evidências que mostram que a expressão da proteína SRY ocorre no cérebro, rim e glândula adrenal de camundongos e ratos machos adultos, o que sugere uma atuação da proteína no sistema nervoso simpático, sistema renina-angiotensina que controla a pressão arterial, regulação dos receptores de andrógenos e fisiologia da próstata (Ely et al., 2008).
3. SRY E A COMPLEXIDADE DA DETERMINAÇÃO SEXUAL
Apesar do gene SRY ser desencadeador de todo o processo de determinação sexual, a sua expressão individual não consegue determinar a formação de gônadas masculinas normais, como é mostrado em trabalho recente (Ishii et al., 2007). Há um grande grupo de evidências que indica que a determinação e a diferenciação sexual são processos muito mais complexos, e que deve haver um número ainda indefinido de genes autossômicos ou ligados aos cromossomos sexuais que atuam antes (upstream genes) e depois (downstream
genes) da determinação testicular, formando uma verdadeira cascata de transcrição
(MacLaughlin & Donahoe, 2004).
Antes da determinação sexual mediada pelo SRY, em embriões humanos com 4 semanas de gestação se inicia a formação das gônadas bipotentes, mediada principalmente pelo fator de transcrição WT1 (Wilms Tumor supressor locus – gene1), essencial para o desenvolvimento renal e gonadal em mamíferos (Pritchard-Jones et al., 1990) e pelo
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receptor nuclear SF-1 (Steroidogenic Factor – 1), essencial para o desenvolvimento adrenal e gonadal (Luo et al., 1994). O fator SF-1 parece ter papel tanto na diferenciação testicular como na ovariana (Combes et al., 2009).
Além desse importante papel primordial, essas duas proteínas codificadas por genes autossômicos ainda estão diretamente envolvidas na transativação da expressão do gene
SRY (de Santa Barbara et al., 2001 ; Hossain & Saunders, 2001; Schumacher et al., 2008;
Bradford et al., 2009). O co-fator de transcrição CITED2 interage com o fator WT1 para estimular a expressão de SF-1, e todos atuam na gônada para aumentar a expressão de SRY a fim de atingir o limiar para iniciar a determinação testicular. A redução das dosagens de WT1 e SF-1 em gônadas mutantes para o gene CITED2 foi suficiente para produzir reversão sexual parcial; dessa forma, uma correlação direta pode ser feita entre reversão sexual e níveis reduzidos de WT1 e SF-1, indicando que o gene SRY é um alvo downstream da via regulatória CITED2/WT1/SF1 (Buaas et al., 2009).
Após esses eventos upstream, com a transcrição do gene e a consequente produção da proteína SRY numa janela temporal restrita, na sexta semana de gestação se inicia a determinação sexual masculina. Possivelmente a proteína SRY interage com proteínas acessórias para modular a expressão de seus genes alvo e desencadear a determinação testicular, como é demonstrado por Polanco e colaboradores (2009), que através de análise funcional chegaram à conclusão que a proteína KRAB-O (Kruppel Associated Box Only) pode mediar a função de SRY.
Durante muito tempo não ficou clara qual era a forma de atuação, os alvos e os genes downstream à expressão de SRY na cascata de transcrição, e como era promovida a diferenciação das células de Sertoli. Recentemente, uma análise bioinformática e experimental (Jin et al., 2007) identificou regiões promotoras alvo potenciais da proteína SRY, mostrando também uma forte correlação dessas regiões com sítios alvo do fator de transcrição OCT4; esse dado sugere uma possível atuação conjunta na regulação da transcrição gênica.
Por outro lado, o gene SOX9 (SRY-related high-mobility group HMG-Box 9) é atualmente reconhecido como o principal alvo da ação de SRY e principal efetor
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hormônio anti-mulleriano causam a regressão dos dutos de Muller e assim possibilitam a diferenciação masculina. O fator SOX9 se mostrou capaz de induzir diferenciação masculina quando expresso em gônadas XX de camundongos transgênicos mesmo na ausência de SRY (Vidal et al., 2001). Outro exemplo da ação efetora de SOX9 é a expressão aumentada desse gene encontrada em homens XX e SRY-negativos (Kojima et al., 2008).
Se o SRY está ausente ou é expresso fora da janela temporal específica, o gene
SOX9 é silenciado e o desenvolvimento ovariano prevalece (Sekido & Lovell-Badge,
2008a). O modelo mais recente proposto afirma que a expressão de SOX9 depende da ação sinérgica das proteínas SRY e SF1 em um enhancer de expressão do gene SOX9. Quando a expressão de SRY cessa, o fator SOX9 juntamente com o fator SF1 se liga ao enhancer ajudando a manter sua própria expressão, numa via de feedback positivo (Sekido & Lovell-Badge, 2008b).
Uma revisão dos últimos dados da literatura (Koopman, 2009), propõe a seguinte série de eventos. A partir da expressão de SRY nas células precursoras, a expressão de SOX9 é ativada. Através de um mecanismo de auto-regulação de feedback positivo, o SOX9 é capaz de estimular e manter a sua própria expressão, além de ativar a transcrição do gene PGDS, resultando na secreção de prostaglandina D2. Essa proteína é capaz de promover a expressão de SOX9, mesmo nas células em que a expressão do gene SRY foi baixa ou inexistente. Esse é só um dos exemplos dos diversos mecanismos de sinalização celular que participam do desenvolvimento gonadal, revisados em diversos trabalhos (Cool & Capel, 2009).
A proteína SOX9, além de principal efetor da determinação testicular, possui aparentemente também o papel de antagonista do desenvolvimento ovariano, suprimindo ativamente a expressão do gene FOXL2. Em um estudo com imunofluorescência em ovotestis (gônadas mistas) em desenvolvimento, foi observado que células individuais precursoras das gônadas podem expressar SOX9 ou FOXL2, mas não os dois juntos, configurando assim um antagonismo (Wilhelm et al., 2009) .
A proteína SRY só desencadeia a determinação das gônadas em testículo sob condições específicas. Primeiramente, a ação dessa proteína é dosagem dependente, ou seja, um limiar de proteína no local de atuação é necessário para que ela comece a exercer
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sua função (Assumpção et al., 2005); dessa forma, a produção de níveis suficientes e a importação adequada dessa proteína e de outros fatores de transcrição para o núcleo são essenciais para manter os níveis funcionais adequados desses fatores. Hanover e colaboradores (2009) afirmam que defeitos na importação nuclear mediada por calmodulina dos fatores de transcrição SRY e SOX9 levam a distúrbios de reversão sexual e desenvolvimento testicular anormal. Outro fator preponderante é a expressão do gene SRY durante a janela temporal correta do desenvolvimento, uma vez que esse espaço de tempo é muito restrito, consistindo de aproximadamente 6 horas em camundongos; se a expressão de SRY atrasa em apenas 1 hora, a ativação do gene SOX9 não é mantida, resultando em desenvolvimento de ovário (Hiramatsu et al., 2009). Dessa forma, a expressão em quantidades suficientes da proteína SRY, durante a janela temporal oportuna, é fundamental para a diferenciação testicular normal, e qualquer anomalia nessa expressão é suficiente para causar uma reversão sexual (Wilhelm et al., 2009). Possivelmente muitos pacientes com disgenesia gonadal 46,XY idiopática, com a sequência do gene SRY normal, possuem mutações ainda não descritas que afetam o timing ou então os níveis de expressão de SRY, deixando a estrutura da proteína intacta mas prejudicando sua atuação. As condições nutricionais em que ocorre o desenvolvimento constituem outro fator que pode influenciar na determinação testicular. Foi demonstrado que a manutenção da expressão de
SOX9 só ocorre sob condições nutricionais adequadas, com altos níveis de glicose (Matoba et al., 2008).
Após esses eventos iniciais da determinação sexual, com a expressão de SRY e
SOX9, ocorre a ativação e repressão de muitos outros genes, em uma intrincada rede
gênica, que vem sendo desvendada gradativamente, principalmente por estudos de expressão gênica utilizando técnicas de microarray (Beverdam & Coopman 2006; Cory et
al., 2007; Bouma et al., 2007). Muitos eventos durante o desenvolvimento envolvem não só
o controle da transcrição, mas também alterações pós-transcricionais, como o controle da tradução e degradação do mRNA codificador da proteína SRY (Bernard & Harley, 2007).
Utilizando uma abordagem proteômica e transcriptômica, Sato e colaboradores (2009) compararam os níveis de síntese protéica e padrões de expressão gênica em linhagens de células NT2-D1 (derivadas de carcinoma testicular de embriões humanos)
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com níveis de expressão do gene SRY aumentados. A análise proteômica revelou que a super-expressão da proteína SRY aumentou a expressão de proteínas como a ERp19, de ligação à laminina, e a α-enolase. Essas proteínas estão envolvidas na formação de microtúbulos e na utilização de energia por células em divisão, tendo um papel importante na diferenciação e proliferação das células de Sertoli. Por outro lado, a super-expressão de SRY diminuiu a expressão de proteínas da classe das chaperonas, envolvidas em modificações pós-traducionais como a formação de pontes dissulfeto e o dobramento de proteínas. A análise transcriptômica revelou que a proteína SRY super-expressa causou um aumento na expressão de genes relacionados a proteínas zinc-finger, com função de fatores de transcrição. Possivelmente esses fatores são alvos da proteína SRY, que atua regulando a divisão e diferenciação celulares através da interação com esses fatores.
Em um levantamento proteômico global realizado com gônadas de camundongos exatamente durante a determinação sexual, 1037 produtos gênicos foram identificados a partir de 620 peptídeos. A classificação funcional e a construção da rede biológica de interações sugerem que a maioria das proteínas identificadas atuam nas modificações pós-transcricionais e transporte do RNA, síntese protéica, dobramento e outras modificações pós-traducionais. Foram revelados novos reguladores potenciais do desenvolvimento e determinação gonadal, além de 60 proteínas com potencial relação com distúrbios do desenvolvimento sexual no homem. Essa forma de comparação em larga escala da expressão de proteínas entre gônadas de ambos os sexos, ou entre gônadas em estágios diferentes do desenvolvimento constitui uma forma importante de identificar novas proteínas e genes envolvidos em eventos sexo ou estágio-específicos da diferenciação gonadal (Ewen et al., 2009).
Enfim, esse e outros trabalhos ilustram que muitos fatores podem influenciar na determinação e diferenciação sexual, que para ocorrer de forma correta depende de um equilíbrio preciso entre expressão e repressão de uma intrincada rede gênica (Figura 7). Existe uma janela de vulnerabilidade que envolve principalmente os eventos anteriores à determinação gonadal, sendo que até fatores ambientais podem exercer influência nesses processos (Koopman, 2009).
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Figura 7. Modelo simplificado da “cascata” de genes envolvidos na determinação do sexo, e patologias decorrentes de distúrbios no processo de determinação e diferenciação gonadal (de Mello et al., 2005).
4. DISGENESIA GONADAL 46,XY E SRY
Como todos os genes, o gene SRY está sujeito à mutações, mas como está localizado no cromossomo Y, não dispõe dos mecanismos de reparo de genes autossômicos, que possuem uma outra cópia no cromossomo homólogo. Diversas mutações no SRY já foram identificadas em humanos, em casos de disgenesia gonadal 46,XY e reversão sexual. Essas mutações afetam tipicamente a estrutura da proteína SRY e sua capacidade de determinar o desenvolvimento testicular (Koopman, 2009).
A denominação “disgenesia gonadal 46,XY” refere-se a um grupo de anomalias nas quais existe um defeito na determinação testicular. A DG Pura 46,XY caracteriza-se por um
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fenótipo feminino e ausência de tecido testicular. Os pacientes apresentam gônadas em forma de fita, constituídas de tecido fibroso, e estão presentes o útero, as tubas uterinas e a vagina, sendo que a genitália externa é feminina. Em geral o diagnóstico é feito na época da puberdade devido à amenorréia primária e à falta de aparecimento dos caracteres sexuais secundários. Na ausência de determinação testicular as gônadas de mulheres 46,XY chegam a se desenvolver em ovários, mas sofrem degeneração devido à falta de um segundo cromossomo X, em processo semelhante ao que ocorre nas pacientes com síndrome de Turner (45,X) (Berkovitz et al., 1991).
Considerando os casos de disgenesia gonadal 46,XY em geral, as mutações no gene
SRY são responsáveis por cerca 20% dos casos; além disso, o SRY está presente em cerca de
20% dos homens com cariótipo 46,XX. Até o momento, foram descritas 68 mutações (Cooper et al., 2007) na ORF do SRY (Shahid et al., 2004; Kellermayer et al., 2005; Zhou
et al., 2005). A grande maioria delas foi encontrada em pacientes 46,XY com diagnóstico
de DG pura, mas há relatos de mutações em pacientes com DG parcial XY, hermafroditismo verdadeiro e reversão sexual com função ovariana parcial (revisado em Assumpção et al., 2002).
Continuamente, novas mutações são descobertas, e ilustram a importância do rastreamento de novas mutações no gene SRY em pacientes com disgenesia gonadal e ambiguidade genital. Recentemente duas irmãs 46,XY com reversão sexual total e caracteres femininos normais tiveram mutações na HMG-Box do gene SRY detectadas, em ambos os casos prejudicando a capacidade de binding da proteína ao DNA (Shahid et al., 2008). Nosso grupo de pesquisa identificou uma mutação na região codificante do gene
SRY, também no domínio HMG-Box, em uma paciente com disgenesia gonadal pura
46,XY. Em outro caso recente que ilustra a variedade fenotípica do efeito das mutações no gene SRY, uma menina 46,XY com disgenesia gonadal e desenvolvimento puberal parciais teve uma mutação na HMG-Box do gene detectada (Paris et al., 2007), o que contrasta com outros casos de disgenesia gonadal parcial.
Mutações fora da HMG-Box são mais raras, mas também podem causar reversão sexual total, como no caso de uma mulher 46,XY portadora de uma inserção de um único nucleotídeo na ORF do gene SRY, causando um frameshift e truncamento da proteína
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(Marchina et al., 2008). Em outro exemplo, um estudo de nosso grupo encontrou uma mutação herdada localizada em um sítio de fosforilação do gene SRY em uma paciente com disgenesia gonadal completa, em seu pai e irmãos normais e em dois irmãos com disgenesia gonadal parcial (Assumpção et al., 2002). Uma inserção na região upstream ao domínio HMG-Box, levando à formação de um stop codon e uma proteína SRY truncada, foi encontrada em uma paciente com disgenesia gonadal 46,XY e amenorréia primária (Marchina et al., 2009).
Geralmente, devido ao comprometimento da capacidade reprodutiva do indivíduo, as mutações em SRY são eventos de novo, ou seja, não herdados e afetando somente um indivíduo da família. Entretanto, em outro caso incomum, foi encontrada uma mutação familial (também na HMG-Box do SRY), presente em uma garota 46,XY e em seu pai, com fenótipo normal (Plaseska-Karanfilska et al., 2007). Mais um caso recente foi reportado (Gimelli et al., 2007), novamente uma mutação familial compartilhada entre pai e filha 46,XY, mas dessa vez fora da região da HMG-Box. Essa grande variedade fenotípica no efeito das mutações no gene SRY muitas vezes dificulta a correlação entre o genótipo e o fenótipo dos pacientes.
5. REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE SRY
Considerando a região promotora do gene SRY, os mecanismos pelos quais a expressão do SRY é regulada in vivo ainda permanecem obscuros. A região promotora não apresenta nenhuma sequência do tipo “TATA” ou “CCAAT box” (Su & Lau, 1993); no entanto, encontram-se várias sequências conservadas na porção 5’, que podem estar relacionadas com o controle da expressão (Vilain et al., 1992; Su & Lau, 1993; Veitia et
al., 1997). Pelo menos três fatores de transcrição que se ligam a essa porção estão
aparentemente envolvidos na trans-ativação do SRY: Sp1, SF-1 e WT1 (Desclozeaux et al., 1998a; De Santa Barbara et al., 2001; Hossain & Saunders, 2001). O fator de transcrição CP2 também apresentou alta atividade de ligação ao promotor do gene SRY, e em análise funcional mostrou ser essencial para a modulação da expressão de SRY (Sato et al., 2009).
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Dentro de um segmento de cerca de 150 pb próximo ao ATG de início da tradução estão localizados dois sítios Sp1 intercalados por um sítio WT1.
Bradford e colaboradores (2009) encontraram níveis baixos da proteína SRY em células de gônadas de camundongos mutantes para a isoforma +KTS do fator WT1, além de a diferenciação das células de Sertoli ter sido bloqueada nessas gônadas. Esses dados sugerem que as isoformas +KTS do fator de transcrição WT1 estão envolvidas na regulação da expressão do gene SRY, que por sua vez influencia a proliferação e diferenciação das células de Sertoli. Pacientes com disgenesia gonadal e reversão sexual completa portadores de mutações no gene codificante do fator WT1 possivelmente tiveram falhas na diferenciação e proliferação das células de Sertoli, que em número insuficiente não puderam desencadear o desenvolvimento testicular.
Mutações na região 5’ promotora do gene são pouco frequentes. Há um relato de uma grande deleção (30-60 kb) localizada a 1,8 kb de distância do início do quadro de leitura do gene SRY (McElreavey et al., 1992) em uma paciente com disgenesia gonadal completa, indicando a presença de fatores cis de regulação que devem ser importantes para a transcrição do gene SRY. Uma análise comparativa desta região revelou sítios consenso de ligação para vários fatores de transcrição (Veitia et al., 1997; Margarit et al., 1998). Outras três variações de sequência foram descritas na região 5’ não-traduzida (Kwok et al., 1996; Poulat et al., 1998). Um estudo de genômica comparativa (Ross et al., 2008) identificou 4 regiões upstream ao gene SRY que mostram altas taxas de conservação entre humanos, bovinos, suínos e caprinos. A região A, mais distante, localiza-se a uma distância de 9 kb do gene. Nesse estudo também foram encontrados cerca de 200 sítios altamente conservados de ligação a fatores de transcrição, o que representa a imensa complexidade que pode estar por trás da expressão do gene SRY.
Estudos de nosso grupo de pesquisa encontraram uma deleção de 3 pb herdada e localizada exatamente em um dos sítios de ligação do fator de transcrição Sp1 em uma paciente com disgenesia gonadal completa (Assumpção et al., 2005). Estes dois sítios foram descritos como Sp1A e Sp1B, e o fator Sp1 já demonstrou envolvimento na ativação da expressão do gene SRY (Desclozeaux et al., 1998a). Intercalada entre estes dois sítios há
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uma sequência consenso de ligação do fator WT1, cuja atividade ativadora in vitro foi comprovada por Hossain & Saunders (2001).
6. O FATOR DE TRANSCRIÇÃO SP1
O fator de transcrição Sp1, foi originalmente isolado de células da linhagem HeLa, identificado como uma proteína de ligação ao DNA que interage com sítios ricos em GC localizados em um elemento repetitivo de 21 pb do promotor SV40 (Dynan & Tjian, 1983; Gidoni et al., 1984). É um dos fatores de transcrição mais abundantes que ativam a transcrição formando um complexo com a enzima RNA polimerase II (Bucher, 1990).
A proteína Sp1 regula a atividade de um grande número de promotores. A expressão de Sp1 em vários tipos celulares durante o desenvolvimento embrionário de camundongos sugere que tenha um papel fundamental nos primeiros processos do desenvolvimento (Saffer et al., 1991; Marin et al., 1997). Seu domínio de ligação ao DNA consiste de 3 motivos zinc finger do tipo C2H2 (Figuras 8 e 9), localizados na região C-terminal da proteína (Kadonaga et al., 1987; Briggs et al., 1986), que reconhecem a sequência consenso “GGGGCGGGGC” e sequências intimamente relacionadas, denominadas “GC Boxes” (Courey & Tjian, 1988).
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e histidinas (H) que se ligam ao íon de zinco são mostrados em amarelo e azul, respectivamente. A sequência consenso de aminoácidos de ligação, mostrada em verde, frequentemente encontra zinc-fingers adjacentes, dispostos em tandem. Dois resíduos hidrofóbicos grandes, importantes para manter a estrutura do domínio, são mostrados em laranja. Os resíduos em preto não são importantes estruturalmente, mas incluem aqueles responsáveis por entrar em contato com o DNA de forma sequência-específica, sendo que seu número pode variar de acordo com o fator de transcrição (Knight & Shimeld, 2001).
Figura 9. Representação de um complexo entre o fator Sp1 e o DNA, contendo os 3 domínios zinc-finger. O fator Sp1 é mostrado em verde, os íons de zinco em azul e o DNA em laranja (Oka et al., 2004).
Além disso, o fator possui dois domínios de transativação ricos em glutamina, A e B, e o domínio C-terminal D (Bouwman & Philipsen, 2002), também importantes para a ativação da transcrição, devido a sua importância na multimerização do fator, que parece
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ser essencial para a superativação e ação sinérgica de outras moléculas de Sp1 ou outros fatores de transcrição (Pascal & Tjian, 1991). Tetrâmeros de Sp1 se mostraram envolvidos na ativação da transcrição mesmo quando atuando em sítios distantes das regiões codificantes (Mastrangelo et al., 1991), e Su e colaboradores (1991) concluíram que fatores Sp1 ligados ao DNA exercem seu sinergismo transcricional por uma associação proteína-proteína que, através da formação de loops, aproximam segmentos distantes milhares de pares de base no DNA.
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1. OBJETIVOS GERAIS
Investigar como a deleção de 3 pb no sítio SP1A na região promotora do gene SRY altera a capacidade de ligação do fator SP1 na presença do sítio SP1B.
Investigar se há diferenças na capacidade dos promotores de SRY com a sequência normal e mutante de ativar a expressão de um gene repórter.
Investigar o efeito da mutação E89K na capacidade de ligação ao DNA da proteína SRY.
Continuar o rastreamento de mutações no gene SRY e sua região promotora em novos pacientes com disgenesia gonadal.
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1. CASUÍSTICA
A paciente 1, uma mulher com atualmente 33 anos, encaminhada ao serviço médico aos 16 anos devido à amenorréia primária. Não havia sinais de dimorfismos, sendo que portava genitália externa feminina normal, porém sem os caracteres sexuais secundários típicos da puberdade. Exames de ultrassom revelaram hipoplasia do útero e ausência das gônadas. Seu cariótipo foi 46,XY, e ela foi diagnosticada como apresentando disgenesia gonadal pura 46,XY.
A paciente possui uma irmã mais velha com menstruação e caracteres sexuais normais, e um irmão mais velho morto em acidente. A investigação da família (Figura 10) revelou que o pai, embora fértil, quando criança foi submetido à 18 cirurgias na região genital, devido a uma grave hipospadia (posição anormal do canal da uretra no pênis). Estudos moleculares demonstraram que o pai e a paciente possuem a mutação 5’ del3-pb na região promotora do gene SRY, que consiste em uma deleção de 3 pares de base em um dos sítios de ligação do fator de transcrição Sp1 presentes no promotor (Figura 11).
Na história familiar há relatos de 4 membros da família com ambiguidade genital, mas infelizmente não foi possível a análise molecular devido à não concordância dos indivíduos em realizar o estudo.
Figura 10. Heredograma da paciente com disgenesial gonadal completa 46,XY (destacada
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Figura 11. Alinhamento da região promotora do gene SRY . Os retângulos pontilhados destacam os 2 sítios de ligação do fator Sp1 (Sp1A e Sp1B). As duas possibilidades da deleção e a sequência mutante resultante são exibidas na última linha.
A paciente 2, uma mulher com atualmente 22 anos, chegou ao ambulatório com 16 anos devido ao hipogonadismo e amenorréia primária. Ela nasceu normalmente, de uma casamento não-consanguíneo, e seu peso ao nascer era desconhecido. Ela foi a primeira criança de uma irmandade de 8 (seis irmãs e um irmão), em uma família com histórico normal. Ao exame físico, pesou 42,4 kg e apresentou 158 cm de altura. Observou-se genitália externa feminina, com desenvolvimento puberal no estágio de Tanner M1P2, sem quadro dismórfico.
Seu cariótipo foi 46,XY. O exame de ultrassonografia não revelou útero nem gônadas femininas na cavidade abdominal. Ambas as gônadas disgenéticas foram removidas, devido ao alto risco de formação de gonadoblastoma, sendo que um pequeno tumor (2x2 mm) foi encontrado na gônada disgenética direita.
Dessa forma, a paciente foi diagnosticada com disgenesia gonadal pura 46,XY. Análises moleculares (Figura 12) revelaram que ela possui a mutação E89K no gene SRY, que foi produzida pela troca de uma base G por A dentro do HMG-Box (no códon determinante do aminoácido 89), que acarreta na tradução do aminoácido Lisina (AAG) ao invés de Ácido Glutâmico (GAG).
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Figura 12. Ilustração do sequenciamento automático evidenciando a mutação e a troca de aminoácidos, assim como a localização da mutação na proteína SRY.
O rastreamento de novas mutações no gene SRY foi realizado com o sequenciamento de 4 pacientes com quadro de disgenesia gonadal 46,XY e 2 familiares da paciente portadora da mutação Glu89Lys na região codificante do gene SRY. A Tabela 1 reúne a descrição de todos os indivíduos analisados no projeto.
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Tabela 1. Descrição clínica dos indivíduos analisados no projeto
Paciente Idade do
diagnóstico
Dados Clínicos Diagnóstico
1 16 anos Amenorréia, útero reduzido, ovários não visualizados
Disgenesia gonadal pura 46,XY 2 16 anos Ausência de desenvolvimento
de mama, amenorréia. Útero e ovário não visualizados.
Disgenesia gonadal pura 46,XY
3 17 anos Ausência de desenvolvimento de mama, amenorréia. Útero e
ovário não visualizados. Ambiguidade genital: genitália com Prader V, sem
gônadas palpáveis nas saliências lábio-escrotais.
Disgenesia gonadal parcial 46,XY
4 14 anos Amenorréia, puberdade de evolução lenta. Reduzido volume uterino e gônadas não
visualizadas.
Disgenesia gonadal pura 46,XY
5 17 anos Amenorréia, útero atrófico, ovário ou gônadas não
visualizadas.
Disgenesia gonadal pura 46,XY
6 Não
disponível
Não disponível Disgenesia gonadal pura 46,XY 7 Irmão da paciente 2 Normal
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2. MÉTODOS
2.1 SEQUENCIAMENTO DO GENE SRY
Novos pacientes com disgenesia gonadal tiveram o gene SRY e sua região promotora sequenciados, a fim de rastrear mutações determinantes da etiologia. As amostras de DNA destes pacientes foram obtidas por extração com fenol-clorofórmio de sangue periférico (10-20 mL de sangue colhido em EDTA 10%), segundo o método proteinase K padronizado no laboratório de Genética Humana (De Araujo et al., 1996).
2.1.1 Reação de Sequenciamento
Os fragmentos amplificados do gene SRY (778 pb) e sua região promotora (331 pb) foram submetidos à reação de sequenciamento, utilizando os seguintes primers:
Gene SRY
XES 10 (sense): 5’ GAG CTC GAG AAT TCG GTG TTG AGG GCG AGA AAT GC 3’ XES 11 (antisense): 5’ GAG CTC GAG AAT TCG TAG CCA ATG TTA CCC GAT TGT C 3’
Região 5’ promotora SRY
SRY 5’ 1s (sense): 5’ GCG AAG CTT TGT TTT TTT AAA GAT AAC ATA CAC 3’ SRY 5’ 1a (antisense): 5’ CCG GAC CAG ATT CTT TGT TAC GTT AAC 3’
Reação
H2O________________________________________ 4 µL 5X Sequencing Buffer (Applied Biosystems)________ 2 µL
