Helicobacter pylori IgG
Código: 60425002 Formato: 3 x 12 testes
B
Somente para Uso Diagnóstico in Vitro
Uso Pretendido
O kit ImmunoComb® II Helicobacter pylori IgG é um teste EIA
rápido para a detecção semi-quantitativa de anticorpos IgG para
Helicobacter pylori, em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit.
Introdução
O Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativo, flagelada, curva em espiral, encontrada na mucosa gástrica e nas criptas gástricas do estômago. A bactéria é caracterizada por uma alta atividade de urease. É um patógeno primata com distribuição mundial, afetando mais de 60% da população humana em países industrializados e porcentagens mais altas em países
subdesenvolvidos. O aumento na freqüência de infecções que ocorrem entre familiares, com gerações e com multidões, indica que o H. pylori é transmitido por contato direto.
Atualmente é geralmente aceito que a infecção pelo H. pylori é a principal causa de gastrite tipo B ativa e crônica, e dispepsia não-ulcerosa. A bactéria tem sido também fortemente associada com úlceras pépticas gastroduodenais e com adenocarcinoma gástrico, uma das formas mais comuns de câncer em humanos. Evidências recentes tem mostrado uma ligação preferencial do H. pylori ao ácido siálico no muco de glicoproteínas e a fucose no antígeno do grupo sanguíneo Lewisb, expresso na superfície das células epiteliais gástricas do estômago.
Os métodos atuais para o diagnóstico da infecção por H. pylori
incluem métodos invasivos (endoscopia e biópsia gástrica), o teste não invasivo, mas radioativo, teste de sopro de uréia e a detecção sorológica. Na biópsias, os organismos podem ser detectados microscopicamente pela produção de urease e pelo isolamento através da cultura celular. Os métodos invasivos são dolorosos e necessitam de várias amostras para sensibilidade adequada, devido à distribuição desigual das colônias de H. pylori. Recentemente foram desenvolvidos testes sorológicos confiáveis. Os principais determinantes antigênicos foram detectados na urease, assim como a proteína externa imunodominante de 128kDa (CagA) e citotoxina (VacA) de cepas patogênicas de H. pylori.
Estudos comparativos tem mostrado correlações positivas entre as respostas de anticorpos IgG às preparações antigênicas de H. pylori, a gravidade da gastrite, a densidade da colonização de H. pylori ou a eficácia da sua erradicação.
O kit ImmunoComb® II Helicobacter pylori IgG permite o
monitoramento sorológico confiável da infecção por H. pylori ou a resposta à terapia.
Princípio do Teste
O teste ImmunoComb®
II Helicobacter pylori IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções (“dentes”).
Cada dente está sensibilizado em duas posições:
Ponto superior – anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno)
Ponto inferior – antígenos de H. pylori inativados
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo o Pente de fileira a fileiracom incubação em cada etapa.
Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são pré-diluídas 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos para H. pylori, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos H. pylori no ponto inferior dos dentes do Pente (figura 1). Simultaneamente, as imunoglobulinas presentes nas amostras serão capturadas pela imunoglobulina anti-humana no ponto superior (Controle Interno). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgG anti-H. pylori capturados nos dentes reagirão com anti-IgG humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.
Ligação do conjugado anti-IgG Humano,20 min
Reação enzimática de cor; 10 min Anticorpo Substrato Chromogenico Conjugado anti-IgG humano AP AP AP
Formação do complexo
Antígeno H.Pylori-anticorpo;
30 min
Figura 1. Princípio do Teste
O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-H. pylori) e um Controle Negativo, para serem inserídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum outro ponto inferior ou um ponto inferior bem fraco. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se a amostra foi adicionada.
Conteúdo do Kit
Pentes
O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2).
Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas:
Ponto superior – anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno)
Ponto inferior – antígenos H. pylori inativados
Controle Interno
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
ImmunoComb® II
Antigenos H. Pylori Figura 2. Pente
Placas Reveladoras
O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio.
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada.
O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Solução de lavagem
Fileira C Anticorpos de cabra anti-IgG humana, marcados com fosfatase alcalina
Fileira D Solução de lavagem Fileira E Solução de lavagem
Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de
nitrotetrazólio (NBT)
Figura 3. Placa Reveladora
Controles
Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 mL de plasma humano inativado pelo calor, diluído para um nível de cut-off de 20 U/mL para IgG anti- H. pylori.
Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,2 mL de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-H. pylori. Diluente de amostra – 1 frasco de 5 mL.
Perfurador – para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora.
CombScaleTM – para leitura dos resultados dos testes.
Segurança e Precauções
• Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV.
• Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes.
• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos de laboratório aceitos para trabalhar com soro ou plasma.
• Não pipetar com a boca.
• Descartar todas as amostras, Pentes* e Placas Reveladoras utilizadas e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante.
• Não misturar reagentes de lotes diferentes. • Não usar o kit após o vencimento.
* A menos que sejam armazenados para documentação posterior.
Armazenamento e Estabilidade do kit
• O kit é fornecido a 2-8 ºC. Durante o transporte o kit pode ser conservado a ≤ 30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas.
• Armazenar os componentes na embalagem original a 2-8ºC. • Não congelar o kit.
• Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados a 2-8ºC.
• O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado a 2-8ºC. • Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser
utilizados mais do que três vezes.
Manipulação de Amostras
• Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. • As amostras podem ser armazenadas por 7 dias a 2-8 ºC
antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior.
• Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
• Os resultados do teste não foram afetados por
anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio.
Procedimento do Teste
Material Necessário
• Pipetas de precisão com ponteiras descartáveis para dispensar 10 µL, 25 µL e 100 µL.
• Tesoura.
• Cronômetro ou relógio de laboratório. • Microtubos ou tiras de microtitulação.
Preparando o Teste
Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22–26ºC.
Preparando a Placa Reveladora
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22–26ºC) por 3 horas.
2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínioda Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio utilizando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste.
Preparando o Pente
Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente.
1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente.
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente o Pente e a Placa Reveladora.
Para usar parte de um pente:
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “25” do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados.
b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes + 2 controles).
c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a 2–8ºC para uso posterior.
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Im m u noC o m b® II
Figura 4. Quebrando o Pente
Instruções do Teste
Pré-diluição das Amostras e Controles
1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µL de diluente de amostra em um microtubo ou cavidade de microtitulação. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µL da
fornecidos com o kit. Misturar enchendo e esvaziando
repetidamente a ponteira com a solução.
Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 3. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-diluída. Perfurar a
cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira.
4. Repetir o passo 3 para as outras amostras e para os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.
5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: inserir e retirar o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B utilizando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário.
c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual das pontas dos dentes com papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes.
Primeira Lavagem (Fileira B)
6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: retirar e inserir o Pente vigorosamente nas cavidades por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c.
Ligação do Conjugado (Fileira C)
7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.
Segunda Lavagem (Fileira D)
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar
repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.
Terceira Lavagem (Fileira E)
9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar
repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.
Reação de Cor (Fileira F)
10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos, retirar o Pente.
Reação de Parada (Fileira E)
11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre.
Armazenamento da parte não utilizada do
kit
Placa Reveladora
Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior:
• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada.
Outros materiais do kit:
• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar a 2–8ºC.
Resultados dos Testes
Validação
Para confirmar o funcionamento correto do teste e para demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5).
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente.
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, sem afetar a interpretação dos resultados.
3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle Interno).
Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.
Controle Positivo
Controle
Negativo ResultadosInválidos
Figura 5. Validação do Teste
Leitura e Interpretação dos Resultados
Triagem
Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior do dente do controle positivo (Figura 6).
• Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgG para H. pylori.
• Um ponto com coloração menos intensa que o controle positivo é considerado como resultado negativo.
Figura 6. Resultados do Teste Leitura Visual dos Resultados
O nível de IgG anti-H. pylori em cada amostra pode ser avaliado pela comparação entre a intensidade de cor do ponto inferior de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit.
Esta comparação se dá como a seguir: (Figura 7)
1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que “20; C+” apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua.
Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade mais semelhante da escala de cor. Marcar o valor que aparecer acima da janela como sendo o título aproximado de anticorpos IgG para H. pylori para a amostra correspondente.
Orgenics CombScale™ Anti-Helicobacter pylori IgG
Low 20 C+ High 120 Medium 60 Calibrar o CombScal Figura 7. CombScale™ Documentação dos resultados
Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior.
Limitações
Características de Desempenho*
O desempenho do kit ImmunoComb II Helicobacter pylori foi avaliado pela comparação com kits EIA de referência em 339 amostras.
Os resultados estão demonstrados na tabela 1.
Tabela 1. Comparação do ImmunoComb II Helicobacter pylori com EIA de referência
ImmunoComb II Helicobacter pylori EIA Referência Positivo Negativo Positivo Negativo 116 41 10 172 Sensibilidade – 92,1% Especificidade – 80,75%
Repetibilidade
10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de várias partes de um lote de produção. Um soro positivo par Helicobacter pylori foi testado 12 vezes em cada pente. Em todos os casos foram detectadas amostras positivas para Helicobacter pylori.
Reprodutibilidade
Três amostras positivas para Helicobacter pylori foram testadas em pentes retirados de 3 lotes diferentes de produção. Em todos os casos foram detectadas as amostras positivas.
Reação Cruzada
A reação cruzada encontrada foi insignificante com amostras positivas de Antígeno de Superfície da Hepatite B, vírus da Hepatite C e HIV 1&2.
Interferência
Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina acima de 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol acima de 281,6 mg/dl); triglicérides (381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (acima de 20 mg/dl).
Bibliografia
Blaser MJ. 1993. Helicobacter pylori: Microbiology of a “slow” bacterial infection. Trends Microbiol 1:255-260.
Borén T, Falk P, Roth KA, et l. 1993. Attachment of Helicobacter pylori to human gastric epithelium mediated by blood group antigens. Science 262:1892-1895.
Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. 1993. Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of
Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Nati Ac Sc, USA 90:5791-5795.
De Giacomo C, Lisato L, Negrini R, et al. 1991. Serum immune response to Helicobacter pylori in children: Epidemiologic and clinical applications. J. Pediatrics 119:205-210.
Halter F, Hurlimann S. Inauen W. 1992. Pathophysiology and clinical relevance of Helicobacter pylori. Yale J Biol Méd 65:625-638.
Kosunen TU, Seppälä K, Sarna S, Sipponen P. 1992. Diagnostic value of decreasing IgG, IgA, and IgM antibody titres after eradication of Helicobacter Pylori. Lancet 339:893.895. Kreuning J, Lindeman, Biemond I, Lamers CBHW. 1994. Relation between IgG and IgA antibody titres against Helicobacter pylori in serum and severity of gastritis in asymptomatic subjects. J Clin Pathol 47:227-231.
Parsonnet J. Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991.
Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325:1127-1136.
Talley NJ, Newell DG, Ormand JE, et al. 1991. Seriodiagnosis of
Helicobacter pylori. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assays. J Clin Microbiol 29:1635-1639.
Telford JL, Covacci A, Ghiara P, Montecucco C, Rappuoli R. 1994. Unravelling the pathogenic role of Helicobacter pylori in peptic ulcer; potential new therapies and vaccines. Trends Biotechnol 12:420-4267.
The Eurogast Study Group (D. Forman, et al). 1993. An international association between elicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet 341:1359-1362.
Registro e Distribuição:
PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A
Praça Carlos Chagas 49-3° andar
Santo Agostinho- CEP: 30.110-012
Belo Horizonte-MG
CNPJ: 06.018.858/0001-60
Atendimento ao consumidor
(31) 2122-2951 ou (31) 2122-2982
[email protected]
Registro ANVISA nº 80195040063
Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo
Soares - CRF-MG 11.390
CONSERVAR ENTRE 2-8ºC
Lote Vide Embalagem
Data de Validade Vide Embalagem
SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO
in vitro
Versão: 60425002/B8/OR
(05/2010)
Resumo dos Principais Procedimentos do Teste
1 2 3 4
Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 horas a temperature ambiente ou 30 minutos a 37°C Aspirar e pré-diluir amostras e controles Adicionar amostras e controles Pré-diluídos na filira A. Misturar. Remover o pente da embalagem. 5 6 7 8
Inserir e agitar o Pente na fileira A. Incubação.
Abrir a fileira B. Absorver o líquido residual do Pente
Inserir e agitar o Pente na fileira B. Incubação.
Após misturar/agitar e incubar nas
colunas C, D E……. 9
10
Reação de cor na fileira F Resultados
Resumo do Procedimento de Teste
As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb Helicobacter pylori IgG.
(Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo).
1. Trazer todos os reagntes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 – 26º C.
2. Pré-diluir 10 µL de cada amostra e controle com 100 µL de diluente de amostra.
3. Dispensar 25 µL de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar.
4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste
Etapa Fileira Proceder como a seguir
Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 30 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre.
