UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DANIEL DE ALMEIDA BORGES
CARACTERIZAÇÃO DO CERATOCONE: AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS TOMOGRÁFICOS E POSSÍVEIS MARCADORES NA LÁGRIMA DE PORTADORES DE
CERATOCONE E FAMILIARES
CAMPINAS
DANIEL DE ALMEIDA BORGES
CARACTERIZAÇÃO DO CERATOCONE: AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS TOMOGRÁFICOS E POSSÍVEIS MARCADORES NA LÁGRIMA DE PORTADORES DE
CERATOCONE E FAMILIARES
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área de Concentração Oftalmologia.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. MÔNICA DE CÁSSIA ALVES DE PAULA COORIENTADOR: PROF. DR. CARLOS EDUARDO LEITE ARIETA
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO/TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO DANIEL DE ALMEIDA BORGES, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. MÔNICA DE CÁSSIA ALVES DE PAULA.
CAMPINAS 2019
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Borges, Daniel de Almeida,
B644c BorCaracterização do ceratocone : avaliação de parâmetros tomográficos e possíveis marcadores na lágrima de portadores de ceratocone e familiares / Daniel de Almeida Borges. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
BorOrientador: Mônica de Cássia Alves de Paula. BorCoorientador: Carlos Eduardo Leite Arieta.
BorDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Bor1. Ceratocone. 2. Córnea. 3. Proteômica. I. Paula, Mônica de Cássia Alves de. II. Arieta, Carlos Eduardo Leite, 1956-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Characterization of keratoconus : evaluation of tomographic parameters and tear biomarkers in keratoconus patients and relatives
Palavras-chave em inglês: Keratoconus
Cornea Proteomics
Área de concentração: Oftalmologia Titulação: Mestre em Ciências Banca examinadora:
Mônica de Cássia Alves de Paula [Orientador] Jose Paulo Cabral de Vasconcellos
Cintia Sade de Paiva
Data de defesa: 26-06-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciências Médicas Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-2879-7950 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4270764907683203
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
DANIEL DE ALMEIDA BORGESORIENTADOR: MÔNICA DE CÁSSIA ALVES DE PAULA COORIENTADOR: CARLOS EDUARDO LEITE ARIETA
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. MÔNICA DE CÁSSIA ALVES DE PAULA
2. PROF. DR. JOSE PAULO CABRAL DE VASCONCELLOS
3. PROFA. DRA. CINTIA SADE DE PAIVA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº 2014/19138-5.
Agradecemos aos seguintes colaboradores:
Laboratório de Espectrometria de Massas e no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), que integram o Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNEPEM) sob supervisão das coordenadoras Adriana Franco Paes Leme e Ana Carolina Mattos Zeri.
Laboratório de Fisiopatologia Médica, Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp sob a supervisão do prof. Dr. Mario José Abdalla Saad e colaboração dos pesquisadores Dioze Guadagnini e Heloisa Balan Assalin.
Departamento de Anatomia Patológica da Unicamp, sob a orientação do prof. Dr Konradim
Metze.
Microscopia Confocal, Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), no Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNEPEM), colaboração dos pesquisadores Matheus Castro Fonseca e Marília Meira Dias.
Resumo
Objetivos e justificativa: o ceratocone é uma doença corneana que afeta
profundamente a acuidade visual e a qualidade de vida dos pacientes acometidos. Seus
mecanismos fisiopatológicos e as influências genéticas ainda são pouco compreendidos.
Estudos recentes mostraram o envolvimento das vias inflamatórias com níveis alterados de
citocinas, aumento da atividade de proteinases e outros possíveis mediadores no filme
lacrimal e no tecido corneano. O presente estudo observacional pretende expandir o atual
conhecimento sobre o ceratocone através de uma investigação detalhada que envolve
tomografia corneana e avaliação do filme lacrimal de pacientes com ceratocone no
Ambulatório de Córnea e Doenças Externas do Hospital de Clínicas da UNICAMP, seus
familiares e um grupo controle.
Métodos: foi realizada a avaliação por tomografia corneana com imagens de
Scheimpflug utilizando o Pentacam comparando 38 pacientes com ceratocone, 29
familiares e 20 controles. Amostras de lágrima foram coletadas para caraterização do
proteoma por espectrometria de massas em um grupo de pacientes com ceratocone e um
grupo controle.
Resultados: comparando o grupo de familiares com o grupo controle, foram
encontradas diferenças significativas nos índices tomográficos de paquimetria corneana
(p=0,0233), Kmax (p=0,0189), ARTMax (p=0,05), Dt (p=0,0227), Da (p=0,0489), D
(p=0,0229) e BEleTh (p=0,0065). A análise proteômica univariada mostrou 7 proteínas
expressas diferencialmente entre o grupo de pacientes com ceratocone e o grupo controle.
A análise multivariada encontrou 8 proteínas com potencial para possíveis marcadores da
Conclusão: familiares de pacientes com ceratocone mostraram índices tomográficos
corneanos alterados em comparação com o grupo controle. A análise proteômica mostrou
proteínas expressas diferencialmente no filme lacrimal de portadores de ceratocone e
selecionou alguns potenciais biomarcadores que podem ajudar a entender a fisiopatologia
da doença.
Abstract
Purpose and objectives: Keratoconus is a corneal disease that profoundly impacts
the visual acuity and quality of life of affected patients. There is a lack of understanding of
its physiopathological mechanisms and familial associations. Recent studies have shown
the implication of inflammatory pathways with altered levels of cytokines, proteinases, and
other possible biomarkers at tear film and corneal tissue. The present observational study
intends to expand the current knowledge about keratoconus through a detailed investigation
which comprises corneal tomography and tear film evaluation of patients from the Cornea
and External Disease Ambulatory, Department of Ophthalmology, UNICAMP, their family
members and a control group.
Methods: corneal tomographic Scheimpflug images with Pentacam were obtained
from 38 keratoconus patients, 29 relatives, and 20 controls. Tear film samples were
collected for a mass spectrometric proteomic analysis from a group of keratoconus patients
and a control group.
Results: Comparing patients’ relatives and control group, we found significant
differences in tomographic indices of corneal pachymetry (p=0.0233), Kmax (p=0.0189),
ARTMax (p=0.05), Dt (p=0.0227), Da (p=0.0489), D (p=0.0229), BEleTh (p=0.0065).
Univariate proteomic analysis showed 7 differentially expressed proteins between
keratoconus subjects and the control group, and multivariate analysis found 8 proteins with
potential as biomarkers of the disease.
Conclusions: keratoconus patients’ relatives showed altered tomographic indices in
in the keratoconus tear film and selected potential biomarkers that could help understand its
physiopathology.
Sumário 1. Introdução... 11 2. Justificativa...16 3. Objetivos ... 17 4. Hipóteses... 18 5. Metodologia...19 6. Resultados... 24 7. Discussão... 46 8. Conclusão... 51 9. Referências bibliográficas... 52 10. Anexos... 56
1. Introdução
1.1. Ceratocone:
A córnea é uma das principais estruturas refrativas do olho humano, com poder
dióptrico em torno de 44D e de fundamental importância na convergência dos raios
luminosos e formação da imagem na retina. O ceratocone é uma doença da córnea que se
caracteriza por uma condição clínica onde ocorre o afilamento do estroma corneano,
seguido de protrusão tecidual. Nesses casos, a córnea assume uma forma cônica e tem o
seu poder refrativo profundamente modificado. As alterações estruturais do ceratocone
provocam miopia e astigmatismo irregular e graus variados de comprometimento da
qualidade visual(1–3).
O ceratocone, de modo geral, tem início na puberdade, com caráter progressivo até
a terceira ou a quarta décadas de vida. O acometimento é em geral bilateral, embora haja
relatos de ceratocone unilateral. A incidência é estimada entre 50 a 230 por 100.000 na
população geral e a prevalência é de 54,5 por 100.000. A grande variação na incidência
pode ser explicada por diferenças nos critérios diagnósticos e na detecção de formas
precoces da doença. O ceratocone tem incidência variável em diferentes grupos étnicos e
não tem predileção por sexo(1–4). Não existem dados sobre incidência e prevalência do
ceratocone na população brasileira(5).
Na maioria das vezes, o ceratocone é uma condição isolada, embora haja relatos de
associação com outras doenças sistêmicas e oculares, sendo as mais frequentemente
citadas a Síndrome de Down, a amaurose congênita de Leber, doenças do tecido
conjuntivo, prolapso de válvula mitral, atopia, além do ato de coçar os olhos e uso de lentes
1.2. Ceratocone e hereditariedade:
Existem fortes evidências de influência genética na patogênese do ceratocone(6,7).
Relatos de incidência de ceratocone em gêmeos monozigóticos mostraram alta
concordância com expressividade variável. Estudos prévios reportaram história familiar
positiva em 6-10% dos pacientes com ceratocone(1,4). A maioria desses estudos sugere
modo de herança autossômico dominante com expressividade variável. Várias mutações
diferentes em diversos genes já foram reportadas em casos de ceratocone familiar,
sugerindo heterogeneidade genética no ceratocone(7,8). Dentre os genes já reportados,
destacam-se o VSX1 (Visual System Homeobox 1), miR-184 (microRNA-184) e DOCK9
(Dedicator of Cytokinesis 9)(7,9). Em estudo recente, análise de segregação complexa
indicou uma forte contribuição genética na transmissão do ceratocone, com modo de
herança mais provavelmente não-mendeliano com efeito de gene maior(10).
Um estudo de prevalência de alterações subclínicas em parentes de pacientes com
ceratocone utilizando o tomógrafo Orbscan II avaliou uma amostra de 11 pacientes com
ceratocone (19 olhos), 90 familiares sem diagnóstico de ceratocone (178 olhos) e 44
controles (88 olhos)(11). Foram pesquisados 4 parâmetros corneanos relacionados a
ceratocone (ceratometria média maior que 47,2D, índice de assimetria superior-inferior
maior que 1,2D, ápice corneano posterior maior que 42µm, paquimetria mais fina menor
que 463µm). Dentre os controles, apenas um indivíduo apresentou um desses parâmetros
alterados, enquanto dentre os 178 olhos dos familiares, 45 olhos apresentaram um ou mais
parâmetros alterados. O risco relativo de um familiar possuir um parâmetro corneano
alterado para ceratocone foi de 14,67 (IC 2,07-104,07 e P<0,001) com relação aos
controles.
Kara et al. estudaram parâmetros biomecânicos da córnea utilizando o Ocular
alterações clínicas ou topográficas, e encontraram diferenças significativas nos parâmetros
de histerese corneana e fator de resistência corneana entre os dois grupos(12).
No nosso estudo, fizemos uma avaliação pormenorizada dos familiares dos
pacientes com ceratocone, com destaque para o exame de tomografia de córnea com uso
do equipamento Pentacam que tem alta sensibilidade para casos de ceratocone iniciais.
Com o diagnóstico de casos subclínicos, muitos pacientes com ceratocone que antes eram
classificados como casos esporádicos foram reclassificados como casos familiares,
facilitando o reconhecimento dos métodos de herança envolvidos e fornecendo dados para
um futuro estudo genético dessas famílias(8,11).
1.3. Potenciais Mediadores no Ceratocone:
Embora o ceratocone seja classicamente descrito como uma doença degenerativa
de caráter não-inflamatório, estudos recentes relacionaram vários mediadores inflamatórios
ao ceratocone, colocando em evidência as vias inflamatórias na fisiopatologia desta
doença. Estudos realizados com amostras de lágrima de pacientes com ceratocone
encontraram níveis alterados de mediadores inflamatórios em comparação com indivíduos
não-afetados(13,14).
Lema et al. encontraram níveis aumentados de Interleucina(IL)-6, metaloproteinase
de matriz(MMP)-9 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em lágrimas de pacientes com
ceratocone, e uma correlação positiva com o estágio da doença(15). Ao estudar as
lágrimas de pacientes com ceratocone assimétrico (um olho com manifestações clínicas e
o outro normal ou com ceratocone subclínico) e controles, Lema et al. encontraram níveis
aumentados de IL-6 e TNF-α em olhos com ceratocone clínico e subclínico, enquanto
MMP-9 só estava aumentada em olhos com ceratocone clínico(16). Jun et al. estudaram diversos
mediadores inflamatórios nas lágrimas de pacientes com ceratocone, e encontraram níveis
quimiocina ligante 5 (CCL5)(17). Kolozsvári et al. estudaram lágrimas de pacientes com
ceratocone e encontraram uma correlação positiva entre CCL5, MMP-13 e fator de
crescimento nervoso (NGF) e diversos índices topográficos, enquanto encontraram uma
correlação negativa entre IL-6 e KCI (keratoconus index)(18). Balasubramanian et al.
encontraram níveis aumentados de MMP-1, -3, -7 e -13, IL-4, -5, -6 e -8, TNF-α e -ß e níveis
diminuídos de imunoglobulina A (IgA) secretória e lactoferrina(19,20). Sorkhabi et al.
encontraram níveis aumentados de IL-6 e IFN-γ e níveis reduzidos de IL-10 nas lágrimas
de pacientes com ceratocone(21). Shetty et al., em um estudo em três estágios,
encontraram níveis aumentados de expressão do mRNA de MMP-9, IL-6 e TNF-α no
epitélio corneano de pacientes com ceratocone, em comparação com controles. Ao estudar
as lágrimas destes pacientes, encontraram níveis aumentados de MMP-9 nos pacientes
com ceratocone, em comparação com controles. Finalmente, após 6 meses de
administração tópica de ciclosporina-A para pacientes com ceratocone, encontraram
diminuição dos níveis de MMP-9 na lágrima destes pacientes e diminuição na curvatura
corneana evidenciada por mapas topográficos(22).
Gaskin et al. demonstraram a presença de células CD11b+, provavelmente
macrófagos, no estroma e na camada basal do epitélio, e também encontraram números
aumentados de células CD45+ no estroma, através de técnica de imunofluorescência com
microscopia confocal em tecido corneano de pacientes submetidos a transplante por
ceratocone avançado(23). No mesmo estudo, foi demonstrada alteração na deposição
tecidual de laminina, colágeno III e fibronectina em córneas com ceratocone e hidrópsia,
em comparação com córneas normais, indicando processo de remodelação tecidual no
1.4. Proteômica
A análise do proteoma de tecidos e fluidos humanos tem se tornado um dos
principais métodos utilizados na pesquisa de biomarcadores em diversas doenças(24). Pela
facilidade de acesso e coleta através de métodos minimamente invasivos, a análise da
lágrima tem se mostrado promissora no diagnóstico e monitoramento de doenças da
superfície ocular(25). Escassos estudos anteriores reportaram possíveis marcadores do
ceratocone através de análise comparativa do proteoma lacrimal. Pannebaker et al.
reportaram diversas proteínas associadas ao ceratocone: MMP-1, queratinas,
imunoglobulinas alfa e kappa, precursores da prolactina, lisozima C e lipocalina(26). Lema
et al. encontraram expressão diferenciada de lactoferrina, imunoglobulina kappa e
zinco-alfa2-glicoproteína, com concentrações diminuídas em lágrimas de pacientes com
ceratocone(27). Balasubramanian et al. reportaram aumento da expressão de catepsina B
e níveis reduzidos do receptor polimérico de imunoglobulina, da cadeia alfa do fibrinogênio
e das cistatinas S e SN(19).
Apesar desses avanços recentes, a fisiopatologia do ceratocone continua pouco
esclarecida. Atualmente, o ceratocone é considerado uma doença corneana multifatorial,
causada pela interação complexa de fatores ambientais e endógenos, levando a aumento
do estresse oxidativo, desequilíbrio entre enzimas e seus inibidores, apoptose e
2. Justificativa:
O ceratocone é uma doença ocular com grande repercussão na acuidade visual e
na qualidade de vida dos pacientes. Existem ainda lacunas importantes no entendimento
dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no aparecimento e progressão do ceratocone
e na apresentação clínica na nossa população.
O presente estudo foi desenhado para permitir uma coleta de dados demográficos,
clínicos pessoais e familiares, investigação complementar com recursos propedêuticos
avançados, como o exame de tomografia corneana e de segmento anterior com o Oculus
Pentacam, e avaliação do proteoma lacrimal por espectrometria de massas. Na disciplina
de Oftalmologia da Unicamp, um número relevante de pacientes portadores de ceratocone
são avaliados, tratados e acompanhados rotineiramente. A compilação e análise detalhada
de dados clínicos de pacientes e familiares associada a investigação do proteoma lacrimal
e com sugestão de possíveis marcadores permitirão uma compreensão dos mecanismos
fisiopatológicos relacionados a essa doença ocular, que traz um grande impacto na visão e
3. Objetivos:
3.1. Objetivos gerais:
- Coleta de um banco de dados clínicos, fatores de risco e testes propedêuticos de
pacientes portadores de ceratocone e seus familiares, no Ambulatório de Doenças Oculares
Externas da Disciplina de Oftalmologia no Hospital de Clínicas da Unicamp, durante as
consultas de diagnóstico e acompanhamento.
- Coleta de amostras de lágrima, sangue e tecido corneano para avaliação de
possíveis marcadores em pacientes portadores de ceratocone e seus familiares.
3.2. Objetivos específicos:
- Análise de dados clínicos e avaliação propedêutica complementar de indivíduos
portadores de ceratocone, familiares e controles.
- Quantificação de possíveis marcadores na lágrima dos pacientes portadores de
4. Hipóteses:
- Presença de parâmetros tomográficos alterados na população de parentes de
pacientes com ceratocone, detectáveis através de análise corneana por tomografia por
princípio de Scheimpflug (Pentacam).
- Perfil proteômico distinto em lágrimas de portadores de ceratocone, em
comparação com controles normais, com expressão diferencial de proteínas detectáveis
5. Metodologia:
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp (CAAE:
55904316.8.0000.5404) e segue os princípios da Declaração de Helsinque.
Trata-se de um desenho transversal, observacional e não intervencionista. Para a
avaliação clínica, os sujeitos da pesquisa foram divididos em três grupos: 38 pacientes com
diagnóstico de ceratocone, 29 familiares de pacientes com ceratocone e 20 controles. Para
a avaliação proteômica das lágrimas por espectrometria de massas, foi selecionada uma
amostra de 4 pacientes com ceratocone e 6 controles. Os sujeitos da pesquisa foram
convidados no Ambulatório de Oftalmologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP,
caracterizando uma amostra de conveniência. Foram incluídos todos os familiares que
puderam comparecer ao Ambulatório para exame clínico e coleta de material.
O diagnóstico de ceratocone foi confirmado por avaliação tomográfica da córnea por
imagens de Scheimpflug (Pentacam), demonstrando os sinais característicos de aumento
da curvatura corneana, afilamento estromal, alterações nos mapas de elevação e
astigmatismo irregular(1,30,31). A versão utilizada do software do Pentacam foi 1.20r134
(Build: 4448) de 22/06/2017.
5.1. Critérios de inclusão e exclusão:
Foram incluídos no presente estudo os pacientes com diagnóstico de ceratocone,
em acompanhamento no Ambulatório de Ceratocone do HC/UNICAMP, bem como seus
familiares por consanguinidade, desde que aceitassem os termos de consentimento livre e
esclarecido. Para o grupo controle, foram incluídos voluntários sem sinais clínicos ou
tomográficos de ceratocone e sem história familiar da doença.
Para a avaliação proteômica da lágrima, foram excluídos do presente estudo aqueles
imunomoduladoras, tópicas ou sistêmicas, bem como aqueles com quadro ocular
inflamatório ou infeccioso em atividade no momento da coleta de dados.
Para a avaliação clínica e tomográfica, foram excluídos aqueles com história prévia
de qualquer cirurgia de superfície ocular, incluindo cirurgia refrativa (PRK, LASIK, RK),
implante de anéis intraestromais, crosslinking corneano, exérese de pterígio, cirurgia de
catarata dentre outros. Foram excluídos os olhos com história de trauma prévio ou sinais
de cicatrizes corneanas traumáticas.
Os familiares de pacientes com ceratocone que tiveram diagnóstico da doença, após
exame de tomografia corneana, foram realocados para o grupo de pacientes com
ceratocone.
5.2. Coleta de dados clínicos:
Foi realizada anamnese detalhada com histórico do ceratocone (uso de óculos,
lentes de contato, transplante de córnea ou crosslinking), história de comorbidades oculares
como conjuntivite alérgica, olho seco e hábito de coçar os olhos, comorbidades sistêmicas,
uso de medicamentos oculares ou sistêmicos, história familiar de ceratocone ou outras
doenças oculares ou sistêmicas, questionário de qualidade de vida, exame de acuidade
visual e refração, exame de biomicroscopia e fundoscopia. Anexo 2 – Protocolo de
avaliação de ceratocone.
5.3. Avaliação tomográfica:
Foram realizados exames de tomografia corneana e de segmento anterior com o
5.4. Avaliação laboratorial
As amostras de lágrima foram coletadas por micropipeta após instilação de 20µL de
água destilada sobre a superfície ocular, sendo então transferidas para Eppendorfs e
congeladas a -80ºC.
Análise Proteômica - espectrometria de massas (MS):
Amostras de lágrima foram processadas para estudos de proteômica realizados no
Laboratório de Espectrometria de Massas e no Laboratório de Ressonância Magnética
Nuclear do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), que integram o Centro Nacional
de Pesquisa em Energia e Materiais (CNEPEM) sob supervisão das coordenadoras Adriana
Franco Paes Leme e Ana Carolina Mattos Zeri. O projeto foi submetido pelo Portal de
Serviços do LNBio (www.lnbio.cnpem.br).
Preparo das amostras
As amostras de lágrimas foram descongeladas em gelo e um volume de 15µL foi
usado para a digestão. A seguir foram adicionados um volume de 1:1 de ureia 8M. As
amostras foram reduzidas com a adição de 5 mM - concentração final - de DTT
(DL-Dithiothreitol – Sigma-Aldrich®), durante 25 min a 56°C, e alquiladas com concentração
final de 14 mM de IAA (Iodoacetamide – SigmaAldrich®) durante 30 min, temperatura
ambiente e no escuro. Após essas etapas, foi adicionado 1mM de cloretode cálcio (Synth®)
seguido da digestão com 0,3ug de tripsina (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111,
Promega) por 16 horas a 37°C. Após a digestão com a tripsina, a reação da mesma foi
interrompida com a adição de 1% de ácidofórmico (Merck®), pH menor que 3. Em seguida,
as amostras foram dessalinizadas utilizando Stage Tips com membranas C18 (Octadecyl C18-bonded sílica - 3M Empore™ extraction disks) e completamente secas em evaporador (SPD 1010 SpeedVac®, Thermo)(32).
Injeção das amostras LC-MS
Uma alíquota de 2 µL para cada amostra foi analisada em espectrômetro de massas
LTQOrbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific) acoplado ao sistema de cromatografia líquida
EASYnLC II (Proxeon) por uma interface de nanoelectrospray. Os peptídeos foram
separados, num tempo total de corrida de 80min, por um gradiente de 2 a 90% de
acetonitrila, contendo 0,1% de ácido fórmicoem uma coluna analítica PicoFrit (20 cm x ID75
μM, 5 μm de tamanho de partícula, NewObjective) em um fluxo de 300 nl/min. A voltagem
do nanoelectrospray foi ajustada para 2,2 kV e a temperatura da fonte em 275°C. Foi
utilizada a análise dependente dos dados na qual os20 íons mais intensos foram escolhidos
para fragmentação do tipo CID (dissociação induzidapor colisão). Os espectros para full
scan dos espectros de massas (m/z 300 – 1600) foramadquiridos no analisador Orbitrap
após acúmulo para um valor de AGC de 10e6. A resolução do Orbitrap foi de 60.000 e os
picos mais intensos foram fragmentados por CID com energia de colisão normalizada de
35% com o tempo de ativação de 10ms. Para a obtenção dos espectros de massas-2, os íons deveriam ter pelo menos 1000 contagens, com exclusão dinâmica de 60 s.
Pré-processamento
Após a obtenção dos dados, os mesmos foram processados usando o programa
MaxQuant versão 1.3.0.3 com o algoritmo Andrômeda, contra o banco de dados Uniprot
Human Protein Database (download em março de 2017 contendo 92.934 sequências e
36.874.315 resíduos).
Análises de bioinformática foram realizadas usando o programa Perseus versão
1.5.1.6. Foi realizada a transformação logarítmica, e aplicação de filtros para eliminar
proteínas com sequências reversas, proteínas que foram identificadas por apenas um
peptídeo modificado e filtragem das proteínas por 5 valores válidos em pelo menos um
5.5. Análise estatística:
As variáveis contínuas coletadas pelo exame de tomografia corneana tiveram sua
distribuição avaliada através de histogramas e do teste de Shapiro-Wilk. Para as variáveis
contínuas com distribuição normal, foi utilizado o teste t não pareado. Para as variáveis
contínuas com distribuição não-paramétrica, foi utilizado o teste da soma dos postos de
Wilcoxon. Os cálculos foram realizados no STATA versão 15.
Os dados da espectrometria de massas foram submetidos a transformação
logarítmica antes das análises estatísticas. As análises univariadas foram realizadas no
GraphPad Prism versão 6.00. As medidas das amostras dos pacientes com ceratocone
foram comparadas com as medidas dos controles através do teste t não pareado, sem e
com correção para múltiplas análises: FDR 5% (false discovery rate), FDR 1% ou método
de Holm-Sidak. As análises multivariadas foram realizadas na plataforma online
Metaboanalyst (https://www.metaboanalyst.ca). As 8 proteínas com maior escore
VIP-PLSDA (Variable Importance in Projection in Partial Least Scores Discriminant Analysis)
foram selecionadas para visualização no gráfico heat map, PCA (principal component
analysis) e curva ROC (receiver operating characteristic). Para a visualização gráfica no
heat map, os dados foram dimensionados automaticamente. A área sob a curva ROC e os
correspondentes intervalos de confiança de 95% foram calculados para estimar o potencial
clínico dos metabólitos selecionados como biomarcadores(33).
As proteínas com valor-p < 0,05 nas análises do teste t foram selecionadas para
prospecção de vias bioquímicas no KEGG Mapper / Search Pathway
(https://www.kegg.jp/kegg/tool/map_pathway1.html, última atualização: 10 de Junho, 2014)
6. Resultados
6.1. Avaliação tomográfica corneana
Os 3 grupos do estudo apresentaram as seguintes características clínicas:
Tabela 1. Características clínicas dos grupos avaliados por tomografia corneana.
Grupo n Idade média
(anos)
Desvio
padrão Amplitude Sexo (F / M)
Alergia ocular
Ceratocone 38 22,8 10,8 7 - 61 16 / 22 20 / 38
Familiares 29 43,5 19,6 4 - 70 19 / 10 3 / 29
Controle 20 30,1 11,4 19 - 54 16 / 4 1 / 20
A avaliação tomográfica da córnea pelo exame do Pentacam foi realizada
considerando-se os 3 grupos descritos acima. Na comparação do grupo Ceratocone com o
grupo Controle, como esperado, todas as variáveis estudadas apresentaram diferenças
com relevância estatística (p<0,0001).
Na comparação do grupo Familiar com o grupo Controle, houve diferença para as
seguintes variáveis: Kmax (ponto mais curvo no mapa axial anterior), com p=0,0189;
paquimetria no ponto mais fino, com p=0,0233; ARTMax, com p=0,0500; índice Dt, com
p=0,0227; índice Da, com p=0,0489; índice D, com p=0,0229; BEleTh (Back Elevation at
Tabela 2. Avaliação de parâmetros tomográficos de córnea em indivíduos com ceratocone, familiares e controles
Variáveis Ceratocone Familiar Controle
Valor-p* (familiar x controle) Valor-p* (ceratocone x controle) K1 (dioptria) 46,81 (45,76 – 47,86) 43,74 (43,11 – 44,37) 43,01 (42,48 – 43,54) 0,0941 <0,0001 K2 (dioptria) 50,79 (49,45 – 52,12) 44,76 (44,12 – 45,41) 43,86 (43,19 – 44,52) 0,0542 <0,0001 Kmax (dioptria) 56,24 (54,46 – 58,03) 45,36 (44,74 – 45,98) 44,27 (43,62 – 44,92) 0,0189 <0,0001 Paquimetria (µm) 458,7 (448,5 – 468,8) 524,2 (515,1 – 533,2) 540,6 (529,2 – 551,9) 0,0233 <0,0001 ARTMax 165,9 (150,5 – 181,5) 376,5 (348,7 – 404,3) 415,7 (389,1 – 442,4) 0,0500 <0,0001 PIMin 1,52 (1,35 – 1,68) 0,8 (0,74 – 0,87) 0,73 (0,67 – 0,79) 0,1126 <0,0001 PIAvg 2,07 (1,88 – 2,26) 1,08 (1,02 – 1,14) 1,01 (0,97 – 1,06) 0,1144 <0,0001 PIMax 2,99 (2,69 – 3,30) 1,43 (1,34 – 1,52) 1,31 (1,25 – 1,38) 0,0593 <0,0001 Df 11,25 (9,33 – 13,16) 0,28 (-0,05 – 0,63) 0,49 (0,06 – 0,92) 0,4527 <0,0001 Db 8,34 (6,96 – 9,72) 0,48 (0,06 – 0,91) -0,01 (-0,42 – 0,40) 0,1031 <0,0001 Dp 7,88 (6,59 – 9,16) 1,19 (0,79 – 1,58) 0,77 (0,44 – 1,10) 0,1243 <0,0001 Dt 2,74 (2,32 – 3,14) 0,43 (0,15 – 0,70) -0,05 (-0,36 – 0,26) 0,0227 <0,0001 Da 2,94 (2,80 – 3,08) 1,02 (0,76 – 1,27) 0,66 (0,41 – 0,90) 0,0489 <0,0001 D 8,63 (7,66 – 9,60) 1,64 (1,32 – 1,95) 1,15 (0,94 – 1,37) 0,0229 <0,0001 FEleTh (µm) 22,68 (19,77 – 25,59) 2,89 (2,04 – 3,74) 3,4 (2,66 – 4,13) 0,3877 <0,0001 BEleTh (µm) 49,71 (44,26 – 55,16) 11,96 (9,77 – 14,16) 7,9 (6,37 – 9,42) 0,0065 <0,0001 Astigmatismo (dioptria) 3,97 (3,29 – 4,64) 1,02 (0,71 – 1,33) 0,85 (0,59 – 1,11) 0,4225 <0,0001 Qval -0,90 (-1,03 – -0,77) -0,32 (-0,36 – -0,28) -0,37 (-0,42 – -0,31) 0,1618 <0,0001
Legenda: média (intervalo de confiança 95%). * Resultados do teste t. K: ceratometria. ARTMax: Maximum Ambrosio Relational Thickness. PI: Progression Index. D: Belin-Ambrosio deviation indices. FEleTh: Front Elevation at Thinnest point. BEleTh: Back Elevation at Thinnest point. Qval: q-value (asfericidade).
As figuras 1A-H mostram exemplos de avaliação tomográfica de córnea em
indivíduos com ceratocone e familiares com quadro subclínico da doença.
Figura 1. Tomografias de córnea de pacientes com ceratocone e familiares
Figura 1B: Filho de paciente com ceratocone. Notar córnea assimétrica, com paquimetria mais fina e aumento no mapa de elevação posterior
Figura 1C: possui familiares com ceratocone: a mãe, dois irmãos e um primo. Notar córnea
Figura 1D: mãe de dois pacientes com ceratocone. Notar córnea assimétrica no mapa axial anterior
Figura 1F: filho da paciente da figura 1D, meio-irmão da paciente da figura 1E (têm pais diferentes). Notar ceratocone superior, manifestação rara da doença.
Figura 1H: paciente com ceratocone, irmã gêmea idêntica da paciente da figura 1G. Notar quadro assimétrico de comprometimento corneano entre as irmãs.
Os seguintes heredogramas (Figuras 2A e 2B) mostram a distribuição familiar dos
casos de ceratocone incluídos no presente estudo. Os indivíduos portadores de ceratocone
estão marcados com cor sólida preta, e os indivíduos marcados com hachuras são os que
apresentaram algum parâmetro alterado no exame de tomografia corneana pelo Pentacam,
a saber: AS = assimetria corneana no mapa de curvatura axial anterior, BE: alterações nos
mapas de elevação posteriores, D: alterações no índice de Belin-Ambrosio, K: alteração no
limite superior da ceratometria, P: alteração no limite inferior da paquimetria no ponto mais
fino, considerando os índices de referência do aparelho.
6.2. Avaliação proteômica das lágrimas
A avaliação proteômica das lágrimas foi realizada considerando-se dois grupos, o
primeiro formado por 4 portadores de ceratocone e o segundo por 6 controles sem sinais
clínicos ou tomográficos da doença. A tabela 3 mostra a média das características clínicas
e tomográficas de cada grupo.
Tabela 3. Características clínicas e tomográficas das amostras avaliadas por proteômica
Variáveis Ceratocone Controle
Kmax 52,12 45,83
Paquimetria 468,5 518,2
Índice D 6,26 2,27
Idade (anos) 30,5 47,5
Sexo (F / M) 2 / 2 5 / 1
A análise quantitativa identificou um total de 208 proteínas distintas nas amostras de
lágrima do grupo Ceratocone. Após as análises estatísticas pelo teste t, foram
encontradas 7 proteínas com níveis significativamente aumentados no grupo
Ceratocone em comparação aos controles, considerando o valor-p menor que 0,05
(Tabela 4 e Figura 3). Após as correções por múltiplas comparações, essas proteínas
não mantiveram níveis de significância estatística. Não foram encontradas proteínas
Tabela 4. Análise proteômica da lágrima: proteínas expressas diferencialmente entre os grupos
Gene Proteína Valor-p FDR 5% FDR 1% FWER Ceratocone* Controle* Razão
IGHV5-10-1; IGHV5-51 Immunoglobulin heavy variable 5-10-1; Immunoglobulin heavy variable 5-51 0,0030 N N N 23,2 21,8 2,63 PRR27 Proline-rich protein 27 0,0030 N N N 25,4 22,3 10,46 IGHM Ig mu chain C region; Ig mu heavy chain disease protein 0,0045 N N N 27,8 26,0 3,73
HIST1H2BA§ Histone H2B type 1-A 0,0047 N N N 22,9 21,1 3,50
KRT13 cytoskeletal 13 Keratin, type I 0,0206 N N N 27,4 25,5 3,59
IGHV3-23# heavy variable 3-Immunoglobulin
23 0,0358 N N N 25,5 24,5 2,26 DEFA1; DEFA3 Neutrophil defensin 1; HP 1-56; Neutrophil defensin 2; Neutrophil defensin 3; HP 3-56; Neutrophil defensin 2 0,0369 N N N 27,9 25,2 7,45
* Média da transformação logarítmica do LFQ (Label-free quantification). FDR: false discovery rate. FEWR: family-wise error rate (método Holm-Sidak). N: não significativo após correção para múltiplas comparações. § histone cluster (HIST1H2BA; HIST1H2BK; HIST1H2BJ; HIST1H2BO; HIST1H2BB; H2BFS; HIST1H2BD; HIST1H2BC; HIST2H2BE; HIST2H2BF; HIST3H2BB; HIST1H2BH; HIST1H2BN; HIST1H2BM; HIST1H2BL). # immunoglobulin cluster (IGHV3-23; IGHV3-30; IGHV3-30-5)
Figura 3. Quantificação de proteínas no grupo Ceratocone versus grupo Controle
Box plot representando quantificação de proteínas em AU (unidades arbitrárias – transformação logarítmica da LFQ)
As proteínas identificadas nos estudos de proteômica de amostras de lágrima podem
representar potenciais marcadores da doença. Foi realizada uma busca em bancos de
dados específicos (UniProt/PubMed) para o descritivo de genes e vias relacionadas a cada
uma das proteínas identificas na análise univariada:
A proteína Immunoglobulin heavy variable 5 (ID A0A0C4DH38) é codificada pelo
gene IGHV5 e representa a região V do domínio variável das cadeias pesadas das
imunoglobulinas que participa do reconhecimento antigênico.
A proteína Proline-rich protein 27 (ID Q6MZM9) é codificada pelo gene PRR27 e
A proteína Immunoglobulin heavy constant mu (ID P01871) é codificada pelo gene
IGHM e representa a região constante das cadeias pesadas das imunoglobulinas.
A proteína Histone H2B (ID Q96A08) é codificada pelo gene HIST1H2B e representa
o componente fundamental do nucleossomo, estrutura que envolve e compacta o DNA em
cromatina, limitando o acesso do DNA ao maquinário celular que precisa do DNA como
modelo. Dessa forma, a histona desempenha papel central na regulação da transcrição, do
reparo, da replicação e da estabilidade do DNA.
A proteína Keratin, type I cytoskeletal 13 (ID P13646) é codificada pelo gene KRT13
e representa um dos dois tipos de queratina microfibrillar e citoesquelética, com função
estrutural no citoesqueleto celular e na queratinização.
A proteína Immunoglobulin heavy variable 3 (ID P01764) é codificada pelo gene
IGHV3 e representa a região V do domínio variável das cadeias pesadas das
imunoglobulinas que participa do reconhecimento antigênico.
A proteína Neutrophil defensin (ID P59665) é codificada pelo gene DEFA e tem
função antibacteriana, fungicida e antiviral, com mecanismo de permeabilização da
membrana plasmática microbiana.
A proteína Immunoglobulin kappa variable 1 (ID P01593), apesar de não atingir
significância estatística (p=0,053), também estava aumentada no grupo Ceratocone, sendo
codificada pelo gene IGKV1, representando a região V do domínio variável das cadeias
A análise de ontologia genética de proteínas selecionas após avaliação estatística
nas lágrimas de pacientes com ceratocone encontrou as vias biológicas descritas na tabela
5.
Tabela 5. Processos biológicos enriquecidos para proteínas expressas diferencialmente no grupo Ceratocone.
Termo Valor-p ajustado Valor-p Genes
male-specific antibacterial humoral
response (GO:0006962) 1.05E-05 1.82E-04 IGHM; DEFA1 antibacterial peptide production
(GO:0002778) 1.13E-05 1.82E-04 IGHM; DEFA1
induction of bacterial agglutination
(GO:0043152) 1.30E-05 1.82E-04 IGHM; DEFA1
antibacterial humoral response
(GO:0019731) 3.59E-04 3.77E-03 IGHM; DEFA1
CENP-A containing nucleosome
disassembly (GO:1905783) 3.60E-03 2.05E-02 HIST1H2BA DNA replication-dependent nucleosome
disassembly (GO:0034725) 3.60E-03 2.05E-02 HIST1H2BA DNA replication-independent
nucleosome disassembly (GO:0034726) 3.60E-03 2.05E-02 HIST1H2BA nucleosome disassembly (GO:0006337) 4.39E-03 2.05E-02 HIST1H2BA
innate immune response in mucosa
(GO:0002227) 4.19E-03 2.05E-02 DEFA1
G-protein coupled receptor signaling pathway involved in defense response
to Gram-negative bacterium (GO:1903554)
6.3. Potenciais biomarcadores
A análise multivariada inclui o dendrográfico heat map, o gráfico PCA e a curva ROC
que são mostrados na Figura 4. Os escores da PCA foram de 57,2% para o PC1
(componente principal 1) e 16,4% para o PC2 (componente principal 2). A área sob a curva
ROC resultante da análise multivariada e os correspondentes intervalos de confiança de
95% são mostrados na Figura 5. As seguintes proteínas foram identificadas como possíveis
biomarcadores, em ordem crescente de importância relativa: IGHV5 (Immunoglobulin
heavy variable 5), EZR (Ezrin), KRT13 (Keratin, type I cytoskeletal 13), IGHM
(Immunoglobulin heavy constant mu), MPO (Myeloperoxidase), CTSG (Cathepsin G),
PRR27 (Proline-rich protein 27), and RARRES1 (Retinoic acid receptor responder protein
1).
As proteínas IGHV5, KRT13, IGHM e PRR27 foram identificadas como possíveis
marcadores tanto na análise univariada quanto na multivariada. As proteínas descritas a
seguir foram encontradas somente na análise multivaridada.
A proteína Retinoic acid receptor responder protein 1 (ID P49788), codificada pelo
gene RARRES1, estava expressa em 5 das 6 amostras do grupo Familiares e ausente em
todas as amostras do grupo Ceratocone. Atua como inibidora da carboxipeptidase AGBL2
citoplasmática, com regulação negativa da proliferação celular.
A proteína Cathepsin G (ID P08311), codificada pelo gene CTSG, é uma protease
com especificidade semelhante a tripsina e quimiotripsina, cliva o complemento C3 e tem
atividade antibacteriana contra Gram-negativos.
A proteína Myeloperoxidade (ID P05164), codificada pelo gene MPO, participa do
sistema de defesa dos leucócitos polimorfonucleares. Tem atividade microbicida contra
uma ampla gama de microrganismos.
A proteína Ezrin (ID P15311), codificada pelo gene EZR, está provavelmente
(A) Heat map, as cores níveis relativos de expressão, com cores vermelhas para níveis aumentados e cores verdes para níveis diminuídos. (B) Gráfico PCA. (C) Curva ROC.
Figura 5. Análise da curva ROC multivariada e importância relativa dos potenciais biomarcadores para Ceratocone versus Controle.
(A) Área sob a curva ROC resultante da análise multivariada e os correspondentes intervalos de confiança de 95%. (B) Predicted Class Probabilities. (C) Potenciais biomarcadores em ordem de importância relativa.
7. Discussão
O ceratocone é uma doença ectásica da córnea que pode afetar profundamente a
acuidade visual dos seus portadores, gerando impacto na qualidade de vida e de visão. O
início da doença ocorre em fases precoces da puberdade e apresenta caráter progressivo.
Estudos recentes têm garantido muitos avanços sobre o ceratocone. O
desenvolvimento de ferramentas propedêuticas permite maior acurácia em análises
pormenorizadas da arquitetura corneana, índices e parâmetros mais confiáveis para
diagnóstico e acompanhamento da doença. Da mesma forma, o tratamento e a reabilitação
visual dos portadores de ceratocone tem evoluído com novas lentes de contato, implantes
intraestromais, novas técnicas de transplante de córnea e o crosslinking corneano para
atenuar a progressão da doença e diminuir o impacto negativo na qualidade da visão(30).
Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos relacionados ao ceratocone ainda não estão
completamente elucidados. Padrões de hereditariedade e o papel da inflamação no
processo de desenvolvimento da doença tem sido investigados em diversas populações.
As análises tomográficas comparativas de familiares de indivíduos com ceratocone
e controles demonstraram que os principais parâmetros associados ao diagnóstico do
ceratocone (paquimetria fina, ceratometria alta, alterações no índice D de Belin-Ambrósio,
aumento na elevação posterior da córnea) encontram-se alterados nesse grupo de estudo,
sem atingir níveis patológicos. Essas alterações subclínicas em familiares de pacientes com
ceratocone podem representar uma maior susceptibilidade genética dessa população, ou
expressividade variável da doença, ou até mesmo uma ausência ou menor resposta a um
possível gatilho ambiental para o desenvolvimento da doença clínica. Vale ressaltar que a
prevalência de alergia ocular foi muito maior no grupo de pacientes com ceratocone, em
comparação aos familiares sem a doença clínica. A avaliação tomográfica das gêmeas
com importante influência ambiental na manifestação da doença, já que elas apresentavam
grau de comprometimento corneano diferente entre si.
As três primeiras variáveis estudadas (K1, K2 e Kmax) referem a pontos de curvatura
no mapa axial anterior, sendo K1 e K2 o ponto mais plano e o mais curvo respectivamente
nos 3 mm centrais e Kmax o ponto mais curvo de toda a superfície anterior. Todos esses
valores encontram-se aumentados em córneas com ceratocone, devido à protrusão
corneana característica da doença, e encontramos no presente estudo o Kmax aumentado
nos familiares, embora em grau muito menor do que na doença.
As próximas variáveis estudadas referem à espessura corneana. Para a avaliação
paquimétrica, foi utilizado o ponto mais fino da córnea medido em micrômetros (µm). Esse
valor é bastante diminuído em córneas com ceratocone, sendo a principal hipótese a
degradação enzimática por metaloproteinases ativadas na cascata inflamatória,
possivelmente relacionada a aumento do estresse oxidativo. Também encontramos esse
valor diminuído no grupo dos familiares, embora em menor grau do que na doença. Os
índices PIMin, PIAvg e PIMax referem ao índice de progressão paquimétrica mínimo, médio
e máximo. É definido como a progressão da espessura corneana do ponto mais fino até o
limbo, onde a córnea tem a maior espessura. O índice ARTMax (ART: Ambrosio Relational
Thinnest) é a divisão da paquimetria mais fina pelo índice de progressão máximo, e foi
criado com o intuito de aumentar a sensibilidade e especificidade no diagnóstico do
ceratocone(31). Não foram encontradas diferenças no grupo dos familiares para os índices
de progressão paquimétrica; já o índice ARTMax estava alterado com significância
estatística.
Em seguida, avaliamos os índices de Belin-Ambrósio, que são valores de
desvio-padrão da córnea avaliada em relação a um banco de dados de córneas normais. Ao
combinar dados paquimétricos com os mapas de elevação, aumenta-se a sensibilidade do
elevação anterior), Db (desvio da elevação posterior), Dp (desvio da progressão
paquimétrica), Dt (desvio da paquimetria mais fina), Da (desvio do ARTMax) e o índice D,
que engloba matematicamente todos os anteriores. Os índices Dt, Da e D apresentaram
diferença estatística no grupo dos familiares com relação aos controles, provavelmente
devido à paquimetria mais fina nesse grupo.
O índice FEleTh refere à elevação anterior no ponto mais fino da córnea e o BEleTh
à elevação posterior no ponto mais fino. Esses índices refletem a protrusão corneana típica
do ceratocone. O BEleTh estava alterado no grupo dos familiares em relação aos controles,
o que pode refletir um aumento na elevação posterior dessas córneas, um dos sinais do
ceratocone subclínico. No entanto, uma parte dessa alteração também pode ser explicada
pela diferença de idade entre os grupos (43,5 anos entre os familiares e 30,1 anos nos
controles), pois já foi descrito que a córnea apresenta aumento fisiológico da elevação
posterior com o passar dos anos(36).
Tanto o astigmatismo quanto o Q-value (asfericidade corneana) são parâmetros
bastante alterados em córneas com ceratocone, especialmente o astigmatismo irregular, e
são alguns dos responsáveis pela diminuição da acuidade visual nesse grupo. Não
encontramos diferenças entre os grupos familiares e controle para essas variáveis.
A proteômica tem se destacado como uma área da biotecnologia recente que permite
a investigação da expressão de proteínas e isoformas em amostras biológicas. O proteoma
representa, assim, um método direto para identificar, quantificar e estudar as modificações
pós-traducionais das proteínas e suas possíveis correlações com mecanismos fisiológicos e/ou mecanismos relacionados a doenças. Neste estudo, observamos a detecção na análise univariada de 7 proteínas com expressão significativamente diferente em amostras de ceratocone. A análise multivariada selecionou 8 proteínas com potencial para biomarcadores da doença. Uma parte dessas proteínas está relacionada a imunidade, o que pode refletir a ativação de vias inflamatórias na doença. A análise de componentes
principais (PCA) e o heat map demonstraram que a análise do proteoma é capaz de diferenciar de forma adequada os portadores de ceratocone dos controles. Tais achados deverão ser validados em estudos futuros e podem representar potenciais marcadores do ceratocone.
Experimentos de proteômica produzem uma grande quantidade de dados. Geralmente, centenas de proteínas distintas são identificadas. Existe um amplo debate na literatura sobre como lidar com toda essa informação e quais seriam as ferramentas estatísticas mais adequadas. Saccenti et al., em uma revisão sobre o uso de análises univariadas e multivariadas com dados de metabolômica, sugerem que ambos os métodos sejam utilizados, já que fornecem informações complementares(37). Essa foi a estratégia utilizada no presente trabalho para a análise estatística dos dados da proteômica da lágrima.
Embora nosso estudo de proteômica tenha um pequeno número amostral, conseguimos demonstrar através da análise multivariada que há diferenças entre o proteoma lacrimal de pacientes com ceratocone e controles.
Como perspectivas futuras, pretendemos complementar a investigação de mediadores inflamatórios no ceratocone através da localização por imunofluorescência confocal dos marcadores CD45 e CD31 em amostras de tecido corneano obtidas de pacientes que foram submetidos a transplante de córnea, comparadas com tecidos normais obtidos da rima do doador. Em paralelo, investigaremos nessas amostras as alterações ultraestruturais do tecido corneano no ceratocone através de marcações de fibronectina e laminina em lâminas preparadas para imunofluorescência confocal. As amostras já foram coletas e processadas e os experimentos estão agendados para o próximo semestre. Para estudo de investigação do papel da hereditariedade no ceratocone, amostras de sangue das famílias incluídas neste estudo foram coletadas e serão posteriormente avaliadas em parceria com o CBMEG em colaboração com a professora Dra. Mônica Melo, através de
análise de exoma e expressão gênica. Também realizaremos uma avaliação de citocinas inflamatórias em lágrimas de pacientes com ceratocone, seus familiares e um grupo controle através de ensaio Multiplex. Uma nova avaliação proteômica por espectrometria de massas também está agendada para o próximo semestre de 2019, com maior número de amostras.
8. Conclusão
O estudo permitiu a análise de dados clínicos, avaliação propedêutica complementar
da córnea e caracterização do proteoma lacrimal de pacientes portadores de ceratocone
no Ambulatório de Doenças Oculares Externas da Disciplina de Oftalmologia no Hospital
de Clínicas da Unicamp, durante as consultas de diagnóstico e acompanhamento.
• Foram avaliados dados clínicos, fatores de risco e testes propedêuticos de pacientes portadores de ceratocone e seus familiares, sendo demostrados
parâmetros tomográficos alterados nos familiares sem doença clínica.
• Foram coletadas amostras de lágrima de pacientes portadores de ceratocone e controles para avaliação de possíveis marcadores através de estudos de
proteômica, que evidenciaram proteínas com expressão significativamente
9. Referências bibliográficas
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10. Anexos:
10.1. Anexo 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
Caracterização do ceratocone, investigação da influência da hereditariedade e do papel de mediadores pró-inflamatórios
Dr. Daniel de Almeida Borges Prof. Dr. Carlos Eduardo Leite Arieta
Profa. Dra. Mônica Alves de Paula Número do CAAE: 55904316.8.0000.5404
Você está sendo convidado a participar como voluntário de uma pesquisa. Este documento, chamado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, visa assegurar seus direitos como participante e é elaborado em duas vias, uma que deverá ficar com você e outra com o pesquisador.
Por favor, leia com atenção e calma, aproveitando para esclarecer suas dúvidas. Se houver perguntas antes ou mesmo depois de assiná-lo, você poderá esclarecê-las com o pesquisador. Se preferir, pode levar este Termo para casa e consultar seus familiares ou outras pessoas antes de decidir participar. Não haverá nenhum tipo de penalização ou prejuízo se você não aceitar participar ou retirar sua autorização em qualquer momento.
Justificativa e objetivos:
O ceratocone é uma doença corneana que leva a diminuição da visão, podendo causar grande impacto na qualidade de vida dos pacientes afetados. É umas das principais causas de transplante de córnea em todo o mundo. Os mecanismos que levam ao desenvolvimento do ceratocone ainda não são conhecidos, mas estudos recentes sugerem que as vias de inflamação estão envolvidas em sua progressão. Também é sabido que existe uma influência genética na apresentação do ceratocone.
O trabalho tem como objetivo avaliar as características do ceratocone em portadores da doença e seus familiares, dosagem de mediadores na lágrima e avaliação da córnea em pacientes que forem submetidos a transplante de córnea para reabilitação visual durante o seu seguimento.
Procedimentos:
Participando do estudo você está sendo convidado a: responder questionário com perguntas sobre alterações nos olhos, exame ocular completo, exames complementares de topografia, tomografia e microscopia especular de córnea e coleta de uma amostra de lágrima para dosagem de mediadores de inflamação (exame de laboratório). Caso você tenha indicação de cirurgia de transplante de córnea durante o acompanhamento e vigência desta pesquisa, será solicitado seu consentimento para a coleta de amostra da córnea para avaliação de mediadores pelo método de imunofluorescência (exame de laboratório). A amostra será constituída da parte da córnea que é retirada durante a cirurgia de transplante de córnea e substituída por um tecido de doador e em nada interferirá no tratamento cirúrgico proposto.
Você será orientado sobre o estudo e submetido a coleta de dados epidemiológicos e de história clínica, e em seguida serão procedidos os exames clínicos e complementares e por fim a coleta de lágrimas conforme descrito abaixo:
1 - Exame ocular: avaliação da superfície ocular à biomicroscopia, quantificando características das pálpebras, do filme lacrimal, córnea e conjuntiva. A biomicroscopia é um exame da parte da frente dos olhos, com um aparelho composto por luzes e lentes, utilizado rotineiramente no exame oftalmológico. Medida da acuidade visual e exame de refração para quantificação da capacidade visual e grau dos óculos.
2 - Topografia de córnea: exame complementar da rotina de investigação de doenças da córnea. As imagens são captadas rapidamente pelo aparelho, sem contato com os olhos e sem necessidade de instilação de colírios e depois são avaliadas com auxílio de programas específicos.
3 - Tomografia de córnea: imagens captadas rapidamente sem contato e sem necessidade de instilação prévia de colírios e analisadas com softwares específicos. O exame permite avaliação de mapas topográficos anteriores e posteriores e diversos comparativos de curvaturas e espessura da córnea.
4 - Microscopia especular de córnea: imagens captadas rapidamente sem contato e sem necessidade de instilação prévia de colírios e analisadas com softwares específicos para avaliação do endotélio corneano.
5 - Coleta de lágrimas: as lágrimas serão coletadas através de pipeta plástica estéril do bordo palpebral inferior, evitando-se tocar a superfície ocular, e serão armazenadas em tubo específico e congeladas para posterior avaliação em nível laboratorial.
6 - Coleta de amostras de córnea: serão coletadas amostras de córnea dos pacientes portadores de ceratocone que forem submetidos a cirurgia após orientação e consentimento. Tais amostras serão avaliadas através de exames laboratoriais para a quantificação de possíveis marcadores da doença. Você será avaliado no Ambulatório de Córnea e Doenças Externas do Hospital de Clínicas da Unicamp e acompanhado por cerca de 2 horas para cumprir os exames desse estudo. Na ocasião, será solicitado a responder ao questionário, e será realizado exame oftalmológico, exames complementares e coleta de lágrimas como já descritos anteriormente. Todo e qualquer esclarecimento prévio à execução das avaliações ou durante o curso da pesquisa sobre a metodologia do estudo será prontamente comunicado pelos pesquisadores envolvidos.
Desconfortos e riscos:
Você não deve participar deste estudo se estiver em uso de medicações antiinflamatórias, imunossupressoras ou imunomoduladoras, tópicas ou sistêmicas, bem como aqueles com quadro ocular inflamatório ou infeccioso em atividade no momento da coleta de dados.
Possíveis transtornos, desconfortos e riscos: os exames clínicos e complementares fazem parte da rotina habitual de investigação e acompanhamento do ceratocone no ambulatório, são indolores e não interferem na visão. Os exames de topografia e tomografia de córnea podem causar fotofobia leve durante sua realização. A coleta de lágrimas pode causar pequeno desconforto, que será atenuado com colírio anestésico se necessário. A coleta de amostras de córnea será feita mediante o consentimento daqueles pacientes que tenham indicação de transplante de córnea durante seu tratamento com finalidade de reabilitação visual. A amostra será obtida do tecido retirado durante o procedimento e substituído pela córnea doada e não interferirá na cirurgia nem no seu resultado.
Benefícios:
O paciente será beneficiado na medida em que os dados do estudo ampliem o conhecimento sobre a apresentação clínica e evolução de sua doença. Todos os exames complementares realizados serão anexados ao prontuário para uso em seu seguimento clínico.
Acompanhamento e assistência:
Todos os pacientes participantes da presente pesquisa continuarão seu acompanhamento regular no Ambulatório de Córnea da Disciplina de Oftalmologia do HC/UNICAMP.
Será disponibilizado tratamento médico em caso de danos diretamente causados pela pesquisa, ou seja, avaliação e tratamento de eventual desconforto relacionado a coleta de lágrimas.
