Perfil de metabólitos voláteis produzidos por Curvularia sp através

Os mesmos procedimentos utilizados na identificação tentativa para

Memnoniella sp. foram aplicados na obtenção dos resultados para Curvularia sp. Para o procedimento do alinhamento dos cromatogramas

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(somente no modo splitless) a técnica COW foi novamente utilizada (Figura 34).

Figura 34. Ilustração dos cromatogramas desdobrados de Curvularia sp. após

alinhamento pela técnica COW.

Com o objetivo de reconhecer os padrões entre os conjuntos de dados, logo após o alinhamento dos cromatogramas foi realizada a modelagem por MPCA, evidenciando que quatro fatores foram responsáveis em descrever 81% da variância dos dados. A CP1 foi responsável em descrever 44,5% e a CP2 21,1% da variância total (Figura 35). A CP3 descreveu 9,82% e a CP4 5,93% da mesma variância total (Figura 36).

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Figura 35. Gráfico de escores para CP1 vs. CP2 para Curvularia sp. (A)

Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp. em função do período de cultivo (B) Discriminação entre replicatas do branco e Memnoniella sp.

A avaliação do gráfico de escores para CP1 vs. CP2 (Figura 35) permitiu observar que a CP1 descreveu uma tendência de valores de escores em função do dia de cultivo (Figura 35A) com aumento na seguinte ordem: 7º < 3º, 6º < 5º < 4º dias de cultivo. Já a CP2 evidenciou a diferença entre as replicatas do branco e de Curvularia sp. (Figura 35B).

A avaliação do gráfico de escores para as CP3 vs. CP4 revelou que a CP3 foi responsável em discriminar um comportamento atípico das replicatas do fungo e branco obtidas no 3º dia de cultivo (Figura 36). Já a CP4 distinguiu as amostras identificadas na CP3, separando-as entre replicatas do branco e Curvularia sp. (Figura 36).

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Figura 36. Gráfico de escores para CP3 vs. CP4 para Curvularia sp.

A avaliação destes resultados sugere que existe uma produção e consumo diferencial na fração volátil de Curvularia sp. após três e quatro dias de cultivo com um destaque diferencial no 3º dia de cultivo. Essa hipótese foi suportada através da inspeção visual dos cromatogramas onde foi visível regiões onde compostos são produzidos e consumidos ao longo do período de cultivo.

Assim como para a outra espécie de fungo também foi possível verificar a existência de ampla variação intra-amostral, ou seja, dentro de um mesmo conjunto de replicatas do fungo. Esse comportamento foi verificado através da obtenção do gráfico da resposta cinética (em função das quatro componentes principais) de emissão dos metabólitos extraídos ao longo dos dias de análise (Figura 37). Ainda de acordo com o perfil cinético foi possível observar a presença de igual variação intra-amostral para as replicatas do branco.

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Figura 37. Gráficos das componentes principais vs. o período de cultivo

explorando o perfil cinético de produção e consumo de metabólitos voláteis de Curvularia sp. (A) Gráficos de escores da CP1 vs. Período de cultivo (B) Gráficos de escores da CP2 vs. Período de cultivo (C) Gráficos de escores da CP3 vs. Período de cultivo (D) Gráficos de escores da CP4 vs. Período de cultivo.

Após o reconhecimento da variação no comportamento das replicatas de Curvularia sp., evidenciada através da modelagem por MPCA, a análise foi complementada pela avaliação dos escores utilizando HCA. A partir do dendrograma obtido foi possível observar a formação de quatro agrupamentos principais das amostras (Figura 38).

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Figura 38. Dendrograma gerado a partir da modelagem HCA para as

replicatas do branco e de Curvularia sp.

O primeiro agrupamento formado evidenciou a distinção entre as replicatas do fungo obtidas no 3º dia de crescimento do fungo e as outras amostras, seguida da distinção das amostras do branco do 3º. dia. Esse resultado indica que a produção e consumo de metabólitos voláteis no 3º dia de análise apresentou comportamento diferencial do restante de replicatas analisadas nos demais dias do experimento. Na sequência foi possível observar a distinção entre as amostras do branco e do Curvularia sp, com a replicata do fungo (replicata “a” obtida no sétimo dia de cultivo) apresentando comportamento ligeiramente diferencial do restante do conjunto.

A avaliação mais detalhada do dendrograma revelou ainda a formação de subgrupos de amostras (replicatas do branco e do fungo),

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relacionados aos dias de cultivo, evidenciando a existência de reprodutibilidade entre o padrão encontrado para o 4º e 5º dias de cultivo e para o 6º e 7º dias de cultivo.

Desta forma, os resultados obtidos com as modelagens MPCA e HCA direcionaram o processo de identificação dos metabólitos produzidos por Curvularia sp. sendo, portanto, avaliados os cromatogramas das replicatas do fungo obtidos no 3º e 4º dias de cultivo.

Novamente, assim como para os resultados da espécie Memnoniella sp., nesta etapa foi feita a escolha por não utilizar os gráficos de pesos durante o processo de identificação dos compostos voláteis de Curvularia sp. Neste caso, os gráficos de pesos apresentariam os tempos de retenção dos compostos relacionados às tendências das amostras (branco e fungo), observadas nos gráficos de escores (Figuras 35 e 36). Porém, devido a existência de elevada variação dentro dos conjuntos de replicatas de

Curvularia sp. (Figura 37), a identificação dos metabólitos somente com

base nos gráficos de pesos poderia comprometer a aquisição do perfil mais representativo.

Assim, a identificação foi realizada levando-se em consideração a orientação de maior diversidade evidenciada pela diferenciação das replicatas nos gráficos de escores e dendrogramas, a fim de se retirar a subjetividade de escolha dos cromatogramas com perfil cinético mais diverso.

De posse do dia onde a extração da fração volátil exibiu maior variação e diversidade de metabólitos, os cromatogramas mais representaivos para a espécie tiveram os tempos de retenção dos compostos na primeira (¹tR) e na segunda dimensão (²tR) identificados utilizando-se o software GCImage através da avaliação diferencial do cromatograma

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obtido para os brancos. A partir destes tempos de retenção e dos espectros de massas foi realizada a identificação tentativa dos metabólitos voláteis do fungo de acordo com suas similaridades espectrais (similaridade acima de 80%) em comparação com a biblioteca de espectros NIST 08 (Tabela 6).

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Tabela 6. Identificação tentativa dos metabólitos voláteis produzidos por Curvularia sp. nas extrações realizadas no 3º e 4º dia de

cultivo do fungo.

# 1tR(min) 2tR(min)

Match

(%) LTPRI LTPRIexp Composto CAS

1 5,2 3 89 844 844 3-metil-1-pentanol 589-35-5

2 5,6 1,56 91 857 867 1-hexanol 111-27-3

3 5,9 1,68 93 880 879 4-heptanol 589-55-9

4 6,1 1,32 97 884 893 etilbenzeno 100-41-4

5 6,7 1,8 84 913 908 cicloexanol 108-93-0

6 7 1,84 88 916 910 ácido propanóico, butil éster 590-01-2

7 7,7 3,76 83 943 936 2,6-dimetil-2-octeno 4057-42-5

8 7,9 2,6 94 952 947 ácido butanóico, 3-hidroxi-etil éster 5405-41-4

9 8,2 1,84 91 962 970 1-heptanol 111-70-6

10 9,2 5,68 97 988 979 ácido hexanóico 142-62-1

11 9,3 1,76 86 997 995 2-etil-1-hexanol 104-76-7

12 9,3 2,44 84 994 1000 3-etil-5-metil-piridina 

13 9,8 2,88 81 1011 1006 2H-piran-2-ona, tetraidro-6-metil (-Hexalactona) 823-22-3

14 10,5 1,12 91 1028 1022 3-etil-2,7-dimetiloctano 62183-55-5

15 10,5 1,76 89 1022 1026 cicloexanocarbonitrila 766-05-2

16 10,9 1,12 89 1038 1041 4-metil-1-deceno 13151-29-6

17 11,2 1,44 83 1040 1033 4-decino 2384-86-3

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19 11,8 2,88 81 1063 1068 1,1'-[metilenobis(oxi)]bis-butano (Dibutoximetano) 2568-90-3 20 12,1 3,92 91 1063 1060 5-etildiidro-(3H)-furanona (-Hexalactona) 2313-01-1

21 12,8 1,52 90 1080 1081 6-dimetil-7-octen-2-ol (Diidromircenol) 18479-58-8

22 13,4 4,2 83 1097 1104 1-metoxipropil-benzeno 59588-12-4

23 13,7 1,76 84 1103 1105 ácido 2-propenóico, (tetraidro-2-furanil) metil éster 2399-48-6

24 13,9 1,76 86 1108 1101 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol (Linalol) 78-70-6

25 14,3 3,24 83 1121 1112 (3E,5E)-3,5-nonadien-7-in-2-ol 43142-43-4

26 16,2 4,88 85 1162 1155 1-fenil-1-propanol 1565-74-8

27 17,7 2,12 86 1196 1192 acetato de -metil-benzenometanol (Gardenol) 93-92-5

28 18,9 2,12 81 1223 1218 nona-(2E,4E)-dienal 5910-87-2

29 19,2 4,12 80 1231 1236 ácido carbônico, etilfenil éster 3878-46-4

30 19,8 2,92 81 1248 1248 9-decen-1-ol 13019-22-2 31 20,7 3,52 87 1265 1263 5-butildiidro-2(3H)-furanona (-Octolactona) 104-50-7 32 20,9 1,48 86 1269 1265 Dec-(2E)-enal 3913-71-1 33 20,9 4,08 82 1270 1275 2-Decin-1-ol 4117-14-0 34 21,1 3,12 81 1274 1266 ácido propilpropanodióico 616-62-6 35 21,6 1,32 82 1293 1302 1,4-ciclooctanodiona 55794-45-1 36 21,2 1,4 81 1336 1341 1,2,3,4-tetraidro-1,8-dimetil-naftaleno 25419-33-4 37 25,1 1,32 85 1367 1359 2,3-dihidro-4-propil-1H-indeno(4-propilindano) 92013-16-6 38 26,5 1,48 90 1400 1393 1,2,3,4-tetraidro-5,7-dimetil-naftaleno 21693-54-9

39 27,9 1,6 84 1434 1428 ácido cicloexanopropanóico, 2-propenil éster 2705-87-5

40 28,5 0,92 81 1458 1465 -elemeno 

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42 29,9 0,88 81 1493 1487 1-octil-1-cicloexeno 15232-87-8

43 30,9 0,8 87 1493 1500 pentadecano 629-62-9

44 34,3 3,64 87 1596 1592 ácido 1,2-benzenodicarboxilico, dietil éster 84-66-2

45 34,4 1,72 87 1598 1594 1,1,4,7-tetrametil- decaidro-1H-cicloprop[e]azulen-4-ol

(Viridiflorol) 552-02-3

46 35,7 0,72 80 1659 1653 2,6,10,14-tetrametil- pentadecano 1921-70-6

47 36,8 2,84 84 1693 1683 N-metóxicarbonil-l-norvalina, pentil éster 

48 41 0,92 84 1860 1859 ácido 14-pentadecenóico 17351-34-7

¹tR, tempo de retenção na primeira dimensão; ²tR, tempo de retenção na segunda dimensão; LTPRI, Índice de Retenção; LTPRIexp,

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A identificação tentativa evidenciou a presença de 48 metabólitos voláteis emitidos por Curvularia sp., principalmente três e quatro dias após seu crescimento em meio de cultura BDA (Tabela 6). A diversidade metabólica apresentada pelo fungo foi consistente com as classes de compostos apresentadas por outros fungos de biocontrole com a presença de ácidos carboxílicos, alcoóis, aldeídos, cetonas, ésteres (lactonas), éteres, hidrocarbonetos e amina (Figura 39).101

Figura 39. Gráfico da diversidade metabólica produzida por Curvularia sp.

Do total de metabólitos identificados (na forma tentativa) os hidrocarbonetos representaram cerca de 33% das emissões de voláteis, seguido por ésteres e alcoóis, que foram responsáveis por 22,9% e 20,8%, respectivamente da produção de metabólitos nos dias de máxima diversidade de compostos (Figura 39).

Os hidrocarbonetos foram responsáveis pela maior diversidade intra- classe. Do total desses compostos, terpenos e aromáticos foram responsáveis pela produção de 50% dos hidrocarbonetos produzidos por

Curvularia sp., seguidos por alcanos com 18,7% das emissões, alcenos e

heterocíclicos que representaram 12,5% da produção de voláteis. Também foi identificado a presença de um alcino (4-decino) (Figura 40).

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Figura 40. Gráfico da diversidade de hidrocarbonetos produzidos por

Curvularia sp.

Os sesquiterpenos corresponderam à metade das emissões dos terpenos com a ocorrência -elemeno e viridiflorol. De forma análoga, os monoterpenos também representaram 50% das emissões de terpenos com a produção de linalol e diidromircenol.