FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LEISA LOPES AGUIAR
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO XPC c.2815A>C
NO RISCO, ASPECTOS CLÍNICOPATOLÓGICOS E PROGNÓSTICO DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE OROFARINGE
CAMPINAS 2018
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO XPC c.2815A>C
NO RISCO, ASPECTOS CLÍNICOPATOLÓGICOS E PROGNÓSTICO DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE OROFARINGE
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LEISA LOPES AGUIAR E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA.
CAMPINAS 2018
Orientadora: PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
2. PROFA. DRA. CARMEN SILVIA BERTUZZO
3. PROFA. DRA. MONICA BARBOSA MELO
4. PROF. DR. MARCOS ANTONIO DOS SANTOS
5. PROF. DR. JOSÉ AUGUSTO RINCK JÚNIOR
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Esta tese é dedicada integralmente ao meu companheiro,Horácio Busolin Júnior, que participou ao meu lado de cada etapa deste trabalho. Seu amor e sua infinita paciência me fortaleceram e me motivaram nessa árdua trajetória. Para Roma com Amor.
EPÍGRAFE
"O mal invisível que esfacela amorese fomenta as dores Com o passar dos anos
perdeu seu poder As armas da persistência
e do conhecimento espantam novos temores Um novo mundo está por vir
a transmutar nosso saber" (HBJ)
À minha orientadora Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, pela motivação diária em produzir com qualidade e com honestidade e também por todos os ensinamentos que me proporcionou nesses sete anos que participei do Laboratório de Genética do Câncer (LAGECA).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pelas concessões das bolsas de doutorado no país e de estágio no exterior.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão pelo financiamento deste trabalho.
Aos pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe e aos doadores de sangue, por aceitarem a participação no estudo.
Aos pesquisadores colaboradores do Brasil, Dr. Gustavo Jacob Lourenço, Profa. Dra. Manoela Marques Ortega, Profa. Dra. Albina Messias de Almeida Milani Altemani e Profa. Dra. Fernanda Viviane Mariano, pelo apoio na realização dos experimentos.
À pesquisadora colaboradora de Portugal, Profa. Dra. Ana Margarida Abrantes, pelo desafio de aceitar uma aluna que mal sabia se comportar em uma sala de cultura de células, pela incrível recepção no país e por todos os ensinamentos dispensados.
À minha companheira de jornada acadêmica, Ericka Francislaine Dias Costa, por caminhar ao meu lado há exatos 10 anos. Não canso de dizer que ela é o meu braço direito e que essa trajetória não seria possível se não estivéssemos juntas.
Aos colegas do LAGECA, Janet Keller, Gabriela Gomez, Tuany Cândido, João Pedro Gomes, Larissa Alegrini Longhi, Angelo Brito e Cristiane Oliveira, que contribuíram direta ou indiretamente para o desenvolvimento deste trabalho. Em especial à Juliana Carron e à Caroline Torricelli, pela amizade, pelo companheirismo e pela disponibilidade em me ajudar.
À biologista Ana Paula Dalla Costa do Laboratório de Fisiopatologia Cardiovascular, por disponibilizar a estrutura do laboratório para a realização de parte dos experimentos, mas acima de tudo por todo o conhecimento compartilhado, pelo positivismo e por toda a ajuda incansável.
Ao Dr. Roberto Schreiber e à Layde Paim do Laboratório de Biologia Cardiovascular, por disponibilizarem a estrutura do laboratório para a realização de parte dos experimentos.
conhecimentos.
Aos professores e colegas do Instituto de Biofísica, Profa. Dra. Maria Filomena Botelho, Dra. Salomé Pires, Inês Marques, Rita Neves, Ricardo Teixo, Beatriz Serambeque, Ricardo Santo, Ana Lúcia Santos, Dra. Mafalda Laranjo, Dr. Miguel Marto, Dr. Fernando Mendes, Adriana Duarte, Simone Graça, Paulo Teixeira, Rafaela Rêgo e Profa. Elisabete Resende, pelos ensinamentos de cultura de células e por se fazerem presentes durante a minha estadia no país.
Aos meus amigos, Guilherme Augusto da Silva Nogueira e Camila Borges Martins de Oliveira, pelo convívio, pela parceria e pelos momentos de diversão.
Ao meu companheiro de jornada de vida, Horácio Busolin Júnior, por estar ao meu lado de forma integral, pela paciência e pelo amor que dedicou a mim todos esses anos.
À minha base, os meus pais Vitor Soares Aguiar e Roseli Lopes da Silva Aguiar, pelo amor incondicional, por acreditarem em mim e por me apoiarem de todas as formas possíveis.
Aos demais familiares, Cleiton Lopes Aguiar, Gisele Souza de Oliveira, Helena Oliveira Aguiar, Áurea Diogo da Silva, Elizabeth Aparecida de Castro Busolin, Orácio Busolin e Alessandra de Castro Busolin, pelo apoio, pela motivação e pelos abraços calorosos nos momentos que mais precisei.
As diferenças individuais geradas por polimorfismos de base única (SNPs) em genes que atuam no mecanismo de reparo de DNA indicam que a constituição genética pode predispor indivíduos ao carcinoma de células escamosas (CCE) de orofaringe (OF) e influenciar no prognóstico de pacientes portadores do tumor. Até onde atinge o nosso conhecimento, o papel dos genótipos do SNP c.2815A>C no gene XPC em CCEOF ainda é incerto e necessita de estudos adicionais. Frente ao exposto, os objetivos do estudo foram os de verificar se os genótipos do referido SNP influenciam o risco de ocorrência e os aspectos clínicopatológicos do CCEOF, assim como o prognóstico dos pacientes portadores do tumor e a expressão do gene XPC. Foram avaliados 250 pacientes com CCEOF e 250 controles. O DNA genômico foi obtido das amostras de leucócitos do sangue periférico dos pacientes e dos controles inseridos no estudo. Os genótipos do SNP XPC c.2815A>C foram identificados pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. O RNA foi obtido das amostras de leucócitos de sangue periférico dos controles inseridos no estudo. A expressão gênica foi avaliada pela técnica de PCR quantitativa. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelos testes da probabilidade exata de Fisher ou qui-quadrado, regressão logística múltipla, Kaplan-Meier, log-rank, análises univariada e multivariada de Cox e Mann-Whitney. Observamos que a frequência do genótipo XPC c.2815AA foi maior em pacientes com CCEOF do que em controles (42,4% versus 30,8%, P= 0,02). Indivíduos portadores deste genótipo tiveram 2,10 mais chances de desenvolver a doença do que os demais. Os genótipos
XPC c.2815AA ou AC também foram mais frequentes em pacientes com metástase cervical
volumosa (N2 ou N3) do que nos demais (92,6% versus 84,1%, P= 0,04). Notamos que os pacientes com CCE de parede anterior de OF com tumor localmente avançado (T3 ou T4) e com o genótipo XPC c.2815AA tiveram menores sobrevidas livre de eventos (21,2% versus 42,2%, P= 0,04) e global (16,3% versus 28,6%, P= 0,02) do que os outros. Indivíduos com os genótipos XPC c.2815AA ou AC apresentaram maior expressão do gene XPC do que os demais [1,78 unidade arbitrária (UA) versus 1,34 UA, P= 0,04]. Nosso estudo sugere, pela primeira vez, que o SNP XPC c.2815A>C influenciou o risco de ocorrência do CCEOF, a agressividade da doença, o prognóstico dos pacientes e a modulação da expressão gênica. Palavras-chave: neoplasias orofaríngeas; risco; prognóstico; polimorfismo genético; reparo do DNA
on the DNA repair mechanisms indicate that the genetic constitution may predispose individuals to oropharyngeal (OP) squamous cell carcinoma (SCC) and influence the prognosis of patients with the tumor. To the best of our knowledge, the role of c.2815A>C SNP genotypes in XPC gene of OPSCC is still uncertain and needs additional studies. Thus, the present study aimed to verify whether the SNP genotypes influence the risk of occurrence and clinicopathological aspects of OPSCC, as well as the prognosis of patients with tumor and the XPC gene expression. We evaluated 250 OPSCC patients and 250 controls. The genomic DNA was obtained from peripheral blood leukocyte samples from patients and controls entered into the study. The XPC c.2815A>C SNP genotypes were identified by real-time polymerase chain reaction (PCR). The RNA was obtained from peripheral blood leukocyte samples from controls inserted into the study. The gene expression was evaluated by quantitative PCR. Differences between groups were assessed using the Fisher exact or chi-square test, multiple logistic regression, Kaplan-Meier, log-rank, univariate and multivariate Cox analyzes and Mann-Whitney. We observed that the frequency of
XPC c.2815AA SNP genotype was more common in OPSCC patients than in controls (42.4%
versus 30.8%, P= 0.02). Individuals with this genotype were under 2.10 increased chances of OPSCC than the others. The XPC c.2815AA or AC SNP genotypes were more frequent in patients with advanced cervical metastasis (N2 or N3) than others (92.6% versus 84.1%,
P= 0.04). We noted that patients with SCC of anterior wall of the OP with locally advanced
tumors (T3 or T4) and carriers of the XPC c.2815AA SNP genotype had lower event-free (21.2% versus 42.2%, P= 0.04) and overall (16.3% versus 28.6%, P= 0.02) survivals than others. Individuals with the XPC c.2815AA or AC SNP genotypes presented higher XPC gene expression than others [1.78 arbitrary unit (AU) versus 1.34 AU, P= 0.04]. Our study suggest, for the first time, that the XPC c.2815A>C SNP influenced the risk of OPSCC, the aggressiveness of disease, the prognosis of patients and the modulation of gene expression. Keywords: oropharyngeal neoplasms; risk; prognosis; polymorphism genetic; DNA repair
Página Figura 1 Mecanismo de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER).
A via NER é ativada quando ocorre uma lesão no DNA. O reconhecimento da lesão e o recrutamento da maquinaria de reparo para o sítio lesionado é feito principalmente pela proteína XPC. A demarcação da lesão é feita pelas proteínas XPB e XPD. A incisão e remoção da região são realizadas pelas endonucleases XPF, ERCC1 e XPG. A enzima DNA polimerase sintetiza a nova fita de DNA utilizando como molde a fita intacta
21
Figura 2 Distribuições dos genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe e controles após a reação em cadeia da polimerase em tempo real.
32
Figura 3 Secção de carcinoma de células escamosas de orofaringe moderadamente diferenciado incluído em parafina e corado por hematoxilina e eosina
40
Figura 4 Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 239 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe por localização do tumor, extensão local, metástase cervical, metástase à distância e tipo de tratamento
46
Figura 5 Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 112 pacientes com carcinoma de células escamosas localizado na parede anterior da orofaringe por extensão local, metástase cervical, metástase à distância e tipo de tratamento
50
Figura 6 Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 181 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe localmente avançado (T3 ou T4) por localização do tumor, metástase cervical, metástase à distância e tipo de tratamento
54
Figura 7 Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 131 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe com metástase cervical volumosa (N2 ou N3) por extensão local e tipo de tratamento
global dos 177 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe tratados com quimioradioterapia por extensão local, metástase cervical e metástase à distância
62
Figura 9 Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 93 pacientes com carcinoma de células escamosas na parede anterior da orofaringe e com tumor localmente avançado (T3 ou T4) por metástase cervical, metástase à distância e tipo de tratamento
67
Figura 10 Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 93 pacientes com carcinoma de células escamosas na parede anterior da orofaringe e com tumor localmente avançado (T3 ou T4) por genótipos AA, AC e CC, AA ou AC versus CC e AA versus AC ou CC do polimorfismo XPC c.2815A>C
68
Figura 11 Expressão do gene XPC dos 43 controles por genótipos AA, AC e CC, AA ou AC versus CC e AA versus AC ou CC do polimorfismo
XPC c.2815A>C
72
Figura 12 Hipótese para os resultados obtidos na tese “Avaliação do polimorfismo XPC c.2815A>C no risco, aspectos clínicopatológicos e prognóstico do carcinoma de células escamosas de orofaringe” e suas inter-relações
Página Tabela 1 Estudos funcionais do polimorfismo XPC c.2815A>C em diferentes
tipos de amostras e danos no DNA 23
Tabela 2 Estudos de associação entre o polimorfismo XPC c.2815A>C, o risco, aspectos clínicopatológicos e prognóstico de tumor de cabeça e pescoço
26
Tabela 3 Meta-análises de associação entre o polimorfismo XPC c.2815A>C e o
risco de câncer de cabeça e pescoço 27
Tabela 4 Símbolos dos genes, sequência dos iniciadores, concentração ideal de cada iniciador e eficiência das curvas de fluorescência de cada um dos referidos genes
35
Tabela 5 Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe e dos 250 controles por aspectos clínicos
38
Tabela 6 Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de
células escamosas de orofaringe por aspectos tumorais 39 Tabela 7 Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de
células escamosas de orofaringe e dos 250 controles por genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C
42
Tabela 8 Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe por aspectos clínicos, biológicos do tumor e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C
43
Tabela 9 Sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 239 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe por aspectos clínicos, tumorais e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em análise univariada de Cox
47
Tabela 10 Sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 112 pacientes com carcinoma de células escamosas localizado na parede anterior da orofaringe por aspectos clínicos, tumorais e genótipos do polimorfismo
XPC c.2815A>C em análise univariada de Cox
carcinoma de células escamosas de orofaringe localmente avançado (T3 ou T4) por aspectos clínicos, tumorais e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em análise univariada de Cox
55
Tabela 12 Sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 131 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe com metástase cervical volumosa (N2 ou N3) por aspectos clínicos, tumorais e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em análise univariada de Cox
59
Tabela 13 Sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 177 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe tratados com quimioradioterapia por aspectos clínicos, tumorais e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em análise univariada de Cox
63
Tabela 14 Sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 93 pacientes com carcinoma de células escamosas na parede anterior da orofaringe e com tumor localmente avançado (T3 ou T4) por aspectos clínicos, tumorais e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em análise univariada de Cox
69
Tabela 15 Expressão do gene XPC dos 43 controles por genótipos do
A Base nitrogenada adenina
A Alelo selvagem
AA Genótipo homozigoto selvagem
AC Genótipo heterozigoto
AJCC American Joint Comitee on Cancer
BAC Gene beta-actin
C Alelo variante
C Base nitrogenada citosina
CC Genótipo homozigoto variante
CCE Carcinoma de células escamosas
CCECP Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço CCEF Carcinoma de células escamosas de faringe
CCEOF Carcinoma de células escamosas de orofaringe
CDDP Cisplatina
cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar
CP Cabeça e pescoço
DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfato
ERCC1 Gene excision repair cross-complementation group 1
Gln Aminoácido glutamina
Gy Gray
HPV Papilomavírus humano
HR Risco relativo de eventos
HW Hardy-Weinberg
IC Intervalo de confiança
LiCl Cloreto de lítio
Lys Aminoácido lisina
M Metástase à distância
M Molar
μg Micrograma
μM Micromolar
mg/m2 Miligrama por metro cúbico mg/mL Miligrama por mililitro
mL Mililitro
mM Milimolar
N Metástase linfonodal
NER Reparo de DNA por excisão de nucleotídeos
ng Nanograma
nM Nanomolar
OF Orofaringe
OR Razão das chances
p16 Proteína 16
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa
QT Quimioterapia
RNA Ácido ribonucleico
rpm Rotações por minuto
rs Número de referência
RT Radioterapia
SG Sobrevida global
SLE Sobrevida livre de evento
SNP Polimorfismo gênico de base única
T Extensão local do tumor
U Unidade
UA Unidade arbitrária
XPB Gene xeroderma pigmentosum complementation group B
XPC Gene xeroderma pigmentosum complementation group C
XPD Gene xeroderma pigmentosum complementation group D
XPF Gene xeroderma pigmentosum complementation group F
XPG Gene xeroderma pigmentosum complementation group G
χ2
Página
INTRODUÇÃO ... 18
Considerações gerais ... 18
Aspectos clínicos e tumorais ... 18
Aspectos ambientais ... 19
Aspectos genéticos ... 20
Mecanismo de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos ... 20
Polimorfismo gênico de base única XPC c.2815A>C ... 22
OBJETIVOS ... 28
MATERIAL E MÉTODOS ... 29
Aspectos clínicos ... 29
Aspectos tumorais ... 29
Avaliação dos genótipos ... 31
Avaliação da expressão gênica ... 33
Análise estatística ... 36
Aspectos éticos ... 36
RESULTADOS ... 37
Aspectos clínicos ... 37
Aspectos tumorais ... 37
Avaliação do risco de ocorrência do tumor ... 41
Avaliação dos aspectos clínicos e tumorais ... 41
Avaliação da sobrevida dos pacientes ... 45
Avaliação da sobrevida dos pacientes com prognósticos desfavoráveis ... 49
Avaliação da sobrevida dos pacientes com prognósticos desfavoráveis associados ... 65
Avaliação da expressão gênica ... 66
DISCUSSÃO ... 73
CONCLUSÕES ... 81
ESTUDOS ADICIONAIS E EXPERIÊNCIA NO EXTERIOR ... 82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 83
INTRODUÇÃO
Considerações geraisO termo carcinoma de células escamosas (CCE) de cabeça e pescoço (CP) é usado para descrever tumores do tipo histológico identificados na cavidade oral, faringe, fossa nasal, seios paranasais ou laringe (Mendenhall et al., 2011).
O CCECP é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo (Mendenhall et al., 2011). É estimado que cerca de 833.000 novos casos do tumor serão identificados em todo o mundo em 2020, com aproximadamente 459.000 mortes a ele atribuídas (Ferlay et al., 2013). No Brasil, estima-se que para cada ano do biênio 2018-2019 ocorram 10,86 casos de CCE de cavidade oral e 6,17 casos de CCE de laringe por 100.000 homens (Instituto Nacional do Câncer, 2018). Já as taxas brutas de 3,28 e 1,20 casos dos respectivos tumores por 100.000 mulheres são estimadas para o mesmo período (Instituto Nacional do Câncer, 2018).
O CCE de faringe (CCEF) inclui tumores localizados na nasofaringe, na orofaringe e na hipofaringe (Mittal, 2011) e merece destaque entre os CCECP devido às altas taxas de mortalidade (Ferlay et al., 2015). Cerca de 276.000 novos casos do tumor serão diagnosticados em todo o mundo em 2020, com aproximadamente 179.000 mortes decorrentes da doença (Ferlay et al., 2013). No Brasil, estima-se que para 2020 ocorram 8.000 novos casos do tumor e 6.000 mortes a ele atribuídas (Ferlay et al., 2013).
O CCE de orofaringe (OF) pode estar localizado na parede anterior (base de língua e valécula), na parede lateral (região amigdaliana), na parede posterior ou na parede superior (palato mole e úvula) da OF (Mittal, 2011). O CCEOF possui um comportamento agressivo, com elevadas taxas de disseminação linfática e com consequente pior prognóstico dos pacientes (Ang et al., 2010).
Aspectos clínicos e tumorais
As queixas mais frequentes referidas por pacientes com o CCEOF são a odinofagia, a disfagia, o aumento de volume na região, a dor e o sangramento local (Mendenhall et al., 2011). A idade média de apresentação do tumor é 64 anos e cerca de dois terços dos pacientes são homens(Mendenhall et al., 2011).
O CCEOF pode ser classificado de acordo com os graus de diferenciação celular em bem diferenciado (grau I), moderadamente diferenciado (grau II), pouco diferenciado ou indiferenciado(grau III) (El-Naggar et al., 2017).
A extensão do acometimento pelo tumor é avaliada pelo sistema TNM, que considera a sua extensão local (T), o acometimento de linfonodos (N) e as metástases à distância (M), de acordo com os critérios definidos pela 8ª edição do Comitê Conjunto Americano sobre o Câncer, do inglês American Joint Comittee on Cancer (AJCC) (Amin
et al., 2017).
O tratamento de pacientes com CCEOF visa a cura com a máxima preservação de estruturas anatômicas e suas respectivas funções. No caso de tumores em estágio inicial, o tratamento fundamenta-se na ressecção cirúrgica ou radioterapia (RT) (Leemans et al., 2011; Mendenhall et al., 2011). Entretanto, a maioria dos pacientes apresenta ao diagnóstico o tumor em estágio avançado, e para eles é preconizada a terapêutica multimodal com cirurgia, RT, quimioterapia (QT) baseada em cisplatina (CDDP) (Mendenhall et al., 2011; Peddi
et al., 2015). Recentemente o anticorpo monoclonal cetuximabe associado à QT tem sido
administrado em pacientes com CCECP recorrente ou metastático (Vermorken et al., 2008; Haddad et al., 2018; Zhang et al., 2018). Apesar dos avanços terapêuticos, a sobrevivência de pacientes com CCEOF é de apenas 30% em cinco anos (Philouze et al., 2017).
Aspectos ambientais
Os principais fatores envolvidos com a origem do CCEOF são o tabagismo e o etilismo (Mendenhall et al., 2011; Szymańska et al., 2011). Os carcinógenos químicos presentes no tabaco e no álcool, como o benzopireno e o acetaldeído, induzem o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio, que resulta em danos oxidativos ao DNA de células epiteliais e no desenvolvimento do tumor (Ziech et al., 2011).
Outro fator de risco para o desenvolvimento do CCEOF é a infecção pelo papilomavírus humano (HPV) particularmente do tipo 16 (Dayyani et al., 2010; Elrefaey
et al., 2014; Krüger et al., 2014; Fossum et al., 2017; Lee et al., 2017; Nørregaard et al.,
2018). A inserção do DNA viral no DNA das células epiteliais da faringe determina o descontrole das proteínas supressoras tumorais p53 e retinoblastoma, tendo o tumor como consequência (Psyrri & Cohen, 2011). Além disso, o prognóstico dos pacientes com CCEOF com HPV positivo é melhor do que os CCEOF com HPV negativo (Fossum et al., 2017; Lee et al., 2017; Nørregaard et al., 2018). Entretanto, a prevalência do CCEOF associado ao HPV do tipo 16 no Brasil ainda é baixa, em particular naqueles atendidos em instituições públicas (López et al., 2014; Hauck et al., 2015; Matos et al., 2015; Betiol et al., 2016; Costa et al., 2016; Petito et al., 2017).
Aspectos genéticos
Múltiplos eventos genéticos e epigenéticos, como a perda ou a aquisição de funções de moléculas que regulam a angiogênese (Cortelazzi et al., 2015), o ciclo celular (Al-Kaabi et al., 2014; Chung et al., 2015), os sistemas de reparo de DNA (Dok et al., 2016; An et al., 2017) e a apoptose (Kwon et al., 2017; Qiao et al., 2017) também estão relacionados com a ocorrência e a agressividade do CCEOF.
Além disso, maior risco de CCEOF em parentes de primeiro grau e sua identificação em pacientes jovens reforça a existência de anormalidades genéticas herdadas na origem do tumor (Lothaire et al., 2006). Estudos recentes demonstraram que diferenças individuais geradas por polimorfismos de troca de base única, do inglês single nucleotide
polymorphisms (SNPs), em genes que atuam no metabolismo de carcinógenos (Troy et al.,
2013), no controle do ciclo celular (Chung et al., 2015; Agostini et al., 2017), no reparo de danos ao DNA (Mahimkar et al., 2012; Song et al., 2013; Nogueira et al., 2015; Stur et al., 2015; Costa et al., 2016; Lopes-Aguiar et al., 2017; Nogueira et al., 2018) e na indução da apoptose (Zhang et al., 2015; Agostini et al., 2017; Lu et al., 2017) indicam que a constituição genética pode predispor indivíduos ao CCECP, assim como pode influenciar no prognóstico dos pacientes.
Mecanismo de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos
O mecanismo de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos, do inglês nucleotide
excision repair (NER), merece destaque entre os mecanismos de reparo por ser considerado
versátil e flexível devido à sua capacidade de eliminar lesões estruturalmente independentes, como as determinadas por carcinógenos químicos, pela radiação e pela formação de adutos da CDDP no DNA (Rouillon & White, 2011; Marteijn et al., 2014).
A via NER envolve quatro etapas distintas (Figura 1). A etapa inicial é o reconhecimento do dano no DNA pela proteína xeroderma pigmentosum (XP) do grupo C (XPC). Na etapa seguinte ocorre a demarcação da lesão pelas helicases XP do grupo B (XPB) e XP do grupo D (XPD). A etapa de incisão e de remoção do fragmento danificado ocorre pelas endonucleases XP do grupo F (XPF), XP do grupo G (XPG) e excision repair
cross-complementation do grupo 1 (ERCC1). A síntese de uma nova fita de DNA utilizando como
molde a fita intacta é feita pela enzima DNA polimerase e constitui a última etapa da via NER (Rouillon & White, 2011; Marteijn et al., 2014).
Figura 1. Mecanismo de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER). (A) A via NER é ativada quando ocorre uma lesão no DNA. (B) O reconhecimento da lesão e o recrutamento da maquinaria de reparo para o sítio lesionado é feito principalmente pela proteína XPC. (C) A demarcação da lesão é feita pelas proteínas XPB e XPD. (D) A incisão e remoção da região são realizadas pelas endonucleases XPF, ERCC1 e XPG. (E) A enzima DNA polimerase sintetiza a nova fita de DNA utilizando como molde a fita intacta (Adaptado de Canevari & Rogatto, 2004)
O gene xeroderma pigmentosum complementation group C (XPC) tem 33.526 pares de bases, está localizado no cromossomo 3, na região p25.1 e codifica a proteína XPC com 940 aminoácidos (Geer et al., 2010). Considerando que tal proteína funciona como um sensor de danos e tem um papel fundamental na via NER (Wang et al., 2013), é biologicamente plausível que SNPs funcionais no gene XPC possam contribuir para a suscetibilidade a tumores (Zhu et al., 2014). Entre os 983 SNPs identificados na região codificadora do gene (Geer et al., 2010), os três mais estudados no processo da carcinogênese são o PAT inserção/deleção (rs77907221), o c.1496C>T (p.Ala499Val) (rs2228000) e o c.2815A>C (p.Lys939Gln) (rs2228001) (Wang et al., 2013).
Polimorfismo gênico de base única XPC c.2815A>C
O SNP c.2815A>C (p.Lys939Gln) (rs2228001), localizado no éxon 15 do gene
XPC, é caracterizado pela troca da base nitrogenada adenina (A) por citosina (C) na posição
2815 da região codificadora do gene, com consequente troca do aminoácido lisina (Lys) por glutamina (Gln) na região 939 da cadeia de aminoácidos da proteína (Geer et al., 2010) e capacidade individual variada para reparar danos no DNA (Vodicka et al., 2004; Cornetta
et al., 2006; Zhu et al., 2008; Wang et al., 2010). As frequências dos alelos selvagem (A) e
variante (C) foram de 54-83% e 16-45%, respectivamente; enquanto que os genótipos homozigoto selvagem (AA), heterozigoto (AC) e homozigoto variante (CC) foram identificados em 33-69%, 26-62% e 2-23% dos indivíduos saudáveis de diferentes populações étnicas, respectivamente (International HapMap 3 Consortium et al., 2010) (Anexo 1).
Níveis similares de expressão do gene XPC foram observados em leucócitos de indivíduos saudáveis com os distintos genótipos do SNP (Slyskova et al., 2012; Zhu et al., 2014). Capacidades similares de reparo de DNA foram observadas em fibroblastos humanos transfectados com os plasmídeos recombinantes pXPC-3(A) e pXPC3(C) após radiação ultravioleta (Khan et al., 2000). Maior capacidade de reparo de DNA após RT foi observada em linfócitos de indivíduos saudáveis com o genótipo XPC c.2815AC comparados àqueles com os genótipos XPC c.2815AA e CC (Cornetta et al., 2006). Menor capacidade de reparo de DNA foi observada em linfócitos de indivíduos saudáveis com os genótipos XPC c.2815AC e/ou CC após radiação gama (Vodicka et al., 2004), radiação gama e benzopireno (Zhu et al., 2008) e exposição a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (Wang et al., 2010) (Tabela 1). Desconhecemos estudos sobre a função do SNP em CCEOF e com danos no DNA induzidos por benzopireno associado ao acetaldeído e por RT combinada à CDDP.
Amostra Dano Principais resultados com
XPC c.2815A>C Referências Fibroblastos humanos transfectados
com os plasmídeos pXPC-3(A) e pXPC-3(C) Radiação ultravioleta Capacidades similares de reparo de DNA Khan et al., 2000 Linfócitos de indivíduos saudáveis
com os genótipos AA, AC e CC Radiação gama
O genótipo CC esteve associado a menor capacidade de reparo de DNA
Vodicka et al., 2004 Linfócitos de indivíduos saudáveis
com os genótipos AA, AC e CC Radiação ionizante
O genótipo AC esteve associado a maior capacidade de reparo de DNA
Cornetta et al., 2006 Linfócitos de indivíduos saudáveis
com os genótipos AA, AC e CC
Radiação gama e benzopireno
Os genótipos AC e CC estiveram associados
a menor capacidade de reparo de DNA Zhu et al., 2008 Linfócitos de indivíduos expostos a carcinógenos
com os genótipos AA, AC e CC
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
O genótipo CC esteve associado a menor
capacidade de reparo de DNA Wang et al., 2010 Leucócitos de indivíduos saudáveis
com os genótipos AA, AC e CC NA Níveis similares de expressão gênica Slyskova et al., 2012 Leucócitos de indivíduos saudáveis
com os genótipos AA, AC e CC NA Níveis similares de expressão gênica Zhu et al., 2014
O SNP XPC c.2815A>C foi alvo de inúmeros estudos de associação com o risco de ocorrência de vários tipos de câncer, como de pulmão (Lee et al., 2005; Zhu et al., 2014), próstata (Hirata et al., 2007), ovário (Zhao et al., 2018), mama (Yang et al., 2012; He et al., 2016; Romanowicz et al., 2017), bexiga (Gangwar et al., 2010a), cervical (Gangwar
et al., 2010b) e colorretal (Wu et al., 2011; Liu et al., 2012; Ahmad et al., 2013; Mucha et al.,
2018). O prognóstico de pacientes com câncer de pulmão (Zhu et al., 2010; Campayo et al., 2011; Wang et al., 2016), ovário (Kang et al., 2013), mama (Yang et al., 2012), bexiga (Gangwar et al., 2010a), osteossarcoma (Caronia et al., 2009) e esôfago (Yang et al., 2013) também foi influenciado pelo referido SNP.
Entretanto, o número de estudos que avaliou o SNP XPC c.2815A>C no risco de ocorrência de CCECP é reduzido. Entre eles, riscos similares de ocorrência do CCECP (An et al., 2007; Yadav et al., 2018), CCE de cavidade oral (Kietthubthew et al., 2006), lesão pré-maligna de cavidade oral (Wang et al., 2007), CCE de nasofaringe (Yang et al., 2008) e CCE de laringe (Abbasi et al., 2009; Sun et al., 2015) foram identificados em indivíduos de diferentes populações étnicas com os distintos genótipos do SNP (Tabela 2). Duas meta-análises demonstraram que o SNP também não favoreceu o desenvolvimento do CCECP (Francisco et al., 2008) e do câncer de CP (Zhang et al., 2014) (Tabela 3).
Além disso, estudos que associaram o SNP XPC c.2815A>C com os aspectos clínicopatológicos de pacientes com CCECP também são escassos. Frequências similares dos genótipos do SNP foram verificadas em pacientes com CCE de cavidade oral (Kietthubthew
et al., 2006), lesão pré-maligna de cavidade oral (Wang et al., 2007), CCE de laringe
(Sun et al., 2015) e CCECP (Yadav et al., 2018) estratificados por sexo, etnia, hábitos de tabagismo e etilismo e estágio do tumor (Tabela 2).
Até onde atinge o nosso conhecimento, somente três estudos foram conduzidos com o intuito de verificar o papel do SNP XPC c.2815A>C na toxicidade e/ou no prognóstico de pacientes com CCECP (Tabela 2). O primeiro foi realizado nos Estados Unidos e não identificou influência do SNP na sobrevida livre de doença de pacientes com CCEOF após tratamento com cirurgia e quimioradioterapia (Song et al., 2013). Os outros dois estudos foram desenvolvidos no Brasil (Stur et al., 2015; Lopes-Aguiar et al., 2017). Um deles demonstrou que os genótipos XPC c.2815AA e AC estiveram associados a menor recidiva local em 81 pacientes com CCEOF e CCE cavidade oral após tratamento com RT (Stur et al., 2015). O outro, conduzido pelo nosso grupo, verificou que o genótipo XPC c.2815AA foi associado com maior toxicidade ao tratamento com RT e CDDP em pacientes com CCECP,
mas não influenciou a sobrevida livre de eventos (SLE) ou a sobrevida global (SG) desses pacientes (Lopes-Aguiar et al., 2017).
Considerando que o papel dos distintos genótipos do SNP XPC c.2815A>C no risco de ocorrência do CCEOF, aspectos clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com CCEOF ainda é desconhecido, incerto ou controverso, foram definidos os objetivos do presente estudo.
Tumor População
Pacientes Controles
Principais resultados com
XPC c.2815A>C Referências N total AA N AC N CC N N total AA N AC N CC N CCE de
cavidade oral Tailândia 106 59 37 10 164 87 67 10
Não influenciou o risco de ocorrência e os
aspectos clínicopatológicos do tumor Kietthubthew et al., 2006 CCE de
cabeça e pescoço
Estados
Unidos 829 312 399 118 854 315 425 114 Não influenciou o risco de ocorrência do tumor An et al., 2007 Lesão pré-maligna
de cavidade oral
Estados
Unidos 128 48 58 22 279 103 128 48
Não influenciou o risco de ocorrência e os
aspectos clínicopatológicos do tumor Wang et al., 2007 Carcinoma de
nasofaringe China 153 66 75 12 168 74 72 22 Não influenciou o risco de ocorrência do tumor Yang et al., 2008 Câncer de laringe Alemanha 248 83 120 45 647 230 329 88 Não influenciou o risco de ocorrência do tumor Abbasi et al., 2009 CCE de orofaringe Estados
Unidos 658 242 337 79 NA
Não influenciou a sobrevida livre de doença após
tratamento com cirurgia e quimioradioterapia Song et al., 2013 CCE de cavidade
oral e orofaringe Brasil 81 69 12 NA
Os genótipos AA ou AC estiveram associados a menor risco de recidiva local após tratamento com radioterapia
Stur et al., 2015
Câncer de laringe China 271 111 123 37 271 125 117 29 Não influenciou o risco de ocorrência e os
aspectos clínicopatológicos do tumor Sun et al., 2015
CCE de
cabeça e pescoço Brasil 70 23 35 12 NA
O genótipo AA esteve associado a maior toxicidade após tratamento com radioterapia e cisplatina, mas não influenciou a sobrevida livre de evento e a sobrevida global
Lopes-Aguiar et al., 2017
CCE de
cabeça e pescoço Índia 166 70 74 22 166 74 65 27
Não influenciou o risco de ocorrência e os
aspectos clínicopatológicos do tumor Yadav et al., 2018 N: número de indivíduos; CCE: carcinoma de células escamosas; NA: não avaliado
Tabela 3. Meta-análises de associação entre o polimorfismo XPC c.2815A>C e o risco de câncer de cabeça e pescoço
Câncer População
Pacientes Controles
Principais resultados com
XPC c.2815A>C Referências N total AA N AC N CC N N total AA N AC N CC N CCE de cabeça e pescoço* Estados Unidosa Coreia do Sulb Tailândiac Japãod
588 238 264 86 798 344 361 93 Não influenciou o risco de
ocorrência da doença Francisco et al., 2008
Câncer de cabeça e pescoço** Tailândiae Suéciaf Estados Unidosg,k Chinah,i Alemanhaj
2218 840 1047 331 3400 1306 1618 476 Não influenciou o risco de
ocorrência da doença Zhang et al., 2014
N: número de indivíduos; CCE: carcinoma de células escamosas; *: meta-análise conduzida em pacientes com CCE de cabeça e pescoço (CP) e CCE de cavidade oral (CO); a: Shen et al., 2001; b: Yang et al., 2005; c: Kietthubthew et al., 2006; d: Sugimura et al., 2006; **: meta-análise conduzida em pacientes com CCECP, CCECO, carcinoma de nasofaringe, câncer de laringe e adenocarcinoma/CCE de esôfago; e: Kietthubthew et al., 2006; f: Ye et al., 2006; g: An et al., 2007; h: Guo et al., 2008;
i
OBJETIVOS
Verificar se os genótipos do SNP XPC c.2815A>C influenciam o risco de ocorrência do CCEOF;
Verificar se os genótipos do SNP XPC c.2815A>C influenciam os aspectos clínicos dos pacientes com CCEOF;
Verificar se os genótipos do SNP XPC c.2815A>C influenciam os aspectos tumorais do CCEOF;
Verificar se os genótipos do SNP XPC c.2815A>C influenciam a SLE e a SG dos pacientes com CCEOF;
Verificar se os genótipos do SNP XPC c.2815A>C influenciam a expressão do gene XPC em indivíduos saudáveis.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram avaliados 250 pacientes com CCEOF atendidos ao diagnóstico nos ambulatórios de Otorrinolaringologia e de Oncologia Clínica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), no período de junho de 1996 a abril de 2016. Também foram avaliados 250 controles (doadores de sangue) do Centro de Hematologia e Hemoterapia da UNICAMP, que foram pareados aos pacientes por sexo e cor da pele.
O tamanho amostral calculado para o estudo foi de 97 indivíduos, segundo as normas descritas por Beiguelman (1995). O cálculo foi baseado nas frequências dos genótipos do SNP XPC c.2815A>C em indivíduos saudáveis de diferentes populações étnicas (International HapMap 3 Consortium et al., 2010) (Anexo 1).
Aspectos clínicos
Os dados relativos à identificação, à idade, ao sexo, à cor da pele, aos hábitos de tabagismo e de etilismo foram coletados dos pacientes com CCEOF e dos controles por meio de questionário específico aplicado pelos pesquisadores responsáveis pelo estudo.
A lassi i a o dos indi duos em tabagistas e etilistas oi realizada de a ordo com o proposto por Freedman et al. (1996) e Huang et al. (2003), respectivamente. Foram considerados fumantes aqueles que relataram ter fumado 100 cigarros ou mais ao longo da vida; ex-fumantes aqueles que cessaram o hábito de fumar há pelo menos cinco anos e não fumantes os que fumaram menos de 100 cigarros ou que nunca possuíram tal hábito (Freedman et al., 1996). Foram considerados etilistas aqueles que ingeriram um ou mais drinques ao menos uma vez por semana de forma regular; ex-etilistas aqueles que cessaram o hábito de consumir bebidas alcoólicas há pelo menos cinco anos e abstêmios aqueles que ingeriram menos de 20 drinques em toda a vida ou que nunca possuíram tal hábito (Huang et al., 2003).
Aspectos tumorais
Os resultados dos exames necessários à determinação da localização, do grau de diferenciação, da pesquisa de HPV e do estágio do tumor foram obtidos dos prontuários dos pacientes.
O diagnóstico do CCEOF foi realizado pela avaliação dos cortes histológicos de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados por hematoxilina e eosina, processados e analisados no Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da UNICAMP. Cada tumor foi classificado de acordo com o grau de diferenciação celular em bem diferenciado, moderadamente diferenciado, pouco diferenciado ou indiferenciado, segundo os critérios definidos por El-Naggar et al. (2017).
A pesquisa de HPV foi investigada em fragmentos do tumor incluídos em parafina pela técnica de imuno-histoquímica automatizada para detecção da expressão da proteína 16 (p16) (Begum et al., 2003) no Departamento de Anatomia Patológica do Centro Internacional de Pesquisa do A.C. Camargo Cancer Center, pela equipe da Profa. Dra. Cláudia Malheiros Coutinho Camillo. Nos casos de expressão positiva para p16, foi investigada a presença do DNA do HPV pela técnica de hibridização in situ com sonda de largo espectro (Singhi & Westra, 2010) no Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da UNICAMP, pela equipe da Profa. Dra. Albina Messias de Almeida Milani Altemani.
O estágio do tumor foi identificado com base nos resultados obtidos do exame clínico, incluindo nasofibrolaringoscopia direta, tomografia computadorizada do pescoço, radiografia do tórax e ultrassonografia abdominal, de acordo com os critérios convencionais definidos pela 7ª edição do AJCC (Edge et al., 2010). Os exames de imagem foram realizados no Serviço de Radiologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP.
O tratamento dos pacientes com CCEOF foi baseado em ressecção cirúrgica do tumor, RT e QT (Mendenhall et al., 2011). De forma geral, a cirurgia foi realizada em pacientes com tumores localizados, enquanto que a RT concomitante com a QT com CDDP foi indicada para pacientes com tumores localmente avançados. A RT com dose de 70 Gy foi fracionada em 35 aplicações diárias de 2 Gy, cinco dias por semana, durante sete semanas. A CDDP foi administrada por via intravenosa, na dose de 80-100 mg/m2 e nos dias 1, 22 e 43. Carboplatina com dose calculada por área sobre a curva de 5 (AUC5) foi administrada aos pacientes que apresentaram toxicidade à CDDP. Os pacientes com resposta parcial ao tratamento e com boa condição clínica foram selecionados para a ressecção cirúrgica do tumor. QT paliativa com metotrexato intravenoso foi indicada para pacientes com doença estável ou progressiva ao tratamento inicial ou com recidiva inoperável do tumor (Nogueira et al., 2018).
Avaliação dos genótipos Extração do DNA
O DNA genômico foi obtido de leucócitos do sangue periférico dos 250 pacientes com CCEOF e dos 250 controles inseridos no estudo pela técnica de extração de DNA com proteinase K (Invitrogen™, Estados Unidos) e cloreto de lítio (LiCl) (Woodhead et al., 1986).
As amostras foram lisadas em 1 mL de tampão de lise (320 mM sacarose; 10 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM cloreto de magnésio e 1% Triton X-100). Posteriormente, o concentrado de células obtido foi ressuspendido em 400 µL de tampão de digestão (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 10 mM EDTA; 10 mM cloreto de sódio e 0,5% dodecil sulfato de sódio) e 20 µL proteinase K (20 mg/mL). Após 2 horas de incubação a 55°C, foram adicionados 200 µL de LiCl (7,5 M) às amostras e estas foram novamente incubadas a -20°C por 4 horas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos e ao sobrenadante foi adicionado 1 mL de etanol absoluto gelado. O DNA precipitado foi centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos, seguido de duas lavagens com etanol 70% e ressuspendido em tampão TE (2 M tris base e 0,2 M EDTA pH 8,0), sendo armazenado a -20°C até o próximo passo. O DNA foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo para verificação de sua integridade. A concentração e a pureza das amostras foram determinadas pelo espectrofotômetro NanoDrop
ND-1000 (Thermo Fisher Scientific™, Estados Unidos).
Genotipagem
A genotipagem foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real utilizando o ensaio TaqMan™ (Thermo Fisher Scientific™, Estados Unidos) (número do ensaio: C_234284_1_; número do catálogo: 4351379).
A região de interesse foi amplificada com a utilização de cerca de 50 ng de DNA, 0,5 μL do ensaio para genotipagem TaqMan™, 5 μL do reagente TaqMan™ Universal Master
Mix (Applied Biosystems™, Estados Unidos) e água estéril. As condições de amplificação
consistiram na ativação inicial da Taq DNA polimerase a 95°C por 10 minutos, seguidos de 45 ciclos de incubação a 92°C por 15 segundos e a 60°C por 1 minuto. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações de genotipagem. Amostras aleatórias (10%) foram novamente genotipadas com 100% de concordância entre as análises. Os resultados da genotipagem foram visualizados por meio do programa TaqMan™ Genotyper (Applied
Figura 2. Distribuições dos genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C em pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe e em controles analisados pelo programa
TaqMan™ Genotyper (Applied Biosystems™, Estados Unidos) após a reação em cadeia da
polimerase em tempo real. O alelo 1 (eixo X) e o alelo 2 (eixo Y) representam os alelos selvagem e variante do referido polimorfismo. Os círculos azuis, verdes e vermelhos representam, respectivamente, os genótipos homozigoto selvagem (AA), heterozigoto (AC) e homozigoto variante (CC). O quadrado preto representa o controle negativo da reação
Avaliação da expressão gênica Extração do RNA
O RNA total foi obtido das amostras de leucócitos do sangue periférico de 43 controles inseridos no estudo (15 com o genótipo AA, 12 com o genótipo AC e 16 com o genótipo CC do SNP XPC c.2815A>C) pela técnica de extração de RNA com Trizol™ (Invitrogen™, Estados Unidos) e clorofórmio.
As amostras foram lisadas por meio do reagente Trizol™ e a seguir, foram adicionados 200 µL de clorofórmio. As amostras foram homogeneizadas e centrifugadas a 13000 rpm por 15 minutos a 4°C. O RNA total presente na fase aquosa foi precipitado com 500 µL de isopropanol gelado, centrifugado novamente e submetido a lavagem com etanol 75%. Posteriormente, o RNA foi ressuspendido em água estéril com dietilpirocarbonato (Sigma-Aldrich®, Estados Unidos) e armazenado a -80°C até o próximo passo. O RNA foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo para verificação de sua integridade. A concentração e a pureza das amostras foram determinadas pelo espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific™, Estados Unidos).
Síntese do cDNA
As amostras de RNAs obtidas anteriormente foram tratadas com a enzima DNAse (New England Biolabs®, Estados Unidos) para impedir a contaminação por DNA. A seguir, foram submetidas à síntese de cDNA com o conjunto de reagentes do kit RevertAid H Minus
Reverse Transcriptase (Thermo Scientific™, Estados Unidos).
O cDNA foi obtido a partir de 1 μg de RNA, utilizando-se1 µL de oligo(dT) (50 μM), 2 µL de dNTPs (10 mM), 4 µL de solução tampão (5x), 1 µL de inibidor de RNAse e 1 µL da enzima transcriptase reversa (200U) em todas as amostras. A mistura foi incubada por 60 minutos a 42°C e por 5 minutos a 70°C em termociclador (Eppendorf®, Alemanha). O cDNA obtido foi armazenado a -80°C até o próximo passo.
Quantificação
A determinação da expressão do gene XPC foi realizada em triplicata por meio da PCR quantitativa (qPCR), utilizando o corante de fluorescência SYBR Green (Thermo Fisher Scientific™, Estados Unidos). Vale comentar que o gene beta-actin (BAC) foi utilizado como controle endógeno em todas as reações.
Os iniciadores para a amplificação dos genes XPC e BAC foram desenhados por meio dos programas IDT SciTools RealTime qPCR Assay e OligoAnalyzer 3.1 e, posteriormente, analisados nos programas BLAST e UCSC in silico PCR para verificar as suas especificidades. Foram realizadas qPCRs com os iniciadores direto e reverso nas concentrações de 100, 150 e 300 nM para identificar a concentração ideal dos mesmos para cada um dos genes a ser avaliado.
As sequências e a concentração ideal de cada iniciador obtida durante a fase exponencial das curvas de fluorescência e as eficiências das curvas de fluorescência estão apresentadas na Tabela 4.
A quantificação da expressão dos genes foi realizada com 300 ng de cDNA de cada amostra, 6 µL do reagente SYBR Green PCR Master Mix® e com os iniciadores específicos. As condições de quantificação consistiram de incubação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. Todas as reações foram realizadas em triplicata e controles negativos também foram utilizados. Os resultados da qPCR para cada gene foram obtidos pelo equipamento StepOnePlus® (Applied Biosystems®, Estados Unidos), em forma de gráficos de fluorescência versus número de ciclos da qPCR. A partir das curvas de fluorescência, uma reta foi gerada pelo referido programa que calculou o coeficiente de correlação da reta. A qPCR foi considerada confiável e reprodutiva quando as amplificações apresentaram 95-100% de eficiência de amplificação, definidas como a identificação do coeficiente de inclinação da reta entre -3,1 e 3,6 e a determinação das curvas maior que 0,95 a cada ciclo em duplicata.
A expressão do gene XPC foi normalizada considerando a expressão do gene BAC e calculada pela aplicação da fórmula aritmética 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001).
Informamos que os dados relativos aos aspectos clínicos e tumorais, assim como as amostras de DNA, RNA e cDNA dos 250 pacientes e dos 250 controles, já faziam parte do biorrepositório do Laboratório de Genética do Câncer, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP, sob a responsabilidade da Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima.
Tabela 4. Símbolos dos genes, sequência dos iniciadores, concentração ideal de cada iniciador e eficiência das curvas de fluorescência de cada um dos referidos genes
Gene Iniciadores Concentração ideal dos iniciadores Eficiência de amplificação (%) Coeficiente de inclinação da reta Coeficiente de determinação
BAC Direto: 5’- AGGCCAACCGCGAGAAG -3’
Indireto: 5’- ACAGCCTGGATAGCAACGTACA -3’ 150 nM 100 -3,30 0,99
XPC Direto: 5’- GGCCCAAGAAGACCAAAAGG -3’
Indireto: 5’- AGTGGGCGCTCAGCTCACA -3’ 300 nM 99 -3,33 0,99
Análise estatística
O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e as diferenças entre os aspectos clínicos e tumorais foram calculadas pelos testes da probabilidade exata de Fisher ou qui-quadrado (χ2).
As determinações dos riscos de ocorrência do CCEOF foram calculadas pelo teste de regressão logística múltipla, com o intuito de obter os valores das razões das chances, do inglês odds ratios (ORs), e do intervalo de confiança (IC) de 95%. Os resultados significativos foram validados usando o teste bootstrap com 1.000 reamostragens (Efron, 1992).
A SLE foi definida como o intervalo de tempo entre a data do diagnóstico e a data da primeira recidiva, da progressão, da morte pelos efeitos do tumor ou da perda de seguimento. A SG foi definida como o intervalo de tempo entre a data do diagnóstico e a data da morte por qualquer causa ou da perda de seguimento.
Os tempos de SLE e SG foram estimados pelas curvas de Kaplan-Meier e comparados pelo teste de log-rank. Os fatores prognósticos foram identificados pelo teste de regressão univariada de Cox, com os valores dos riscos relativos de eventos, do inglês hazard
ratios (HRs), e respectivos IC de 95%. Variáveis com valor de P≤ 0,05 foram avaliadas pela
análise multivariada de Cox. Os resultados obtidos na análise multivariada foram validados usando o teste bootstrap com 1.000 reamostragens (Efron, 1992).
As expressões gênicas foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney.
Os valores de P≤ 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises foram realizadas pelo programa estatístico SPSS 21.0 (SPSS Incorporation, Estados Unidos).
Aspectos éticos
O referido estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FCM da UNICAMP (CAAE: 48904215.8.0000.5404 e número do parecer: 1.832.468) (Anexo 2).
RESULTADOS
Aspectos clínicosAs distribuições individualizadas dos 250 pacientes com CCEOF e dos 250 controles estratificados por aspectos clínicopatológicos e genótipos do SNP XPC c.2815A>C estão apresentadas no Anexo 3 e Anexo 4.
As frequências das distribuições dos 250 pacientes com CCEOF e dos 250 controles estratificados por aspectos clínicos estão apresentadas na Tabela 5.
A idade dos pacientes variou entre 31 e 85 anos (mediana: 56 anos). Observamos que a maior parte dos pacientes foi do sexo masculino, com a cor da pele branca e tabagistas e etilistas.
A idade dos controles variou entre 18 e 66 anos (mediana: 44). Observamos que os controles foram, em sua maioria, do sexo masculino e da cor da pele branca. Cerca da maior parte dos controles foi constituída por indivíduos não tabagistas e não etilistas.
Os pacientes foram mais velhos e apresentaram mais frequentemente os hábitos do uso de tabaco e de bebidas alcoólicas do que os controles. Essas diferenças foram corrigidas em todas as comparações de frequências dos genótipos em pacientes e controles por análise estatística pertinente.
Aspectos tumorais
As distribuições individualizadas dos 250 pacientes com CCEOF estratificados por aspectos biológicos do tumor e genótipos do SNP XPC c.2815A>C estão apresentadas no Anexo 5.
As frequências das distribuições dos 250 pacientes com CCEOF estratificados por aspectos tumorais estão apresentadas na Tabela 6.
Cerca da metade do número de pacientes apresentou tumor na região da parede anterior (base de língua e valécula) da OF e a maioria deles apresentou tumor moderadamente diferenciado (Figura 3), HPV negativo, tumor localmente avançado (T3 ou T4) e tumor avançado (estágios III ou IV). Cerca de metade da casuística apresentou metástases cervicais volumosas (N2 ou N3). Metástases distantes foram incomuns ao diagnóstico.
Tabela 5. Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe e dos 250 controles por aspectos clínicos
Aspectos Pacientes N (%) Controles N (%) P valor Idade mediana ≤ 56 anos 130 (52,0) 227 (90,8) <0,001 > 56 anos 120 (48,0) 23 (9,2) Sexo Masculino 227 (90,8) 227 (90,8) 1,00 Feminino 23 (9,2) 23 (9,2) Tabagismo* Sim 223 (89,2) 44 (19,8) <0,001 Ex 15 (6,0) 21 (9,5) Não 12 (4,8) 157 (70,7) Etilismo* Sim 194 (77,6) 113 (62,8) <0,001 Ex 34 (13,6) 8 (4,4) Não 22 (8,8) 59 (32,8) Cor da pele Branca 200 (80,0) 200 (80,0) 1,00 Não Branca 50 (20,0) 50 (20,0)
N: número de indivíduos; *: os números de controles avaliados diferem do número total, pois não foi possível obter informações consistentes de alguns dos casos inseridos no estudo
carcinoma de células escamosas de orofaringe por aspectos tumorais Aspectos Pacientes N (%) Localização do tumor* Parede anterior 116 (46,8) Parede lateral 83 (33,5) Parede posterior 2 (0,80) Parede superior 47 (18,9) Grau de diferenciação* Bem diferenciado 13 (6,2) Moderadamente diferenciado 162 (76,8) Pouco diferenciado 33 (15,6) Indiferenciado 3 (1,4)
Papilomavírus humano tipo 16*
Positivo 1 (1,2) Negativo 83 (98,8) Extensão local* T1 17 (6,9) T2 43 (17,4) T3 73 (29,6) T4 114 (46,1) Metástase cervical* N0 71 (28,7) N1 42 (17,1) N2 91 (36,8) N3 43 (17,4) Metástase à distância* M0 243 (98,4) M1 4 (1,6) Estágio do tumor* I 9 (3,6) II 12 (4,9) III 44 (17,8) IV 182 (73,7)
N: número de indivíduos; *: os números de pacientes avaliados diferem do número total, pois não foi possível obter informações consistentes de alguns dos casos inseridos no estudo
Figura 3. Secção de carcinoma de células escamosas de orofaringe moderadamente diferenciado incluído em parafina e corado por hematoxilina e eosina (aumento de 10x)
Avaliação do risco de ocorrência do tumor
Os pacientes com CCEOF estiveram em equilíbrio de HW (χ2= 0,19, P= 0,66) e os controles em desequilíbrio de HW (χ2= 4,62, P= 0,03), considerando o grau de liberdade 1, no lócus do SNP XPC c.2815A>C.
As frequências das distribuições dos 250 pacientes com CCEOF e dos 250 controles estratificados por genótipos do SNP XPC c.2815A>C estão apresentadas na Tabela 7.
Observamos que a frequência do genótipo XPC c.2815AA foi maior em pacientes com CCEOF do que em controles (42,4% versus 30,8%, P= 0,02, Pbootstrap= 0,01). Indivíduos
portadores deste genótipo tiveram 2,10 vezes mais chances de desenvolver o CCEOF do que indivíduos com os genótipos XPC c.2815AC ou CC.
Avaliação dos aspectos clínicos e tumorais
As frequências das distribuições dos 250 pacientes com CCEOF estratificados por aspectos clínicos, biológicos do tumor e genótipos do SNP XPC c.2815A>C estão apresentadas na Tabela 8.
Observamos que os genótipos XPC c.2815AA ou AC foram mais comuns em pacientes com metástase cervical volumosa (N2 ou N3) do que nos demais (N0 ou N1) (92,6% versus 84,1%, P= 0,04, Pbootstrap= 0,03).
Frequências similares dos genótipos do SNP XPC c.2815A>C foram observadas em pacientes estratificados por idade, sexo, hábitos do tabaco e álcool, localização do tumor, grau de diferenciação do tumor, extensão local do tumor, metástases distantes e estágio do tumor.
Tabela 7. Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe e dos 250 controles por genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C
Genótipos Pacientes N (%) Controles N (%) OR (IC 95%) * P valor XPC c.2815A>C AA 106 (42,4) 77 (30,8) 1,34 (0,47-3,82) 0,58 AC 116 (46,4) 138 (55,2) 0,61 (0,23-1,61) 0,32 CC 28 (11,2) 35 (14,0) Referência AA+AC 222 (88,8) 215 (86,0) 1,23 (0,47-3,18) 0,66 CC 28 (11,2) 35 (14,0) Referência AA 106 (42,4) 77 (30,8) 2,10 (1,10-4,01) 0,02 AC+CC 144 (57,6) 173 (69,2) Referência
N: número de indivíduos; OR: razões das chances; IC: intervalo de confiança;
*
Tabela 8. Frequências das distribuições dos 250 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe por aspectos clínicos, biológicos do tumor e genótipos do polimorfismo XPC c.2815A>C
Aspectos AA N (%) AC N (%) CC N (%) P valor AA+AC N (%) CC N (%) P valor AA N (%) AC+CC N (%) P valor Idade mediana ≤ 56 anos 53 (40,8) 61 (46,9) 16 (12,3) 0,78 114 (87,7) 16 (12,3) 0,68 53 (40,8) 67 (55,8) 0,61 > 56 anos 53 (44,2) 55 (45,8) 12 (10,0) 108 (90,0) 12 (10,0) 53 (44,2) 77 (59,2) Sexo Masculino 95 (41,9) 105 (46,2) 27 (11,9) 0,53 200 (88,1) 27 (11,9) 0,48 95 (41,9) 132 (58,1) 0,66 Feminino 11 (47,8) 11 (47,8) 1 (4,4) 22 (95,6) 1 (4,4) 11 (47,8) 12 (52,2) Tabagismo Sim + Ex 101 (42,4) 111 (46,7) 26 (10,9) 0,81 212 (89,1) 26 (10,9) 0,63 101 (42,4) 137 (57,6) 1,00 Não 5 (41,7) 5 (41,7) 2 (16,6) 10 (83,4) 2 (16,6) 5 (41,7) 7 (58,3) Etilismo Sim + Ex 99 (43,4) 102 (44,8) 27 (11,8) 0,20 201 (88,2) 27 (11,8) 0,48 99 (43,4) 129 (56,6) 0,36 Não 7 (31,8) 14 (63,7) 1 (4,5) 21 (95,5) 1 (4,5) 7 (31,8) 15 (68,2) Localização do tumor* Parede anterior 43 (37,1) 58 (50,0) 15 (12,9) 0,27 101 (87,1) 15 (12,9) 0,54 43 (37,1) 73 (62,9) 0,12 Outras 62 (47,0) 57 (43,2) 13 (9,8) 119 (90,2) 13 (9,8) 62 (47,0) 70 (53,0) Grau de diferenciação* Bem + Moderadamente 75 (42,9) 76 (43,4) 24 (13,7) 0,66 151 (86,3) 24 (13,7) 0,58 75 (42,9) 100 (57,1) 0,71 Pouco + Indiferenciado 17 (47,2) 16 (44,5) 3 (8,3) 33 (91,7) 3 (8,3) 17 (47,2) 19 (52,8)
Extensão local* T1 + T2 26 (43,3) 28 (46,7) 6 (10,0) 0,92 54 (90,0) 6 (10,0) 0,81 26 (43,3) 34 (56,7) 0,88 T3 + T4 78 (41,7) 87 (46,5) 22 (11,8) 165 (88,2) 22 (11,8) 78 (41,7) 109 (58,3) Metástase cervical* N0 + N1 42 (37,2) 53 (46,9) 18 (15,9) 0,07 95 (84,1) 18 (15,9) 0,04 42 (37,2) 71 (62,8) 0,15 N2 + N3 62 (46,3) 62 (46,3) 10 (7,4) 124 (92,6) 10 (7,4) 62 (46,3) 72 (53,7) Metástase à distância* M0 102 (42,0) 114 (46,9) 27 (11,1) 0,56 216 (88,9) 27 (11,1) 0,38 102 (42,0) 141 (58,0) 1,00 M1 2 (50,0) 1 (25,0) 1 (25,0) 3 (75,0) 1 (25,0) 2 (50,0) 2 (50,0) Estágio do tumor* I + II 11 (52,4) 9 (42,8) 1 (4,8) 0,46 20 (95,2) 1 (4,8) 0,48 11 (52,4) 10 (47,6) 0,36 III + IV 93 (41,2) 106 (46,9) 27 (11,9) 199 (88,1) 27 (11,9) 93 (41,2) 133 (58,8)
N: número de indivíduos; *: os números de pacientes avaliados diferem do número total, pois não foi possível obter informações consistentes de alguns dos casos inseridos no estudo
Avaliação da sobrevida dos pacientes
A média de tempo de seguimento dos 239 pacientes com CCEOF foi de 43 meses (variação: 3-173 meses). Os dados clínicos de 11 pacientes foram inconsistentes e, portanto, não foram considerados nas análises de sobrevida.
As taxas de SLE e de SG em 60 meses dos pacientes analisados foram de 43,1% e 43,8%, respectivamente. Até a data da análise (setembro 2017), 65 pacientes estavam vivos sem doença e 25 estavam vivos com a doença, 112 pacientes foram a óbito devido às causas relacionadas à doença e 37 por outras causas.
Na análise de Kaplan-Meier, observamos que aos 60 meses de acompanhamento clínico, a SLE e a SG foram menores em pacientes com tumores localizados na parede anterior da OF (36,6% versus 49,9%, P= 0,03; 32,1% versus 51,9%, P= 0,01), tumores T3 ou T4 (40,6% versus 50,9%, P= 0,05; 35,9% versus 63,5%, P= 0,004), linfonodos N2 ou N3 (30,0% versus 58,3%, P< 0,001; 32,3% versus 54,3%, P= 0,002), metástase à distância (M1) (0,0% versus 43,5%, P= 0,003; 0,0% versus 43,0%, P= 0,001) e aqueles tratados apenas com quimioradioterapia (36,2% versus 62,7%, P< 0,001; 31,1% versus 70,8%, P< 0,001), respectivamente (Figura 4).
Na análise univariada de Cox, observamos que as diferenças entre os grupos permaneceram as mesmas do teste de log-rank. Na análise multivariada de Cox (ajustada por localização do tumor, extensão local, metástase cervical, metástase à distância e tipo de tratamento), notamos que pacientes com CCEOF com linfonodos N2 ou N3, metástase à distância (M1) e tratados apenas com quimioradioterapia tiveram riscos 2,12; 3,38 e 2,09 vezes maiores de apresentar progressão, recidiva ou evoluir a óbito devido à doença, respectivamente. Já os pacientes com CCEOF com tumores T3 ou T4, linfonodos N2 ou N3, metástase à distância (M1) e tratados apenas com quimioradioterapia tiveram riscos 1,55; 1,56; 4,15 e 2,10 vezes maiores de evoluir para o óbito, respectivamente. Observamos que a idade, o sexo, o uso do tabaco e bebidas alcoólicas, o grau de diferenciação e o estágio do tumor, bem como os distintos genótipos do SNP XPC c.2815A>C não influenciaram a SLE e a SG dos pacientes com CCEOF (Tabela 9). Os resultados obtidos na análise multivariada foram confirmados pelo teste bootstrap.
Figura 4. Curvas de probabilidades de sobrevida livre de eventos e sobrevida global dos 239 pacientes com carcinoma de células escamosas de orofaringe por (A) (F) localização do tumor, (B) (G) extensão local, (C) (H) metástase cervical, (D) (I) metástase à distância e (E) (J) tipo de tratamento
