Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012
Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em MEDICINA
1º Ano
ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO
4ª AULA PRÁTICA
1. Princípios gerais de espetrofotometria de absorção
2. Análise dos espetros de absorção da hemoglobina
Princípios gerais de espectrofotometria de absorção
A luz visível (espectro visível) é uma pequena porção do espetro da radiação eletromagnética, que vai desde as ondas de rádio aos raios gama. O espetro visível abrange comprimentos de onda (λ) entre os 400 e os 700nm, localizando-se entre a radiação ultra-violeta (λ<400nm) e os raios infra-vermelhos (λ >700nm).
Cada substância absorve mais fortemente a radiação eletromagnética, nomeadamente da luz, nuns λdo que noutros, uma vez que a absorção da radiação eletromagnética resulta da sua interação com os electrões da última camada (de valência), cujo nº e nível energético são próprios de cada substância. A absorção da radiação eletromagnética característica de cada substância, que representa o seu espectro de absorção. Este pode ser utilizado para caracterizar e identificar uma ou mais substâncias numa mistura.
Por outro lado, a absorção da radiação eletromagnética por uma substância em solução pode ser utilizada para determinar a sua concentração. De facto, para soluções diluídas e usando radiação monocromática, ie com um determinadp λ (ou uma gama muito estreita de λ) existe uma relação linear entre a concentração da substância e a quantidade de radiação absorvida.
Leis da absorção aplicáveis à determinação da concentração de substâncias em solução (Lei de Beer-Lambert)
Quando um feixe de luz passa através de uma solução, parte da luz é absorvida pelos componentes da solução (Fig. 3). A relação matemática entre a concentração de uma substância em solução e a absorção é dada pela lei de Beer-Lambert.
Fig. 3- Percurso de um feixe de luz no espectrofotómetro. A luz emitida pelo monocromador tem um único comprimento de onda e incide na amostra contida no tubo ou cuvete. A luz que não é absorvida, é transmitida e o detetor permite-nos determinar a luz que foi absorvida pela amostra. De forma a evitar fenómenos de refracção, reflexão ou absorvância inespecífica por outros componentes da amostra que contém a substância a analisar, usa-se um “branco”, que contém todos os componentes da amostra, excepto aquele que se quer detectar.
Consideremos um tubo de espessura (l), contendo uma solução, e um feixe de luz monocromática (Io) que a atravessa:
Io I
l
A lei de Lambert pode expressar-se por:
Io
log K1 x l I
em que: Io = intensidade original do feixe de luz ; I = intensidade do feixe de luz depois de atravessar a solução; l = espessura da solução, expressa em centímetros; K1 = constante de proporcionalidade que depende das características de absorção da substância, da temperatura e do comprimento de onda utilizado
A lei de Beer pode também expressar-se de outra forma:
Io
log K2 x C
I
em que: Io e I têm o mesmo significado; C = concentração da substância em solução, expressa em moles por litro (ou molar); K2 = constante de proporcionalidade
Combinando as duas expressões obtém-se a equação fundamental da absorção da luz, conhecida como lei de Beer-Lambert:
Io
log = k x l x C I
em que: k = coeficiente de extinção molar, normalmente referido por εεεε Io
e log = DO (densidade óptica)
I
Assim, a expressão da lei de Beer-Lambert pode tomar a seguinte forma:
DO = εεεε x l x C
Designa-se coeficiente de extinção molar (εεεε) ao valor da DO de uma substância de concentração 1 M, medida num tubo com uma espessura de 1cm.
O coeficiente de extinção molar é específico da substância, para um dado comprimento de onda, e tem normalmente um valor grande quando a luz de um dado comprimento de onda é absorvida eficientemente pela substância.
A lei de Beer-Lambert pode ser utilizada para determinar o coeficiente de extinção molar de substâncias e para determinar a concentração de uma ou mais substâncias, em solução. Deve notar-se que as leis da absorção indicadas só se aplicam à luz monocromática (de um só comprimento de onda) e não podem ser aplicadas a bandas, ainda que estreitas, de diferentes comprimentos de onda.
A lei de Beer-Lambert é válida somente para soluções relativamente diluídas, uma vez que acima de certas concentrações a relação entre a DO e a concentração deixa de ser linear, como se exemplifica na Fig. 4.
Para que seja possível utilizar a relação entre a densidade óptica de soluções de concentração conhecida e a concentração (curva padrão), para extrapolar concentrações de amostras de concentração desconhecida a partir da sua DO, é necessário que o meio usado na preparação dos padrões seja o mesmo usado na preparação das amostras e que se desconte sempre a leitura da DO do solvente sem substância adicionada, a todas as leituras das amostras.
DO
0,6
0,5
Lei de Beer-Lambert não aplicável 0,4
0,3 Lei de Beer-Lambert aplicável
0,2
0,1
0
2,5 5,0 7,5 10,0
Concentração (mg/ml)
Fig. 4- Relação entre a densidade óptica (DO) e a concentração de uma substância em solução. Esta curva padrão só deve ser utilizada para calcular a concentração de uma dada solução a partir da DO avaliada na região linear (linha a tracejado). No exemplo indicado, a uma DO de 0,2, corresponde uma concentração de 2,5 mg/ml.
● A absorção da luz e a identificação de diferentes substâncias - espetros de absorção de diferentes formas de hemoglobina
A análise por difracção de raios X da desoxihemoglobina mostra que a estrutura terciária das quatro subunidades é idêntica à observada na oxihemoglobina; porém, existe uma alteração significativa na estrutura quaternária, isto é, no modo como as cadeias estão orientadas umas em relação às outras. Na desoxigenação, as cadeias α sofrem uma rotação de cerca de 9º e as cadeias β de cerca de 7º, seguindo eixos diferentes, o que origina uma alteração nos pontos de contacto entre as quatro subunidades e a formação de novas ligações iónicas entre elas. Na oxigenação, a ligação das quatro moléculas de oxigénio, cada uma apresentando um diâmetro relativamente pequeno, pode ocasionar uma profunda alteração na estrutura quaternária da hemoglobina.
A hemoglobina constitui cerca de 90% da proteína total do GV, encontrando-se concentrada no citoplasma. Devido à capacidade da hemoglobina em ligar oxigénio, o sangue total pode absorver cerca de 21 ml de oxigénio gasoso por 100 ml de sangue, enquantoque o plasma sanguíneo absorve apenas cerca de 0,3 ml de oxigénio.
O modo como a molécula de hemoglobina liga o oxigénio tem uma importância fundamental na sua função como transportador de oxigénio no glóbulo vermelho (GV), dos pulmões para os tecidos periféricos, “pobres” em oxigénio.
A curva sigmoidal de ligação do oxigénio pela hemoglobina (Fig. 1) significa que esta possui uma afinidade relativamente baixa para a ligação da primeira ou segundamoléculas de oxigénio; porém, uma vez que estas estejam ligadas, a ligação das moléculas de oxigénio subsequentes é bastante favorecida. É de salientar que a ligação da hemoglobina ao oxigénio requer que o ião ferro do grupo hémico se encontre na forma reduzida (Fe2+). De forma inversa, a perda de uma molécula de oxigénio pela molécula de hemoglobina, totalmente oxigenada, ocasiona a dissociação das moléculas de oxigénio restantes mais rapidamente, favorecida também quando a pressão parcial de oxigénio é baixa.
% saturação
100%
50%
0
pO2 (mmHg)
Fig. 1- Curva sigmoidal de ligação do oxigénio pela hemoglobina.
A interacção hemoglobina/oxigénio é também afectada pelo pH. Quanto mais elevado for o pH da solução de hemoglobina, a uma determinada pressão parcial de oxigénio, maior é a percentagem de saturação com o oxigénio. Este efeito, reversível, ocorre, porque a hemoglobina oxigenada se ioniza, libertando um protão por cada oxigénio ligado, de acordo com a Reacção 1:
HHb+ + O2 ⇔⇔⇔⇔ HbO2 + H+ (Reacção 1),
na qual HHb+, é uma subunidade protonada da molécula de desoxi-hemoglobina. Uma vez que essa reacção é reversível, o aumento na concentração de H+ ocasionará o deslocamento do equilíbrio para a esquerda, no sentido da menor saturação, enquanto que uma diminuição da concentração hidrogeniónica (↓ [H+
] ↑ pH) ocasionará o
deslocamento do equilíbrio para a direita, no sentido do aumento da saturação. O efeito do pH no equilíbrio oxigénio/hemoglobina é denominado efeito de Bohr.
A pressão parcial do oxigénio e o pH são os dois factores mais importantes que regulam a função da hemoglobina no transporte do oxigénio. Nos pulmões, onde a pressão parcial do oxigénio é elevada (cerca de 100 mmHg) e o pH é também relativamente alto, a hemoglobina tende a atingir quase o máximo de saturação com o oxigénio (cerca de 96%). No interior dos tecidos periféricos, onde a tensão do oxigénio é
baixa (cerca de 45 mmHg) e o pH também é baixo (devido à elevada concentração do CO2, formado como produto final do metabolismo energético), a hemoglobina liga-se ao
oxigénio com menos intensidade e irá, assim, ceder parte do seu oxigénio às células. Ao nível dos tecidos, a hemoglobina apresenta cerca de 65% saturação pelo O2. Assim, a
hemoglobina apresenta uma variação entre 65 e 96% de saturação, na sua função como transportadora do oxigénio.
A determinação dos espetros de absorção das diferentes formas de hemoglobina tem como objectivo ilustrar como o espetro de absorção serve para caracterizar substâncias de acordo com as suas propriedades de absorção da luz.
Na Fig. 2 são apresentados, como exemplo, os espectros de absorção da hemoglobina na forma oxigenada (oxi-hemoglobina) e desoxigenada (desoxi-hemoglobina). Os espectros da hemoglobina oxigenada e desoxigenada são diferentes, o que impossibilita uma determinação precisa da concentração de hemoglobina total numa solução que contém as duas formas (oxigenada e desoxigenada) em proporções desconhecidas. Uma possibilidade de resolver o problema é converter toda a hemoglobina na forma desoxigenada, medindo a sua concentração nesta forma. O problema prático é que uma solução de hemoglobina desoxigenada, por exemplo, pela acção do ditionito de sódio, não é estável, porque a reação é reversível e a hemoglobina vai-se oxigenando lentamente. No entanto, a hemoglobina pode ser convertida irreversívelmente em cianometahemoglobina, através da adição de um reagente apropriado, o reagente de Drabkins, usado correntemente na determinação clínica da concentração de hemoglobina no sangue.
--- Oxi-hemoglobina ____ Desoxi-hemoglobina Coeficiente de 532 576 extinção molar (cm-1M-1) 542 15 000 10 000 5 000 450 500 550 600 650 Comprimento de onda λλλλ (nm)
Fig. 2- Espectros de absorção da oxi-hemoglobina e desoxi-hemoglobina. O espectro da hemoglobina modifica-se acentuadamente, quando a hemoglobina liga O2, como se observa pelos máximos de absorção característicos de cada espectro.
Determinação da concentração da hemoglobina
Como se discutiu anteriormente, os espetros da hemoglobina oxigenada e desoxigenada são diferentes, o que impossibilita uma quantificação simples da hemoglobina total duma solução que contém as duas formas em proporções desconhecidas. Uma possibilidade de resolver o problema é converter toda a hemoglobina na forma desoxigenada, medindo a sua concentração nesta forma. O problema prático é que a solução de hemoglobina desoxigenada pelo ditionito de sódio não é estável, porque a reacção é reversível e a hemoglobina vai-se oxigenando lentamente.
Uma outra possibilidade é a conversão irreversível da hemoglobina num derivado, a cianometahemoglobina, através da adição de um reagente apropriado. Um reagente com estas características é o reagente de Drabkins, que é usado correntemente na determinação clínica da concentração de hemoglobina no sangue (Spectronic 20 Spectrophotometer Clinical Methods Manual).
Para se determinar a concentração da hemoglobina através da sua absorvância é necessário conhecer o seu coeficiente de absortividade molar, ou dispor de um método para o determinar. Um método para determinar essa constante é a utilização de uma curva padrão produzida com soluções de hemoglobina de concentração conhecida, permitindo traçar graficamente a relação entre a absorvância e a concentração. A recta obtida permite a determinação da concentração de hemoglobina em amostras de sangue de concentração desconhecida, a partir da sua absorvência.
Um pormenor que é necessário levar em conta ao montar uma técnica deste tipo, é a diluição que é necessário efetuar para que o espectrofotómetro possa ler a absorvância, já que o sangue fresco é demasiado opaco para permitir a leitura. Outro pormenor relacionado com a diluição é o facto de a relação linear absorvância vs concentração (Lei de Beer-Lambert) só ser verdadeira para soluções diluídas, pelo que deve ser determinada a gama de concentrações utilizável dentro da zona linear da curva padrão..
Uma outra forma é a utilização de uma solução de hemoglobina standard ou padrão -hemotrol-, que nos permite determinar a concentração da hemoglobina na amostra, em g/ l, utilizando a seguinte fórmula:
[Hb] (g/ l) = DO amostra x Título indicado
DO padrão no frasco do Hemotrol
A existência desta solução de hemotrol, evita a utilização de uma curva padrão.
A escolha do comprimento de onda a utilizar é também muito importante. O primeiro passo é obter um espetro da substância a determinar. Deve-se escolher um
pequeno erro na seleção do comprimento de onda tem um efeito pouco significativo na absorção. Isto já não ocorre se se escolher um comprimento de onda num dos lados de uma banda de absorção, situação para a qual o mesmo erro de seleção se traduz numa variação significativa da absorvância. Por outro lado, deve-se escolher um máximo e um mínimo de absorvância, ao qual a primeira condição enunciada também se aplica, porque, neste último, a relação sinal vs ruído é menos favorável. Portanto, a melhor eficiência obtém-se ao comprimento de onda de absorção máxima. A regra de escolher sempre um máximo tem limites práticos de que a solução de cianometahemoglobina é exemplo: se na banda comprimento de onda escolhida a absorção for muito intensa, pode haver necessidade de diluir muito a amostra original, limitando ao mesmo tempo a gama de concentrações mensurável, porque quanto mais extensa for a diluição, maior o erro experimental resultante desta operação (Spectronic 20 Spectrophotometer Educational Manual).
Outro facto a que se deve atender, é que a precisão de leitura do Spectronic 20 é boa apenas entre 0,1 e 0,7 unidades de absorvância (Spectronic 20 Spectrophotometer Educational Manual).
● Funcionamento de um espetrofotómetro
O espetrofotómetro utilizado nestas experiências é o Spectronic 20 (Baush & Lomb) ou o Jenway 6300 (representados na Fig. 5), por serem de fácil manuseamento em demonstrações práticas de espetrofotometria.
O espetrofotómetro consiste essencialmente num prisma de difracção, que funciona como monocromador e de um sistema eléctrico de deteção, amplificação e medição. Assim, a luz, proveniente de uma lâmpada, passa através de um monocromador que a separa nos vários comprimentos de onda (λ); apenas um feixe de luz (de um λ específico) atravessa uma pequena fenda e incide na amostra. Esta absorve uma parte da luz e a que não é absorvida é transmitida através da amostra e vai ser detectada por um detetor; o sinal eléctrico gerado é amplificado no amplificador e é enviado para o voltímetro (calibrado em unidades de absorvância), que lê a quantidade de luz que passou através da amostra. O voltímetro pode ligar-se a um registador, onde se pode obter um registo da absorvância da amostra em função do tempo.
A
B
Figura 5- A: Representação esquemática do espectrofotómetro Spectronic 20.
Legenda: 1-Interruptor – ajuste da transmitância a zero (absorvância infinita);
2-Seleccionador de λ (comprimento de onda); 3-Porta-amostra; 4-Ajuste do zero (0) de absorvância; 5-Escala de transmitância; 6-Escala de absorvância.
B: Representação esquemática do espectrofotómetro Jenway 6300.
Legenda: Ajusta os valores do visor; passar pelos menus; para seleccionar o menu pretendido; inicia a calibração; tecla para imprimir; visor.
Ano Lectivo 2011/2012
BIOQUÍMICA I 1º Ano
PROTOCOLO DE BANCADA - 4ª AULA PRÁTICA
I. Análise dos espectros de absorção da Hemoglobina A) Hemoglobina oxigenada (GRUPO 1)
1. Colocar 2-3 gotas de sangue num tubo de ensaio e adicionar-lhe 1 ml de tampão
fosfato.2. Agitar o tubo e esperar que se dê a lise dos glóbulos vermelhos (aproximadamente 5
minutos).3. Diluir com o mesmo tampão até obter uma leitura de absorvância de aproximadamente
0,8 unidades a 540 nm, contra um “branco” de tampão fosfato, anotando o volume tampão utilizado.4. Obter o espectro de absorção da solução da hemoglobina lendo a D.O. da solução aos
vários comprimentos de onda (λ) na gama de 500 a 600 nm, de 10 em 10 nm. Para cada λ seleccionado, utilizar o tubo contendo apenas tampão fosfato para ajustar o espectrofotómetro para zero de absorvância, antes de fazer a leitura da D.O. da amostra.5. Em papel milimétrico fazer um gráfico da D.O. versus o comprimento de onda (λ).
Assinalar os picos de absorção máxima, característicos desta forma de hemoglobina.B) Hemoglobina desoxigenada (GRUPO 2)
1. Colocar 2-3 gotas de sangue num tubo de ensaio e adicionar-lhe 1 ml de tampão
fosfato.2. Agitar o tubo e esperar que se dê a lise dos globulos vermelhos.
3. Adicionar, ao tubo, alguns cristais de ditionito de sódio e agitar suavemente. A
solução deve apresentar um reflexo azulado. Se necessário, juntar alguns cristais adicionais para se notar claramente o reflexo azulado. Evitar, no entanto, adicionar em excesso. Diluir com o volume de tampão fosfato utilizado para a hemoglobina.4. Obter o espectro de absorção da solução da hemoglobina lendo a D.O. da solução aos
vários comprimentos de onda (λ) na gama de 500 a 600 nm, de 10 em 10 nm. Para cada λ seleccionado, utilizar o tubo contendo tampão fosfato para ajustar o espectrofotómetro para zero de absorvância, antes de fazer a leitura da D.O. da amostra.5. Em papel milimétrico fazer um gráfico da D.O. versus o comprimento de onda (λ). Assinalar os picos de absorção máxima, característicos desta forma de hemoglobina.
C) Hemoglobina reduzida (Fe2+) (GRUPO 3)
1. Obter uma gota de sangue (ex. picando um dedo com uma lanceta hematológica esterilizada).
2. Colocar a gota de sangue num tubo de espectrofotómetro contendo 5 ml de água desionizada. Agitar bem e esperar alguns segundos para permitir a hemólise dos glóbulos vermelhos e obter uma solução límpida de hemoglobina.
3. Preparar outro tubo contendo apenas 5 ml de água desionizada.
4. Obter o espectro de absorção da solução da hemoglobina lendo a D.O. da solução aos vários comprimentos de onda (λ) na gama de 500 a 600 nm, de 10 em 10 nm. Para cada λ seleccionado, utilizar o tubo contendo água desionizada para ajustar o espectrofotómetro para zero de absorvância, antes de fazer a leitura da D.O. da amostra.
5. Em papel milimétrico fazer um gráfico da D.O. versus o comprimento de onda (λ). Assinalar os picos de absorção máxima, característicos desta forma de hemoglobina.
D) Hemoglobina oxidada (Fe3+) (GRUPO 4)
1. Obter uma gota de sangue, picando um dedo com uma lanceta hematológica esterilizada.
2. Colocar uma gota de sangue num tubo de espectrofotómetro contendo 5 ml de HCl 0,1 N. Nesta solução diluída de HCl, os glóbulos vermelhos hemolisam e o Fe2+ passa a Fe3+, isto é, oxida, o que confere ao grupo heme da hemoglobina diferentes características de absorção de luz.
3. Obter o espectro de absorção da solução da hemoglobina lendo a D.O. da solução aos vários comprimentos de onda (λ) na gama de 500 a 600 nm, de 10 em 10 nm. Para cada λ seleccionado, utilizar um tubo contendo água desionizada, para ajustar o espectrofotómetro para zero de absorvância, antes de fazer a leitura da D.O. da amostra.
4. Em papel milimétrico fazer um gráfico da D.O. versus o comprimento de onda (λ). Assinalar os picos de absorção máxima, característicos desta forma de hemoglobina.
Todos os grupos:
- Discuta os resultados obtidos de acordo com a estrutura da hemoglobina e as características da ligação do oxigénio ao grupo hémico.
