Carina Solon da Silva
O aminoácido taurina ativa sinalização
anorexigênica no hipotálamo de ratos
Campinas
2011
III FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP Bibliotecária: Rosana Evangelista Poderoso – CRB-8ª / 6652
Título em inglês: Taurine enhances the anorexigenic effects of insulin in the rat hupothalamus Keywords: Taurine Hypothalamus Insulin Amino acids Titulação: Mestrado em Fisiopatologia Médica
Área de concentração: Biologia Estrutural, Celular,Molecular e do Desenvolvimento
Banca examinadora:
Prof. Dr. Lício Augusto Velloso Prof. Dr. Eduardo Rochete Ropelle Prof. Dr. Silvana Chiavegatto Data da defesa: 04-02-2011
Silva, Carina Solon da
Si38a O aminoácido taurina ativa sinalização anorexigênica no
hipotálamo de ratos / Carina Solon da Silva. -- Campinas, SP : [s.n.], 2011.
Orientador : Lício Augusto Velloso
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Taurina. 2. Hipotálamo. 3. Insulina. 4. Aminoácidos. I. Velloso, Lício Augusto. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
II
Carina Solon da Silva
O aminoácido taurina ativa sinalização
anorexigênica no hipotálamo de ratos
Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Fisiopatologia Médica da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Mestre
Orientador: Prof. Dr. Lício Augusto Velloso
Campinas 2011
V À Deus, por tudo que me proporciona na vida. À minha mãe e meu pai, os quais amo muito, pelo exemplo de vida e pelo suporte para que eu tenha chegado até aqui. Ao meu namorado Anthony pelo apoio de sempre.
VI AGRADECIMENTOS
Inicialmente, agradeço ao Professor Lício pelo incentivo, supervisão, apoio e infra-estrutura para o desenvolvimento e conclusão deste projeto. Um agradecimento especial à professora Adriana, quem me apresentou ao Laboratório de Sinalização Celular, da Unicamp, e ensinou-me os primeiros passos na carreira científica.
Meus irmãos, obrigado João, pelos breves (bem breves) momentos no uso de seu computador, e Carol, pelas eventuais ajudas financeiras.
Aos meus pais, agradeço por todo o suporte familiar e pela estrutura que utilizo como base para tudo em minha vida. Mãe, obrigado por tudo, você é um exemplo para mim.
Ao meu namorado Anthony por todo apoio, amizade e amor.
Um agradecimento a todos os alunos do Laboratório de Sinalização Celular, em especial à Josi, Dani e Lucas e aos técnicos Gerson e Márcio.
Obrigada também aos professores associados ao laboratório, Márcio, Gabriel, Dennys, Marciane por estarem sempre prontos a ajudar, e colaboraram muito na compreensão dos experimentos.
À Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP e ao Departamento de Fisiopatologica Médica da Faculdade de Ciências Médicas pela oportunidade em realizar mais esta etapa da minha formação acadêmica.
À FAPESP e ao CNPq pelo suporte financeiro.
Às demais pessoas amigas, que direta ou indiretamente, contribuíram não somente com nesse trabalho, mas em toda a minha vida. Peço-lhes desculpas ao não mencioná-las, por limitações alheias à minha vontade. A todos esses talentos o meu muito obrigado.
2
LISTA DE ABREVIATURAS
ACC, Acetil-CoA carboxilase
AgRP, Proteína relacionada ao “agouti” Akt, Proteína quinase B
AMP, Monofosfato de adenosina
AMPK, Proteína quinase ativada por AMP ATP, Trifosfato de adenosina
CART, Peptídeo regulado por cocaína e anfetamina CRH, Hormônio liberador de corticotrofina
FOXO-1, Forkhead box 1
HMG-CoA, Hidroximetilglutaril-CoA redutase ICV, Intracerebroventricular
IR, Receptor de insulina
IRS – 1, Substrato 1 do receptor de insulina IRS – 2, Substrato 2 do receptor de insulina JAK2, Janus quinase 2
mTOR, alvo da rapamicina de mamíferos MCH, Hormônio concentrador de melanina NPY, Neuropeptídeo Y
PI3K, Fosfatidilinositol 3-quinase POMC, Pro-opiomelanocortina
STAT3, Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 Tau, Taurina
3 RESUMO
Nas últimas décadas, a prevalência da obesidade teve um expressivo aumento no mundo, tornando-se um dos mais importantes fenômenos clínicos-epidemiológicos da atualidade. Fatores como o alto consumo calórico e diminuição no gasto energético, associados a determinantes genéticos, desempenham papel relevante na patogênese desta doença. A taurina (Tau) é conhecida por modular diversos parâmetros metabólicos, como ação e secreção da insulina e os níveis sanguíneos de colesterol. Dados recentes sugerem que Tau também pode reduzir a adiposidade corpórea em C. elegans e roedores. Desde que a adiposidade corpórea é principalmente regulada por neurônios hipotalâmicos responsivos à insulina e envolvidos no controle da fome e termogênese, nós hipotetizamos que algumas das atividades da Tau, relacionadas ao controle da gordura corpórea, pode exercer efeitos através da sua ação direta no hipotálamo de ratos. Aqui, nós mostramos que a infusão intracerebrocentricular de doses agudas de Tau reduzem a ingestão alimentar e ativam a transdução de sinal através das vias de sinalização Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 e mTOR/AMPK/ACC. Esses efeitos são acompanhados pela modulação da expressão de NPY. Além disso, Tau pode melhorar o efeito anorexigênico da ação da insulina. Assim, o aminoácido Tau exerce uma potente ação anorexigênica no hipotálamo e melhora o efeito da insulina no controle da ingestão alimentar.
4 ABSTRACT
In the last decades, the obesity prevalence have a expressive increase in the world, been one of the most important actual phenomenon clinical-epidemiological. The high caloric intake and decrease of energy expenditure, associated with genetics factors play a relevant role in this disease. Taurine (Tau) is known to modulate a number of metabolic parameters such as insulin secretion and action and blood cholesterol levels. Recent data have suggested that Tau can also reduce body adiposity in C. elegans and in rodents. Since body adiposity is mostly regulated by insulin-responsive hypothalamic neurons involved in the control of feeding and thermogenesis, we hypothesized that some of the activity of Tau in the control of body fat would be exerted through a direct action in rat hypothalamus. Here, we show that the intracerebroventricular injection of an acute dose of Tau reduces food intake and activates signal transduction through the Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 and mTOR/AMPK/ACC signaling pathways. These effects are accompanied by the modulation of expression of NPY. In addition, Tau can enhance the anorexigenic action of insulin. Thus, the aminoacid, Tau, exerts a potent anorexigenic action in the hypothalamus and enhances the effect of insulin on the control of food intake.
5 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A ingestão alimentar e o gasto energético por termogênese são fenômenos fisiológicos controlados através de mecanismos complexos e, até certo ponto, relacionados entre si (Flier JS, 2004; Spiegelman BM et al., 2001; Schwartz MW et al., 2000). Em períodos de jejum prolongado, o aumento da sensação de fome é acompanhado por redução da termogênese, o que tem por objetivo poupar energia durante o período de privação calórica. Uma vez obtido o alimento, a sensação de saciedade será acompanhada de um aumento proporcional do gasto energético por termogênese. Ao prevalecer o equilíbrio entre os componentes deste ciclo, a massa corpórea total e a massa relativa de tecido adiposo serão mantidas estáveis, sofrendo apenas ligeiras oscilações decorrentes das variações eventuais da composição da dieta ou ainda, ao longo da vida, em decorrência do envelhecimento, o que proporciona um lento e gradativo aumento da massa relativa de tecido adiposo. Nestas circunstâncias não haverá ganho de peso excessivo,ou seja a obesidade não se instalará. Por outro lado, se a oferta calórica for maior do que o gasto energético ocorrerá aumento gradativo da massa corpórea devido ao aumento da massa relativa de tecido adiposo, o que levará ao desenvolvimento de obesidade (Flier JS, 2004; Spiegelman BM et al., 2001; Schwartz MW et al., 2000).
A obesidade é um dos mais importantes problemas de saúde pública no mundo (Velloso, 2006). Atualmente a população dos Estados Unidos possui mais de 30 % de pessoas obesas (Baskin et al., 2005) e no Brasil, estudos feitos até o ano de 1997 mostraram que 12,5% das mulheres e 7% dos homens eram obesos (Uauy et al., 2001).
6 O excesso de peso e a obesidade resultam da interação entre fatores genéticos, metabólicos, comportamentais e ambientais. O alto consumo calórico, a diminuição no gasto energético ou a combinação de ambos leva a um balanço energético positivo e a um aumento acentuado no peso (Stein, 2004).
Nos últimos 15 anos houve um aumento do conhecimento biológico a respeito dos fenômenos que participam do controle neural da fome e da termogênese (Flier JS, 2004). O ponto de partida para tais avanços foi a identificação da leptina, um hormônio produzido pelo tecido adiposo branco em quantidade diretamente proporcional à massa total deste tecido (Zhang Y et al., 2005). O principal sítio de ação da leptina é o núcleo arqueado do hipotálamo (Flier JS, 2004; Friedman JM et al., 1998). Para alcançar os neurônios dessa região a leptina atravessa a barreira hemato-encefálica utilizando um sistema saturável de transporte mediado por receptores (Schwartz MW et al., 2000).
Pelo menos dois grupos distintos de neurônios estão presentes no núcleo arqueado, ambos possuindo receptores para leptina. São eles: neurônios produtores dos neurotransmissores orexigênicos NPY e AgRP (NPY/AgRPérgicos), e neurônios produtores dos neurotransmissores anorexigênicos POMC e CART (POMC/CARTérgicos). Além de expressarem receptores para leptina, tais grupos de neurônios expressam também receptores para insulina, hormônio este que desempenha um papel fundamental na modulação da ação da leptina (Schwartz MW et al., 2000).
Estudos realizados na segunda metade da década de 1990 revelaram que tanto a leptina quanto a insulina, mas principalmente ambos, agindo de forma combinada, têm a capacidade de inibir neurônios NPY/AgRPérgicos e ativar neurônios POMC/CARTérgicos (Schwartz MW et al., 2000; Zhang Y et al., 2005;
7 Torsoni MA et al., 2003). Neurônios NPY/AgRPérgicos encontram-se ativados durante períodos de jejum ou quando a massa total de tecido adiposo está reduzida. Nestas circunstâncias, projeções axonais entre neurônios do núcleo arqueado e neurônios dos núcleos paraventricular e hipotalâmico lateral levam à inibição da produção de neurotransmissores anorexigênicos e ativadores da termogênese (TRH e CRH) no núcleo paraventricular, além de ativação da produção de neurotransmissores orexigênicos e inibidores da termogênese (orexina e MCH) no núcleo hipotalâmico lateral. O resultado desta regulação é o aumento da fome e redução da termogênese.
Por outro lado, em períodos pós-prandiais ou quando estoques de energia no tecido adiposo são satisfatórios, há aumento dos níveis sanguíneos de insulina e leptina, o que leva à inibição dos neurônios NPY/AgRPérgicos e ao estímulo dos neurônios POMC/CARTérgicos. O resultado é a inibição de neurônios do núcleo hipotalâmico lateral, produtores de orexina e MCH e estímulo de neurônios do núcleo paraventricular, produtores de CRH e TRH. Ocorrerá então saciedade acompanhada de aumento da termogênese (Flier JS, 2004; Zhang Y et al., 2005).
8 Controle hipotalâmico da fome: A) Esquema representativo do hipotálamo de um momento de jejum, onde os hormônios insulina e leptina estão baixos na circulação, os neurônios orexigênicos localizados no núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) liberam neurotransmissores NPY/AGRP que por sua vez estimulam (linha verde) os neurônios do hipotálamo lateral (LH) a liberarem orexina e MCH e inibem o núcleo paraventricular (PVN) representado pela linha vermelha. Ação que resulta no aumento da fome e diminuição do gasto energético.
B) Esquema representativo do hipotálamo de um momento de pós prandial, onde os hormônios insulina e leptina estão em alta concentração na circulação, os neurônios orexigênicos localizados no núcleo arqueado do hipotálamo (ARC) liberam neurotransmissores NPY/AGRP nessa situação inibem os neurônios do hipotálamo lateral (LH), representado pela linha vermelha, e estimulam o núcleo paraventricular (PVN) a liberarem CRH e TRH, neuropeptídios anorexigênicos, representados pela linha verde. Ação que resulta na diminuição da fome e no aumento do gasto energético.
Os mecanismos moleculares de sinalização da insulina vêm sendo estudados de forma mais intensa desde o início da década de 1980, quando ocorreu a caracterização da atividade tirosina quinase intrínseca do seu receptor (IR) (Kasuga et al., 1982). Entretanto, a maioria dos estudos que geraram o conhecimento relativo à ação molecular da insulina foi desenvolvida em tecidos periféricos (tradicionais alvos da ação deste hormônio) como músculo esquelético, fígado e adiposo (Saltiel AR et al., 2001). Alguns estudos ocasionais publicados durante as décadas de 1960 a 1980 haviam revelado a presença da insulina e de seu receptor no sistema nervoso central (Margolis RU et al., 1967; Havrankova J et al., 1979; Woods SC et al., 1979). Entretanto, somente durante os últimos 10 anos obtiveram-se avanços importantes no conhecimento da ação central da insulina, especificamente nos núcleos hipotalâmicos.
Não existem diferenças estruturais entre o IR expresso em tecidos periféricos e no sistema nervoso central (Saltiel AR et al., 2001). Assim, após ligar-se ao IR
9 expresso no hipotálamo, a insulina promove, através de modificação conformacional, a ativação de um sítio catalítico localizado na região que compreende as tirosinas 1145, 1150 e 1151 da subunidade β do receptor (White MF, 2007). Uma vez ativo, este sítio catalisa a fosforilação em tirosina dos resíduos 953, 960, 1316 e 1322, o que torna o receptor apto a dar continuidade à transdução do sinal (White MF, 2007).
No hipotálamo, a insulina promove a ativação de pelo menos duas vias distintas de sinalização. A primeira via depende do recrutamento e fosforilação em tirosina de substratos clássicos do IR, os IRSs (Carvalheira JB et al, 2001; Torsoni MA et al., 2003). Aqui, como no caso da leptina, o IRS-2 parece desempenhar um papel predominante, podendo ser explicado, em parte, pela sua expressão preferencial em regiões que possuem maior número de neurônios que portam o IR (Torsoni MA et al., 2003). A fosforilação de IRSs promove a ligação e ativação da enzima PI3K (Torsoni MA et al., 2003; Carvalheira JB et al., 2003) que, como ocorre com a leptina, conecta o sinal da insulina ao controle do ritmo de disparos neuronais (Xu AW et al, 2005), mediado pela ativação de canais de potássio ATP-dependentes (Plum L et. Al., 2005). Através do controle do ritmo de disparos neuronais, a insulina modula, em paralelo à leptina, a liberação de neurotransmissores nas sinapses efetoras (Plum L et. Al., 2005).
A segunda via depende da ativação da enzima JAK2. Apesar de possuir atividade tirosina quinase intrínseca, o IR é capaz de interagir e ativar JAK2 em vários tecidos, inclusive no hipotálamo (Carvalheira JB et. Al., 2001). Uma vez fosforilada e ativa, a JAK2 recruta e fosforila STAT3, a qual conecta o sinal da insulina ao controle da transcrição de genes de neurotransmissores envolvidos com o controle da fome e da termogênese (Carvalheira JB et. Al., 2001). Entretanto a
10 ativação da transcrição gênica pela insulina através de STAT3 só é efetiva na presença da leptina (Carvalheira JB et. Al., 2001).
Avaliando as proteínas ativadas pela leptina e pela insulina no hipotálamo, fica evidente que ambas atuam sobre vias celulares similares. Esta sobreposição de vias de sinalização sugere que ambos hormônios controlam de forma recíproca seus efeitos. Este fenômeno de comunicação entre vias de sinalização e modulação de eventos celulares denomina-se cross-talk molecular. Aparentemente, o cross-talk entre as vias de sinalização da leptina e da insulina exerce um importante papel regulador sobre os efeitos fisiológicos finais de cada um destes hormônios (Carvalheira JB et. Al., 2001).
Adicionalmente, tem sido atribuído à insulina o papel de modulador do metabolismo celular em razão do controle negativo que este hormônio exerce sobre a AMPK (proteína ativada por AMP). De acordo Kovacic (2003), a insulina atua sobre a AMPK através da via PI3K/Akt em diferentes tecidos. A AMPK é também expressa em neurônios do sistema nervoso central (Turnley et al., 1999; Culmsee et al., 2001) e a modulação de sua atividade no hipotálamo é suficiente para alterar a ingestão alimentar e o peso corpóreo (Minokoshi et al., 2004). A AMPK foi primeiramente descrita como uma enzima capaz de fosforilar e inativar hidroximetilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA) e acetil-CoA-carboxilase (ACC), enzimas chaves na síntese de colesterol e ácidos graxos, respectivamente (Beg et al., 1973; Carlson e Kim, 1973). Na célula, a AMPK atua como um sensor energético intracelular (Hardie et al., 2003) e sua atividade é regulada pela razão AMP/ATP (Hardie et al., 1999).
O aumento na razão AMP/ATP ativa a AMPK em três vias: (1) a fosforilação da AMPK em Thr 172, pela enzima quinase AMPKK (conhecida como LKB-1), (2)
11 modificação alostérica, e (3) inibição da proteína fosfatase-2C. Este complexo mecanismo regulatório permite que a atividade da AMPK seja sensível a pequenas mudanças nas concentrações intracelulares de AMP. Quando ativada, a AMPK inibe as vias de consumo de ATP (síntese de ácidos graxos e síntese de colesterol) e ativa as vias que geram ATP (glicólise e oxidação de ácidos graxos), mantendo assim o balanço energético intracelular. Em roedores, a AMPK hipotalâmica é inibida por altas concentrações de glicose, leptina e insulina, ou seja, moléculas que diminuem a ingestão alimentar. Já a grelina, um hormônio produzido pelo estômago e que estimula a ingestão alimentar, ativa a AMPK (Andersson et al., 2004; Minokoshi et al., 2004). Portanto, a AMPK parece atuar como um elo entre os sinalizadores nutricionais e hormonais, os quais provêm da alimentação e das reservas energéticas. (Minokoshi et al., 2004). Acredita-se que a enzima mTOR (assim como a AMPK) seja um sensor energético intracelular uma vez que, quando a disponibilidade de energia intracelular é baixa (como ATP ou outras moléculas ricas em energia), a atividade da mTOR está diminuída.
Tanto a insulina quanto a leptina são capazes de modular a atividade dessa enzima quinase, com importante papel no metabolismo energético. A mTOR é uma serina/treonina quinase altamente conservada, responsável por controlar os aspectos críticos da regulação do crescimento celular, incluindo a transcrição, início da tradução e elongação protéica, além da progressão do ciclo celular (Lindsley JE et al., 2004; Wullschleger S et al., 2006). Quando há disponibilidade adequada de nutrientes a atividade quinase da mTOR é aumentada, levando à fosforilação de proteínas alvos da cascata de sinalização celular.
Deste modo, os níveis de atividade da mTOR variam diretamente de acordo com o estado nutricional, e inversamente à atividade da AMPK (proteína ativada por
12 AMP) (Hardie D G et al., 1997;Dennis PB et al., 2001). A razão AMP:ATP é considerada um sinal energético para a célula, pois indica a disponibilidade de energia para qualquer atividade celular. O aumento da fosforilação da mTOR dita o aumento da atividade anabólica, crescimento e reparo celular, enquanto a diminuição da ativação da mTOR causa o recuo dessas atividades celulares (Shaw R J et al., 2006; Wullschleger S et al, 2006).
A taurina (2 – ácido aminoestilsulfônico, Tau) é um aminoácido não protéico, presente em diversos tecidos animais. Apresenta-se em altas concentrações no músculo esquelético, coração, cérebro e retina. Embora possa ser sintetizada a partir de outros ácidos aminossulfônicos, como metionina e cisteína, a produção endógena de Tau em humanos é baixa, devendo ser consumida através da dieta. Produtos de origem animal como peixe, carne e leite são fontes ricas deste aminoácido, o qual apresenta propriedades anti-oxidantes, regula a concentração intracelular de Ca2+, atua como neuromediador e neuromodulador, é responsável pela osmoregulação, está envolvido na produção de ácido cólico e modula reações inflamatórias (Huxtable R, 1992).
Em pacientes com diabetes mellitus tipo I (insulino-dependente) e tipo II (não insulino-dependente), as concentrações plasmáticas e plaquetárias de Tau apresentam-se reduzidas (Franconi et al., 1995; De Luca et al., 2001). Ainda, trabalhos descrevem a deficiência de Tau em ratos com diabetes induzida por estreptozotocina (Copeland et al., 1990; Aerts & Van Assche, 2001; Colivicchi et al., 2004) e em ratos com resistência à insulina (Anuradha & Balakrishnan, 1999). Baixos níveis de Tau em diabetes relacionam-se diretamente à hiperglicemia e distúrbios na osmorregulação celular (Hansen SH, 2001). Dado que a Tau potencializa os efeitos da insulina, a suplementação de Tau fornecida a animais com
13 resistência à insulina normaliza não somente a concentração plasmática de insulina e glicose, mas também a sensibilidade à insulina, hipertensão e hiperlipidemia (Anuradha & Balakrishnan, 1999; Nakaya et al., 2000; Nandhini & Anuradha, 2002). Além disso, exerce efeito protetor contra a destruição de células em ratos tratados com estreptozotocina (Chang & Kwon, 2000) e, a longo prazo, aumenta a taxa de sobrevivência destes animais (Di Leo et al., 2004).
Como já descrito anteriormente, há evidências de que a Tau tenha propriedades hipoglicemiantes, uma vez que potencializa os efeitos da insulina (Lampson et al., 1983), além de interagir com seu receptor (Maturo e Kulakowski, 1988). A Tau aumenta a síntese de glicogênio, a glicólise e a captação de glicose no fígado e coração de ratos adultos (Lapson et al., 1983; Kulakowski e Maturo, 1984). Em ratos da linhagem OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty), modelos para diabetes mellitus tipo II com resistência à insulina, e também em humanos, a Tau melhora a sensibilidade à insulina (Nakaya et al., 2000; Xiao et al., 2008). Com base em todos estes relatos, nos quais encontramos evidências de que Tau exerce efeitos positivos sobre a sinalização da insulina na periferia, aventamos a hipótese de que a Tau pode exercer efeitos semelhantes aos da insulina no hipotálamo, reduzindo a ingestão alimentar.
14 OBJETIVOS Objetivo Geral
Avaliar a ação do aminoácido Tau sobre as vias de sinalização da insulina e da leptina em hipotálamo de ratos.
Objetivos Específicos
Avaliar a ação anorexigênica da Tau no hipotálamo;
Avaliar a ação molecular da Tau sobre a via de sinalização da leptina através da fosforilação e ativação de JAK2 e STAT3, substratos específicos dessa via;
Avaliar a ação molecular da Tau sobre a via de sinalização da insulina através da fosforilação e ativação de substratos dessa via (AKT e FOXO1);
Avaliar a ação molecular da Tau sobre alvos moleculares responsivos a alteração de nutrientes através da fosforilação e ativação das proteínas mTOR, AMPK e ACC;
Avaliar a ação do aminoácido Tau na ingestão alimentar através da inibição das vias de sinalização PI3K/Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 e ativação da AMPK; Avaliar o efeito da Tau sobre a expressão de neuropeptídeos orexigênicos e
15 MATERIAIS E MÉTODOS Animais experimentais
Foram utilizados ratos (Rattus norvergicus) machos com oito semanas de idade, da linhagem Wistar, provenientes do Biotério Central da UNICAMP (CEMIB). Ciclos de luz de 12 horas foram aplicados a todos os grupos e o peso dos animais foi obtido por meio de pesagem em balança de precisão. Os animais foram randomicamente divididos em três grupos: tratados por via intracerebroventricular com 2 µL de solução salina (C), insulina10-6
M (I), leptina10-6
M (L) e taurina 3x10-2
M (T).
Cirurgia Estereotáxica
Ao atingirem oito semanas de idade (250-300g) os ratos foram submetidos à canulação do ventrículo lateral. Os animais foram previamente anestesiados por via intraperitoneal com uma mistura de 2:8 (1mL) de diazepan (5,0mg/mL) e de cloridrato de cetamina (50mg/mL). Depois de testados os reflexos corneano, pedioso e caudal os animais foram posicionados no aparelho de estereotaxia para o implante de uma cânula no ventrículo lateral do hipotálamo, seguindo as coordenadas do atlas Paxinos-Watson (Paxinos et al, 1980) que variam de acordo com o peso do animal. Em ratos de aproximadamente 300g as coordenadas utilizadas são, anteroposterior: 0,2mm; lateral: 1,5mm; profundidade: 4,0mm. Os animais receberam analgesia durante três dias com paracetamol (3 gotas diluídas em 250mL de água).
16 Infusão Intracerebroventricular
Após o período de uma semana de recuperação da cirurgia estereotáxica, os animais foram submetidos a um teste de resposta a ingestão hídrica, decorrente do teste com angiotensina II (2,0µL de solução 10-6M), o qual avalia o correto posicionamento da cânula. Ratos com resposta positiva à angiotensina II foram selecionados e utilizados nos experimentos. Animais de cada grupo experimental receberam 2,0µL ICV de salina, insulina ou taurina nas concentrações já descritas.
Para infusão intracerebroventricular foi utilizada uma seringa Hamilton (50µL) acoplada, por meio de uma cânula plástica, a uma agulha 30G, de modo que esta ultrapassasse o comprimento da cânula metálica (0,1 – 0,2mm) garantindo a entrada do liquido no ventrículo lateral.
Avaliação de ingestão alimentar
Os animais foram colocados em gaiolas metabólicas e mantidos em jejum por 6 horas (início às 12h). Às 18h os ratos foram submetidos aos diferentes tratamentos por via ICV e a ingestão alimentar de 12 horas foi determinada pela aferição da diferença de peso entre o alimento oferecido e o alimento restante na gaiola.
Dissecção do hipotálamo
Os animais foram anestesiados através da administração intraperitonial de tiopental sódico (15mg/kg) e a perda dos reflexos pedioso, corneano e caudal foram utilizados como controle da anestesia. O crânio foi aberto, o hipotálamo retirado e em seguida homogeneizado em aproximadamente 10 volumes de Trizol ou em 10
17 volumes de tampão de solubilização (Triton X-100; 100mM Tris ph 7,4; contendo 100mM de pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio; 10mM de vanadato de sódio; 2mM PMSF e 0,1mg de aprotinina/ml) a 4° C em “Politron PTA 20S generator” (Brinkmann Instruments mode PT 10/35) com velocidade máxima por 30 segundos.
O homogeneizado com tampão de solubilização foi então centrifugado a 11.000 rpm por 30 minutos para remoção de material insolúvel. No sobrenadante foi determinada a concentração de proteínas utilizando-se o método de Bradford (Bradford, 1976).
Análises por Western blotting
Os imunocomplexos contendo 0,125mg de proteína foram ressuspensos em tampão de Laemmli, contendo 100mM de DTT. Após rápida fervura (5 minutos) foram aplicados em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (SDS- PAGE). As proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD. A membrana de nitrocelulose foi incubada 16-18 horas com anticorpo específico. A ligação do anticorpo à proteínas não específicas foi minimizada pela pré-incubação da membrana de nitrocelulose com tampão de bloqueio (5 % de leite em pó desnatado; 10mM de Tris; 150mM de NaCl; 0,02% de Tween 20) por 2 horas. As bandas protéicas foram visualizadas através de reação com anticorpos secundários ou ainda terciários, conjugados a peroxidase detectados por quimioluminescência. As membranas foram expostas a filmes de RX Kodak a temperatura ambiente por períodos variados. A quantificação das bandas foi feita através de densitometria óptica (Velloso et al., 1996; Araújo et al., 2005).
18 Análises por RT – PCR
Extração de RNA de hipotálamo – Após diferentes tratamentos, o hipotálamo
foi extraído segundo o método de extração de tecidos. O material foi homogeneizado com politron em 1mL de Trizol. Após a homogeneização, o material insolúvel foi removido por centrifugação a 12.000 x g, por 10 minutos, a 4°C. O sobrenadante, contendo o RNA, foi então transferido para outro tubo e mantido em repouso por 5 minutos, permitindo a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas. Em seguida, foi adicionado 0,3mL de clorofórmio / 1,0mL de Trizol e a amostra foi agitada vigorosamente por 15 segundos e incubada em temperatura ambiente por 3 minutos. Após centrifugação a 12.000 x g, por 15 minutos, a 4°C, a amostra se separou em duas fases: a orgânica (inferior, de coloração rosada) e a aquosa (superior, mais clara), que abrange cerca de 2/3 do volume total. Nestas fases estavam solubilizados o DNA e o RNA, respectivamente, além da banda de proteínas presente entre as duas. A fase aquosa foi coletada e transferida para um novo tubo, onde o RNA foi precipitado através de incubação por 10 minutos, à temperatura ambiente, com 0,5mL de isopropanol, seguida de centrifugação a 12.000 x g , por 10 minutos, a 4°C. Para lavar o RNA, o precipitado foi ressuspendido em 1mL de etanol 75% e a amostra centrifugada a 7.500 x g, por 5 minutos, a 4°C. O RNA foi eluído em 50µL de água RNAse-free e quantificado em espectrofotômetro a 260nm. A integridade do RNA obtido foi determinada submetendo as amostras à eletroforese em gel de agarose (1,5%).
Reação de transcrição reversa – A fita-molde de cDNA foi obtida através de
uma reação de transcrição reversa. Para tanto, as amostras de RNA foram submetidas a uma seleção do RNAm, utilizando-se um oligonucleotídeo poli dT, e posteriormente à transcrição com a enzima transcriptase reversa. O cDNA obtido,
19 tanto de animais controle quanto o de animais tratados, foi utilizado na reação do PRC e tempo real.
PCR quantitativo (qPCR) – Real Time PCR
As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems), que é constituído por um par de oligonucleotídeos e uma sonda marcada com um fluoróforo. Foram utilizadas as seguintes análises:
Gene NPY: análise Rn: 0056168-m1e Mm:00445771-m1 (Applied Biosystems).
Gene POMC: análise Rn: 00595020-m1e Mm:00435874-m1 (Applied Biosystems).
O gene GAPD (TaqManTM - Applied Biosystems) foi escolhido como controle endógeno da reação, o qual serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD está marcada com o fluoróforo VIC.
Antes de se iniciarem os experimentos de quantificação relativa da expressão de qualquer gene, foi feita a validação do sistema para os genes acima e para o controle endógeno (GAPD), a fim de se verificar se as eficiências de amplificação de ambos os genes foram semelhantes e próximas a 100%. Esse passo é essencial para que o controle endógeno possa ser utilizado para normalizar os valores de expressão relativa do gene de interesse. A validação consiste na amplificação, tanto com os oligonucleotídeos do gene de interesse quanto do controle endógeno, dos cDNAs de triplicatas de sete concentrações diferentes (diluições seriadas de três vezes) de uma amostra escolhida aleatoriamente. Em seguida, foi construída uma
20 curva padrão a partir do logarítmo da concentração das amostras pelo Ct (Threshold
Cycle: ciclo em que cada curva de amplificação atravessa o limiar de detecção
(Threshold), o qual é definido arbitrariamente). Nessa curva, foram obtidos os valores da inclinação (slope) da curva e da confiabilidade das réplicas (R2). Dessa forma, a eficiência de um sistema é calculada através da fórmula: E = 10(-1/slope) -1. Para a placa de validação dos genesforam feitas triplicatas da amostra de cDNA de hipotálamo referentes aos tratamentos citados acima em sete concentrações diferentes.
Após o cálculo das eficiências de amplificação do gene de interesse e do controle endógeno, foi construído um gráfico de dispersão, o qual teve por finalidade definir qual era a amplitude de concentrações para as quais o sistema era eficiente. Para a construção do gráfico, foram utilizados os mesmos valores de logarítmo da concentração das amostras no eixo X e a diferença entre as médias dos Cts do controle endógeno e as médias dos Cts do gene de interesse para cada concentração no eixo Y. A seguir, obteve-se uma linha de tendência para estes valores, a qual possuía uma equação de reta na qual era possível verificar o valor da inclinação desta reta. Para que um sistema seja considerado eficiente, o valor da inclinação deve ser menor que 0,1 (quanto mais próximo de zero for este valor, menor é a inclinação da curva e, portanto, mais constante é a diferença entre as médias dos Cts do gene de interesse e do controle endógeno). Os pontos no gráfico, correspondentes às concentrações, que estiveram mais próximos à linha de tendência foram considerados validados (o sistema tem 100% de eficiência nestas concentrações).
Para a quantificação relativa do gene em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 6,25µL de TaqMan Universal
21 PCR Master Mix 2x, 0,625µL da solução de oligonucleotídeo e sonda, 1,625µL de água e 4,0µL de cDNA, sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0µL de água ao invés do cDNA. As condições de ciclagem utilizadas foram: 50oC por 2 minutos, 95oC por 10 minutos e 40 ciclos de 95oC por 15 segundos e 60oC por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Quando comparados dois grupos, foi utilizado teste t de Student para dados não pareados. Quando necessário foi utilizada ANOVA (análise de variância), seguida de teste para comparação múltipla de médias. Foi adotado o nível de significância P<0,05.
22 ARTIGO
Research Article
Taurine enhances the anorexigenic effects of insulin in the hypothalamus 1-2
Carina S. Solon3, Daniel Franci3, Letícia M. I. Souza3 , Talita Romanatto3, Erika R. Roman3, Ana P. Arruda3, Adriana S. Torsoni3, Everardo M. Carneiro4, Licio A. Velloso3*
3
Laboratory of Cell Signaling and 4Department of Physiology and Biophysics, University of Campinas, Brazil
1
Supported by grants from the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
2
Author disclosures: CSS, DF, LMIS, TR, ERR, APA, AST, EMC and LAV have nothing to declare
* To whom correspondence should be addressed: L. A. Velloso email
23 Introduction
Taurine dietary supplementation is reported to exert a number of beneficial effects in diseases such as diabetes, hypercholesterolemia, ischemia and neuronal damage (1-3). The mechanisms involved on its actions range from increasing insulin secretion (4) and action (5), in diabetes; reduction of hepatic cholesterol production, in hypercholesterolemia (6); and reduction of caspase-8 and -9, in ischemic neuronal apoptosis (7). Some of these mechanisms depend, at least in part, on the antioxidant actions of taurine (8,9).
In type 2 diabetes, both experimental and clinical evidence suggest that taurine can reduce insulin resistance, leading to increased insulin-dependent glucose uptake (9). In humans, it has been suggested that the taurine-dependent reduction of oxidative stress could be one of the mechanisms responsible for reducing insulin resistance, but other mechanisms have not been ruled out (9). In experimental animals, taurine was shown to increase insulin signal transduction though the PI3-kinase pathway, resulting in increased glucose uptake (10).
Besides its well known actions in peripheral tissues, insulin, acting in concert with leptin, also plays an important physiological role in the hypothalamus, controlling food intake and energy expenditure (11). Recent studies have shown that resistance to the effects of leptin and insulin in the hypothalamus is involved in the pathogenesis of obesity and may precede peripheral insulin resistance in experimental animals with obesity and type 2 diabetes (12-14). Since taurine can improve insulin action in peripheral tissues and, bearing in mind that this amino acid is present in high amounts in the central nervous system, we decided to evaluate its effect on food intake and insulin signal transduction in the hypothalamus. Our results show that
24 taurine can reduce food intake and stimulate all the intracellular pathways involved in insulin and leptin actions in the hypothalamus.
Materials and methods
Antibodies, chemicals and buffers. The reagents for SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis and immunoblotting were from Bio-Rad (Richmond, CA, USA). HEPES, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), aprotinin, dithiothreitol, Triton X-100, Tween 20, glycerol and bovine serum albumin (fraction V) were from Sigma (St. Luis, MO, USA). Nitrocellulose membrane (BA85, 0.2 m) was from Amersham (Aylesbury, UK). Amobarbital and human recombinant insulin (Humulin R) were from Lilly (Indianapolis, IN, USA). Anti-JAK2 (sc-278, rabbit polyclonal), anti-Akt (sc-1618, goat polyclonal), phosphotyrosine (pY) (sc-508, mouse monoclonal), anti-phospho Ser473 Akt (sc-7985-R, rabbit polyclonal), anti-STAT3 (sc-7179, rabbit polyclonal), anti-phospho [Tyr705] STAT3, anti-FOXO1 (sc-11350, rabbit polyclonal), anti-phospho [Ser256] FOXO1 (sc-22158-R, rabbit polyclonal), anti-AMPK (sc-25792, rabbit polyclonal), and anti-phospho [Thr172] AMPK (sc-101630, rabbit polyclonal) antibodies were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-phospho [Ser79] acetyl CoA carboxylase (ACC) (#07-184, rabbit polyclonal) antibody was from Upstate Biotechnology (Charlottesville, VA, USA). Anti-mTor (#4517, mouse monoclonal) and anti-phospho [Ser2448] mTor (#2971, rabbit polyclonal) antibodies were from Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Anti -actin (#ab6276, mouse monoclonal) was from Abcam (Cambridge, MA, USA). The PI3K inhibitor LY294002, the JAK2 inhibitor AG490 and the AMPK activator, AICAR, were from EMD Chemicals (Darmstadt, Germany).
25
Animal model and experimental protocols. In all experiments, 8 w old, male Wistar
rats with a body mass of 250-300 g were employed. The animals were maintained on a 12:12 h artificial light-dark cycle and housed in individual cages. The investigation followed the University guidelines for the use of animals in experimental studies and conforms to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the US National Institutes of Health (NIH publication No. 85-23 revised 1996). The animals were stereotaxically instrumented to receive a cannula placed in the lateral ventricle, as previously described (15). After seven days, the correct location of the cannula was tested by injecting 2.0 l angiotensin II (10-6 M) and determining the thirst response (13). For this, rats were water deprived for two hours and immediately after icv injection of angiotensin II, a bottle containing 10.0 ml water was made available. Only the rats spontaneously drinking at least 5.0 ml water in 30 min were considered correctly cannulated and used in the experiments. For evaluation of spontaneous food intake, the rats were food deprived for 6 h (12:00 – 6:00 PM) and then treated with a single dose (2.0 l) of insulin (1.0 M), taurine (1.0, 3.0 or 5.0 mM), or insulin (1.0 M)+taurine (3.0 mM). For immunoblot experiments, icv cannulated rats were acutely treated with a single dose (2.0 l) of insulin (1.0 M), taurine (3.0 mM) or insulin (1.0 M)+taurine (3.0 mM) and the hypothalami were obtained for protein extract preparation. In some experiments, rats were treated in advance with a single dose of LY294002 (3.0 pmol), AG490 (10.0 pmol) or AICAR (25.0 mM).
Immunoprecipitation and immunoblotting. For evaluation of protein expression and
activation of signal transduction pathways, the hypothalami of anesthetized rats were excised and immediately homogenized in solubilization buffer at 4ºC [1% Triton X-100, 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM sodium pyrophosphate, 100 mM sodium
26 fluoride, 10 mM EDTA, 10 mM sodium orthovanadate, 2.0 mM PMSF and 0.1 mg aprotinin/ml] with a Polytron PTA 20S generator (model PT 10/35; Brinkmann Instruments, Westbury, NY, USA). Insoluble material was removed by centrifugation for 40 min at 11,000 rpm in a 70.Ti rotor (Beckman) at 4ºC. The protein concentration of the supernatants was determined by the Bradford dye method. Aliquots of the resulting supernatants containing 0.2 mg of protein extracts were separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and blotted with antibodies. Specific bands were detected by chemiluminescence and capture was performed with a Syngene GBox (Imgen Technologies, Alexandria, VA, USA).
Real-time PCR. The expressions of NPY and POMC mRNAs were measured in
hypothalami obtained from rats treated icv with insulin (2.0 L, 1.0 M) or taurine (2.0 L, 3.0 mM). Intron-skipping primers were obtained from Applied Biosystems. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase primers were used as a control. Real-time PCR analysis of gene expression was performed with an ABI Prism 7700 sequence detection system (Applied Biosystems). The optimal concentration of cDNA and primers, as well as the maximum efficiency of amplification, were obtained through five-point, two-fold dilution curve analysis for each gene. Each PCR contained 3.0 ng of reverse-transcribed RNA, 200 nM of each specific primer, TaqManTM (Applied Biosystems), and RNase free water in a final volume of 20 l. Real-time data were analyzed using the Sequence Detector System 1.7 (Applied Biosystems) (16).
Statistical analysis. Specific protein bands present in the blots were quantified by
digital densitometry (Dimension, Imgen Technologies). Mean values ± SEM obtained from densitometry scans and food intake measurements were compared utilizing
27 Turkey-Kramer test (ANOVA) or Student’s t test, as appropriate; p<0.05 was accepted as statistically significant.
Results
Taurine injection in the hypothalamus reduces food intake. The acute injection of a
single dose of taurine icv in the hypothalamus produces a dose-dependent reduction of spontaneous food intake (Fig. 1A). This effect is of similar magnitude to that produced by insulin, reducing food intake by approximately 30% (Fig. 1B). Moreover, taurine and insulin have additive effects, since simultaneous injections of both compounds produce a net food intake reduction that is 15% lower than that achieved by either compound alone (Fig. 1B).
Taurine modulates signal transduction though the same pathways targeted by insulin. The injection of a single icv dose of taurine in the hypothalamus activates
signal transduction through the Akt/FOXO1 (Fig. 2A and 2B), JAK2/STAT3 (Fig. 2C and 2D) and mTOR/AMPK/ACC (Fig. 2E-2G) pathways. Interestingly, in at least four of the evaluated proteins, taurine significantly increases the effect of insulin: FOXO1 (Fig. 2B); JAK2(Fig. 2C); STAT3 (Fig. 2D); and, mTOR (Fig. 2E).
Taurine reduces NPY expression in the hypothalamus. Since the anorexigenic action
of insulin in the hypothalamus depends on neurotransmitter expression, we evaluated the effects of taurine in two neurotransmitters expressed by first order hypothalamic neurons. Similarly to insulin, taurine alone is capable of reducing the hypothalamic expression of NPY (Fig. 3A) without affecting the expression of POMC (Fig. 3B).
The anorexigenic effect of taurine is targeted by inhibitors of the PI3K and JAK2. To
28 employed chemical inhibitors of PI3K and JAK2 and an inducer of AMPK activity, in parallel with icv taurine. As depicted in Figure 4, the inhibition of either PI3K (Fig. 4A) or JAK2 (Fig. 4B) completely blocks the anorexigenic effect of taurine. Conversely, treatment with the AMPK stimulating compound, AICAR, promotes only a partial reversion of the anorexigenic effect of taurine (Fig. 4C).
Discussion
Following the identification of leptin in 1994 (17), great progress has been obtained in the characterization of the roles played by the hypothalamus in the control of feeding, thermogenesis and adiposity. Leptin and insulin provide the most robust adiposity signals acting primarily, but not exclusively, through first-order neurons of the arcuate nucleus (18). In addition, a number of hormones and nutrients provide satiety signals that play important roles in the initiation and termination of a meal (19-21). The hypothalamic signals generated by some of these hormones and nutrients can integrate with the adipostatic signals produced by leptin and insulin, therefore modulating the energy balance in the whole body (20,21). At the molecular level, this integration of signals occurs through conserved pathways, where the JAK2/STAT3, PI3K/Akt/FOXO1 and AMPK/ACC pathways are the most relevant (18,20). Some examples of molecular cross-talk in the hypothalamus, which lead to the modulation of energy homeostasis, have been recently explored and invariably involve one or more of the pathways described above. Thus, adiponectin, an adipokine produced in the adipose tissue, can enhance the hypothalamic actions of insulin by activating the IRS/PI3K/Akt pathway (22), while leucine can modulate insulin/leptin signaling through the AMPK pathway (23).
29 Despite the rapid progress in the characterization of the involvement of the hypothalamus in the genesis of obesity, no major innovation has been introduced so far in the treatment of this prevalent disease. Most efforts to limit or reduce body adiposity still rely on behavioral approaches and on the employment of a few drugs that produce a body mass reduction of 10-15%, at most. Thus, characterizing novel mechanisms involved in the control of feeding and thermogenesis may uncover potential targets for the development of more efficient methods to tackle this disease. In association with a number of studies advocating a beneficial role for taurine in diabetes, atherosclerosis and neural ischemia, recent studies have reported the potential role for taurine in obesity. Initially, it was suggested that the nutritional deficiency of taurine could predispose to obesity (24). This was followed by the demonstration of a reduced adiposity in C. elegans cultivated in a taurine reach medium (25). Finally, a recent study showed a reduction of body adiposity in a rodent model of obesity treated with taurine supplementation (26). Therefore, we decided to evaluate the hypothalamic effects of taurine on the modulation of feeding.
Initially, we showed that taurine exerts a potent and dose dependent anorexigenic effect when injected in the hypothalamus. This effect is of similar magnitude to the effect produced by either insulin or leptin (22), alone. Interestingly, when administered simultaneously with insulin, an enhancement of the anorexigenic actions of either compound alone was obtained. Thus, the potential for taurine to act as an insulin-sensitizing compound goes beyond its effects on peripheral tissues, as previously reported (27).
To define the molecular mechanisms involved in the anorexigenic effect of taurine, we evaluated proteins involved in the orexigenic/anorexigenic signaling of three distinct pathways. In all cases, taurine acted similarly to insulin, stimulating the
30 activities of the Akt/FOXO1 and JAK2/STAT3 signaling pathways, while inhibiting the AMPK signaling pathway. In four of the evaluated proteins, taurine was capable of enhancing the effect of insulin alone, in accordance with the effect of taurine on the suppression of food intake.
Most of the hypothalamic actions of insulin are mediated by first order neurons of the arcuate nucleus (18,21). Two distinct subpopulations of neurons coexist in this anatomical region. Orexigenic neurons expressing NPY and AgRP, which are mostly active during fasting, and anorexigenic neurons expressing POMC and CART, which are active following a meal (18,21). Previous studies have shown that insulin alone can reduce NPY expression, whereas only leptin or a combination of leptin and insulin can increase the expression of POMC. Here, taurine was capable of reproducing the effects of insulin, reducing the expression of NPY, without affecting the expression of POMC (18,21).
In the last part of the study, we used a pharmacological approach to define the impact of each of the analyzed signaling pathways, i.e., PI3K/Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 and AMPK, on the anorexigenic actions of taurine. Interestingly, the inhibition of either PI3K or JAK2 resulted in the complete abolition of the effect of taurine. However, while the treatment with the AMPK stimulating agent, AICAR, increased basal food intake, its effect on taurine suppression of feeding was only partial. Since the PI3K and JAK2 signaling pathways have rather overlapping and complementary roles in the control of feeding, we suspect that by inhibiting one of these pathways we almost completely disrupted the action of taurine. Conversely, although the AMPK pathway can establish a cross-talk with either the PI3K and/or the JAK2 signaling systems, it plays a minor role in the net effect of taurine, as it occurs with insulin (23).
31 In summary, the aminoacid, taurine, acts in the hypothalamus to suppress food intake and enhance the action of one of the most important adipostatic messengers, insulin. These data reinforce the clinical and nutritional observations regarding an anti-adipogenic action of taurine, providing a mechanistic basis for this effect.
Acknowledgements. Grants for these studies were provided by Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). The Laboratory of Cell Signaling is a member of the Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Obesidade e Diabetes and also a member of the Gastrocentro – University of Campinas. We thank Dr. N. Conran for English grammar review and Mr. G. Ferraz and Mr. M. Cruz for technical assistance.
32 Figures
Figure 1. Taurine inhibits food intake. Icv cannulated rats were food deprived for 12 h and treated with saline (2.0 L) (Ct) or taurine, (2.0 L, 1.0, 3.0 or 5.0 mM) (Ta) just before food reintroduction for determination of spontaneous food intake over 12 h (A); another group of rats were treated with saline (2.0 L) (Ct), insulin (2.0 L, 10
-6
M) (In), taurine (2.0 L, 3.0 mM) (Ta), or a combination of insulin and taurine (2.0 L, 10-6M and 2.0 L, 3.0 mM, respectively) (In+Ta) and spontaneous food intake was determined over 12 h (B). In all experiments, n=5, *<0.05 vs. Ct; #<0.05 vs. In.
34 Figure 2. Taurine activates signal transduction in the hypothalamus. Icv cannulated rats were treated with saline (2.0 L) (Ct), insulin (2.0 L, 10-6M) (In), taurine (2.0 L, 3.0 mM) (Ta), or a combination of insulin and taurine (2.0 L, 10-6M and 2.0 L, 3.0 mM, respectively) (In+Ta) and, after 10 min, hypothalami were obtained for total protein extract preparation for SDS-PAGE and immunobloting for detection of phosphorylated (p) forms of Akt (A), FOXO1 (B), JAK2 (C), STAT3 (D), mTOR (E), AMPK (F) and ACC (G). All membranes were stripped and reblotted with anti- actin antibodies. In all experiments, n=5, *<0.05 vs. Ct; #<0.05 vs. In.
35 Figure 3. Taurine modulates NPY expression in the hypothalamus. Icv cannulated rats were treated with saline (2.0 L) (Ct), insulin (2.0 L, 10-6M) (In) or taurine (2.0 L, 3.0 mM) (Ta) and, after 3 h, hypothalami were obtained for RNA preparation for real-time PCR for NPY (A) and POMC (B). In all experiments, n=5, *<0.05 vs. Ct.
36 Figure 4. Exploring the pathways involved in taurine action in the hypothalamus. Icv cannulated rats were food deprived for 12 h and treated with saline (2.0 L), LY294002 (2.0 L , 3.0 pmol) (A), AG490 (2.0 L , 10.0 pmol) (B) or AICAR (2.0 L , 25.0 mM) (C), right after the animals were treated with saline (2.0 L) (Ct) or taurine, (2.0 L, 3.0 mM) (Ta) just before food reintroduction for determination of spontaneous food intake over 12 h. In all experiments, n=5, *<0.05 vs. Ct; #<0.05 vs. Ta.
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40 CONCLUSÃO
Um vasto número de publicações científicas tem nos revelado que, no SNC, o hipotálamo é a principal região envolvida com o controle do metabolismo energético. Esta região do encéfalo é alvo da ação de diferentes moléculas anorexigênicas, dentre elas hormônios (insulina e leptina) e nutrientes (glicose e aminoácido). Tais substâncias estimulam o gasto energético e diminuem a ingestão alimentar, controlando dessa maneira o peso corpóreo. Em situações nas quais ocorre resistência hipotalâmica à sinalização anorexigênica é comum a hiperfagia que, por sua vez, pode levar à obesidade e ao diabetes mellitus tipo II.
Dentro desse contexto, os estudos acerca do metabolismo energético têm se tornado frequentes. Recentemente, Dennis et al. (2001) publicaram um trabalho mostrando que a mTOR atua como um sensor energético intracelular, dado que esta serina/treonina quinase é capaz de perceber mudanças no estado energético celular a partir de variações na concentração de ATP. Sabatini et al. (1994) e Schmelzle et al (2000) mostraram ainda que a mTOR integra vias de sinalização desencadeadas por nutrientes e hormônios. Ainda, Cota et al. (2006), demonstraram que o aminoácido L-leucina, administrado ICV, foi capaz de induzir a anorexia, o que foi acompanhada de uma significativa perda de peso.
Em nosso estudo demostramos que a taurina age no hipotálamo suprimindo a ingestão alimentar, com magnitude similar a da insulina, agindo de forma semelhante à insulina por estimular as atividades das vias de sinalização Akt/FOXO1, mTOR, JAK2/STAT3 enquanto inibiu a atividade da via de sinalização da AMPK. A inibição das vias de sinalização da PI3K/Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 resultou na abolição total do efeito da taurina sobre o controle da fome, enquanto a
41 utilização do ativador alostérico da AMPK promoveu uma supressão apenas parcial da ingestão alimentar. Por fim verificamos que a taurina foi capaz de reproduzir os efeitos da insulina, reduzindo a expressão do neuropeptídeo NPY, sem afetar a expressão da POMC.
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