UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANA LUÍZA ASSIN SQUILLACE
Expressão, purificação e caracterização da
co-chaperona HOP ('Hsp70-Hsp90 Organizing Protein') de
sorgo
CAMPINAS 2015
CAMPINAS 2015
s, 28 de julho de 2015.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos pré-requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica. ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ANA LUÍZA ASSIN SQUILLACE E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS.
Campinas, 28 de julho de 2015
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos (Orientador)
Profa. Drª. Melissa Regina Fessel
Prof. Dr. Carlos Sampaio Bonafé
Prof. Dr. Mario Tyago Murakami
Profa. Drª. Alessandra Sussulini
A Ata de Defesa, assinada pelos mebros da banca, da Comissão Examinadora, consta no processo de vida acadêmica do aluno
Dedico À minha família: pais, irmão, avô e tia pelo incentivo e apoio em minhas decisões, por serem fonte de amor e exemplos de vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, por guiar meus caminhos e não me deixar fraquejar nos momentos difíceis.
À minha família, meus pais Maria Claudia e Luiz Otávio, pelo apoio, incentivo e estímulo. Por serem meus exemplos de amor incondicional, honestidade, humildade e força. Ao meu irmão, Luís Felipe, pelo carinho e por me ensinar a ver as coisas de uma forma mais leve. Ao meu avô Anohar e minha tia Analúcia, por acreditarem na minha capacidade e serem fonte de estímulo diário. Obrigada pelo amor, pela compreensão e por serem alicerce para que meus sonhos se tornem realidade. Amo vocês!
Ao André, meu namorado, por não medir esforços para me ajudar, me consolar e por estar sempre ao meu lado, meu amigo e companheiro. Você torna minha vida mais feliz, te amo!
Ao Prof. Dr. Carlos H. I. Ramos, pela oportunidade e orientação. Obrigada pela confiança, paciência e dedicação, por ser um exemplo de competência, perseverança e profissionalismo. Obrigada pelas discussões científicas e por todo conhecimento que contribuíram para realização deste trabalho.
Aos professores que participaram da banca de qualificação: Melissa Fessel, Carlos Bonafé e Jörg Kobarg, as contribuições foram muito importantes para a versão final da dissertação. Aos membros da banca examinadora: Melissa Fessel, Carlos Bonafé, Mario Murakami e Alessandra Sussulini. Obrigada pela atenção e disponibilidade.
Agradeço a todos os técnicos e aos amigos do laboratório de Bioquímica de proteínas, Anne, Aline, Claudinha, Vanessa, Ana Olívia, Daniel, Danieli, Viviane, David, Bárbara, Conrado. Obrigada pela troca de experiências, discussões científicas e por tornarem essa jornada mais leve e divertida. Um agradecimento especial à Mariana, Glaucia, Letícia e Regina, obrigada pela amizade, por todo conhecimento que me proporcionaram, pelo apoio, incentivo e por nunca deixarem de acreditar em mim.
Aos membros da Pós-graduação em Biologia Funcional e Molecular do Instituto de Biologia da UNICAMP, em especial à secretária Andréia Vigilato pela paciência e auxílio na preparação dos documentos para qualificação e defesa.
Ao Instituto de Química da UNICAMP, pelas instalações do Laboratório de Bioquímica de Proteínas. Ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), pela ótima infra-estrutura disponível.
À FAPESP, que financiou diretamente a realização desse projeto com a concessão da bolsa de mestrado; e às demais agências de fomento e outros financiamentos: CNPq e CAPES.
“O que sabemos é uma gota, o que não sabemos é um oceano” (Isaac Newton)
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA CO-CHAPERONA HOP ('HSP70-HSP90 ORGANIZING PROTEIN') DE SORGO
As chaperonas moleculares representam uma classe de proteínas que atuam prevenindo a agregação e o enovelamento incorreto de proteínas. Em plantas, as chaperonas moleculares possuem suma importância pois desempenham funções ligadas à proteção contra diversos tipos de estresses ambientais e, uma vez que são organismos sésseis, as plantas devem ser capazes de responder de forma eficiente a mudanças na temperatura, salinidade, déficit hídrico, entre outros. A chaperona Hsp90 é essencial para a fisiologia celular, pois está envolvida na estabilização de diversas proteínas envolvidas em sinalização. Sua interação com co-chaperonas, proteínas auxiliares das chaperonas, permite que a Hsp90 atue como uma proteína ‘hub’, ou seja, um ponto central de regulação de diversas proteínas e de diversas vias de regulação. A intervenção na interação da Hsp90 com co-chaperonas é, portanto, uma estratégia potencialmente efetiva para intervir na função desta chaperona. Uma de suas co-chaperonas é a Hop, que está presente em diversos organismos, é capaz de se associar diretamente as chaperonas, Hsp70 e Hsp90, e também mediar a associação entre elas, e que é dependente da hidrólise de ATP e troca ADP/ATP. A Hop é composta por três domínios com repetições de tetratricopeptídeos (TPR), relacionados à interação com as chaperonas, entretanto, como esse mecanismo ocorre nos seres-vivos ainda não é bem conhecido e divergências acerca de seu estado oligomérico ainda são encontradas na literatura. Nesse trabalho foram realizados estudos de expressão de Hop de sorgo (SbHop) em Escherichia coli e sua caracterização utilizando técnicas biofísicas. A proteína foi produzida pura e os resultados de dicroísmo circular (CD) indicaram que a proteína estava enovelada e com estrutura predominante de hélice α; já os experimentos de desenovelamento térmico monitorado por CD e por fluorescência extrínseca mostraram que a proteína se mantém estável pelo menos até 40°C. Ademais, estudos envolvendo gel filtração e espalhamento de luz mostraram que SbHop se comporta como um monômero em solução. A realização desse estudo se faz extremamente relevante uma vez que o conhecimento sobre os mecanismos de resposta e tolerância a estresses abióticos em plantas ainda é limitado.
EXPRESSION, PURIFICATION AND CARACTERIZATION OF SORGHUM CO-CHAPERONE HOP ('HSP70-HSP90 ORGANIZING PROTEIN') Molecular chaperones are a class of proteins that act by preventing aggregation and misfolding. In plants, the molecular chaperones have great importance because they have a role in protection against various types of environmental stresses. Since plants are sessile they need to respond efficiently to changes in temperature, salinity, drought, among others. The chaperone Hsp90 is essential for cell physiology, it is involved in the stabilization of various proteins, mostly involved in signaling. Its interaction with co-chaperones allows Hsp90 to act as a 'hub', a central point of regulation of several different proteins and regulatory pathways. Intervention in the interaction of Hsp90 co-chaperone is therefore a potentially effective strategy to modulate the function of this chaperone. One of its co-chaperones is Hop, that is present in many organisms, is able to associate directly to Hsp70 and Hsp90 mediating their association, which is dependent on ATP hydrolysis and exchange ADP / ATP. Hop consists of three domains with tetratricopeptides (TPR) repetions, involved in the interaction with chaperones. However, details about HOP oligomerization and mechanism of interaction are still missing in the literature. In this work, recombinant Hop from sorgum (SbHop) was expressed in Escherichia coli. The protein was produced pure and was investigated by biophysical tools. Circular dichroism (CD) was used to investigate the secondary structure of the protein showing that it was produced folded and was predominantly α helical. Thermal-induced unfolding experiments followed by CD and extrinsic fluorescence showed that the protein was stable up to 40°C. The monomeric state of Hop was showed by a technique combining gel filtration and light scattering. This study adds to a broad investigation on the mechanisms of plant stress tolerance.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Esquema do papel das chaperonas moleculares na célula... 21
Figura 2: O sistema chaperona... 22
Figura 3: Alinhamento múltiplo de sequências de Hsp90... 25
Figura 4: Estrutura da Hsp90... 26
Figura 5: Sequência primária de aminoácidos da Hsp90 de cana-de-açúcar... 27
Figura 6: Dinâmica conformacional da Hsp90 no ciclo de atividade chaperona... 30
Figura 7: Transporte das proteínas importadas para a mitocôndria... 33
Figura 8: Esquema estrutural da Hop e ligação da TPR ao MEEVD... 34
Figura 9: Motivos TPR da Hop e seus parceiros de interação (peptídeos da Hsp90 e Hsp70)... 35
Figura 10: Sorgo encontrado na natureza... 41
Figura 11: cDNA da proteína hipotética de Sorghum bicolor... 45
Figura 12: Sequência de aminoácidos proteína hipotética de S. bicolor... 46
Figura 13: Oligonucleotídeos ‘Forward’ (HOP_F) e ‘Reverse’ (HOP_R)... 47
Figura 14: Mapa do vetor pET28a... 48
Figura 15: Ilustração do sistema pET para expressão de proteínas recombinantes... 51
Figura 16: Sequência de aminoácidos proteína hipotética de Sorghum bicolor... 66
Figura 17: Predição da estrutura secundária da proteína SbHop feita pelo software SMART protein... 67 Figura 18: Alinhamento múltiplo de sequências de Hop de diversas plantas 68
Figura 19: Análise por SDS-PAGE (12%) do teste de indução para a proteína SbHop em cepa de E. coli BL21(DE3) a 37°C... 70 Figura 20: Análise por SDS-PAGE (12%) do teste de indução para a proteína SbHop em cepa de E. coli BL21(DE3)CodonPlus a 37°C... 71 Figura 21: Análise por SDS-PAGE (12%) do teste de indução para a proteína SbHop em cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS a 37°C... 72 Figura 22: Análise por SDS-PAGE (12%) do teste de indução para a proteína SbHop em cepa de E. coli BL21(DE3)pRARE a 37°C... 73 Figura 23: Análise por SDS-PAGE (12%) da purificação por cromatografia de afinidade da fração solúvel da proteína SbHop induzida por 4 h a 37 °C... 74 Figura 24: Análise por SDS-PAGE (12%) da purificação por cromatografia de Afinidade da fração solúvel da proteína SbHop induzida por 4 h a 20 °C.... 75 Figura 25: Cromatografia de gel filtração para purificação da proteína SbHop... 76 Figura 26: Análise por SDS-PAGE (12%) da purificação por cromatografia de exclusão por tamanho da proteína SbHop... 77 Figura 27: Espectros de CD da SbHop em diferentes tampões... 78 Figura 28: Espectros de desenovelamento e reenovelamento da SbHop monitorados por CD – Tris.... 79 Figura 29: Espectros de desenovelamento e reenovelamento da SbHop monitorados por CD – Fosfato_NaCl... 80 Figura 30: Espectros de desenovelamento e reenovelamento da SbHop monitorados por CD – Fosfato... 81 Figura 31: Espectros de emissão de fluorescência para a SbHop em diferentes tampões... 83 Figura 32: Espectros obtidos por fluorimetria diferencial de varredura (DSF) para a proteína SbHop 3 µM... 84
Figura 33: Espectros obtidos por fluorimetria diferencial de varredura (DSF) para a proteína SbHop 5 µM... 85 Figura 34: Espectro obtido através da técnica de SEC-MALS para a SbHop. 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Co-chaperonas da Hsp 90... 29 Tabela 2: Características dos oligonucleotídeos HOP_F e HOP_R... 47 Tabela 3: Tampões utilizados para teste de estabilidade... 58 Tabela 4: Hop de organismos vegetais alinhados e suas respectivas identidades. 69 Tabela 5: Tm dos experimentos de desenovelamento e reenovelamento da
SbHop monitorados por CD nos três tampões... 82
Tabela 6: Dados de emissão de fluorescência... 83 Tabela 7: Tm dos experimentos monitorados por DSF... 85
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ε: Coeficiente de extinção molar λ: Comprimento de onda
ADP: adenosina 5’ Di-fosfato
Aha1: Proteína ativadora da Hsp90 1 (Activator of Hsp90 ATPase 1) ATP: Adenosina-5‟-trifosfato
CD: Dicroísmo circular (Circular Dichroism)
Cdc37: Proteína ortóloga da p50 em levedura (Cell Division Cycle 37 homologue) Chip: Co-chaperona da Hsp90 e Hsp70 (E3 ubiquitin-protein ligase)
Crp6: Co-chaperona da Hsp90 (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)
CYP40: Proteína de 40 kDa envolvida com receptor de esteróides (Cyclophilin 40) Deg: Grau (degree)
DSF: Fluorimetria Diferencial de Varredura (Differential Scanning Fluorimetry) EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético (Ethylenediaminetetraacetic acid)
Grp94: Hsp90 homóloga do retículo endoplasmático HCl: Ácido clorídrico
Hop: Proteína organizadora das Hsp70-Hsp90 (Hsp70-Hsp90 organizing protein) HSF1: Fator de transcrição de choque térmico 1 (Heat Shock transcription Factor 1) HSP: Proteína de choque-térmico (Heat shock protein)
Hsp40: Proteína de choque térmico de 40 kDa Hsp60: Proteína de choque térmico de 60 kDa Hsp70: Proteína de choque térmico de 70 kDa Hsp90: Proteína de choque térmico de 90 kDa
Hsp90α: Hsp90 homóloga citosólica induzida por estresse Hsp90β: Hsp90 homóloga citosólica constitutiva
Hsp100: Proteína de choque térmico de 100 kDa
LB: Luria Bertani
NB-LRR: (Nucleotide Binding site-Leucine Rich Repeat) PDB: banco de dados de proteínas (Protein Data Bank) PP5: co-chaperona da Hsp90 envolvida no ciclo celular SDS: Dodecil sulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS-PAGE: Eletroforese de gel poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
SEC-MALS: Cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada a espalhamento
de luz em multiângulos (Size Exclusion Chromatography – Multi Angle Light
Scattering)
smHsp: Proteína de choque térmico de massa molecular abaixo de 40 kDa Sti1: Proteína ortóloga da Hop em levedura
Tom70: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 70 kDa TPR: Tetratricopeptídeo (Tetratricopeptide Repeat)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 19
1.1 Enovelamento proteico e chaperonas moleculares... 19
1.2 Hsp90... 23
1.3 Hop... 33
1.4 Chaperonas moleculares e plantas... 37
1.5 Sorgo... 39
2. OBJETIVOS... 43
2.1 Objetivos Gerais... 43
2.2 Objetivos Específicos... 43
3. MATERIAIS E MÉTODOS... 45
3.1 Bioinformática - sequência da Hop cana-de-açúcar... 45
3.2 Reação em cadeia da DNA polimerase (PCR)... 48
3.3 Eletroforese em gel de agarose... 49
3.4 Sistema pET de expressão de proteínas... 49
3.5 Linhagens de Escherichia coli... 52
3.6 Meios de cultura... 53
3.7 Transformação de bactérias competentes com vetor de expressão 53 3.8 Testes de expressão... 54
3.9 Purificação de proteína recombinante... 55
3.9.1 Lise... 55
3.9.2 Cromatografia de Afinidade... 55
3.9.3 Cromatografia de exclusão molecular (Gel filtração)... 56
3.10 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)... 57
3.11 Teste da estabilidade da Hop de sorgo em diferentes tampões... 57
3.12 Determinação da concentração de proteínas... 58
3.13 Dicroísmo Circular (CD)... 59
3.13.1 Estrutura secundária... 60
3.13.2 Estabilidade térmica... 60
3.15 Fluorimetria diferencial de varredura (Differential Scanning
Fluorimetry - DSF)... 62
3.16 Cromatografia de exclusão molecular acoplada a espalhamento
de luz multiângulos (SEC-MALS)... 63
4. RESULTADOS... 66
4.1 Bioinformática - Hop de Sorgo... 66
4.2 Testes de expressão... 69
4.3 Purificação de proteína recombinante... 73
4.4 Dicroísmo Circular (CD)... 77
4.4.1 Estrutura secundária... 77
4.4.2 Estabilidade térmica... 78
4.5 Espectroscopia de emissão de fluorescência... 82
4.6 Fluorimetria diferencial de varredura (Differential Scanning Fluorimetry - DSF)... 84
4.7 Cromatografia de exclusão molecular acoplada a espalhamento de luz multiângulos (SEC-MALS)... 86
5. DISCUSSÃO... 88
5.1 Hop de sorgo... 88
5.2 Hop de sorgo foi produzida pura e enovelada... 89
5.3 Estabilidade da Hop de sorgo... 91
5.4 Estado oligomérico da Hop de sorgo... 92
5.5 Considerações finais sobre a Hop de sorgo... 93
6. CONCLUSÃO... 96
6.1 Perspectivas futuras... 96
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 99
1. INTRODUÇÃO
1.1 Enovelamento proteico e chaperonas moleculares
As proteínas são polímeros de aminoácidos sintetizadas nos ribossomos celulares e, do ponto de vista químico, talvez sejam as moléculas mais complexas e sofisticadas já conhecidas, visto que desempenham inúmeras funções no organismo (Alberts et al., 2002; Nelson e Cox, 2004). Entre proteínas de diversas funções biológicas, temos a actina, a miosina e a tubulina, responsáveis pelo mecanismo de contração; as enzimas, responsáveis por catalisar praticamente todas as reações químicas que envolvam moléculas orgânicas; a queratina e o colágeno, proteínas estruturais, as quais fornecem sustentação e resistência; as proteínas de defesa, como os anticorpos, que são capazes de reconhecer e neutralizar agentes exógenos; proteínas de regulação (como, por exemplo, a insulina, hormônio estimulante da tiróide), entre outras (Nelson e Cox, 2004; Whitford, 2005).
Entretanto, para que tais funções sejam exercidas, normalmente, a proteína precisa ser ativa e funcional, ou seja, deve apresentar uma estrutura tridimensional específica, denominada de estrutura nativa, e ser solúvel. A estrutura tridimensional de uma proteína é mantida, principalmente, por interações não covalentes entre cadeias laterais de aminoácidos, sendo que o processo de aquisição dessa estrutura é chamado enovelamento proteico (Wegele et al., 2004; Ramos e Ferreira, 2005).
No enovelamento proteico, logo que uma cadeia polipeptídica deixa o ribossomo, ela deve se enovelar de maneira eficiente garantindo o desempenho correto de sua função no ambiente celular. No caso de proteínas não enoveladas ou parcialmente enoveladas, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, que deveriam ter sido internalizados na matriz proteica, permanecem acessíveis ao solvente, tornando a associação de proteínas mais suscetível e levando à agregação (Bukau e Horwich, 1998; Hartl e Hayer-Hartl, 2002; Ramos e Ferreira, 2005). A compreensão do enovelamento de proteínas é considerada um dos mais complexos problemas biológicos, sendo alvo de pesquisas há mais de meio século. Estudos pioneiros realizados por Anfinsen e seus colaboradores (Anfinsen et al., 1961; Anfinsen, 1973) a partir de experimentos realizados in vitro
sugeriram que o processo de enovelamento de uma proteína é autônomo e espontâneo. Estes pesquisadores propuseram que a estrutura nativa é determinada termodinamicamente, sendo constatado experimentalmente que a cadeia polipeptídica perde ou readquire sua conformação nativa se as condições do solvente (ambiente) se afastam ou se aproximam das condições fisiológicas, concluindo que a sequência de aminoácidos da proteína contém toda a informação necessária para definir a sua estrutura tridimensional e, por consequência, a sua função biológica (Anfinsen et al., 1961; Anfinsen, 1973; Micheletti et al., 1999). Contudo, trabalhos posteriores ao de Anfinsen e colaboradores mostraram que durante o enovelamento de proteínas na célula, muitas não atingem ou não mantêm sua estrutura correta sem a assistência de outras proteínas.
Uma classe de proteínas conhecidas por desempenhar a função de auxiliar outras proteínas a atingirem sua estrutura funcional é a classe das chaperonas moleculares. O termo “chaperona molecular” foi proposto por Ellis em 1987 para descrever essa classe de proteínas auxiliares ao enovelamento (Laskey et al., 1978; Ellis, 1987). Um termo bastante adequado, haja vista que a palavra chaperone (do inglês: dama de companhia) sugere que tais proteínas atuem evitando interações indesejáveis. As chaperonas foram inicialmente descritas como proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins - HSP), pois sua síntese é aumentada em células submetidas ao estresse térmico. Porém, estudos posteriores mostraram que as chaperonas também respondem a outros tipos de estresses e possuem síntese constitutiva, sendo importantes na manutenção da homeostase celular em condições ótimas e adversas (Lindquist e Craig, 1988). Desta maneira, atualmente, os termos chaperonas e Hsp não definem necessariamente a mesma classe de proteínas, algumas Hsps não são chaperonas e vice-versa.
As chaperonas moleculares atuam, portanto, como um sistema de controle de qualidade, reconhecendo, mantendo, marcando e/ou enviando proteínas desenoveladas ou incorretamente enoveladas para degradação (Welch e Brown, 1996). É importante notar que essas chaperonas moleculares não fornecem informações estéricas específicas para o enovelamento da proteína alvo, mas inibem interações não produtivas e permitem que a proteína
se enovele mais eficientemente na sua estrutura nativa (Hartl, 1996; Borges e Ramos, 2005; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011).
O efeito deletério do enovelamento incorreto resulta em perda de função, como no caso de fibrose cística e alguns tipos de câncer ou ganho de função ‘maléfica’, como no caso de várias doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson (Bolshette et al., 2014). Muitos cânceres e várias desordens metabólicas ligadas ao enovelamento incorreto são causadas por mutações em proteínas que atuam como reguladores no crescimento e diferenciação celular (Macario, 2007). Essas mutações, geralmente, formam placas de agregados resultando em neurotoxicidade e morte celular. Chaperonas moleculares, portanto, são alvos promissores para o tratamento de doenças causadas pela formação de agregados (Peterson e Blagg, 2009). Tais proteínas também participam da translocação de proteínas através de membranas e organelas (Hartl e Hayer-Hartl, 2002), na entrega de substratos para proteólise (Schirmer et al., 1996) e na recuperação de proteínas agregadas (Sanchez e Lindquist, 1990) (Figura 1).
Figura 1: Esquema do papel das chaperonas moleculares na célula. Estão destacados a translocação para subcompartimentos celulares, a atuação no enovelamento proteico e o transporte celular (Adaptada de Hahn, J. 2007, http://biomolecule.snu.ac.kr/research.html).
As chaperonas interagem entre si, com proteínas acessórias conhecidas como co-chaperonas e com proteínas clientes, ou seja, as quais terão o enovelamento auxiliado ou que serão direcionadas para degradação (Ramos, 2008). Há pelo menos cinco famílias principais de chaperonas moleculares que reconhecem e se ligam às superfícies hidrofóbicas de proteínas desenoveladas ou parcialmente enoveladas, sendo as famílias classificadas de acordo com sua massa molecular, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e smHsp (Borges e Ramos, 2005), presentes tanto no citoplasma e em organelas como núcleo, retículo endoplasmático, mitocôndria e cloroplastos (Waters et al., 1996). Na figura 2 estão representadas as principais classes de Hsps, as quais são conservadas em procariotos e eucariotos (Borges e Ramos, 2005).
Figura 2: O sistema chaperona. As chaperonas também são conhecidas como HSP (Heat Shock Protein) e são classificadas de acordo com a massa molecular. A maquinaria da Hsp70 tem um papel central no enovelamento proteico, pois distribui substratos entre diferentes chaperonas além de prevenir a agregação e promover o enovelamento, translocação e degradação de polipeptídeos. A Hsp90 age na manutenção conformacional, estabilidade e função de uma grande variedade de proteínas envolvidas em transdução de sinal, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema Hsp60/Hsp10 é responsável por enovelar substratos parcialmente desenovelados (Adaptada de Borges & Ramos, 2005).
A Hsp40 é uma proteína que funciona como uma co-chaperona da Hsp70 pois interage com substratos de forma transitória, carregando-os para a Hsp70 (Fan et al., 2003; Summers et al., 2013).
No sistema Hsp60/Hsp10 as proteínas substrato parcialmente enoveladas entram na cavidade central da Hsp60 onde estão protegidas da agregação através de contatos hidrofóbicos (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011). As chaperonas de baixa massa molecular (small heat shock proteins – smHsps) são proteínas diversas que se ligam a proteínas parcialmente enoveladas e previnem a agregação e a desnaturação irreversíveis das mesmas em situações de estresse (calor, frio, seca, sal, oxidativo e ambiental) (Vierling, 1991).
As proteínas da família das Hsp70 exercem papel central entre as famílias chaperonas e inibem o enovelamento prematuro e a agregação proteica se ligando aos polipeptídeos recém-sintetizados no ribossomo, até a formação de sua estrutura final e estável (Borges e Ramos, 2005; Mayer, 2013). A família Hsp100 atua na desagregação e degradação proteica, porém não é capaz de reenovelar substratos sem a cooperação do sistema Hsp70 (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011).A família da Hsp90, envolvida na manutenção da conformação, estabilidade e função de uma grande variedade de proteínas envolvidas em transdução de sinal, controle do ciclo celular e apoptose será detalhada na seção a seguir.
1.2 Hsp90
A Hsp90 (Heat Shock Protein 90) é uma chaperona altamente conservada (Borkovich et al., 1989; Csermely et al., 1998; Young et al., 2001; Taipale et al., 2010) (Figura 3), amplamente distribuída, encontrada em bactéria e em todos os eucariotos, mas, aparentemente, ausente em Archaea (Wegele et al., 2004). Além disso, a Hsp90 é considerada abundante pois representa 1 a 2% do total de proteínas citosólicas na ausência de estresse (Welch e Feramisco, 1982).
Hsp90-S.cerevisiae ---MASETFEFQAEITQLMSLIINTVYSNKEIFLRELISNASD--- Hsp90-H.sapiens MPEETQTQDQPMEEEEVETFAFQAEIAQLMSLIINTFYSNKEIFLRELISNSSD--- Hsp90.2-A.thaliana ---MADAETFAFQAEINQLLSLIINTFYSNKEIFLRELISNSSDVRSLSL Hsp90-S.officinarum ---MASETETFAFQAEINQLLSLIINTFYSNKEIFLRELISNSSD--- *** ***** **:******.**************:** Hsp90-S.cerevisiae ---ALDKIRYKSLSDPKQLETEPDLFIRITPKPEQKVLEI Hsp90-H.sapiens ---ALDKIRYESLTDPSKLDSGKELHINLIPNKQDRTLTI
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Figura 3: Alinhamento múltiplo de sequências de Hsp90. Foram alinhadas sequências de Hsp90 de S. cerevisiae (gi:6325016), Hsp90α2 de H. sapiens (gi:154146191), Hsp90 de A. thaliana (gi:334188442) e Hsp90 de S. officinarum (gi:442577830). Percebe-se nestas sequências o pentapeptídeo MEEVD no final do domínio C-terminal, importante para interação com co-chaperonas TPR. Sequências alinhadas com a ferramenta ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/).
As Hsp90 são especializadas no enovelamento de proteínas e possuem um seleto, mas amplo grupo de proteínas clientes, como receptores para hormônios esteróides, polimerases, quinases, entre outras, além de serem essenciais para o crescimento de células eucarióticas (Pratt e Toft, 1997, Gava e Ramos, 2009). Apesar de as bases moleculares de tal especificidade não serem bem compreendidas, a Hsp90 parece ser relativamente específica em relação à interação com suas clientes. Há quatro isoformas de Hsp90 em humanos: duas citosólicas, denominadas Hsp90 e Hsp90β, altamente similares, mas com algumas características distintas (Jackson, 2013); uma mitocondrial (Trap1); e uma específica do retículo endoplasmático (Grp94) (Da Silva e Ramos, 2012). Todas as isoformas atuam obrigatoriamente como dímeros e possuem três domínios. Na figura 4A está representada a estrutura tridimensional da Hsp90 de Saccharomyces cerevisae, a qual é 82% similar à Hsp90 humana (Strebbins et al., 1997, Pearl e Prodomou, 2006) e 64% similar à Hsp90 de cana-de- açúcar (Figura 5) como descrito em Da Silva et al., 2013.
Em plantas, as Hsp90 têm estrutura e funcionamento similar ao de animais, contudo parecem ter papel em atividades específicas como interação parasita-hospedeiro e estresse hídrico (Breiman, 2014; Xu et al., 2012)
Figura 4: Estrutura da Hsp90. A) Estrutura dimérica da Hsp90 de Saccharomyces cerevisae. A cada N-terminal (azul) encontra-se ligada uma molécula de ATP (cinza), em vermelho e laranja o domínio central e em amarelo o C-terminal (PDB: 2CG9). (Adaptada de Morra, G. et al., 2012) B) Esquema dos domínios da Hsp90 de levedura, onde N é o domínio N-terminal, M o domínio central e C o domínio C-terminal (Adaptada de Pearl e Prodomou, 2006).
O domínio N-terminal possui um sítio de ligação a nucleotídeo altamente conservado, possui aproximadamente 30 kDa e está conectado a um domínio central (de aproximadamente 35 kDa) por uma região desestruturada, altamente carregada. O domínio C-terminal tendo aproximadamente 20 kDa, é responsável pela dimerização da Hsp90 (revisado em Da Silva e Ramos, 2012). O domínio C-terminal também está envolvido na interação com várias co-chaperonas e proteínas clientes e é onde se encontra o motivo MEEVD (ou seja, há dois destes motivos por dímero de Hsp90) que se liga a co-chaperonas com domínio TPR (tetratricopeptide repeat). Em células eucariotas mais de 20 co-chaperonas já
N
C
1 220 255 540 709
M
B)
A)
foram identificadas, entretanto, as funções biológicas de muitas delas ainda permanecem desconhecidas (Taipale, Jarosz e Lindquist, 2010).
Figura 5: Sequência primária de aminoácidos da Hsp90 de cana-de-açúcar (GI:442577830), colorida de acordo com a sequência de aminoácidos dos respectivos domínios. N-terminal: azul; região desestruturada: preto; domínio central: vermelho e C-terminal: laranja com ênfase para o pentapeptídeo MEEVD (roxo) onde ocorre a ligação à co-chaperonas com domínio TPR. Destacados em verde e sublinhados estão os triptofanos, os quais são utilizados como sonda na técnica de emissão de fluorescência para avaliação conformacional.
Funções
A Hsp90 participa da estabilização, ativação e maturação de mais de duzentas proteínas, denominadas proteínas clientes (ou substrato), que dependem dela para atingir e/ou manter sua conformação funcional, sendo que muitas dessas clientes são essenciais para sinalização e transcrição celular além de respostas adaptativas a situações de estresse (Mayer e Bukau, 1999; McClellan et al., 2007; Li et al., 2011; Da Silva e Ramos, 2012)
Essa chaperona é considerada como como um capacitor para a evolução e aquisição de novas características, pois age promovendo a estabilização de proteínas mutadas, as quais não seriam funcionais ou seguiriam para degradação na ausência ou atividade reduzida desta chaperona. Tal atividade permitiria variações na sequência e até mesmo a divergência de genes (Queitsch
et al., 2002; Sangster et al., 2008).
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MEEVD
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
651
A Hsp90 é tida como um mediador chave da homeostase celular, função que realiza sendo um facilitador de diversas interações proteína-proteína do tipo transiente e de baixa afinidade (Pratt et al., 2008; DeZwaan e Freeman, 2008). A reposta imune, tanto em mamíferos como em plantas, também tem a participação da Hsp90. Em plantas, a Hsp90 juntamente com a SGT1 (Supressor
G2 allele of SKP1) e RAR1 (Required for Mla12 resistance) formam um complexo
envolvido em eventos de sinalização da resposta imune. Estas moléculas têm um importante papel na ativação de proteínas NLR (ou NB-LRR, nucleotide
binding site-leucine rich repeat) (Seo et al., 2008). Tais proteínas têm a
habilidade de reconhecer, direta ou indiretamente, moléculas derivadas de patógenos e disparar a resposta imune, funcionando como sensores.
Em plantas, a atuação da Hsp90 também é importante no transporte de pré-proteínas para mitocôndrias e cloroplastos. Tal processo é essencial para a montagem dos complexos fotossintéticos em cloroplastos (Fellerer et al., 2011). Adicionalmente, a Hsp90 responde a sinais mediados por cloroplastos e faz parte do complexo proteico que regula a expressão de genes associados à fotossíntese (PhANG – photosynthesis-associated nuclear genes) (Kindgren et
al., 2011).
Co-chaperonas da Hsp90
As co-chaperonas são proteínas capazes de modular a atividade das chaperonas com uma determinada proteína cliente, apresentando-a para Hsp90 e/ou Hsp70, e então coordenando o ciclo de ligação e liberação pelas chaperonas de maneira a facilitar o enovelamento/manutenção ou a desagregação proteica. Fazendo-se uma comparação genômica das co-chaperonas da Hsp90, é possível detectar que os organismos possuem uma compilação singular de co-chaperonas, sugerindo que essas combinações específicas de co-chaperonas são capazes de adequar a atividade da Hsp90 para melhor se adaptar às condições de cada organismo em particular (Johnson & Brown, 2009).
Em eucariotos, a Hsp90 é, comumente, encontrada complexada a uma gama de co-chaperonas que, por sua vez, exercem efeitos diversos nas funções
da Hsp90. Na tabela 1 estão apresentadas algumas co-chaperonas comuns em H. sapiens e suas respectivas nomenclaturas em S.cerevisiae e A. thaliana. Algumas co-chaperonas como a Aha1 (activator of Hsp90 ATPase 1), a p23 - também conhecida como PTGES3 (prostaglandin E synthase 3), a Hop (Hsp70/Hsp90 organizing protein, também chamada Sti1 ou p60) e a Cdc37 (cell division cycle 37 homologue), modulam o ciclo ATPásico da Hsp90 afetando a dinâmica conformacional da proteína. Esse tipo de modulação é bastante importante, pois regula o tempo de permanência das proteínas clientes no complexo chaperona (Cox & Jonhson, 2011; McLaughlin et al., 2006; Richter et al., 2004).
Tabela 1: Co-chaperonas da Hsp 90.
Co-chaperona
(H.sapiens/S.cerevisiae/A.thaliana)
Função Sítio de ligação da co-chaperona
Sítio de ligação da Hsp90 HOP/ SGT1/ HOP Adaptadora, seleção
de substrato
Domínio TPR2A C-terminal (MEEVD)
p23/ SBA1/ p23 Inibição da atividade ATPásica
N-terminal N-terminal
AHA1/ AHA1, HCH1/ AHA1 Inibição da atividade ATPásica N-terminal/ C-terminal N-terminal/ Domínio central CDC37/ CDC37/ - Inibição da atividade ATPásica C-terminal N-terminal
CHIP/ CHIP/ CHIP Ubiquitinção N-terminal C-terminal (MEEVD)
CYP40/ CYP7/ CYP40 Imunofilina C-terminal C-terminal (MEEVD)
PP5/ PPT1/ PAPP5 Fosfatase proteica TPR1, TPR2, TPR3
C-terminal (MEEVD)
TOM70/ TOM70, TOM71/ - Adaptadora, replicação
N-terminal C-terminal (MEEVD)
XAP2/ - / - Receptora nuclear C-terminal C-terminal (MEEVD) (Adaptada de Da Silva et al., 2012; Caldewood, 2013).
Contudo, outras co-chaperonas afetam a Hsp90 pois catalisam reações como a ligação de ubiquitina (a ubiquitina ligase E3 ou CHIP - C-terminal Hsp70-interacting protein) e desfosforilação (a fosfatase PP5). A ubiquitinação de
proteínas clientes da Hsp90, dependente da CHIP, as direciona para o complexo proteassoma, marcando as proteínas propensas à degradação, o que encurta ciclos adicionais de reenovelamento mediado por chaperonas (Ballinger et al.,1999; Zhang et al., 2005; Trepel et al., 2010) (Figura 6).
Figura 6: Dinâmica conformacional da Hsp90 no ciclo de atividade chaperona. A Hsp90 é um dímero em todo o ciclo de ligação à proteínas clientes e trocas de nucleotídeos com a Hsp70. Nesse ciclo, a ligação de ATP leva a proteína de uma estrutura aberta, quando recebe a proteína cliente, para uma estrutura fechada, com o N-terminal também dimerizado. A ligação à proteína cliente é mediada pela co-chaperona Sgt1. Por sua vez, as co-chaperonas p23 e Cdc37 inibem a atividade ATPásica e estabilizam o complexo Hsp90-proteína cliente. A troca de nucleotídeos é mediada pela Aha1. Tal como ocorre com a Hsp70, a passagem da proteína cliente entre as vias de controle de qualidade envolve a co-chaperona Hop, a qual funciona como um adaptador. O motivo TPR da co-chaperona liga-se ao C-terminal da Hsp90 a qual pode-se ligar a outras proteínas e assim desempenhar o papel de regulação celular (Adaptada de Calderwood, 2013). Ainda que haja centenas de co-chaperonas diferentes em mamíferos, a maioria delas pode ser classificada em duas principais classes, baseada na estrutura de seus domínios. São as “Domínio-J” e as que apresentam unidades repetitivas de tetratricopeptídeos (TPR), co-chaperonas que interagem com a Hsp70 (no motivo C-terminal IEEVD) e com a Hsp90, no motivo C-terminal MEEVD, como a Hop, Tom70 e CHIP, por exemplo (Caplan, 2003).
Aberta
Ciclo da
Hsp90
Proteínas clientes desenoveladas
Fechada
Proteínas clientesInteração Hsp90 – co-chaperonas TPR
O maior subconjunto de co-chaperonas é aquele que contém domínios TPR (tetratricopeptide repeat), os quais se ligam à última porção (resíduos MEEVD) do domínio C-terminal da Hsp90. Proteínas TPR possuem diversas propriedades interessantes, incluindo sua característica de enovelamento, modulação e uma ampla especificidade de ligações. O domínio TPR está presente em uma gama de proteínas, sendo responsável por mediar interações proteína-proteína e a formação de complexos multi-proteicos. O domínio consiste de 3-16 repetições em tandem de 34 resíduos de aminoácidos cada, adotando uma estrutura hélice-conector-hélice com outras regiões TPR adjacentes e de forma paralela resultando numa espiral de α-hélices antiparalelas.
O conjunto de co-chaperonas TPR é extraordinariamente diverso apesar de possuírem um mecanismo comum de ligação à Hsp90. Muitas delas são capazes de inibir (por exemplo, Hop, Cdc37 e p23) ou estimular (Aha1 e Cpr6) a atividade ATPásica da Hsp90, a qual foi avaliada medindo-se a atividade in vitro na presença e na ausência das co-chaperonas. (Taipale, Jarosz e Lindquist, 2010). Proteínas que possuem a região TPR estão envolvidas em uma variedade de processos biológicos tais como, regulação do ciclo celular, controle da transcrição, transporte proteico mitocondrial, neurogênese e enovelamento de proteínas (D’Andrea e Regan, 2003).
Em particular, Hsp90 e Hsp70 interagem com inúmeras co-chaperonas contendo domínios TPR. Além de desempenharem as funções de ancoragem, os domínios TPR das co-chaperonas Hip e p60/Hop, por exemplo, também são capazes de regular as atividades ATPásica da Hsp70 e Hsp90, respectivamente. O domínio TPR contendo co-fatores do sistema-chaperona Hsp70/Hsp90 interage com os domínios C-terminal da Hsp70 e Hsp90. Estudos envolvendo mutagênese por deleção têm sugerido que a região EEVD-COOH do C-terminal, que é altamente conservada em todas as Hsp70s e Hsp90s citosólicas de eucariotos, tem um papel importante na ligação ao domínio TPR.
Embora a mitocôndria contenha um grande número de proteínas, poucas são traduzidas nessa organela (Sickmann et al., 2003, Gray et al., 1999). Muitas
proteínas mitocondriais são produzidas no citosol e então translocadas para a mitocôndria onde serão reconhecidas pelo complexo TOM (Translocase of the
mitochondrial outer membrane), presente na membrana externa. O complexo
TOM contém as proteínas receptoras integrais de membrana Tom20, Tom22 e Tom70, o poro de inserção composto pela Tom40 além de proteínas menores Tom5, Tom6 e Tom7 (Rehling, et al., 2004). A figura 7 representa os principais eventos envolvendo esse complexo, onde a maioria das proteínas mitocondriais sintetizadas nos ribossomos são transportadas até a membrana externa da mitocôndria pelas chaperonas Hsp70 e Hsp90, onde é formado um complexo precursora/chaperona, que ao chegar até essa organela, é reconhecido pelo domínio citosólico da Tom70 (Fan & Young, 2011; Li et al., 2009; Rehling et al., 2004). A Tom70 contém um domínio N-terminal transmembrana ligado a um domínio TPR citosólico (também chamado de grampo TPR ou TPR clamp). Tal domínio TPR funciona como um sítio de interação para a Hsp70 e Hsp90 e, desse modo, para complexos multi-chaperona contendo a proteína precursora.
Figura 7: Transporte das proteínas importadas para a mitocôndria. O complexo TOM contém as proteínas Tom20, Tom22, Tom70, Tom40, Tom5, Tom6 e Tom7. A membrana mitocondrial interna contém duas translocases, o complexo Tim22 e o complexo Tim23. Muitas proteínas precursoras (em azul) são entregues ao complexo TOM pelas chaperonas Hsp70 e Hsp90. (Figura retirada e adaptada de Rehling et al., 2004).
1.3 Hop (Hsp70-Hsp90 Organizing Protein)
Identificada pela primeira vez por Nicolet e Craig (1989) como Sti1
(Stress-inducible protein 1), a co-chaperona Hop é uma proteína responsiva a choque
térmico em leveduras. Essa co-chaperona serve como um adaptador para Hsp70 e Hsp90, otimizando a sua cooperação funcional sem que atue como uma chaperona molecular (Yamamoto, 2014). Ortólogos de Hop foram identificados em seres humanos (Honoré et al., 1992), camundongo (Blatch et al., 1997), rato (Demand et al., 1998), insetos (Carrigan et al., 2005), plantas, como Arabidopsis
thaliana, milho, trigo (Triticum aestivum) e soja (Zhang et al., 2003), e parasitas
literatura (Yi et al., 2010; Onuoha et al., 2008) e necessita de mais estudos, entretanto sabe-se que essa co-chaperona é composta por 9 motivos TPR agrupados em 3 domínios (TPR1, TPR2A e TPR2b) e tal característica define os ortólogos da Hop. Na figura 8B, são representados os domínios TPR1 e TPR2A, os quais possuem estrutura cristalográfica conhecida e consistem de hélices-alfa antiparalelas empilhadas de modo a formar um grande sulco ao longo da superfície do domínio facilitando as interações proteína-proteína específicas (Carrigan et al., 2004; Odunuga et al., 2004; Song & Masison, 2005; Flom et al., 2007; Scheufler et al., 2000). Intercalados aos domínios TPR ainda existem duas repetições de resíduos de ácido aspártico e prolina (DP) chamadas DP1 e DP2 que, de acordo com análises por RMN (Ressonância Magnética Nuclear) consistem de seis e cinco hélices, respectivamente. Adicionalmente, o domínio DP2 fornece suporte de suma importância para a atividade de chaperona Hsp90 (Yamamoto, 2014). Sugere-se, por fim, que a estrutura da Hop siga o seguinte arranjo: TRP1-DP1-TPR2A-TPR2B-DP2 (Odunuga, 2004), como representado na figura 8A.
Figura 8: Esquema estrutural da Hop e ligação da TPR ao MEEVD. A) A Hop é composta por 3 domínios TPR e 2 domínios compostos por repetições de aspartato e prolina (DP). A ligação do motivo MEEVD na co-chaperona Hop (B). Verifica-se a estrutura característica da TPR, formada por hélices antiparalelas em sequência, formando um sulco no interior da estrutura. O motivo MEEVD parece estar envolvido pelo TPR quando ligado a Hop. Adicionalmente, a conformação do MEEVD pode ser modificada em função da co-chaperona ligada. (Adaptada de Gava et al., 2011).
TPR1
DP1
TPR2A
TPR2B
DP2
A)
O domínio TPR no N-terminal da Hop, TPR1, especificamente reconhece no C-terminal da Hsp70 sete aminoácidos (PTIEEVD) (figura 9B), enquanto TPR2A reconhece cinco resíduos (MEEVD) no C-terminal da Hsp90 (figura 9A) (Brinker et al., 2002; Odunuga et al., 2003; Onuoha et al., 2008). Em particular, a interação entre TPR e Hsp90 ocorre na região MEEVD do C-terminal da Hsp90, entretanto, por serem muito difundidos, a presença de um domínio TPR em uma proteína não significa que ela automaticamente irá se ligar à chaperona. Curiosamente, a função e especificidade de ligação do terceiro domínio TPR (TPR2B), no C-terminal da Hop, ainda permanece incerto.
Figura 9: Motivos TPR da Hop e seus parceiros de interação (peptídeos da Hsp90 e Hsp70). A) Esquerda: domínio TPR2a da Hop em complexo com o peptídeo MEEVD da Hsp90. Direita: Detalhe da região de interação (PDB código: 1ELR). B) Esquerda: domínio TPR1 da Hop em complexo com o peptídeo EEVD da Hsp70. Direita: Detalhe da região de interação (PDB código: 1ELW). (Adaptada de Zeytuni e Zarivach, 2012).
Segundo estudos de Alvira e colaboradores (2014), a Hop interage com a Hsp90 (dimérica) na forma de monômero, ao passo que sua interação com a
A)
Hsp70 parece ser mediada também pela Hsp40. Já estudos de Hernández et
al., indicam que a afinidade de ligação entre Hsp70-Hop é aumentada em cerca
de 5 vezes pela ligação da Hsp90 (Hernández et al., 2002). Desta forma, a Hsp90 poderia causar alterações na conformação da Hop para melhor acomodar as interações com a Hsp70; outra possibilidade é que a Hop causaria um rearranjo conformacional da Hsp90, promovendo sítios de contato para a Hsp70 (Hernández et al., 2002; Murphy et al., 2001).
Embora a Hop seja capaz de interagir com a Hsp90 na presença e na ausência de ATP, há uma preferência pelo estado Hsp90-ATP. A Hop previne a troca de nucleotídeos, inibindo a atividade ATPásica e favorecendo uma conformação aberta da Hsp90 (Da Silva e Ramos, 2012).
Apesar de ser bem estabelecido que o motivo MEEVD da Hsp90 corresponde ao principal sítio de reconhecimento na interação com a Hop, estudos recentes têm revelado a presença de contatos adicionais de sítios secundários tanto no domínio C-terminal como no central e N-terminal da Hsp90 (Lee et al., 2012; Onuoha et al., 2008; Southworth e Agard, 2011).
Para reconhecer potenciais patógenos, eucariotos superiores possuem receptores intra e extracelulares para desencadear uma resposta inicial a possíveis doenças. Em plantas, esses receptores chamados de receptores de reconhecimento padrão (PRRs - Pattern Recognition Receptors) reconhecem moléculas derivadas de patógenos (PAMPS - Pathogen-Associated Molecular
Patterns), sendo o sistema Hsp90-Hop/Sti1 essencial no desenvolvimento desse
tipo de resposta, pois são integrantes de um complexo imune chamado “defensoma”, como demonstrado por Chen et al., 2010. Sendo assim o estudo do complexo Hsp90 e uma de suas co-chaperonas, a Hop, é essencial na compreensão dos mecanismos de defesa das plantas. Ademais, por desempenharem importantes funções no desenvolvimento e resistência a estresses, o conhecimento dos efeitos adversos do estresse térmico pode ser útil no desenvolvimento de plantas cultivadas com maior termotolerância através de melhorias genéticas.
1.4 Chaperonas moleculares e plantas
Como organismos sésseis, as plantas devem ser capazes de responder rapidamente a múltiplos estresses ambientais, como variações de temperaturas e salinidade, presença de metais pesados e deficiência hídrica. A presença de sistemas de resposta a estresses eficientes são pré-requisitos para a sobrevivência e produtividade das plantas (Neumann et al., 1989; Tiroli-Cepeda & Ramos, 2011).
O estresse térmico devido ao aumento da temperatura é um problema agrícola em muitas regiões do mundo. Temperaturas transitórias ou constantemente elevadas podem causar uma série de mudanças morfo-anatômicas, fisiológicas e bioquímicas em plantas, que afetam seu crescimento e desenvolvimento e podem levar a uma redução drástica no rendimento econômico que proporcionam. Os efeitos adversos do estresse térmico podem ser atenuados através do desenvolvimento de plantas cultivadas com maior termotolerância através de melhorias genéticas. Para isso, no entanto, uma profunda compreensão das respostas fisiológicas das plantas à alta temperatura, mecanismos de tolerância ao calor e possíveis estratégias para melhorar a tolerância térmica de cultivares é essencial (Wahid et al., 2007). As chaperonas desempenham importantes funções no desenvolvimento e resistência a estresses em plantas. Por exemplo, há uma forte correlação entre o acúmulo de smHsps e a tolerância a estresses em plantas (Wang et al., 2004). Entretanto, o mecanismo pelo qual as HSPs contribuem para a termotolerância ainda não é completamente conhecido, embora vários papéis tenham sido atribuídos a elas em estudos recentes (Wahid et al., 2007).
Diferente das demais chaperonas, a Hsp90 parece desempenhar uma função reguladora, pois a concentração desta proteína é crucial para um adequado desenvolvimento da resposta a estresses (Kanzaki et al., 2003). Adicionalmente, acredita-se que a Hsp90 tenha um importante papel na manutenção da função dos receptores de brassinosteróides (hormônio esteróide vegetal), importante na tolerância a estresses abióticos, no crescimento do vegetal e desenvolvimento das raízes (Divi et al., 2010). Outra importante ação da Hsp90 em plantas está relacionada à resistência a pragas, visto que esta
chaperona desempenha importantes funções quando associada a proteínas do sistema imune (Wang et al. 2004).
Estudos do nosso grupo de pesquisa também apontam para as chaperonas como importantes moléculas para o desenvolvimento e homeostase vegetal, assim como alvos de importância biotecnológica. Análises de ESTs do consórcio FORESTs evidenciaram que as chaperonas moleculares apresentam um notável nível de expressão em células de Eucalyptus (1,6% das sequências), o que demonstra a importância destas nas espécies estudadas. Ainda, os perfis de expressão são espécie-dependentes e o tecido caulinar está entre as bibliotecas que apresentaram maior expressão de chaperonas (Cagliari et al., 2005). Ainda em Eucalyptus, tratamentos para promover a redução do conteúdo de ligninas no caule estão relacionados com uma expressão aumentada de chaperonas (Gonçalves et al., 2011). Em cana-de-açúcar, um total de 4702 ESTs de chaperonas foram anotadas, dentre as quais 9% foram referentes a ESTs de Hsp90. Os dados reportam a grande variabilidade e abundância de chaperonas moleculares em cana-de-açúcar e evidenciam sua importância nos processos de enovelamento de proteínas e tolerância a estresses na espécie (Borges et al., 2007).
Adicionalmente, nosso grupo tem investigado a estrutura e função da Hsp90 de diversos organismos, inclusive cana-de-açúcar com sequências provenientes do projeto SUCEST. Em um dos trabalhos, clone da Hsp90-3 (uma das proteínas alvo) foi totalmente sequenciado, com a sequência subclonada e expressa em E.coli (sistema pET28a). A proteína foi purificada de forma enovelada e como um dímero em solução (Cagliari, 2009).
Ainda sobre a cana-de-açúcar, um dos estudos consistiu na clonagem, expressão e caracterização de Hsp90 de um híbrido de cana derivado de
Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum, as quais são cultivares com
importância agrícola. Os resultados mostraram que a SsHsp90 possui estrutura e funções características de outras Hsp90 homólogas. Também foi demonstrado que a expressão da SsHsp90 de cana-de-açúcar é constitutiva, além de ser capaz de prevenir a agregação, sugerindo a importância dessa chaperona para
a cana e contribuindo para o conhecimento acerca dessa família de chaperonas (Da Silva et al., 2013).
Mendonça & Ramos fizeram em 2012 a identificação, clonagem, caracterização biofísica e funcional de uma Hsp90 de Citrus cinensis (rCsHsp90 – recombinant Citrus cinensis Hsp90). Neste trabalho a rCsHsp90 foi expressa em E. coli, purificada enovelada como um dímero em solução, e com atividade protetora contra agregação da proteína citrato sintase (substrato modelo). Também foi demonstrado através de Western Blot que a Hsp90 estudada apresenta expressão constitutiva em Citrus cinensis. Tais dados demonstram o quanto o grupo tem avançado e se especializado no estudo de proteínas da família Hsp90, especialmente em plantas. E também trazem à tona novas questões e perspectivas de investigação.
Dada a importância das chaperonas moleculares tanto no desenvolvimento de plantas quanto na tolerância a estresses, estas representam importantes alvos de estudo, uma vez que o conhecimento acerca dos mecanismos de resposta e tolerância a estresses abióticos em plantas e como suas co-chaperonas auxiliam na execução dessas funções ainda é limitado (Wang et al., 2004). A compreensão da função das proteínas da família Hsp90 e suas co-chaperonas nos múltiplos processos regulatórios de resposta a estresses, plasticidade e desenvolvimento vegetal apresenta também uma importância biotecnológica, visando a introdução ou modulação de características úteis à produtividade e qualidade de cultivares. No caso específico da chaperona HOP, esta é considerada como o principal fator de interação entre os subsistemas da Hsp70 com o subsistema Hsp90. O sistema Hsp70/Hsp90 é o principal complexo no sistema de qualidade proteico celular, tendo papel central nos eventos de enovelamento e degradação. Portanto, o estudo desta co-chapeona é importante para entender como os subsistemas se relacionam e desempenham suas funções.
1.5 Sorgo
O sorgo é uma extraordinária fábrica de energia, de enorme utilidade em regiões muito quentes e muito secas, onde o homem não consegue boas
produtividades de grãos ou de forragem cultivando outras espécies, como o milho. A origem do sorgo está provavelmente na África, embora algumas evidências indiquem que possa ter havido duas regiões de dispersão independentes: África e Índia (Ribas, 2008).
Esse cultivar é, entre as espécies alimentares, uma das mais versáteis e mais eficientes, tanto do ponto de vista fotossintético, como em velocidade de maturação. É classificado como planta C4, de dia curto e com altas taxas fotossintéticas. A grande maioria dos materiais genéticos de sorgo requerem temperaturas superiores a 21°C para um bom crescimento e desenvolvimento (Magalhães et al., 2008).
O sorgo possui características fisiológicas que permitem paralisar o crescimento ou diminuir as atividades metabólicas durante o estresse hídrico e reiniciar o crescimento quando a água se torna disponível. Além de que, logo após o término de um período de estresse hídrico, as plantas podem até crescer mais rapidamente do que as que não sofreram estresse. Essa situação ocorre, provavelmente, pelo acúmulo de fotoassimilados no início do período de estresse. Essas reservas, que são pouco utilizadas durante a seca, ficam disponíveis para estimular o crescimento quando a água se torna novamente disponível (Amaral et al., 2003).
Sua reconhecida versatilidade se estende desde o uso de seus grãos como alimento humano e animal; como matéria prima para produção de álcool anidro, bebidas alcoólicas, colas e tintas; o uso de suas panículas para produção de vassouras; extração de açúcar de seus colmos; até às inúmeras aplicações de sua forragem na nutrição de ruminantes. Em termos globais, sorgo é a base alimentar de mais de 500 milhões de pessoas em mais de 30 países. Somente arroz, trigo, milho e batata o superam em termos de quantidade de alimento consumido (Ribas, 2008). Na figura 10 estão representadas a plantação de sorgo e seus grãos.
Figura 10: Sorgo encontrado na natureza. A) Plantação de sorgo. O caule do sorgo tem de dois ou três metros de altura, folhas sem pelos e ásperas nas margens, flores em panícula pouco densa, grande e direita, espessa em forma de cacho e pendente. B) Grãos de sorgo. Os grãos são redondos e podem ter coloração avermelhada, esbranquiçada ou amarela (Retirada de www.embrapa.br/milho-e-sorgo)
A)
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Um dos principais objetivos do nosso grupo de pesquisa é o estudo da estrutura, função e interação de chaperonas e Hsps para compreender os mecanismos moleculares da resposta celular ao estresse (Borges & Ramos, 2005; Tiroli-Cepeda & Ramos, 2011; da Silva & Ramos, 2012; Cyr & Ramos, 2015). Para tanto, uma das linhas de pesquisa envolve o estudo de chaperonas e Hsps de plantas pois, estas são muito susceptíveis ao estresse ambiental principalmente por serem sésseis. São estudadas, principalmente, proteínas de cana-de-açúcar (Borges et al., 2007; Tiroli-Cepeda & Ramos, 2010; Cagliari et
al., 2011; da Silva et al., 2013; Tiroli-Cepeda et al., 2014) dada a sua importância
para a economia brasileira e pelos esforços de diversos grupos brasileiros em estudar a biologia desta planta.
Este trabalho teve por objetivo caracterizar a estrutura e função da HOP de Sorghum bicolor (SbHop) para posteriormente compreender seu papel de co-chaperona da Hsp90 de cana-de-açúcar. A Hop de sorgo foi escolhida pois a informação completa sobre seu gene está disponível no banco de dados BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), enquanto a informação sobre o gene de cana não está e pelo fato de proteínas de sorgo serem altamente similares às de cana-de-açúcar.
2.2. Objetivos Específicos
Para tanto, foram estabelecidos os seguintes objetivos específicos em relação à Hop de sorgo:
Clonagem do gene;
Expressão da proteína em grande quantidade e de forma solúvel;
Caracterização do enovelamento da proteína por técnicas espectroscópicas;
Obtenção de parâmetros biofísicos da proteína por técnicas hidrodinâmicas;
1 66 131 196 261 326 391 456 521 586 651 716 781 846 911 976 1041 1106 1171 1236 1301 1366 1431 1496 1561 1626 1691 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Bioinformática - sequência da Hop cana-de-açúcar
Como proposto pelo projeto inicial, um dos objetivos era a clonagem, expressão e caracterização de co-chaperonas da Hsp90, sendo uma delas a Hop de cana-de-açúcar , a qual já foi anotada por Borges et al., 2007.
Para tal, foi pesquisado no banco de dados BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), a partir da sequência de Hop de A.
thaliana (gi: 332657726), as sequências de cDNA homólogas a ela já anotadas.
Dessa forma foi encontrada uma proteína hipotética de Sorghum bicolor (gi: 242066549). A sequência de cDNA e sua sequência de aminoácidos correspondentes podem ser conferidas nas figuras 11 e 12, respectivamente.
Figura 11: cDNA da proteína hipotética de Sorghum bicolor. (gi: 242066549) 1740 pares de base. ATGGCCGACGAGGCGAAGGCGAAGGGTAATGCGGCGTTCTCGGCCGGCCGCTTCGAGGAGGCGGC GCGGCACTTCACGGACGCCATCGCGCTCGCCCCGGGCAACCACGTCCTCTACTCCAACCGGTCGG CGGCGCTCGCCTCGCTCCACCGCTACTCCGATGCGCTCGCCGACGCGCACAAGACCGTCGAGCTC AAGCCCGACTGGGCCAAGGGCTACTCCCGCCTCGGCGCGGCGCACCTCGGTCTCGGCGACGCCGC CAGCGCCGTCGCGGCGTACGAGAAGGGCCTCGCGCTCGACCCCAGCAACGACGGCCTCAAGGCGG GGCTCGACGACGCTAAGAAGGCGGCCGCCGCCCCGCCCCGCCGCGGGCCGTCCGGCCCCGACGGC CTCGGCCAGATGTTCCAGGGCCCCGAGCTGTGGAGCAAGATCGCGTCCGACCCCACCACGCGCGC CTACCTTAGCGAGCCCGATTTTATGCAGATGCTGCGCGAGGTGCAGAGGAATCCCAGCAGCATCA GTATGTACCTCTCCGATCCCCGGATGATGCAGGTGCTCAGCCTCATGCTTAACGTCAAGATCCAG AGACCCGAGGCCTCCGAGTCGTCGCAGTCTACTCCATCGCAGCCGCCGCCGCAGCAGCAGCAGAC GCCGCCTCCTGAGACAAAGGCGAGGGAGGTAGAGCCGGAACCGGAGCCAGAGCCAATGGATTTAA CTGATGAGGAAAAGGATCGCAAGGAGAAGAAAGCTGCTGCTCAGAAGGAGAAGGAGTTAGGTAAC ACAGCTTACAAGAAGAAGGACTTCGAGACGGCAATCCAGCATTACACCAAAGCCTTGGAACTTGA CGATGAGGATATTTCCTATCTGACTAACCGAGCAGCAGTCTACATTGAGATGGGAAAGTACGATG AATGCATCAAGGATTGCGATAAGGCTGTGGAGAGGGGAAGAGAGCTCCGTGCTGATTTCAAGATG ATTTCAAGGGCACTGACAAGAAAAGGAACAGCTCTGGTCAAACTTGCTAAGACCTCTAAGGATTT TGATATTGCCATCGAGACCTTCCAGAAGGCTCTAACTGAGCATCGGAACCCAGACACTCTTAAAA AGTTAAATGAGGCTGAGAGAGCAAAGAAAGATTTGGAGCAACAAGAGTATTATGATCCAAAATTA GCAGATGAGGAGAGAGAGAAAGGTAACGAGTTCTTCAAGGAGCAAAAATACCCAGAAGCAATAAA ACACTACACAGAGGCTCTCAGGAGGAACCCAAAGGATCCTAGGGTTTACAGCAATAGGGCCGCCT GCTACACCAAGTTAGGAGCCATGCCTGAAGGTCTTAAAGACGCAGAGAAGTGTCTTGATCTAGAC CCCACCTTCACCAAAGGGTATACAAGGAAAGGTGCAATTCAATTCTTCATGAAAGAATATGACAA GGCCATGGAAACCTACCAGGCTGGCTTGAAGCATGACCCAAACAACCCGGAACTGCTTGATGGTG TTAGGAGGTGTATTGAACAGATCAACAAGGCCAACAGAGGTGAAATAAGTCAGGACGAATTGCAA GAAAGACAGAACAAAGCTATGCAAGACCCAGAGATCCAGAACATTCTTACCGACCCTATCATGCG ACAGGTGCTAATTGATTTCCAGGAGAACCCAAGGGCAGCCCAGGAGCACCTGAAGAACCCCGGAG TTATGCAGAAGATTCAGAAGCTTGTAAGTGCTGGGATAGTTCAAATGA
