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PAULA FELICIANO DE LIMA
APLICAÇÕES DE CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE (GC×GC) NO ESTUDO DE METABÓLITOS
VOLÁTEIS DE FUNGOS SAPRÓBIOS
CAMPINAS 2014
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
PAULA FELICIANO DE LIMA
APLICAÇÕES DE CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE (GC×GC) NO ESTUDO DE METABÓLITOS VOLÁTEIS
DE FUNGOS SAPRÓBIOS
ORIENTADOR: PROF. DR. FABIO AUGUSTO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR PAULA FELICIANO DE LIMA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FABIO AUGUSTO
_______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Lima, Paula Feliciano de,
L628a LimAplicações de cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) no estudo de metabólitos voláteis de fungos sapróbios / Paula Feliciano de Lima. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
LimOrientador: Fabio Augusto.
LimDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Lim1. GCxGC-qMS. 2. SPME. 3. Metabolômica. 4. Voláteis de fungos sapróbios. I. Augusto, Fabio. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Applications of comprehensive two-dimensional gas chromatography (GCxGC) in the study of volatile metabolites of saprobes fungi
Palavras-chave em inglês: GCxGC-qMS
SPME Metabolomic
Volatile of saprobes fungi
Área de concentração: Química Analítica
Titulação: Mestra em Química na área de Química Analítica Banca examinadora:
Fabio Augusto [Orientador] Márcia Ortiz Mayo Marques Dosil Pereira de Jesus Data de defesa: 25-09-2014
Programa de Pós-Graduação: Química
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DEDICATÓRIA
A Deus dedico a minha vida e o meu trabalho,
Obrigada Senhor por permitir que minha mãe Odete e meu pai Benedito fossem meus pais, que me concederam a vida tão maravilhosa que sempre tive e ainda tenho. Obrigada meus pais por me deixarem o maior legado da vida – o caráter e o amor pelo estudo.
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"...Seja você quem for, seja qual for a posição social que você tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta muita força, muita determinação e sempre faça tudo com muito amor e com muita fé em Deus, que um dia você chega lá. De alguma maneira você chega lá."
Ayrton Senna da Silva
A maioria das pessoas acha que o que faz um bom cientista é o intelecto. Elas estão erradas: é o caráter.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Fabio Augusto pela orientação, confiança depositada no meu trabalho e oportunidade de fazer parte de seu grupo.
A CAPES pela concessão da bolsa de mestrado e ao Instituto de Química da Universidade de Campinas pela oportunidade de cursar a pós-graduação.
Ao Projeto SisBiota, ao professor Dr. Sérgio Florentino Pascholati (ESALQ/USP) pelo aprendizado dentro do grupo e ao professor Luiz Gusmão (UEFS) pelo fornecimento do material biológico em estudo.
A Dra. Fabiana Alves de Lima Ribeiro por todas as análises quimiométricas realizadas no trabalho e amizade.
Aos amigos de trabalho que tive a ilustre oportunidade de partilhar momentos de muita riqueza e alegria: Paloma Prata, Gaby Mogollón, Lucília Vilela, Jadson dos Reis, Bruna Tol edo e Leandro Wang.
A grande amiga e companheira inseparável Mayra Furlan. Sem sua parceria e paciência eu não conseguiria chegar até aqui!
A Soraia Braga que permitiu compartilhar de sua amizade, sempre me guiando nas dúvidas diárias do trabalho. Super obrigada por tudo amiga!!
Ao grupo da professora Carla Bottoli, em especial Mariana, Jordana e Bruno. Vocês sempre fizeram parte do meu trabalho e se tornaram meus amigos de verdade!
Ao professor Carlos Colombo (IAC), que além de ser meu eterno orientador é para mim um amigo excepcional que com a gentileza de sempre permitiu que meu trabalho pudesse ser realizado.
As minhas grandes amigas do IAC que sempre me apoiaram e encheram minha vida de alegria: Bárbara “Bittencourt”, Daiane de Laat, Maria Manuela, Fernanda Almeida e ao meu grande amigo João.
xiii
Paula Feliciano de Lima
Formação acadêmica/titulação
2012 – 2014 Mestrado em Química Analítica
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas, Brasil
Título: Aplicação de Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) no estudo de metabólitos voláteis de fungos sapróbios
Orientador: Fabio Augusto
Bolsista do (a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
2006 - 2011 Graduação em Química
Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, Brasil Orientador: Carlos Augusto Colombo
Formação complementar
2008 - 2008 Extensão Universitária em Bioinformática na Prática I
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas, Brasil
2013 - 2013 Programa de Ensino à Docência - PED C: Química Analítica Clássica (QA282)
Prêmios e títulos
2006 "Prêmio Maria Beatriz Perecin de Iniciação Científica", Instituto Agronômico de Campinas
Produção bibliográfica
Artigos completos publicados em periódicos
1. LIMA, P. F. de, Colombo, C. A, Chioratto, A. F., Yamaguchi, L. F., Kato, M. J., Carbonel, S. A. occurrence of Isoflavonoids in Brazilian Common Bean Germplasm (Phaseolus vulgaris L.). Journal of Agricultural and Food
xiv
2. Yoshida, N. Y., LIMA, P. F. de, Priolli, R. H. G., Kato, M. J., Colombo, C. A. Isolation and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in
Piper solmsianum (Piperaceae). Applications in Plant Sciences, v. 2, p. 1-3,
2014
3. Pavinato, V. A. C., Martinelli, S., LIMA, P. F. de, Zucchi, M. I., Omoto, C. Microsatellite markers for genetic studies of the fall armyworm, Spodoptera
frugiperda. Genetics and Molecular Research, v.12, p.370-380, 2013
4. Santos, F. R. C., LIMA, P. F. de, Priolli, R. H. G., Siqueira, W. J., Colombo, C.A. Isolation and characteristics of eight novel polymorphic microsatellite loci in Lippia alba (Miller) N.E. Brown (Verbenaceae).
American Journal of Botany, v.99, p.1-3, 2012
5. LIMA, P. F. de, Ramos, F. N., Zucchi, M. I., Möller, M., Priolli, R. H. G., Colombo, C. A., Solferini, V. N. Development and characterization of microsatellite markers for Psychotria tenuinervis (Rubiaceae), a shrub species from the Atlantic forest, and primers transferability from Coffea.
Conservation Genetics, v.10, p.1883-1886, 2009
6. Sigrist, M. S., Pinheiro, J. B., Azevedo-Filho, J., Colombo, C. A., Bajay, M. M., LIMA, P. F. de, Santos, F. R. C., Sandhu, S., Souza, A. P., Zucchi, M. I. Development and characterization of microsatellite markers for turmeric (Curcuma longa). Plant Breeding, v.129, p.570-573, 2009
7. LIMA, P. F. de, Ramos, F. N., Zucchi, M. I., Priolli, R. H. G., Colombo, C. A., Solferini, V. N. Development and chacacterization of microsatellite markers from Guarea guidonia (Meliaceae), a tree species from different habitats within the Brazilian Atlantic forest. Conservation Genetics, v.1, p.171-173, 2009
8. Ramos, F. N., LIMA, P. F. de, Zucchi, M. I., Colombo, C. A., Solferini, V. N., LIMA, P. F. de. Genetic structure of tree and shrubby species among anthropogenic edges, natural edges, and interior of an Atlantic forest fragment. Biochemical Genetics, v.48, p.215-228, 2009
Artigos aceitos para publicação
1. Mogollon, N. G. S., LIMA, P. F. de, Gama, M. R., Prata, P. S., Braga, S. C. N., Furlan, M. F., Jardim, I. C. S. F., Augusto, F. O estado da arte da Cromatografia Líquida Bidimensional Abrangente: Conceitos fundamentais, instrumentação e aplicações. Química Nova (Online), 2014
xv RESUMO
APLICAÇÕES DE CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE (GC×GC) NO ESTUDO DE METABÓLITOS
VOLÁTEIS DE FUNGOS SAPRÓBIOS
O uso de compostos voláteis produzidos por fungos como parte das estratégias de biocontrole na prevenção de doenças ocasionadas por fitopatógenos vem impulsionando o mercado de biofungicidas. Neste cenário, a análise do metaboloma utilizando apenas uma técnica analítica é por vezes inviável devido à magnitude química dos compostos bem como de sua faixa de concentração. Desta forma, o trabalho utilizou a combinação de HS-SPME (Microextração em Fase Sólida) aliada à técnica GC×GC-qMS (Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada à Espectrometria de Massas Quadrupolar) para a obtenção do perfil metabólico volátil inédito de duas espécies de fungos com potencial ação para biocontrole e indução de resistência a fitopatógenos na agricultura, Curvularia sp e Memnoniella sp. Através de modelagem MPCA e HCA foi possível a obtenção de um perfil cinético característico da produção de compostos voláteis das espécies que delimitou o processo de identificação tentativa destes metabólitos. Hidrocarbonetos e álcoois foram responsáveis pela maior produção volátil de ambas as espécies avaliadas, com destaque para a produção de lactonas como
-octalactona, -hexalactona e -hexalactona por Curvularia sp e sesquiterpenos como acoradieno, β-chamigreno, α-chamigreno, β-elemeno e valenceno por Memnoniella sp. A partir do perfil volátil das espécies, os estudos poderão ser direcionados à ação biocontrole e indução de resistência na agricultura.
xvii ABSTRACT
Applications of comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC×GC) in the study of volatile metabolites of saprobes fungi
Volatile compounds produced by fungi as part of biocontrol strategies in preventing diseases caused by pathogens has been stimulating the market of biofungicides. So, the analysis of the metabolome using only one analytic technique is sometimes not feasible due to chemical compounds as well as the magnitude of its concentration range. Thus, the study used a combination of HS-SPME technique (Solid-Phase Microextraction) coupled with GC×GC-qMS (Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography coupled to Quadrupole Mass Spectrometry) to obtain volatile metabolic profiles of two species of fungi with potential for biocontrol activity and induction of resistance to plant pathogens in agriculture, Curvularia sp and Memnoniella sp. Through modeling MPCA and HCA was possible to obtain a typical kinetic profile of volatile compounds from the production of species which delimited the process of identification of these metabolites. Hydrocarbons and alcohols were responsible for most volatile production of both studied species, with emphasis on the production of lactones such as -octalactone, -hexalactone and -hexalactone by Curvularia sp and sesquiterpenes as acoradiene, β-chamigrene, α-chamigrene, β-elemene and valencene by
Memnoniella sp. From the profile of volatile species, the studies may be
xix SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS...xxiii LISTA DE TABELAS...xxvii LISTA DE FIGURAS...xxix 1 INTRODUÇÃO ... 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 9
2.1 Metabólitos Voláteis de Fungos ... 11
2.1.1 Metabolômica ... 11
2.1.2 Metabolismo Fúngico ... 13
2.1.2.1 Compostos Orgânicos Voláteis ... 13
2.2 Tecnologias Analíticas para os Estudos de Metaboloma ... 17
2.2.1 Preparo de Amostras – Considerações em Metabolômica ... 17
2.2.2 Microextração em Fase Sólida (SPME) ... 19
2.2.3 Instrumentação Analítica em Metabolômica ... 24
2.2.4 Avanços em Cromatografia – Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) ... 27
2.2.5 Processamento e Análise de Dados - GC×GC e Metabolômica .... 34
3 Objetivos ... 43
3.1 Geral ... 45
xx
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 47
4.1 MATERIAIS ... 49
4.1.1 Seleção e Obtenção do Material Biológico ... 49
4.1.2 Meio de Cultivo ... 52
4.1.3 Dispositivo de Extração da Fração Volátil ... 52
4.1.4 Fibra Extratora... 53 4.1.5 Colunas Cromatográficas ... 54 4.1.7 Cromatógrafo à Gás ... 54 4.1.8 Softwares utilizados ... 55 4.2 MÉTODOS ... 56 4.2.1 Meios de Cultura ... 58
4.2.2 Cultivo e Manutenção dos Fungos Sapróbios ... 59
4.2.3 Preparo das Amostras para Extração ... 60
4.2.4 Condições de Extração da Fração Volátil ... 61
4.2.5 Condições Cromatográficas ... 62
4.2.6 Identificação Tentativa da Composição Volátil ... 64
4.2.7 Modelagem Quimiométrica ... 65
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 67
5.1 Emprego da SPME na extração da fração volátil de fungos ... 69
5.2 Avaliação da influência e escolha do meio de cultura para produção de voláteis através de GC-qMS ... 71
xxi
5.3 Aplicação de GC×GC-qMS no estudo do perfil volátil de fungos de
biocontrole ... 75
5.3.1 Perfil de metabólitos voláteis produzidos por Memnoniella sp. por de GC×GC-qMS ... 81
5.3.2 Perfil de metabólitos voláteis produzidos por Curvularia sp. através de GC×GC-qMS ... 97
5.3.3 Fração volátil de Curvularia sp e Mamnoniella sp ... 109
6 CONCLUSÕES ... 119
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS
¹D: primeira dimensão
¹tR: tempo de retenção na primeira dimensão
²D: segunda dimensão
²tR: tempo de retenção na segunda dimensão
A: ágar
AA: arroz-ágar
BDA: batata-dextrose-ágar BOD: câmara de crescimento
CCMB: Coleção de Micro-organismos da Bahia CE: Eletroforese Capilar
CE-MS: Eletroforese Capilar acoplada à Espectrometria de Massas CMA: cenoura-milho-ágar
COW: Correlation Optimized Warping CP: Componente Principal
DB-Wax: coluna capilar contendo fase estacionária de polietilenoglicol
DVB/CAR/PDMS: fibra de SPME contendo recobrimento divinilbenzeno, carboxeno e polidimetilsiloxano
GC: Cromatografia Gasosa
xxiv
GC-FID: Cromatografia Gasosa com detecção por Ionização em Chama GC-MS: Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
GC×GC-qMS: Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada à Espectrometria de Massas Quadrupolar
HCA: Análise de Agrupamentos Hierárquicos
HP-5MS: coluna capilar contendo fase estacionária de 5% fenil-95% polidimetilsiloxano
HS-SPME: Microextração em Fase Sólida por Headspace
Kfs: constante de distribuição LC: Cromatografia Líquida
LC-MS: Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas LDA: Análise Linear Discriminante
LLE: Extração líquido-líquido
LTPRI: Índice de Retenção com Programação Linear de Temperatura
m/z: razão massa-carga
MDGC: Cromatografia Gasosa Multidimensional por Frações Parciais MPCA: Análise de Componentes Principais Multimodo
MS: Espectrometria de Massas
n: capacidade de pico
n1: capacidade de pico na primeira dimensão n2: capacidade de pico na segunda dimensão
xxv NMR: Ressonância Magnética Nuclear PCA: Análise de Componentes Principais
PLS-DA: Regressão por Quadrados Mínimos Parciais Discriminante
PM: período de Modulação RNAs: Ácido ribonucléico SPE: Extração em Fase Sólida
xxvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Patossistemas avaliados no projeto SisBiota para escolha de fungos candidatos a biocontrole de fitopatógenos. ... 50 Tabela 2. Identificação dos fungos sapróbios cultivados para estudo do perfil metabólico volátil. ... 51 Tabela 3. Meios de cultura avaliados para inoculação dos fungos em estudo. ... 52 Tabela 4. Condições de separação e detecção mantidas nos ensaios de análise da fração volátil dos fungos sapróbios avaliados. ... 63 Tabela 5. Identificação tentativa dos metabólitos voláteis produzidos por
Memnoniella sp. nas extrações realizadas no 4º e 6º dias de cultivo do fungo
(cromatogramas adquiridos no modo de injeção splitless) e 3º e 4º dias de do fungo (cromatogramas adquiridos no modo de injeção split). ... 93 Tabela 6. Identificação tentativa dos metabólitos voláteis produzidos por
Curvularia sp. nas extrações realizadas no 3º e 4º dia de cultivo do fungo. . 105
Tabela 7. Metabólitos voláteis diferencialmente produzidos por Curvularia sp. e Memnoniella sp. ... 112
xxix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. (A) Dispositivo básico empregado na técnica de SPME. (B) Ilustração da fibra que contém a fase extratora. (C) Fibras comerciais com diferentes tipos de polímero de recobrimento. ... 21 Figura 2. Principais modos de extração em SPME. Adaptado de Valente e Augusto 2000.50 ... 23 Figura 3. Natureza multidimensional dos dados gerados a partir de GC-MS. No eixo X encontra-se os tempos de retenção referente à separação cromatográfica e no eixo Y os espectros de massas. As intensidades dos sinais encontram-se no eixo Z. Górecki et al. 2003.62 ... 26 Figura 4. Comparativo das capacidades de pico (n) entre as técnicas MDGC [n1 + (n2×x)] e GC×GC (n1×n2). ... 28
Figura 5. Diagrama geral do sistema de cromatografia gasosa bidimensional abrangente. (1) Coluna capilar de GC convencional, referente a primeira dimensão (¹D) da técnica; (2) Modulador e (3) Coluna capilar de dimensões reduzidas, referente a segunda dimensão da técnica (²D). ... 29 Figura 6. Processo de modulação em (A) e (B) coleta e reconcentração de bandas pela incidência de jatos de ar frio no início da ²D, (C) processo de remobilização do analito na ²D, (D) importância da interface (modulador) em GC×GC. Ilustração da resolução de bandas coeluídas na ¹D e separadas em picos estreitos e intensos após modulação. Modificado de Mondello et al. 2008.64 ... 33
xxx
Figura 7. Ilustração do processo geral de resolução de picos por GC×GC e como a interpretação da estruturação cromatográfica pode ser obtida através de inspeção visual dos cromatogramas em gráficos bi e tridimensionais. (A) cromatograma de um pico coeluido no final da ¹D. (B) Processo de modulação e (C) Cromatograma bruto na saída da ²D. Modificado de Dallüge et al. 2003.68 ... 34 Figura 8. Ilustração do procedimento de alinhamento através da técnica COW. Região contendo picos cromatográficos desalinhados (1). Processo de alinhamento através da técnica COW. As setas ilustram o deslocamento em maior ou menor grau em função da correção requerida no segmento em correção (2). Resultado após alinhamento (3). Modificado de Amigo et al. 2010.73 ... 36 Figura 9. Representação matricial da análise de componentes principais. Decomposição da matriz de dados “X” em duas outras matrizes, uma dos escores (T) e outra dos pesos (Pt). Modificado de Teófilo 2013.87 ... 39 Figura 10. Representação de um gráfico de escores e de um gráfico de pesos. Modificado de Brereton 2007.88 ... 40 Figura 11. Ilustração de um dendrograma e seus níveis. ... 41 Figura 12. Dispositivo para crescimento e extração dos compostos voláteis. (A) peças que compõe o dispositivo com tubo plástico (polipropileno) de 50 mL, tampa plástica, anel de alumínio com orifício central e septo de teflon. (B) conjunto já adaptado com septo, anel alumínio e tampa plástica. ... 53 Figura 13. (A) Ilustração do dispositivo de extração já contendo o fungo em avaliação. (B) Sistema completo para extração da fração volátil. ... 53
xxxi
Figura 14. Ilustração do processo experimental para aquisição da fração volátil de Curvularia sp. e Memnoniella sp. por de HS-SPME-GC×GC-qMS ... 57 Figura 15. (A) Transferência de um disco de micélio de um dos fungos em estudo para crescimento e manutenção da espécie. (B) Após transferência, as placas contendo os micélios foram mantidas em câmara de crescimento a 25 °C com fotoperíodo de 12 h. ... 59 Figura 16. Ilustração dos esporos das duas espécies de fungos estudadas. (A)
Curvularia sp. (B) Memnoniella sp. ... 60
Figura 17. Montagem do experimento para extração da fração volátil dos fungos avaliados. (A) Posicionamento dos esporos no centro da superfície do meio de cultura com ajuda de micropipeta. (B) Dispersão dos esporos em toda superfície do meio de cultura com auxílio de alça de vidro. ... 61 Figura 18. Fluxograma das etapas do processamento quimiométrico utilizado na identificação dos metabólitos voláteis dos fungos Memnoniella sp. e
Curvularia sp. ¹tR: tempo de retenção na primeira dimensão. ²tR: tempo de
retenção na segunda dimensão. ... 66 Figura 19. Prancha do crescimento de Curvularia sp. e Memnoniella sp. após 10 dias de cultivo em meios de cultura com grau diferenciado de nutrientes. CMA: cenoura-milho-ágar; A: Agar; AA: arroz-ágar e BDA: batata-dextrose-ágar. ... 72 Figura 20. Cromatogramas GC-qMS de (A) Curvularia sp. e (B)
Memnoniella sp. cultivados em meio de cultura BDA e obtidos a partir de
GC-qMS. Condições de extração: 30 min de extração a 25 °C com fibra DVB/CAR/PDMS. Condições cromatográficas: coluna HP-5MS (30 m × 0,25
xxxii
mm × 0,25 m), H2 (1 mL/min), temperatura injetor 250 °C, temperatura do
detector 250 °C, programação de temperatura 60 °C a 165 ºC (3 °C/min); 165 °C a 260 °C (20 °C/min). ... 73 Figura 21. Cromatograma parcial obtido para Curvularia sp. Identificação tentativa dos picos (1) butil-2-metilvalerato, (2) trans-pinocarveol, (3) -copaeno e (4) -santaleno. Condições de separação similares a da Figura 20. ... 74 Figura 22. Cromatogramas GC×GC-qMS de (A) Memnoniella sp. (destaque superior com split 1:10) com extração da fração volátil no 6º dia após inoculação inicial e (B) Curvularia sp. com extração da fração volátil no 4º dia após inoculação inicial. Fração volátil extraída através de fibra de SPME DVC/CAR/PDMS 50/30 m. Conjunto de colunas HP 5-MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 m)/DB-Wax (1 m × 0,1 mm × 0,1 m); programação de temperatura: 60 °C a 165 °C (3°C/min), 165 °C a 260 °C (20 °C/min), 260 °C durante 5 min; modo de injeção splitless; vazão de 0,6 mL/min de H2;
temperatura do injetor e detector a 260 °C e 200 °C, respectivamente; período de modulação de 6 s e taxa de aquisição de 25 espectros/s. ... 78 Figura 23. Cromatogramas obtidos para as replicatas das amostras dos brancos. (A) Replicata do branco adquirida no 5º dia de condução dos experimentos com o fungo Memnoniella sp. (B) Replicata do branco adquirida no 4º dia de condução dos experimentos com o fungo Curvularia sp. Em ambos os casos a fração volátil foi amostrada utilizando fibra de SPME DVB/CAR/PDMS 50/30 m. Conjunto de colunas HP 5-MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 m)/DB-Wax (1 m × 0,1 mm × 0,1 m); programação de temperatura: 60 °C a 165 °C (3°C/min), 165 °C a 260 °C (20 °C/min), 260 °C
xxxiii
durante 5 min; modo de injeção splitless; vazão de 0,6 mL/min de H2;
temperatura do injetor e detector a 260 °C e 200 °C, respectivamente; período de modulação de 6 s e taxa de aquisição de 25 espectros/s. ... 80 Figura 24. Cromatogramas bidimensionais típicos de Memnoniella sp. (A) Cromatograma obtido no modo splitless (sem razão de divisão dos analitos). (B) Cromatograma obtido no modo split, com razão de divisão de injeção 1:10. (C) Cromatograma obtido no modo split, com razão de divisão 1:10 com com seleção da região do cromatograma compreendida entre 21 e 35 min de corrida cromatográfica. ... 83 Figura 25. Ilustração dos cromatogramas desdobrados de Memnoniella sp. após alinhamento pela técnica COW. (A) Alinhamento com os cromatogramas obtidos no modo splitless (sem razão de divisão de injeção) e (B) Alinhamento com os cromatogramas obtidos no modo split (com razão de divisão de injeção de 10:1) ... 84 Figura 26. Gráfico de escores para CP1 vs. CP2 para Memnoniella sp. no modo de injeção splitless. (A) Discriminação entre replicatas do branco e
Memnoniella sp. (B) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella
sp. em função do período de cultivo. ... 85 Figura 27. Gráficos da CP1 e CP2 vs. o período de cultivo explorando o perfil cinético de produção e consumo de metabólitos voláteis Memnoniella sp. no modo de injeção splitless. (A) Gráficos de escores da CP1 vs. Período de cultivo indicando elevada variação (qualitativa e quantitativa) dentro das replicatas de Memnoniella sp. (B) Gráficos de escores da CP2 vs. Período de cultivo indicando o 6º dia de cultivo como contendo produção e consumo diferencial dos metabólitos produzidos por Memnoniella sp. ... 86
xxxiv
Figura 28. Dendrograma gerado a partir da modelagem HCA para as replicatas do branco e de Memnoniella sp. no modo de injeção splitless. ... 87 Figura 29. Gráfico de escores para CP1 vs. CP2 para Memnoniella sp. no modo de injeção split. (A) Discriminação entre replicatas do branco e
Memnoniella sp. (B) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella
sp. em função do período de cultivo. ... 88 Figura 30. Gráficos da CP1 e CP2 vs. o período de cultivo explorando o perfil cinético de produção e consumo de metabólitos voláteis Memnoniella sp. no modo de injeção split. (A) Gráficos de escores da CP1 vs. Período de cultivo indicando elevada variabilidade dentro das replictas de Memnoniella sp. (B) Gráficos de escores da CP2 vs. Período de cultivo indicando o 3º e 4º dias de cultivo como contendo produção e consumo diferencial dos metabólitos produzidos por Memnoniella sp. ... 90 Figura 31. Dendrograma gerado a partir da modelagem HCA para as replicatas do branco e de Memnoniella sp. no modo de injeção split. ... 91 Figura 32. Gráfico da diversidade metabólica produzida por Memnoniella sp. ... 96 Figura 33. Gráfico da diversidade de hidrocarbonetos produzidos por
Memnoniella sp. ... 97
Figura 34. Ilustração dos cromatogramas desdobrados de Curvularia sp. após alinhamento pela técnica COW. ... 98 Figura 35. Gráfico de escores para CP1 vs. CP2 para Curvularia sp. (A) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp. em função do
xxxv
período de cultivo (B) Discriminação entre replicatas do branco e
Memnoniella sp. ... 99
Figura 36. Gráfico de escores para CP3 vs. CP4 para Curvularia sp. ... 100 Figura 37. Gráficos das componentes principais vs. o período de cultivo explorando o perfil cinético de produção e consumo de metabólitos voláteis de
Curvularia sp. (A) Gráficos de escores da CP1 vs. Período de cultivo (B)
Gráficos de escores da CP2 vs. Período de cultivo (C) Gráficos de escores da CP3 vs. Período de cultivo (D) Gráficos de escores da CP4 vs. Período de cultivo. ... 101 Figura 38. Dendrograma gerado a partir da modelagem HCA para as replicatas do branco e de Curvularia sp. ... 102 Figura 39. Gráfico da diversidade metabólica produzida por Curvularia sp. ... 108 Figura 40. Gráfico da diversidade de hidrocarbonetos produzidos por
1
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Como parte da biologia de sistemas a importância dos estudos em metabolômica colocou essa ciência em destaque, devido ao seu caráter multidisciplinar de investigação. Aliado a isso, o estudo sistêmico do perfil de metabólitos, de sua composição e de como sua dinâmica pode ser afetada por fatores genéticos, estímulos fisiológicos e fatores ambientais, permite a detecção de biomarcadores potenciais e perturbações metabólicas de forma precoce.1 Uma vez que o metaboloma de um organismo vivo engloba todos os metabólitos ali presentes sua análise não é tão trivial e por isso ainda não existe ainda uma metodologia única para tal determinação.2,3
Diferentemente da genômica e da proteômica, a metabolômica abrange uma variedade muito grande de compostos. A fração volátil do metaboloma de plantas e fungos, por exemplo, é composta por aproximadamente 10 ou 100 mil metabólitos, dos quais diversos derivados presentes nos ciclos bioquímicos dos ácidos graxos, aminoácidos e carboidratos sendo ainda constituídos por compostos saturados, insaturados podendo conter diversos grupos funcionais tais como álcool, aldeído, cetonas, éster e éter.1 Isso significa que a combinação de plataformas analíticas e técnicas de extração adequadas são necessárias no contexto de identificação e avaliação destes compostos.4-6
O objetivo atual dos procedimentos analíticos para preparo de amostras busca aliar qualidade de extração à pré-concentração dos analitos em estudo. Essa preocupação se justifica principalmente na metabolômica, onde o passo chave é a extração dos metabólitos, encontrados em baixas concentrações em matrizes por vezes complexa, sendo essa a etapa mais importante.7,8 Desta forma, a escolha de procedimentos que alie elevado rendimento de extração à
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pré-concentração é crucial, pois, a eficácia desta etapa afeta diretamente a obtenção do perfil metabólico representativo da amostra.
A técnica de microextração em fase sólida (SPME, Solid-Phase
Microextraction) introduzida na década de 1990 por Arthur e Pawliszyn é,
atualmente, um dos procedimentos mais empregados na extração de compostos orgânicos voláteis e semivoláteis de uma variedade de matrizes, como amostras biológicas, ambientais e alimentos.8,9 Baseada no princípio de equilíbrio entre fases, a SPME envolve os fenômenos de sorção e partição dos analitos entre a amostra e uma fibra extratora recoberta com um sorvente. Além de proporcionar extração dos analitos combinada ao processo de pré-concentração da amostra, a SPME é um processo altamente positivo e indispensável quando se trabalha com metabólitos presentes em baixas concentrações.10 É também um método livre do uso de solventes, não-destrutivo, sensível, barato, simples e que promove amostragem rápida e precisa dos resultados.11
Os fungos são um grupo de organismo que apresentam uma ampla diversidade com cerca de 230.000 espécies distribuídas no ecossistema.12 Muitos deles são benéficos, outros patogênicos e ainda podem ser empregados como agentes de biocontrole, como no caso dos sapróbios. Um fungo que atua como agente de biocontrole produz uma série de metabólitos secundários que são tóxicos para os patógenos de plantas em baixas concentrações.
Diversos trabalhos relatam a ação potencial de metabólitos secundários de fungos no controle de patógenos em plantas e atuam, por exemplo, induzindo respostas de defesa em plantas hospedeiras contra infecção de organismos patogênicos; promovendo mecanismos de antagonismo de um
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fungo endofítico em relação a um fungo patogênico, produzindo metabólitos secundários que interferem na atividade biológica do patógeno. Este é o caso da inibição de crescimento de Fusarium oxysporum, agente causador de perdas nas lavouras de feijão, e da inibição do mofo patogênico pela ação dos metabólitos de fungos do gênero Trichoderma.12-15 Entre os mecanismos de antagonismo a antibiose é considerado o mais importante, em que os antagonistas produzem uma variedade de metabolitos secundários que contribuem para sua ação como agentes de biocontrole contra fungos patogênicos de plantas.12
A expansão do setor agrícola aliada a plantios sucessivos e condições climáticas favoráveis facilitou a entrada de problemas fitossanitários, principalmente os causados por fungos.16 Os severos danos causados por esse tipo de patógeno são importantes, pois comprometem e limitam o desenvolvimento de culturas econômicas importantes, e o método de controle mais utilizado é através do uso de fungicidas dependente de produtos químicos agressivos ao ambiente.16
Atualmente, os fungos sapróbios vêm recebendo importante atenção devido ao fato de atuarem como potencial fonte de resistência, fato que os leva a serem classificados como agentes de biocontrole. Por exemplo, o estudo de fungos inibidores de Puccinia psidii é crucial principalmente para a cultura de eucalipto, pois seu ataque implica em perdas das plantações e queda na produção de celulose, uma vez que o uso de fungicidas no campo não é economicamente viável.16 Neste caso, desde a década de 1990 a ferrugem é apontada como doença severa para a cultura, bem como outras culturas tropicais e subtropicais.17 É ainda importante para o setor brasileiro de florestas plantadas, pois a cultura de eucalipto representa uma das maiores
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áreas de reflorestamento mundial voltada para a demanda madeireira de diferentes setores produtivos.16
Aliado ao poder elucidativo da metabolômica, a investigação do papel de metabólitos de certos fungos patogênicos e de fungos sapróbios em culturas importantes pode oferecer respostas mais rápidas quanto ao controle precoce de doenças evitando ou minimizando os prejuízos econômicos a agricultura e permitindo a identificação de agentes de biocontrole que possam induzir resistência nas plantas. O uso de fungos sapróbios é ainda importante, pois junto ao manejo integrado promove a supressão da doença similar ao alcançado pelo uso de fungicidas.18
Os estudos sobre o benefício dos compostos voláteis e semi-voláteis oriundos da resposta de antagonismo de fungos inibidores é relativamente recente e só podem ser estudados por técnicas que integrem plataformas analíticas que melhorem a representatividade dos metabólitos expandindo a faixa de identificação desses compostos.7,19,20 Geralmente o perfil dos metabólitos de fungos é identificado através de cromatografia gasosa com detector de chama, GC-FID (Gas Chromatography - Flame Ionisation
Detection) ou com detector de massas, GC-MS (Gas Chromatography -Mass Spectrometry). Contudo, a resolução e/ou detectabilidade destes equipamentos
podem omitir informações importantes geradas por compostos que apresentam baixa relação sinal/ruído.21,22
É neste contexto que a cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC, Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography) se insere viabilizando a separação de vários componentes voláteis e semivoláteis de uma amostra, identificando e quantificando um grande número de metabólitos
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em uma matriz biológica complexa.23 Descrita originalmente por Liu e Phillips, a GC×GC é uma técnica que trouxe aperfeiçoamento para a separação cromatográfica gasosa convencional (GC) uma vez que alia robustez a simplicidade instrumental, sendo provavelmente a invenção mais promissora em GC desde o desenvolvimento de colunas capilares.24,25 Esta técnica utiliza duas colunas capilares conectadas em série com um dispositivo fundamental para a técnica, chamado de modulador que coleta e reconcentra as frações de eluato da primeira coluna, injetando-as continua e periodicamente na segunda coluna. Esse processo garante bandas mais estreitas prevenindo ainda coeluições.
De maneira geral, as três principais vantagens da GC×GC sobre GC convencional são (1) potencial para maior capacidade de pico, (2) aumento do sinal e (3) produção de cromatogramas estruturados.23 Quando associada ao estudo do metaboloma, onde o objetivo é a busca e identificação de mudanças sutis no perfil metabólico, a GC×GC acoplada à espectrometria de massas (GC×GC-MS) é uma técnica bem estabelecida na elucidação de amostras complexa.1
É importante enfatizar que a análise completa do metaboloma utilizando apenas uma técnica analítica é por vezes inviável devido à magnitude química dos compostos bem como de sua faixa de concentração, pois os metabólitos são amplamente distribuídos nos organismos em diferentes níveis. Nos procariotos ocorrem em número aproximado de 750 metabólitos enquanto em plantas e fungos ocorrerem às dezenas ou centenas de milhares.1 Desta forma, a combinação de métodos simples e eficazes de extração e pré-concentração de amostra aliada a uma técnica robusta de separação e identificação se torna imprescindível.
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Assim, a busca por metodologias analíticas robustas que ampliem e facilitem o estabelecimento de métodos e análise de controle biológico e/ou identificação de agentes de biocontrole na agricultura devem ser investigadas como forma de minimizar ou identificar possíveis perdas econômicas e sociais de forma antecipada. Neste cenário, o estudo de compostos voláteis e semivoláteis de fungos sapróbios em culturas com importância econômica podem disponibilizar ferramentas de controle utilizando para isso técnicas analíticas como a HS-SPME-GC×GC-MS.
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11 2.1 Metabólitos Voláteis de Fungos
2.1.1 Metabolômica
A metabolômica consiste no estudo do perfil metabólico de organismos bem como sua composição e dinâmica frente a flutuações genéticas e fisiológicas ou exercidas por perturbações.1,26 Assim, envolve a análise compreensiva (qualitativa e quantitativa) dos metabólitos de um organismo ou sistema biológico utilizando para isso tecnologias analíticas sofisticadas.27
O alto grau de diversidade do metaboloma de um organismo é verificado pela variação dos metabólitos que o compõem, com moléculas orgânicas e inorgânicas de massa molecular até 1500 Da, de polaridade, solubilidade (propriedades químicas) e volatidade (propriedade física) variáveis. Essas moléculas presentes nas células participam de reações metabólicas e são requeridas para manutenção, crescimento e função celular.28
O tamanho do metaboloma apresenta excepcional variação e está intimamente ligado ao organismo e ou tipo de amostra estudado. Assim, considerando procariotas, Escherichia coli contém, por exemplo, cerca de 750 metabolitos, sistemas eucarióticos podem variar de aproximadamente 1100 em leveduras para muitos milhares em seres humanos e até dezenas ou centenas de milhares de espécies de plantas e fungos.1
Dependendo dos processos analíticos, as análises metabolômicas podem ser divididas em função da abordagem, estratégia ou situação de estudo como:7
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(i) análise de alvos: aplicada quando o objetivo é estudar quantitativamente e qualitativamente um pequeno grupo de metabólitos com similaridade química;
(ii) perfil global metabolômico: permite a detecção de uma ampla variedade de metabólitos (não alvos) através de uma única plataforma analítica ou uma combinação delas como GC-MS, LC-MS, CE-MS a fim de se obter um perfil compreensivo dos metabólitos;
(iii) fingerprinting metabolômico: avaliação total e rápida da amostra biológica para discriminação dos diferentes grupos de metabólitos (padrões), permitindo a triagem e classificação das amostras analisadas;
(iv) footprinting metabolômico: permite o estudo de metabólitos em fluidos extracelulares também conhecidos como exometaboloma ou secretoma.
A metabolômica apresenta status de relevância no contexto biológico. Isso se justifica no fato de que o metaboloma é mais sensível a perturbações do que o transcriptoma e o proteoma, uma vez que as atividades das vias metabólicas são mais precisamente refletidas nas concentrações de classes de metabólitos em comparação a enzimas ou expressão de RNAs mensageiros.29
A análise compreensiva de um perfil metabólico representa o principal objetivo dentro da metabolômica, considerando o papel fundamental do metabolismo no contexto da função celular global. Considerando que o perfil metabólico seja compreensivo ele pode revelar o estado bioquímico do organismo no momento da análise, permitindo assim a compreensão da variedade de processos biológicos envolvidos, por exemplo, na avaliação da progressão de doenças, no desenvolvimento de agentes de biocontrole, no
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melhoramento genético assistido, na resposta de um organismo a um tratamento ou o efeito de estímulos ambientais em processos de desenvolvimento. Ainda permite com grande eficácia a detecção de biomarcadores, identificação e/ou quantificação e posterior correlação para as perturbações metabólicas selecionadas.30
A visualização e interpretação de eventos biológicos tem-se beneficiado dos avanços na metabolômica, principalmente no que se refere a avanços na instrumentação analítica com vistas a concepção de instrumentos e técnicas de maior sensibilidade, seletividade e especificidade.31,32 A combinação complementar de métodos analíticos de análise, avaliação estatística e interpretação dos dados a partir de um ponto de vista biológico vêm propiciando o avanço de poderosas abordagens que conduz ao exame da variação no perfil metabólico total, capaz de determinar mudanças biológicas complexas, consolidando-se como uma valiosa ferramenta na detecção de potenciais biomarcadores e perturbações metabólicas em fase precoce.27
2.1.2 Metabolismo Fúngico
2.1.2.1 Compostos Orgânicos Voláteis
Compostos orgânicos voláteis compreendem grupos quimicamente diversos de moléculas orgânicas (como por exemplo, hidrocarbonetos, alcoóis, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, aminas e tióis) com massa molecular na faixa de 50 a 200 Da, que possuem pressão de vapor de 10 Pa sob condições normais de temperatura, sendo, portanto, facilmente evaporáveis a temperatura ambiente.33 Como possuem elevada pressão de vapor e baixa massa molecular se difundem rapidamente para a fase gasosa, o
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que contribui para suas aplicações e importância, principalmente no cenário biológico. Ocorrem naturalmente no ambiente bem como em resposta a ações antrópicas, em uma ampla faixa de concentração.34
2.1.2.2 Fungos e Importância na Agricultura - Controle biológico
As diferenças climáticas encontradas no Brasil levaram ao estabelecimento de grandes variações ecológicas formando o que se conhece como biomas ou zonas biogeográficas distintas, como por exemplo, a Floresta Amazônica, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica entre outros. A diversidade de flora e fauna alocadas nesses diferentes biomas reflete a diversidade de plantas, fungos, animais.35
No caso dos micro-organismos como os fungos, que são organismos eucarióticos e se diferenciam das plantas por possuírem parede celular formada por quitina, recentemente foi estimado que o número de espécies ultrapasse a 5 milhões em todo o mundo sendo que aproximadamente 100.000 destas espécies encontram-se descritas.36 No Brasil não há um registro do total de espécies nativas identificadas. Segundo Forzza et al. estão registrados no Catálogo de Plantas e Fungos do Brasil 78 ordens, 924 gêneros e mais de 3600 espécies nativas de fungos.37
A avaliação sobre a diversidade de fungos tem sido tradicionalmente estudada em virtude destes micro-organismos produzirem uma série de compostos, principalmente metabólitos primários e secundários com amplo espectro de aplicações industriais e agrícolas.38 No caso específico de metabólitos voláteis produzidos por fungos, todos são derivados do
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metabolismo primário e secundário o que permite se difundirem tanto no solo quanto no ambiente externo.39
Neste sentido, devido as suas características, os metabólitos voláteis de fungos podem atuam como moléculas sinalizadoras entre e intra-organismos (semioquímicos), como hormônios, intermediando processos específicos como comunicação, competição e predação entre organismos, como indicadores de contaminação ambiental e controle de qualidade pós-colheita bem como na defesa de vegetais contra pragas e doenças.40,41
Tradicionalmente o controle de pragas e doenças é realizado através do uso pesticidas e fungicidas. Porém, no cenário sócio-econômico atual há uma crescente preocupação pública sobre o uso continuado de agrotóxicos que são prejudiciais para a saúde humana e para o meio ambiente. Tais preocupações estão impulsionando a busca de métodos de controle de doenças e pragas em plantas que aliem a sustentabilidade na agricultura.
Combinado ao fato de que os custos para desenvolvimento de novos pesticidas e fungicidas químicos continuam aumentando, a ampliação de opções de gestão alternativa para o controle de doenças no setor agrícola é um assunto urgente.34 Entre essas estratégias de gestão de manejo de doenças destacam-se a indução de resistência em plantas e o controle biológico.42
Neste sentido, as pesquisas sobre agentes de biocontrole se intensificaram nos últimos anos, principalmente utilizando micro-organismos antagonistas.43 O controle biológico tem por objetivo a inibição do crescimento, infecção ou reprodução de um organismo por outro.44,45 Assim, um agente de biocontrole antagonista de patógenos de plantas interfere
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potencialmente no processo de vida do patógeno, podendo residir nas raízes, folhas ou outras partes do vegetal.46
O controle biológico utilizando fungos antagonistas contra fungos e outros patógenos de plantas é uma abordagem real e atrativa. Inúmeros são os fungos identificados e utilizados como biofungicidas (agentes de biocontrole) de maneira promissora na substituição de fungicidas químicos.43 A explicação para tal sucesso reside no fato destes micro-oganismos atuarem secretando ou emitindo compostos químicos com função antibiótica e antifúngica como enzimas e uma vasta classe de metabólitos voláteis e não voláteis, ou seja, uma série de metabólitos secundários que são tóxicos para os patógenos de plantas, mesmo em baixas concentrações.39,42,47
A indução de resistência contra fitopatógenos é um método de controle de doenças em plantas que atua ativando mecanismos de defesa no vegetal. Assim, a resistência de uma planta pode ainda ser definida como o processo que atrasa ou evita a entrada e atividade de um fitopatógeno nos tecidos vegetais. Este processo é regulado por genes que codificam proteínas relacionadas à patogênese e enzimas envolvidas na síntese de fitoalexinas e lignina.48
Desta forma, os estudos envolvendo metabólitos voláteis de micro-organismos benéficos que atuem como controle biológico em potencial e seus modos de ação apresentam crescente importância. A abordagem utilizando fungos como biocontrole no combate integrado de pragas e doenças bem como na promoção de resistência a fitopatógenos é uma realidade e importante estratégia com vistas a redução do uso de fungicidas comerciais.39
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De maneira similar aos patógenos, os fungos sapróbios são capazes de secretar pectatoliases que hidrolisam a parede celular do vegetal ativando a resposta de defesa da planta. Porém, como não produzem toxinas não são capazes de infectar a planta, atuando apenas como indutores de resistência no vegetal.49
Estes fungos podem ser obtidos a partir de matéria orgânica em decomposição, sendo a hostilidade do ambiente de bioprospecção preponderante para as chances de sucesso como biocontrole no ecossistema. Alguns organismos tem sido extensivamente explorados como controle biológico em um contexto comercial, o chamado mercado biopesticida.34 Entre os fungos mais utilizados para biocontrole de doenças em plantas destacam-se as espécies dos gêneros Trichoderma, Muscudor e
Talaromyces.39
2.2 Tecnologias Analíticas para os Estudos de Metaboloma
2.2.1 Preparo de Amostras – Considerações em Metabolômica
A escolha e otimização correta do tipo de processamento da amostra bruta a fim de se evitar interferências e incompatibilidade com a equipamentos analíticos são requeridas. Neste sentido, a utilização de um procedimento adequado de preparo de amostra é fundamental durante a execução da análise química, garantindo de maneira adequada o isolamento e concentração do(s) analito(s) em avaliação.50
Portanto, um dos objetivos da química analítica relacionada aos avanços nos estudos de metaboloma tem sido promover metodologias e instrumentação
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adequadas que possam responder de maneira precisa e sensível às mudanças sutis que ocorrem no perfil de metabólitos produzidos por um sistema vivo.
Considerando que amostras biológicas contêm centenas e/ou milhares de componentes, a extração de analitos de interesse numa matriz complexa não pode ser realizada sem um preparo de amostra adequado que anteceda a análise, mesmo quando moderna instrumentação analítica é empregada.48 Em bioanalítica os métodos de preparo de amostra geralmente empregam o uso de técnicas de extração líquido-líquido (LLE, Liquid-Liquid Extraction) e extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction).51
No caso de os analitos de uma amostra complexa ser voláteis o perfil há consideravel variação em suas propriedades físicas e químicas. Assim, a eficiência da extração destes compostos também será variável e dependente da metodologia de extração utilizada. Assim, os perfis de voláteis são altamente dependentes do método de amostragem e da manipulação das amostras. Desta forma, a extração completa de um perfil metabólico utilizando apenas uma abordagem analítica é por vezes inviável, uma vez que os metabólitos são amplamente distribuídos nos organismos em diferentes níveis devido à magnitude química dos compostos bem como de sua faixa de concentração.52
Uma variedade de métodos pode ser utilizada para extrair e concentrar metabólitos voláteis a partir de uma amostra biológica. De maneira geral duas abordagens básicas podem ser utilizadas: a amostragem direta de compostos voláteis a partir do headspace da amostra ou a extração com solvente dos compostos voláteis que a constitui.
A extração dos analitos contidos no headspace da amostra é uma metodologia livre do uso de solventes. Neste caso, a extração dos analitos
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pode ser conduzida de dois modos: (i) estático, onde os analitos presentes em uma amostra são mantidos em equilíbrio com o seu headspace (de volume pequeno e definido) sendo a quantidade extraída proporcional ao volume da fase gasosa ou (ii) dinâmico, onde um volume conhecido de gás, purgado sobre a amostra, arrasta os analitos presentes concentrado-os num material sorvente.40,53
Métodos de extração baseados em solventes geralmente propiciam a extração de um perfil metabólico volátil mais representativo e completo. No entanto, muitos outros componentes presentes no momento da extração também serão extraídos, necessitando posteriormente de outras metodologias de purificação. Os extratos obtidos por esse tipo extração devem ser concentrados através de evaporação levando a diminuição de seu volume original e aumentando a sensibilidade, porém resultando numa perda seletiva de compostos voláteis. No entanto, essas perdas podem ser compensadas pelo uso de padrão interno durante as extrações. Este método de extração confere facilidade de manuseio das amostras que podem ser armazenadas antes de serem identificadas e quantificadas.40
2.2.2 Microextração em Fase Sólida (SPME)
O preparo de uma amostra é totalmente dependente do processo amostragem que irá representar os analitos alvo presentes e assim pode-se dizer que é a ligação entre a identidade química dos constituintes de uma matriz química e o instrumental analítico a ser empregado.50
Neste sentido, contrária as técnicas de extração exaustivas como a LLE, que empregam o uso de um grande volume de fase extratora para extração do
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analito de uma matriz (amostra), a microextração em fase sólida (SPME,
Solid-Phase Microextraction) é uma técnica de extração de equilíbrio.48
Assim, a SPME é uma microtécnica de extração porque os processos de extração e pré-concentração dos analitos estão baseados numa escala dimensional não tão usual, ou seja, emprega uma pequena quantidade de fase extratora (sorvente que pode ser um sólido ou líquido adsorvido) que extrai apenas uma pequena porção dos analitos que estão presentes na matriz, mas de maneira representativa de todo o perfil químico ali presente.50
Além de proporcionar extração dos analitos combinada ao processo de pré-concentração da amostra, a SPME é um processo altamente positivo e indispensável quando se trabalha com metabólitos presentes em baixas concentrações.10 Entre suas vantagens destaca-se por ser um método livre do uso de solventes, não-destrutivo, sensível, barato, simples e que promove amostragem rápida e precisa dos resultados.53
Desenvolvida por Arthur e Pawliszyn é atualmente um dos procedimentos mais empregados na extração de compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis de uma variedade de matrizes.9 Sua teoria está baseada na cinética de transferência de massa entre fases e na termodinâmica que estabelece o equilíbrio de partição ou adsorção (no caso de recobrimentos sólidos) do analito, entre a fase extratora e o meio que os envolve.50 Um dispositivo típico de SPME é ilustrado pela Figura 1:
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Figura 1. (A) Dispositivo básico empregado na técnica de SPME. (B) Ilustração
da fibra que contém a fase extratora. (C) Fibras comerciais com diferentes tipos de polímero de recobrimento.
Disponível em: www.sigmaaldrich.com/japan/analyticalchromatography/sample-preparation/spme.html
Neste caso, a extensão da extração dos analitos é governada pela constante de distribuição entre a fase extratora (polímero de recobrimento da fibra de SPME) e o analito de interesse contido na matriz, dada por Kfs. Como
esta constante refletirá a afinidade do composto pela fase extratora sua natureza também refletirá a seletividade da extração. Desta forma, a quantidade do analito alvo extraído (n) no equilíbrio pode ser representada pela equação 1 a seguir:53
(Equação 1)
onde C0 é a concentração inicial do analito, n é a quantidade de analito
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condições negligenciáveis de VfKfs, ou seja, Vs>>VfKfs a quantidade de analito
extraída (n) por SPME é independente do volume da amostra (Vs) e será dada
por (Equação 2):
(Equação 2)
Assim, sob aspectos termodinâmicos, a quantidade de analito extraída no equilíbrio será função de sua afinidade pela fase extratora. Entretanto, em termos cinéticos é necessário que haja um intervalo de tempo para que o equilíbrio entre as duas fases seja atingido, experimentalmente fundamental e dependente da transferência de massa no sistema.50
Basicamente três modos de extração podem ser operados utilizando SPME: (a) extração direta, (b) extração por headspace e (c) extração protegida por membrana (Figura 2). No modo de extração direta e protegida por membrana a fibra é mantida em contato direto com a amostra líquida e os analitos da matriz são diretamente da matriz para o polímero extrator. No modo headspace a fibra é mantida acima da amostra líquida ou sólida e somente os analitos voláteis e semi-voláteis serão extraídos.54
23
Figura 2. Principais modos de extração em SPME. Adaptado de Valente e
Augusto 2000.50
2.2.2.1 Aplicações em Metabolômica – SPME in vivo
Em bioanalítica a SPME apresenta-se como uma técnica de extração bastante versátil devido a várias características. Entre elas, possibilita um processo de clean-up muito eficiente da amostra, uma vez que emprega um volume de fase extratora baixa além de sua seletividade. Como resultado, limita que eventuais interferentes presentes na matriz sejam co-extraídos com os analitos de interesse eliminando assim efeitos de matriz.51
Desta forma, a SPME torna-se uma técnica de preparo de amostra fundamental em análises de amostras in vivo e in vitro. Nos estudos in vivo, onde os processos químicos são dinâmicos e ocorrem de maneira continua e sistemática no sistema vivo, a SPME é um formato conveniente de amostragem e preparo de amostras, pois atua diretamente no organismo vivo de interesse, possibilitando a aquisição de uma interpretação biológica mais próxima da idealidade.51
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Por atuar de maneira rápida e livre do uso de solventes, a SPME não promove distúrbios no sistema vivo, uma vez que pequenas frações dos analitos são removidas. Desta forma, a técnica apresenta grande destaque nos estudos in vivo, pois a amostragem é local podendo ser repetida para a mesma amostra ao longo do período de avaliação do sistema vivo.
A técnica tem sido amplamente empregada em estudos de metabólitos voláteis de insetos, fungos, bactérias e plantas em interações com o ambiente, em avaliações de concentrações de drogas intravenosas em animais, em estudos de biomarcadores como indicativo de doenças, análises de bioacumulação e toxicidade ambiental entre outros.54
2.2.3 Instrumentação Analítica em Metabolômica
Nos estudos de metabolômica a aquisição do perfil metabólico representativo da amostra biológica requer técnicas analíticas capazes de identificar e mensurar potencialmente uma variedade de classes químicas de moléculas bem como sua faixa dinâmica de concentração.55
Quando o objetivo é obter o perfil metabólico global, técnicas como a espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry) e ressonância magnética nuclear (NMR, Nuclear Magnetic Resonance) são as mais rotineiramente empregadas.56,57 A espectroscopia de RMN fornece uma visão abrangente dos analitos sob certas condições de modo não destrutivo. Porém, apresenta a desvantagem de baixa sensibilidade e resolução espectral.58
A espectrometria de massas é a técnica melhor estabelecida para metabolômica em função de sua alta sensibilidade e ampla faixa cobertura de metabólitos de alta complexidade. Neste caso, as análises de amostras
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biológicas podem ser utilizadas tanto no modo de injeção direto quanto através de separação cromatográfica.57 Quando acoplada a outras técnicas de alto desempenho como a cromatografia gasosa (GC, Gas Chromatography), cromatografia líquida (LC, Liquid Chromatography) e mais recentemente a eletroforese capilar (CE, Capillary Electrophoresis) na análise de compostos polares ou iônicos, seu cenário de aplicação aumenta ainda mais.59
Técnicas hifenadas têm sido amplamente empregadas nos estudos de metaboloma.57 Uma gama destas ferramentas tem sido utilizadas para aquisição de informações metabólicas complexas sendo a GC-MS, na detecção de compostos voláteis ou volatilizáveis, e LC-MS, na detecção de compostos não-voláteis polar e não-polar, as mais empregadas atualmente.60,61
2.2.3.1 Cromatografia Gasosa
O objetivo central dos estudos em metabolômica reside no entendimento sistemático dos metabólitos presentes numa amostra biológica. Quando o entendimento deste perfil metabólico é representado pela fração volátil e não alvo, especialmente metabólitos hidrofílicos, a plataforma analítica mais utilizada é a GC-MS.
Como técnica multidimensional, a GC aliada à espectrometria de massas oferece um sistema poderoso de análise, pois mais uma dimensão está adicionada a separação cromatográfica, ou seja, espectros de massas são obtidos em conjunto a análise.62
Neste caso, a técnica fornece análises eficientes e reprodutíveis quando se trabalha com elevado número de amostras, proporcionando não apenas a
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identificação em função dos tempos de retenção, mas também baseada nas informações dos espectros de massas dos analitos em avaliação (Figura 3).57,62
Figura 3. Natureza multidimensional dos dados gerados a partir de GC-MS. No
eixo X encontra-se os tempos de retenção referente à separação cromatográfica e no eixo Y os espectros de massas. As intensidades dos sinais encontram-se no eixo Z. Górecki et al. 2003.62
Para o estudo de metabólitos voláteis a GC-MS tem sido amplamente empregada, pois é uma técnica valiosa para uma gama de aplicações em metabolômica.1 Sua utilização tornou-se rotineira em análises metabolômicas globais de amostras complexas devido a possibilidade de trabalho com altas taxas de aquisição e elevada sensibilidade.63
Porém, quando o objetivo é a completa resolução dos compostos voláteis de interesse em um tempo mínimo de análise, a GC-MS apresenta limitações.64 Nos estudos de metaboloma, onde centenas ou mesmo milhares de compostos voláteis estão presentes em uma ampla faixa dinâmica de concentração, a limitação da técnica reside no fato de que como os metabólitos voláteis se apresentam de maneira randômica, analitos
27
frequentemente coeluem mesmo quando a capacidade máxima do sistema é muito maior do que o necessário para acomodar todos os componentes da amostra. Como consequência direta desta resolução insuficiente, têm-se como resultados dificuldades ou erros durante o processo de identificação e quantificação de componentes alvo.59
Neste sentido, quando há a demanda por separações mais seletivas com um aumento no poder de resolução a Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) têm sido a técnica de escolha para a caracterização de amostras complexas principalmente na busca por fingerprints e biomarcadores de normalidade/anormalidade.65
2.2.4 Avanços em Cromatografia – Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC)
O aspecto mais revolucionário acerca da GC×GC no cenário da cromatografia multidimensional está relacionado a fato de que uma mesma amostra estar sujeita a duas separações analíticas diferentes. Este conceito já existia muito antes de a GC ser desenvolvida. Através da utilização de duas migrações ortogonais descrita nos anos de 1940, a cromatografia planar bidimensional já fazia uso de separações independentes.64
Entre o desenvolvimento da GC convencional até a inovação da GC×GC, uma maneira mais eficiente em aumentar o ganho no poder de resolução foi alcançada com o aparecimento da Cromatografia Gasosa Multidimensional (MDGC, Multidimensional Gas Chromatography) também conhecida como "heart-cutting" ou frações parciais. Nesta técnica, que utiliza duas colunas para resolver os analitos de uma amostra, frações de picos
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coeluídos na primeira dimensão (previamente selecionados através de GC convencional) são reinjetados e separados numa segunda coluna. Desta forma, a capacidade de pico (n) do sistema é igual à soma da capacidade de pico de primeira dimensão (n1) pelo produto da capacidade de pico da segunda coluna
pelo número (x) das frações transferidas (n2×x), ou seja, [n1 + (n2×x)] (Figura
4). Neste caso, apenas algumas frações selecionadas serão efetivamente submetidas a uma segunda separação.64 Porém, a técnica apresenta tempo elevado de análise e instrumentação mais complexa. Há ainda a possibilidade de sobreposição dos picos de compostos previamente resolvidos na primeira separação.
Figura 4. Comparativo das capacidades de pico (n) entre as técnicas MDGC [n1
+ (n2×x)] e GC×GC (n1×n2).
É uma boa escolha quando se tem um número limitado de frações a ser submetida à segunda separação, não sendo utilizada quando todas as frações de um eluato devem ser reanalisados.64 Para estes casos a técnica a ser considerada é a GC×GC. Desenvolvida em 1991 por Liu e Phillips, seu impacto frente à GC unidimensional pode ser comparado ao impacto gerado
