Detecção e Identificação de Fungos de Importância Médica

(1)

Detecção e Identificação de

Fungos de Importância Médica

Dra. Marilene Rodrigues Chang Mestre em Análises Clínicas, área de Micologia – USP/SP Doutora em Ciências, área de Bacteriologia – FIOCRUZ/RJ

Docente do Depto. de Farmácia e Bioquímica da UFMS: Microbiologia Clínica

Como Fazer ???

Quando Valorizar o Isolamento de

Fungos em Cultura?

• Qualquer amostra biológica com resultado positivo ao exame microscópico • Micose cutânea

• Fluídos corporais normalmente estéreis • Tecidos obtidos por biópsias ou peças operatórias

• Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independente da contagem de colônias

• Raspado de córnea

• Paciente imunodeprimido (transplantado ou com Aids)

• Paciente em uso de antibióticos por longo tempo, internado em UTI ou submetido a ventilação, cateterismo ou outras manipulação

• Paciente de hemodiálise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doença infecciosa independente do tipo de amostra clínica

Além desses casos, têm importância as culturas de fungos: • Dimórficos

• Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra biológica, coletada em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente

• Isolados de ponta de cateter (alimentação parenteral, infusões venosas, etc.)

IMPORTÂNCIA de se identificar os

fungos na atualidade

Grande valor diagnóstico

Diagnóstico preciso

Terapêutica mais específica

Exames Micológicos

•

• Micológico DiretoMicológico Direto

–

– A fresco com KOH 20% ou DMSOA fresco com KOH 20% ou DMSO –

– A fresco com Tinta nanquimA fresco com Tinta nanquim – – CoradoCorado • • GramGram • •GiemsaGiemsa • •CroccottCroccott •

•Azul de Azul de ortoorto--toluidinatoluidina

• •PAS, HEPAS, HE • •MucicarminMucicarmin • • Cultura Cultura –

– ASD com e sem antibióticoASD com e sem antibiótico

–

– ASD com antifúngico (ASD com antifúngico (cicloheximidacicloheximida) *) * –

– Ágar BHIÁgar BHI – – Ágar BatataÁgar Batata •

• Provas de IdentificaçãoProvas de Identificação

– – LevedurasLeveduras

–

– Fungos FilamentososFungos Filamentosos •

• AntifungigramaAntifungigrama

–

– Difusão em ágarDifusão em ágar –

– MicrodiluiçãoMicrodiluiçãoem caldo (CLSI)em caldo (CLSI)

Fluxograma para Exames Micológicos

Cultura do sedimento

Cultura do triturado

KOH e Tinta nanquim

Gram

KOH e Tinta nanquim

Giemsa

HE, PAS, Groccot

(2)

Exame direto

-

Leveduras

Exame Micológico Direto com KOH a 20%

Dermatófitos causando Tinea pedis “ Pé de atleta”

Resutado: Filamentos micelianos hialinos septados e artroconídeos sugestivo de dermatófitos ++

Exames de pelo, pele, unha, tecidos e exsudatos espessos

Cuidado...

Exames Micológico Direto com KOH a 20%

Material: escamas de pele de lesões Hipo ou hipercrômicas: Pitiríase Versicolor

Resultado: Presença de filamentos micelianos curtos e tortuosos e blastoconídeos

agrupados sugestivos de Malassezia spp +++

Exames Micológico Direto com KOH a 20%

Presenças de blastoconídeos e pseudo hifas: ++

Exames Micológico Direto de fio de cabelo

com KOH a 20%

(3)

Exames Micológico Direto com KOH a 20%

Coleta: material abaixo das crostas HD: cromomicose

Presença de corpos escleróticos sugestivos de agentes de cromomicose

Exames Micológico Direto com KOH a 20%

Resultado: Presença de estruturas com morfologia característica de Paracoccidioides brasiliensis: ++

Exames Micológicos

Biópsia de Pulmão examinada com KOH 20% ( 400 X)

Líquido cérebro espinal examinado com Tinta nanquim (100 X)

?

Exame Micológico com Tinta Nanquim

Resultado: presença de leveduras

capsuladas sugestivas de Cryptococcus spp +++

Materiais: Sedimento de LCR, urina e outros líq biológicos, escarro, Lavado brônquico, aspirado de medula Óssea e biópsia.

Exame Micológico

–

Técnica de Gram

Material: Secreção vaginal com aspecto de

“leite coalhado” Resultado: Presenças de leveduras _{(blastocinídeos) e pseudo-hifas sugestivos} de Candida spp: ++ ( 1000X)

Exame Micológico

–

Técnica de Gram

(4)

Exame Microscópico com Coloração

Panótica

(

Giemsa

,

Leishman

ou

Wright

)

Leveduras intracelulares sugestivas de Histoplasma capsulatum. Materiais: sangue periférico e Biópsia de pele ( 1000 X)

Processamento de Biópsia para Exames Processamento de Biópsia para Exames Micológicos

Micológicos

1 – Cortar o tecido em pedaços peqs Em placa estéril com NaCl 2 – Aspirar com pipeta Pasteur e Semear em ASD e ABHI c/ atb 3 – Incubar a 30 e 35ºC 3 – Fazer lâminas c/ KOH e T. nanquim 4 – Fazer lâmina para Giemsa

Processamento de Biópsia para Exames Processamento de Biópsia para Exames Micológicos

Micológicos

Exames

Histopatológicos

Exame Micológico

–

Técnica de

Groccott

Fiilamentos ramificados sugestivos de actinomicetos ( 1000 x)

Biópsia: Coloração com PAS

Blastoconídeos e pseudo hifas de Candida albicans em rim de Camudongo Balb-c (1000 x)

(5)

Biópsia: Coloração com HE

Parede de artéria hepática em zona de anastomose com hifas de Zigomicetos (HE 400 X)

Arteríola retroperitoneal com trombose oclusiva e hifas de Zigomicetos (HE 400 x)

Mucicarmim

IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS

Procedimentos Laboratoriais

•

• Diagnóstico laboratorial

Diagnóstico laboratorial

–

–Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ?Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ?

–

–Cultura: isolamento e identificaçãoCultura: isolamento e identificação

•

• Condições adequadas de incubação

Condições adequadas de incubação

–

–Meio de cultivo Meio de cultivo

–

–Temperatura Temperatura

–

–TempoTempo

Cultura de Amostras Biológicas para

Isolamento de Fungos

•

• Amostra semeada em estrias em tubo Amostra semeada em estrias em tubo tamponado com algodão hidrófobo

tamponado com algodão hidrófobo •

• Armazenamento em saco plástico à Armazenamento em saco plástico à temperatura ambiente

temperatura ambiente •

• Isolamento primário:Isolamento primário:

–

– Agar Agar SabouraudSabouraudDextroseDextrose –

– ÁgarÁgarbatata (PDA)batata (PDA) –

– Ágar BHI com Ágar BHI com CloClo, , PnPnou ou EstrepEstrep •

• Meio Seletivo para fungos Meio Seletivo para fungos patogênicos

patogênicos**: ASD + : ASD + cicloheximidacicloheximida

(

(MycoselMycosel, , MycobioticMycobiotic)) •

• Meio Presuntivo:Meio Presuntivo:

– – Ágar Ágar nígerníger –

– DermatophyteDermatophytetesteteste –

– Candida Candida testtest – – ChromAgarChromAgar •

• 2 tipos de Meio a temp ambiente2 tipos de Meio a temp ambiente

www.anvisa.gov.br/servicosaude/ manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf

Candida

albicans

em

ágar

sangue

Colônias de cor creme, com formação de franjas que lembram “ estrelas”.

(6)

Hemocultura

Metodologia ConvencionalMetodologia Convencional

Características morfológicas

Características morfológicas macroscópicamacroscópica (colônia), (colônia), microscópicas

microscópicas (tamanho, cápsula, hifas e/ou pseudo(tamanho, cápsula, hifas e/ou pseudo--hifas, hifas, produção de tubo germinativo e de clamidósporo)

produção de tubo germinativo e de clamidósporo)

T

Testes bioquímicos (capacidade de assimilação, fermentação de estes bioquímicos (capacidade de assimilação, fermentação de

carboidratos e assimilação de nitrato

carboidratos e assimilação de nitrato, hidrólise da uréia, hidrólise da uréia););

Testes SorológicosTestes Sorológicos

Sistemas manuais Sistemas manuais e/oue/oucom Kitscom Kits

AuxacolorAuxacolor ApiApi2020 CromoagarCromoagar

Sistemas automatizadosSistemas automatizados

VITEK (VITEK (BioBioMerieuxMerieux))

WalkWalkawayaway((DadeDadeBehringBehring))

IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS

•

• Tubo de ensaio + 0,5 Tubo de ensaio + 0,5 mLmLde soro humano, coelho ou de soro humano, coelho ou

cavalo

•

• Incubar a 37º até 3 hIncubar a 37º até 3 h

•

• Adicionar ao 1 gota entre lâmina e lamínula e Adicionar ao 1 gota entre lâmina e lamínula e

observar ao microscópio

•

• Tubo germinativo +: identificação presuntiva de Tubo germinativo +: identificação presuntiva de C. C.

albicans

Metodologia Convencional

1

1 --Pesquisa doPesquisa dotubo germinativotubo germinativo

Teste do tubo germinativo negativo

CUIDADO! observar a constricção entre a célula mãe (blastoconídio) e o início da formação da pseudohifa.

METODOLOGIA CONVENCIONAL

2 2 ––AuxanogramaAuxanograma

Assimilação de fontes de Carbono e Nitrogênio

Halo de turvação

2 mL da suspensão da levedura Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)

Placa de Petri, estéril e previamente numerada no verso

Meio YNB fundido

Incubação 30o_{C por 24-48h}

Aplicação de discos ou açúcar in natura

(7)

Auxanograma

•

• Aplicação de compostos Aplicação de compostos nitrogenados

nitrogenados

–

–Peptona (controle positivo)Peptona (controle positivo) –

–Nitrato de potássioNitrato de potássio •

• Incubação 30Incubação 30oo_{C por 24}_{C por 24}_-_-_{48 h}_{48 h}

até 7 dias

•

• Resultados: presença de zona Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual)

de crescimento (leitura visual)

72 h a 25º C

METODOLOGIA CONVENCIONAL METODOLOGIA CONVENCIONAL

Técnica de cultivo em câmara úmida

3

3 ––Microcultivo em ágar fubá com Tween 80, a 25ºCMicrocultivo em ágar fubá com Tween 80, a 25ºC

Aspectos Microscópicos de Leveduras

de Interesse Médico

Candida

albicans

Observação de filamentos micelianos hialinos septados, blastoconídeos Agrupados e clamidoconídios terminais (100 X e 400X)

Candida

Tropicalis

Pseudo-hifas e blastoconídios intercalados ao longo dos filamentos (400 X)

Candida

parapsilosis

Pseudo hifas ramificadas, blastoconídeos alongados e ligeiramente curvos; às vezes, presença de “ hifas gigantes”

Colônias de cor creme. Podem lembrar “renda”.

(8)

Candida

glabrata

•

MacromorfologiaMacromorfologia (

(ágarágarSabouraudSabouraud) )

Colônias de cor branca a creme, de textura cremosa.

• Micromorfologia

Blastoconídios pequenos, ovais ou com gemulação terminal única. Não há formação de pseudohifa.

C.

C. krusei

krusei

•

• PseudohifasPseudohifascom com blastoconídiosblastoconídiosalongados e ramificados, alongados e ramificados,

por vezes com aparência de arvoredos

Trichosporon

Colônias de cor creme, podem escurecer com o tempo. Aspecto seco e rugoso

Rhodothorula

spp

Colônias de cor laranja a vermelha,

aspecto cremoso. Blastoconídios:

células redondas ou ovais, com gemulação e raramente apresentam pseudohifa.

Cryptococcus

spp

Blastoconídios arredondados, sem pseudo-hifa

METODOLOGIA CONVENCIONAL

5

5 --Produção de Produção de ureaseurease

6

6 --Produção de fenol Produção de fenol oxidase

(9)

METODOLOGIA CONVENCIONAL

4 4 -- Crescimento a 42 ºCCrescimento a 42 ºC Candida albicas C. albicans X C. dubliniensis Cultura positiva Exame direto Bactéria Levedura Cultura Pura Sim Não

Obter Colônia Pura por isolamento

Cápsula +

Macromorfologia Colônia bege: Criptococcus spp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp -Tubo Germinativo - + C. albicans

Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)

Fluxograma para Identificação de Leveduras de

Importância Médica Importância Médica Cultivo em Lâmina Cultivo em Lâmina

Provas Bioquímicas

•

• Blastoconídios

Blastoconídios

-

Urease

positiva

:

–

–Inositol Inositol --: : RhodotorulaRhodotorula

–

–InositolInositol++: : CryptococcusCryptococcus

•

• Presença de artrósporos(=

Presença de artrósporos(=

artroconidios

)

–

–UreaseUrease--: : GeotrichumGeotrichum

–

–UreaseUrease++: : TrichosporonTrichosporon(brotamento +)(brotamento +)

Métodos Comerciais para

Identificação de Leveduras

•

• ChromoagarChromoagarCandidaCandida •

• API 20C AUX (API 20C AUX (BioMérieuxBioMérieux))

•

• ID 32C (ID 32C (BioMérieuxBioMérieux))

•

• CandifastCandifast((InternationalInternationalMicrobioMicrobio))

•

• MicroscanMicroscan((DadeDadeBeringhBeringh))

•

• VitekVitek((BioMérieuxBioMérieux))

Meios

Cromogênicos

•

• Detectam enzimas Detectam enzimas

através de substratos através de substratos específicos ou substratos específicos ou substratos cromógenos cromógenos •

• Permitem detecção de Permitem detecção de

colônias mistas

•

• Rápida identificação de Rápida identificação de C. C. albicans

(10)

Chromoagar

Candida

C. albicans C. krusei C h r o m A g a

r Candida Cromogenic Agar (Oxoid)

Verde = C. albicans

Azul = C. tropicalis

Pink = C. krusei Bege =C. parapsilosis Amarelo/bege/pink= C. glabrata

API

-

20

•

• 19 testes assimilativos 19 testes assimilativos •

• Incubação 30Incubação 30oo_C_C_-_-_{24, 48 e 72}_{24, 48 e 72}

horas

•

• Leitura: verificação de Leitura: verificação de crescimento

crescimento --turbidezturbidez •

• Necessidade de correlação Necessidade de correlação com a análise morfológica

com a análise morfológica

•

• Informa a necessidade de Informa a necessidade de testes adicionais

testes adicionais

•

• Método de referênciaMétodo de referência •

• AcuráciaAcuráciaentre 96 e 98% para entre 96 e 98% para

as espécies patogênicas mais

comuns, sem testes adicionais

API

-

20

C. tropicalis 345 H

“

“Assimilação de 13 açúcaresAssimilação de 13 açúcares +

+ Resistência à cicloResistência à ciclohheximidaeximida

Kit” comercial Auxacolor

(

Sanofi

-

Pasteur

)

Candifast

(International

Microbio

)

•

• IdentificaçãoIdentificaçãoe e testetestede de sensibilidadesensibilidade •

• GênerosGêneros: : CandidaCandida, , TrichosporonTrichosporon,,CryptococcusCryptococcus, , RhodotorulaRhodotorula

e

e SaccharomycesSaccharomyces •

• ÚnicoÚnicoinóculoinóculoe e leituraleituracolorimétricacolorimétrica

•

• ResultadosResultadosemem24 a 72 24 a 72 horashoras(37(37oo_C)_C)

•

• IdentificaçãoIdentificação

–

– sensibilidadesensibilidadeactidioneactidione –

– fermentaçãofermentaçãode 7 de 7 açúcaresaçúcares –

– hidrólisehidrólisedadauréiauréia •

• TesteTestede de SensibilidadeSensibilidade –

– seteseteantifúngicosantifúngicos: 1 : 1 concentraçãoconcentração

Uni

-

Yeast

Tek

Plate

•

11 11 pocinhospocinhos

periféricos com teste

de hidrólise da uréia, de hidrólise da uréia, assimilação de assimilação de carboidratos e nitrato. carboidratos e nitrato.

•

No No pocinhopocinhocentral central

ágar

ágarbatata com batata com

Tween

Tweenpara exame para exame

morfológico

•

(11)

Sistema

Microscan

•

Painel Painel cromogênicocromogênico

•

Identificação em 4hIdentificação em 4h

•

O sistema detecta a O sistema detecta a presença de enzimas presença de enzimas pré pré--formadas formadas utilizadas pelo utilizadas pelo microrganismos pela microrganismos pela utilização substratos utilização substratos específicos. específicos.

ID 32 C STRIPS

(

BioMérieux

)

•

29 testes29 testes

•

leitura após 24/48 horas de incubação a 30leitura após 24/48 horas de incubação a 30oo_C_C_-

-visual ou automatizada

visual ou automatizada

•

taxas de identificação variam de 94 a 98 %taxas de identificação variam de 94 a 98 %

•

RamaniRamanietetal, 1998al, 1998 –

–taxa de identificação de 92% para as espécies taxa de identificação de 92% para as espécies

comuns de leveduras

–

–85 % para isolados raros85 % para isolados raros

•

apresenta uma base de dados bastante ampliadaapresenta uma base de dados bastante ampliada

Vitek

System

(

BioMérieux

)

•

• Sistema automatizado: Sistema automatizado:

leitura

leitura turbidimétricaturbidimétrica

•

• 26 substratos baseado 26 substratos baseado

nos métodos

convencionais

•

• BionúmeroBionúmero--banco de banco de

dados do sistema

•

• Resultado: percentual de Resultado: percentual de

probabilidade de ser a

espécie identificada

Vitek

System

(

BioMérieux

)

•

• 16 espécies de

16 espécies de

Candida

•

• 6 espécies de

6 espécies de

Cryptococcus

•

• 3 espécies de

3 espécies de

Rhodotorula

•

• 2 espécies de

2 espécies de

Trichosporon

•

• 3 espécies de

3 espécies de

Geotrichum

•

• 2 espécies de

2 espécies de

Prototheca

,

Pichia

anomala

,

Pichia

ohmeri

,

Saccharomyces

cerevisiae

e

Yarrowia

lipolytyca

Vitek

system

(

BioMérieux

)

•

Percentual de probabilidade é baixo = testes Percentual de probabilidade é baixo = testes

adicionais

•

93 % das leveduras comuns foram identificadas93 % das leveduras comuns foram identificadas

•

55 % das leveduras menos comum foram 55 % das leveduras menos comum foram

corretamente identificadas

•

Falhas na identificação:Falhas na identificação:

– –42% de 42% de C. C. kruseikrusei – –80 % de 80 % de C. C. lambicalambica – –88 % de 88 % de T. T. beigellibeigelli –

–83 % de 83 % de CryptococcusCryptococcus(não (não C.neoformansC.neoformans))

Vitek

2

•

VitekVitek2 ID YST Card2 ID YST Card

•

47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos)47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos)

•

leitura fluorescente automatizadaleitura fluorescente automatizada

•

15 horas de incubação15 horas de incubação

•

base de dados com 51 espéciesbase de dados com 51 espécies

•

inclui inclui CandidaCandidadubliniensisdubliniensise a atualização e a atualização sistemática dos gêneros

sistemática dos gêneros RhodotorulaRhodotorulae e

Trichosporon

•

(12)

Considerações...

•

• Diversos métodos Diversos métodos

•

• Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acuráciaacuráciaem em cada sistema

cada sistema

•

• Necessidade de estudo morfológico Necessidade de estudo morfológico e/oue/oua complementação com a complementação com

testes tradicionais

•

• Escolha do(s) método(s) Escolha do(s) método(s)

–

–Realidade de cada laboratórioRealidade de cada laboratório –

–Freqüência de isolamentoFreqüência de isolamento –

–Custo do testeCusto do teste –

–Eficácia do testeEficácia do teste

Identificação de Fungos Filamentosos

•

Aspectos Aspectos macroscópicos macroscópicos – –Cor Cor –

–Textura da colôniaTextura da colônia

–

–Pigmento difusívelPigmento difusível

–

–Velocidade de Velocidade de

crescimento

Identificação de Fungos Filamentosos

MICROCULTIVO EM ÁGAR BATATA

Aspectos Microscópicos de Fungos Filamentosos

Agentes de

Agentes de DermatofitosesDermatofitoses

Microsporum canis Epidermophyton flocosum

Trichophyton mentagrophytes

Aspectos Microscópicos de Fungos Filamentosos,

Demácios

Demácios(pigmento escuro)(pigmento escuro)

(13)

Diagnóstico Laboratorial de Fungos

Dimórficos

H. capsulatum P. brasiliensis

Testes Sorológicos

•

• Úteis no diagnóstico da Úteis no diagnóstico da paracoccidioidomicose paracoccidioidomicosee e também para também para acompanhamento de acompanhamento de tratamento. tratamento. •

• O teste de O teste de imunoimunodifusão é difusão é positivo em 80

positivo em 80 --90% dos 90% dos

casos.

casos. •

• Os títulos de anticorpos Os títulos de anticorpos diminuem com o sucesso do

diminuem com o sucesso do

tratamento.

Infecções

Fungicas

Sistêmicas

•

• PlateliaPlatelia® ® AspergillusAspergillus EIA

EIA testtest((BioBio--RadRad))

•

• Detecta o Detecta o AgAg galactomana

galactomana de de

Aspergillus

Aspergillusno no sgsgcomo como

indicador de infecção indicador de infecção invasiva invasiva (transplantados, (transplantados, imunocomprometidos, imunocomprometidos, em uso de em uso de quimioterapia) quimioterapia) •

• Resultado disponível Resultado disponível

em 3 h

Teste de Susceptibilidade aos

Antifúngicos

Normatizações disponíveis

segundo NCCLS

Espécies Candida spp. e Cryptococcus neoformans Aspergillus spp, Fusarium spp, Rhizopus spp, Pseudollescheria boydii e Sporothrix schenckii Candida spp. Documentos • M27-P – 1992 • M27-T – 1995 • M27-A – 1997 • M27-A2 – 2002 • M38-P – 1998 • M38-A – 2002 • M44-P – 2003 • M44-A – 2004

Variáveis relevantes na padronização

do ensaio

•

• Solubilização de drogasSolubilização de drogas

•

• Tamanho do inóculoTamanho do inóculo

•

• Meio de composição definida e tampãoMeio de composição definida e tampão

•

• Temperatura do ensaioTemperatura do ensaio

•

• Tempo e critérios de leituraTempo e critérios de leitura

•

• Avaliação da correlação clínicaAvaliação da correlação clínica

•

• Estabelecimento de “breakpointsEstabelecimento de “breakpoints””

Sheehan et al, CID 17 (suppl 2):S494-500, 1993 Rex et al, Clin Micr Rev 14:643-58, 2001 Rodrigues-Tudela JCM 39:2513-17, 2001

(14)

Metodologia NCCLS: diluição em caldo

Meio: RPMI

Meio: RPMI--1640 1640 tamponado

tamponado c/MOPSc/MOPS

•

InóculoInóculo: 0,5 a 2,5 x : 0,5 a 2,5 x 10 1033_cels/mL_cels/mL

•

Temperatura:35ºCTemperatura:35ºC

•

Tempo de leitura: 48 hTempo de leitura: 48 h

NCCLS, Documento M27A2, 2002 Inóculos cepas ATCC INÓCULOS Controle de crescimento dos inóculos MIC CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO Controle de esterilidade do meio Critério de leitura:

AnfoB: inibição total Azóis: inibição significativa (trailing)

Antifungigrama

: Método

Etest

Descrição

da

Metodologia

•

• PlacaPlacade de petripetri90mm 90mm paraparatestartestarum um ú

úniconicoantifantifúúngicongico

•

• PlacaPlaca120mm 120mm paraparaate 3 ate 3 antifantifúúngicosngicos

•

• FitaFitaplpláásticasticacontendocontendoososantifantifúúngicosngicos

•

• RPMI 1640 + 1.5% de agar RPMI 1640 + 1.5% de agar

suplementado

suplementadocom 2% de com 2% de glicoseglicose

•

• MicrorganismoMicrorganismopuropurocom com subcultivosubcultivo recente

recente(18(18--24h)24h)

•

• 0.5 de McFarland (0.5 de McFarland (espectrofotômetroespectrofotômetro))

•

• SwabSwab

•

• TemperaturaTemperaturade de incubaincubaççãoão: 35: 35°°CC

•

• Tempo de Tempo de incubaincubaççãoão: 24h (: 24h (azazóólicoslicose e

5FC) e 48h (

5FC) e 48h (anfotericinaanfotericinaB)B)

•

• CritCritéérioriode de leituraleitura: : inibiinibiççãoãoparcialparcial

(

(azazóólicoslicose 5FC) e total (e 5FC) e total (anfotericinaanfotericinaB)B)

Sensibilidade

Princípio de Difusão em Disco:

Etest e Disco Difusão

Ilustração esquemática do gradiente de

concentração concentração Disc Disc o o trailing

trailing trailingtrailing

Sensibilidade

(15)

Resistência Resistência Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995 Presença de Macrocolônias indicam subpopulações resistentes Resistência Resistência Peyron et al, JCM 39:339-42, 2001 DISCO DIFUSÃO DISCO DIFUSÃO Documento

DocumentoM44M44--A (A (aprovadoaprovado) ) ––NCCLS NCCLS

2004 2004

Disco Difusão

•

• DiscoDisco--difusão em difusão em ágarágar::

•

•Ótimos resultados com discos de fluconazol 25 Ótimos resultados com discos de fluconazol 25 µµµµ

µµµµg em g em MuellerMueller--HintonHintonagaragare 2% glicose e 2% glicose

•

•Alta reprodutibilidadeAlta reprodutibilidade

•

•Boa correlação com o NCCLSBoa correlação com o NCCLS

•

•Ótima Ótima performance performance no no reconhecimento reconhecimento de de isolados sensíveis

isolados sensíveis

•

•Adicionar azul de metileno Adicionar azul de metileno

Meis et al Diag Microbiol Infect Dis 36:215-23, 2000 Hoffman & Pfaller, Pharmacotherapy, 21(8s): 111s-123s, 2001

(Halo de inibição≥30 mm) Traili Traili ng ng Traili Traili ng ng

Isolado sensível a fluconazol

(presença de trailing)

Cuidado

na

distribuição

do inóculo

Inadequado

(16)

Isolado Resistente, sem halo de inibição definido

Isolado Sensível , com halo de inibição bem definido Leituras de Ensaio de Disco-Difusão com fluconazol

Métodos comerciais e alternativos ao “Padrão Ouro”

Colorimétricos

- Sensititre YeastOne (EUA) - Asty (Japão)

Concentr. Reduzidas - Fungitest (França) - Candifast (Itália)

- Integral System Yeasts (Itália)

• Mais antigos

• ATB Fungos (França) • Mycostandard (França) • Mycototal (França) • Difusão em Meios sólidos

• Difusão em disco • Etest • Microdiluição • - EUCAST (Europeu)

Referências Recomendadas

•

• LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINSLACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINS--VACCARI, E. M.; MELO, N. T. VACCARI, E. M.; MELO, N. T. TRATADO DE MICOLOGIA MEDICA LACAZ

TRATADO DE MICOLOGIA MEDICA LACAZ. 9. ed. São Paulo: . 9. ed. São Paulo: SavierSavier, 2002, 2002

•

• LARONE, D.H. LARONE, D.H. Medically Important Fungi: a guide to identificationMedically Important Fungi: a guide to identification: 7 ed., : 7 ed., Washington: ASM Press, 1995

Washington: ASM Press, 1995

•

• SIDRIM, J.J.C. e MOREIRA, J.L.B. SIDRIM, J.J.C. e MOREIRA, J.L.B. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais de Fundamentos Clínicos e Laboratoriais de

Micologia Médica

Micologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara . Rio de Janeiro: Guanabara KooganKoogan, 1999., 1999. •

• www.anvisa.gov.br/servicosaude/www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdfmanuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf