Perfil de metabólitos voláteis produzidos por Memnoniella sp por

O objetivo do estudo reside na obtenção da fração volátil diferencial entre as espécies de fungos aqui avaliadas através de GC×GC-qMS. Para alcance de tal objetivo foi necessario que a identificação da fração

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metabólica volátil representativa de cada fungo fosse executada de maneira a evidenciar mudanças sutis no perfil metabólico. Como verificado na Figura 22, que ilustra o perfil volátil das espécies avaliadas, a densidade de informação contida no cromatograma não permitiu que somente a inspeção visual revelasse tais mudanças de forma rápida e segura.

Neste sentido, foram utilizadas estratégias que empregaram o uso de ferramentas quimiométricas para o estabecimento de um perfil cinético mais diverso, ou seja, que contivesse a maior diversidade e variação (qualitativa e quantitativa) destes compostos.

Deve ser destacado que para a obtenção da diversidade volátil produzida por Memnoniella sp. foi necessário adquirir os cromatogramas das replictas no modo com e sem razão de divisão de injeção (Figura 24). Desta forma, os cromatogramas obtidos foram alinhados nos modos split e

splitless a fim de se evitar o mascaramento de parte dos cromatogramas em

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Figura 24. Cromatogramas bidimensionais típicos de Memnoniella sp. (A)

Cromatograma obtido no modo splitless (sem razão de divisão dos analitos). (B) Cromatograma obtido no modo split, com razão de divisão de injeção 1:10. (C) Cromatograma obtido no modo split, com razão de divisão 1:10 com com seleção da região do cromatograma compreendida entre 21 e 35 min de corrida cromatográfica.

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Qualitativamente foi verificada a ocorrência de pequenos deslocamentos nos tempos de retenção dos picos cromatográficos ao longo da corrida tanto para as replicatas do fungo quanto para as do branco. Desta forma, para evitar incorreções durante o processo de identificação do perfil metabólico e obtenção de uma modelagem equivocada da cinética de emissão dos compostos, o primeiro passo após a separação cromatográfica consistiu no alinhamento dos cromatogramas bidimensionais brutos das replicatas de Memnoniella sp. e do branco (Figura 25).

Figura 25. Ilustração dos cromatogramas desdobrados de Memnoniella sp.

após alinhamento pela técnica COW. (A) Alinhamento com os cromatogramas obtidos no modo splitless (sem razão de divisão de injeção) e (B) Alinhamento com os cromatogramas obtidos no modo split (com razão de divisão de injeção de 10:1)

Após o alinhamento dos cromatogramas em ambos os modos de divisão de injeção ser concluído foi realizada a modelagem por MPCA com o objetivo de reconhecer os padrões entre os conjuntos de dados. A modelagem dos dados obtidos com injeção no modo splitless evidenciou que duas componentes principais (CP) foram responsáveis em descrever

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83% da variância presente nos dados, sendo a CP1 responsável em descrever 74,7% e a CP2 7,9% da variância total dos dados (Figura 26).

O gráfico de escores descreveu a relação entre as amostras e neste sentido, através do gráfico da CP1 vs. CP2 (Figura 26) foi possível observar que a CP1 discriminou as replicatas do branco das replicatas do fungo (Figura 26A). Já a CP2 foi responsável em discriminar as replicatas de Memnoniella sp em função dos diferentes dias de cultivo (Figura 26B), evidenciando valores de escores crescentes na seguinte ordem: replicatas fungo no 3º e 4º dias de cultivo < replicatas do branco e replicatas fungo no 5º dia de cultivo < replicatas fungo no 6º e 7º dias de cultivo.

Figura 26. Gráfico de escores para CP1 vs. CP2 para Memnoniella sp. no

modo de injeção splitless. (A) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp. (B) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp. em função do período de cultivo.

A avaliação destes resultados sugere a existência de produção e consumo diferencial na fração volátil de Memnoniella sp. no sexto e sétimo dia de cultivo. Essa hipótese foi suportada na inspeção visual dos cromatogramas onde foi visível a observação de regiões nos

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cromatogramas onde compostos são produzidos e consumidos ao longo das extrações.

Os resultados evidenciaram também a existência de ampla variação intra-amostral para as replicatas de Memnoniella sp, ou seja, dentro de um mesmo conjunto de replicatas (Figura 27A). Esse comportamento foi verificado através da modelagem por MPCA com a obtenção do gráfico da resposta cinética de emissão dos metabólitos extraídos ao longo dos dias de análise (Figura 27), que evidenciou ainda não existir variabilidade dentro das replicatas do branco. Neste caso, o 6º dia de cultivo evidenciou ser aquele como contendo produção e consumo diferencial de metabólitos voláteis (Figura 27B).

Figura 27. Gráficos da CP1 e CP2 vs. o período de cultivo explorando o

perfil cinético de produção e consumo de metabólitos voláteis Memnoniella sp. no modo de injeção splitless. (A) Gráficos de escores da CP1 vs. Período de cultivo indicando elevada variação (qualitativa e quantitativa) dentro das replicatas de Memnoniella sp. (B) Gráficos de escores da CP2 vs. Período de cultivo indicando o 6º dia de cultivo como contendo produção e consumo diferencial dos metabólitos produzidos por Memnoniella sp.

Após o reconhecimento da variação no comportamento das replicatas de Memnoniella sp., evidenciada através da modelagem por MPCA, a análise foi complementada pela avaliação dos escores utilizando HCA. A

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partir do dendrograma obtido foi possível observar a formação de dois agrupamentos principais das amostras (Figura 28).

Figura 28. Dendrograma gerado a partir da modelagem HCA para as

replicatas do branco e de Memnoniella sp. no modo de injeção splitless.

O primeiro agrupamento formado evidenciou a distinção entre as replicatas de Memnoniella sp. e as replicatas do branco. O segundo agrupamento foi constituído pelas amostras obtidas no 6º dia de crescimento do fungo, seguido pelas amostras do 5º e 7º dias e das amostras do 3º e 4º dias. Provavelmente, existe o indicativo de que a produção e consumo de metabólitos voláteis no 6º dia de análise apresentou comportamento diferencial do restante de replicatas analisadas nos demais dias do experimento. Esse resultado corrobora com o resultado obtido por

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MPCA onde as replicatas com maiores escores ocorrem para o 6º e 7º dias de cultivo do fungo (Figura 27B).

A avaliação mais detalhada do dendrograma revelou ainda a formação de agrupamentos secundários das replicatas de Memnoniella sp. relacionados aos dias de cultivo, mas com a presença de algumas amostras atípicas referentes ao fungo (amostras que pertencem à uma classe, mas que estão alocadas em outro subgrupo no dendrograma), relacionadas as replicatas “a” para o 5º e 6º dias e “c” para o 3º dia.

De forma análoga aos resultados obtidos para Memnoniella sp. no modo splitless, foram conduzidas as modelagens MPCA e HCA para o modo split. A modelagem dos dados obtidos com injeção no modo split evidenciou que duas componentes principais foram responsáveis em descrever 94% da variância presente nos dados, sendo a CP1 responsável em descrever 84,20% e a CP2 9,87% da variância total dos dados (Figura 29).

Figura 29. Gráfico de escores para CP1 vs. CP2 para Memnoniella sp. no

modo de injeção split. (A) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp. (B) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp. em função do período de cultivo.

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A avaliação do gráfico de escores para CP1 vs. CP2 (Figura 29) permitiu observar que a CP1 discriminou as replicatas do branco das replicatas do fungo (Figura 29A). Já a CP2 foi responsável em discriminar as replicatas do fungo em função dos diferentes tempos de cultivo (Figura 29B), evidenciando valores de escores crescentes na seguinte ordem: replicatas fungo no 6º dia de cultivo < replicatas “a” e “c” fungo do 6º e 7º dia de cultivo < replicatas do 5º e do branco < replicatas fungo no 3º e 4º dia de cultivo.

A avaliação destes resultados sugere a existência de produção e consumo diferencial na fração volátil de Memnoniella sp. no 3º e 4º dias de cultivo. Essa hipótese foi suportada através da inspeção visual dos cromatogramas onde foi visível regiões onde compostos surgem e são consumidos ao longo das extrações.

Os resultados evidenciaram também a existência de ampla variação intra-amostral, ou seja, dentro do mesmo conjunto de replicatas de

Memnoniella sp. Esse comportamento foi verificado através da modelagem

por MPCA com a obtenção do gráfico da resposta cinética de emissão dos metabólitos extraídos ao longo dos dias de análise (Figura 30), que evidenciou ainda não existir variabilidade dentro das replicatas do branco.

Ainda de acordo co o perfil cinético obtido para a espécie, foi possível observar que os 3º e 4º dias de cultivo apresentaram-se como aqueles contendo produção e consumo diferencial de metabólitos voláteis (Figura 30B).

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Figura 30. Gráficos da CP1 e CP2 vs. o período de cultivo explorando o

perfil cinético de produção e consumo de metabólitos voláteis Memnoniella sp. no modo de injeção split. (A) Gráficos de escores da CP1 vs. Período de cultivo indicando elevada variabilidade dentro das replictas de Memnoniella sp. (B) Gráficos de escores da CP2 vs. Período de cultivo indicando o 3º e 4º dias de cultivo como contendo produção e consumo diferencial dos metabólitos produzidos por Memnoniella sp.

Após o reconhecimento da variação no comportamento das amostras, evidenciada através da modelagem por MPCA, a análise foi complementada pela avaliação dos escores utilizando HCA. A partir do dendrograma obtido foi possível observar a formação de dois agrupamentos principais das amostras (Figura 31).

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Figura 31. Dendrograma gerado a partir da modelagem HCA para as

replicatas do branco e de Memnoniella sp. no modo de injeção split.

O primeiro agrupamento formado evidenciou a distinção entre as replicatas de Memnoniella sp. e as replicatas do branco. A seguir há separação das replicatas do fungo em função do período de cultivo com clara distinção entre as replicatas obtidas no 3º e 4º dias das replicatas obtidas no 5º, 6º e 7º dias de cultivo. Esse resultado corrobora com o obtido através de MPCA onde as replicatas com maiores escores ocorrem para o terceiro e 4º dia de cultivo do fungo. Este resultado indica que a produção e consumo de metabólitos voláteis nesses dois agrupamentos apresentou comportamento diferencial entre si.

Desta forma, os resultados obtidos com as modelagens MPCA e HCA direcionaram o processo de identificação dos metabólitos produzidos

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por Memnoniella sp. sendo, portanto, avaliados os cromatogramas das replicatas do fungo obtidos no 4º e 6º diaa de cultivo para o modo splitless e 3º e 4º dias de cultivo para o modo split.

Nesta etapa, foi feita a escolha por não utilizar os gráficos de pesos durante o processo de identificação dos compostos voláteis. Neste caso, os gráficos de pesos apresentariam os tempos de retenção dos compostos relacionados às tendências das amostras (branco e fungo) observadas nos gráficos de escores (Figuras 26 e 29). Porém, devido a existência de elevada variação (qualitativa e quantitativa) dentro dos conjuntos de replicatas de Memnoniella sp. (Figuras 27 e 30), a identificação dos metabólitos somente com base nos gráficos de pesos poderia comprometer a aquisição do perfil mais representativo.

Assim, a identificação foi realizada levando-se em consideração a orientação de maior diversidade evidenciada pela diferenciação das replicatas nos gráficos de escores e dendrogramas, a fim de se retirar a subjetividade de escolha dos cromatogramas com perfil cinético mais diverso.

De posse do dia no qual a extração da fração volátil exibiu maior variabilidade e diversidade de metabólitos, os cromatogramas mais representativos para Memnoniella sp. tiveram os tempos de retenção dos compostos na primeira (¹tR) e na segunda dimensão (²tR) identificados

utilizando o software GCImage, através da avaliação diferencial do cromatograma obtido para os brancos. A partir destes tempos de retenção e dos espectros de massas foi realizada a identificação tentativa dos metabólitos voláteis do fungo de acordo com suas similaridades espectrais (similaridade acima de 80%) em comparação com a biblioteca de espectros NIST 08 (Tabela 5).

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Tabela 5. Identificação tentativa dos metabólitos voláteis produzidos por Memnoniella sp. nas extrações realizadas no 4º e 6º

dias de cultivo do fungo (cromatogramas adquiridos no modo de injeção splitless) e 3º e 4º dias de do fungo (cromatogramas adquiridos no modo de injeção split).

# 1tR(min) 2tR(s)

Match

(%) LTPRI LTPRIexp Composto CAS

1 2,61 0,56 86 716 712 4-metil-2-pentanol 108-11-2

2 2,72 1,24 80 718 717 ácido fórmico, 1-metilpropil éster 589-40-2

3 3,62 0,92 90 754 760 2-hexanona 591-78-6

4 3,74 2,24 90 761 766 1-pentanol 71-41-1

5 4,81 0,76 94 815 818 1,3-octadieno 1002-33-1

6 5,12 1,08 85 822 832 ácido butanóico, 2-oxo-metil éster 3952-66-7

7 5,15 2,72 97 831 834 4-metil-pentanol 626-89-1 8 5,35 2,92 93 842 843 7-metil-1-octeno 13151-06-9 9 5,74 3,04 80 867 862 2,3,4-trimetil-1-pentanol 6570-88-3 10 6,53 2,28 85 924 900 2-noneno 2216-38-8 11 7,05 1,68 96 918 916 metóxi-benzeno 100-66-3 12 7,52 2,72 84 960 932 N-etil-trimetilenodiamina 38571-87-8 13 7,53 1,44 89 961 932 4-metil-cicloexanona 589-92-4 14 8,52 2 95 989 963 2,3-heptanodiona 96-04-8 15 8,78 1,2 88 982 972 benzaldeído 100-52-7 16 8,96 4,68 96 969 978 1-octen-3-ol 3391-86-4 17 9,22 3,88 81 1004 986 pseudolimoneno 499-97-8 18 9,26 1,08 86 989 987 3,6-heptanodiona 1703-51-1 19 9,40 3,32 86 996 991 1-(2-metil-1-ciclopenten-1-il)-etanona 3168-90-9 20 9,46 5,84 91 995 994 2-etil-1-hexanol 104-76-7 21 10,32 3,68 90 1018 1017 -terpineno 99-86-5

94 22 10,38 1,12 82 1020 1018 5-etil-2-furaldeído 23074-10-4 23 10,55 4,96 85 1022 1023 1-metóxi-4-metil-benzeno 100-66-3 24 10,72 3,08 95 1018 1027 1-metil-4-(1-metiletenil)-cicloexeno 5989-54-8 25 11,00 1,16 84 1033 1027 2-hidroxi-3,5-dimetilciclopent-2-en-1-ona 21834-98-0 26 12,62 5,8 83 1086 1075 2,5-dimetil-decano 17312-50-4 27 13,24 1,48 90 1093 1091 p-cimeneno 1195-32-0 28 13,56 2,36 88 1101 1099 linalol 78-70-6

29 13,82 3,68 87 1109 1105 ácido butanóico, 3-metil-3-metilbutil éster 659-70-1

30 14,03 1,36 83 1107 1110 1,1-dimetilpropil-benzeno 2049-95-8 31 14,32 1,6 85 1120 1117 acetato de 3-octanol 4864-61-3 32 14,35 1,48 81 1108 1117 dimetilacetal-benzaldeído 1125-88-8 33 14,46 3,04 85 1110 1120 1-metóxi-2,4-dimetil-benzeno 6738-23-4 34 14,54 3,32 89 1113 1122 4-etil-3-octanol 19781-26-1 35 14,39 2,64 96 1113 1118 benzenoetanol 60-12-8 36 15,75 5,6 85 1151 1150 1,6-diol-6-metil-heptano 5392-57-4

37 17,03 3,08 90 1176 1179 ácido oxálico, alil isobutil éster 

38 17,15 1,92 83 1180 1182 terpinen-4-ol 562-74-3 39 19,75 3,16 81 1239 1242 2-metóxi-1-metil-4-(1-metiletil)-benzeno 6379-73-3 40 20,23 2,88 89 1249 1253 5-metil-dodecano 17453-93-9 41 20,26 1,6 85 1261 1254 2-etil-2-hidroximetil- 1,3-propanodiol 77-99-6 42 24,12 3,56 87 1349 1343 4-metil-tridecano 26730-12-1 43 25,32 1,24 81 1377 1371 -elemeno 20307-84-0 44 25,41 1,36 86 1384 1374 4,8-dimetil-tridecano 55030-62-1 45 25,62 0,88 80 1376 1378 6-dodecanol 6836-38-0 46 25,72 1,04 87 1387 1381 7-epi-sesquitujeno 159407-35-9 47 26,03 1,32 90 1390 1388 -elemeno 515-13-9 48 26,36 1,56 83 1398 1396 7-metil-6-trideceno 24949-42-6

95 49 27,52 3,64 88 1423 1424 -cedreno 546-28-1 50 27,63 1,48 84 1424 1427 (E)-cariofileno 87-44-5 51 28,23 1,8 85 1445 1442 elixeno 3243-08-8 52 29,33 1,88 89 1471 1469 -acoradieno 28477-64-7 53 29,83 2,04 94 1483 1481 -curcumeno 644-30-4 54 29,23 2,04 89 1459 1466 acoradieno 24048-44-0 55 29,93 1,64 93 1479 1476 -chamigreno 18431-82-8 56 30,33 2 92 1493 1492 valenceno 4630-07-3 57 30,83 1,72 86 1516 1506 -chamigreno 19912-83-5 58 31,92 1,76 83 1537 1534 1-cicloexil-1-4-metilcicloexil-etano  59 31,94 1,48 83 1530 1534 1,1,7-trimetil-4-metilenedecaidro-1H- ciclopropa[e]azulen-7-ol-, (1aR- (1aα,4aα,7β,7aβ,7bα))- (Espatulenol) 6750-60-3 60 34,34 2,16 86 1600 1596 hexadecano 544-76-3

¹t_R, tempo de retenção na primeira dimensão; ²t_R, tempo de retenção na segunda dimensão; LTPRI, Índice de Retenção; LTPRI_exp, Índice de Retenção Experimental; CAS, número de registro no Chemical Abstracts Service.

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A identificação tentativa evidenciou a presença de 60 metabólitos voláteis emitidos por Memnoniella sp., principalmente seis dias após seu crescimento em meio de cultura BDA (Tabela 5). A diversidade metabólica apresentada pelo fungo foi consistente com as classes de compostos apresentadas por outros fungos de biocontrole com a presença de alcoóis, aldeídos, cetonas, ésteres, éteres hidrocarbonetos e amina (Figura 32).15

Do total de metabólitos identificados (na forma tentativa) os hidrocarbonetos representaram aproximadamente 46,7% das emissões de voláteis, seguido por alcoóis e cetonas, que foram responsáveis por 21,7% e 10%, respectivamente da produção de metabólitos nos dias de máxima diversidade de compostos (Figura 32).

Figura 32. Gráfico da diversidade metabólica produzida por Memnoniella sp.

Os hidrocarbonetos foram marcadamente responsáveis pela maior diversidade intraclasse. Do total desses compostos, os terpenos foram maioria com 61,5% da emissão seguidos por alcanos e alcenos que juntos representaram aproximadamente 27% dos voláteis produzidos para esta classe de compostos. Também foram identificados, em menor número, hidrocarbonetos aromáticos como p-cimeneno e tert-pentil-benzeno e um

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dieno, 1,3-octadieno, que juntos representaram 11,5% da produção de hidrocarbonetos (Figura 33).

Figura 33. Gráfico da diversidade de hidrocarbonetos produzidos por

Memnoniella sp.

Entre os terpenos, a maior produção ocorreu entre os sesquiterpenos, que foram responsáveis por 75% do total de emissão da classe, dentre eles

-elemeno, -elemeno, -cedreno, (E)-cariofileno, elixeno, -acoradieno, acoradieno, -curcumeno, valenceno, -chamigreno e 7-epi-sesquitujeno. Os outros 25% foram representados por monoterpenos como linalol, limoneno e -terpineno.

5.3.2 Perfil de metabólitos voláteis produzidos por Curvularia sp.