UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ALEXANDRE ANDERSON DE SOUSA MUNHOZ SOARES
MODIFICAÇÕES DAS CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS E FENOTÍPICAS DA LIPOPROTEÍNA DE ALTA DENSIDADE (HDL) NA FASE AGUDA DO INFARTO DO
MIOCÁRDIO
FUNCTIONAL AND FENOTIPIC CHARACTERISTICS MODIFICATIONS IN HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN (HDL) DURING ACUTE PHASE OF MYOCARDIAL
INFARCTION
CAMPINAS 2018
MODIFICAÇÕES DAS CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS E FENOTÍPICAS DA LIPOPROTEÍNA DE ALTA DENSIDADE (HDL) NA FASE AGUDA DO INFARTO DO
MIOCÁRDIO
FUNCTIONAL AND FENOTIPIC CHARACTERISTICS MODIFICATIONS IN HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN (HDL) DURING ACUTE PHASE OF MYOCARDIAL
INFARCTION
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas, na área de Pesquisa Clínica.
Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of State
University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for PhD degree in Medical Sciences, in the area of Clinical Research.
ORIENTADOR: PROFESSOR DOUTOR ANDREI CARVALHO SPOSITO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO ALEXANDRE ANDERSON DE SOUSA MUNHOZ SOARES, E ORIENTADO PELO PROF. DR. ANDREI CARVALHO SPOSITO.
CAMPINAS 2018
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4716-9543
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Functional and phenotypic characteristics modifications in high- density lipoprotein (HDL) during acute phase of myocardial infarction
Palavras-chave em inglês:
Myocardial infarction Lipoproteins, HDL
Lipid metabolism Acute phase reaction
Myocardial reperfusion injury Magnetic resonance imaging
Área de concentração: Pesquisa Clínica Titulação: Doutor em Ciências Médicas Banca examinadora:
Andrei Carvalho Sposito [Orientador] Helena Coutinho Franco de Oliveira José Roberto Matos Souza
Adriana Bertolami Manfredi Antonio Gabriele Laurinavicius Data de defesa: 22-08-2018
Programa de Pós-Graduação: Ciências Médica
Soares, Alexandre Anderson de Sousa Munhoz, 1988-
So11m Modificações das características funcionais e fenotípicas da lipoproteína de alta densidade (HDL) na fase aguda do infarto do miocárdio / Alexandre Anderson de Sousa Munhoz Soares. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Andrei Carvalho Sposito.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Infarto do miocárdio. 2. Lipoproteínas HDL. 3. Metabolismo dos lipídeos. 4. Reação de fase aguda. 5. Traumatismo por reperfusão. 6. Imagem por
ressonância magnética. I. Sposito, Andrei Carvalho, 1967-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
ORIENTADOR: ANDREI CARVALHO SPOSITO
MEMBROS:
1. PROF. DR. ANDREI CARVALHO SPOSITO
2. PROF. DR. ANTONIO GABRIELE LAURINAVICIUS
3. PROF. DR. ADRIANA BERTOLAMI MANFREDI
4. PROF. DR. HELENA COUTINHO FRANCO DE OLIVEIRA
5. PROF. DR. JOSÉ ROBERTO MATOS SOUZA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica.
das maiores causas de mortalidade global. A injúria miocárdica após reperfusão é responsável por aproximadamente 50% da massa infartada. A lipoproteína de alta densidade (HDL) é candidata potencial para atenuar lesão de isquemia/reperfusão (I/R) por meio de diversas vias de sinalização. Entretanto, durante o IM, a captura de moléculas oxidadas e pró-inflamatórias gera mudanças fenotípicas e funcionais profundas na HDL. Múltiplos aspectos e implicações da relação recíproca entre HDL e IM necessitam de investigação. O primeiro capítulo da Tese objetiva investigar se na fase agudo do IM, a transferência de lípides para HDL de outras lipoproteínas e células é alterada. No segundo, a presença de interação entre HDL-C e massa infartada no IM com supradesnivelamento do segmento-ST (IMCSST), além da necessidade de reperfusão coronária para essa interação, foram investigas. Depois, verificou-se se o efeito cardioprotetor é diferente entre HDL de paciente infartados e voluntários saudáveis.
MÉTODOS: Primeiro, as seguintes medidas relacionadas à HDL foram determinadas na admissão (D1) e no quinto dia (D5) em 41 pacientes pós-IMCSST: proteína C-reativa (PCR), atividade de CETP e PLTP, composição da HDL, efluxo de colesterol de macrófagos J774, e transferência de colesterol livre e esterificado, triglicérides e fosfolípides de nanoemulsão doadora para HDL. No segundo capítulo, HDL-C foi medido no D1 e a massa infartada foi quantificada por ressonância magnética cardíaca (n=94) e pelo pico de CKMB (n=393). Em modelo de coração de rato ex-vivo, comparou-se área infartada e a dP/dt máxima após reperfusão coronária com HDL de pacientes infartados e voluntários saudáveis.
RESULTADOS: Do D1 para o D5, a atividade de CETP diminuiu em 25%, mas a atividade de PLTP não mudou. O conteúdo de colesterol éster (-23%) e fosfolípides (-9,5%) na HDL reduziu. A transferência de triglicérides (-36,5%) e colesterol éster (-14,7%) para HDL das nanoemulsões diminuiu, assim como o efluxo celular de colesterol (-8,5%) (p=0,04). A redução do efluxo foi mais pronunciada nos pacientes acima do p75 de PCR. Em geral, HDL-C acima da mediana (35 mg/dL) se associou com maiores níveis de CKMB [255(145-415) vs. 136(84-287)UI/L; p=0,02], maior massa infartada [17(9-21) vs. 10(6-14)g; p<0,01] e menor fração de ejeção [51(43-59)vs. 47(34-53);p=0,02] do que sua contraparte. Em restricted cubic spline e regressão linear multivariada, o HDL-C foi diretamente associado com o pico de CKMB (p<0,01) e massa infartada (p<0,01) apenas nos pacientes reperfundidos até 4 horas. Reperfusão com HDL saudável, mas não HDL de pacientes infartados, reduziu a massa infartada (p<0,01) e aumentou dP/dt máxima (p=0,02) em modelo animal.
CONCLUSÕES: Após IM, uma redução simultânea da transferência de lípides e da capacidade da HDL em promover efluxo de colesterol de células ocorre. Nos pacientes infartados submetidos a reperfusão coronária precoce, níveis de HDL-C na admissão estão diretamente associados com tamanho do IM. Contrariamente à HDL saudável, a reperfusão com HDL de pacientes infartados não reduz área de IM em modelo animal ex-vivo. O sistema HDL gerado após IM é disfuncional impedindo suas potenciais ações benéficas na reperfusão.
PALAVRAS-CHAVE: INFARTO DO MIOCÁRDIO; LIPOPROTEÍNAS HDL;
METABOLISMO DOS LIPÍDEOS; REAÇÃO DE FASE AGUDA;
TRAUMATISMO POR REPERFUSÃO MIOCÁRDICA; IMAGEM POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA; CREATINA QUINASE FORMA MB
leading cause of death worldwide. Myocardial injury following coronary reperfusion is responsible for about 50% of the infarcted mass. High-density lipoproteins (HDL) is a potential candidate for mitigating ischemia/reperfusion (I/R) injury via a broad spectrum of signaling pathways. Nevertheless, during MI, the capture of oxidized and proinflammatory molecules generate large phenotypic and functional changes in HDL. Multiple aspects and implications of the reciprocal relationship between HDL and MI need further investigation. The first chapter of the Thesis was aimed to investigate whether in acute phase of MI the transfer of lipids to HDL from other lipoproteins and cells are altered. In the second chapter, the presence of interaction between HDL-C and MI mass in STEMI and the requirement of coronary reperfusion to this interaction was investigated. Further, it was verified if cardioprotective effect differs between HDL obtained from MI patients or healthy volunteers.
METHODS: In the first chapter, the following HDL-related measures were determined upon admission (D1) and on the fifth day (D5) in 41 patients after STEMI: C-reactive protein, CETP and PLTP activity, HDL composition, efflux of cholesterol from J774 macrophages to HDL, and transfer of unesterified and esterified cholesterol, triglycerides and phospholipids from a donor nanoemulsion to HDL. In the second chapter, HDL-C was measured in D1 and MI mass was quantified by cardiac magnetic resonance (n=94) and peak CKMB (n=393). In an ex-vivo rat heart model, it wa compared MI area and dP/dt max after coronary reperfusion with HDL from MI patients or healthy volunteers.
RESULTS: From D1 to D5, the activity of CETP decreased by 25%, but PLTP activity remained unchanged. Esterified cholesterol (−23%) and phospholipid (−9.5%) contents of HDL decreased. Transfer of triglycerides (−36.5%) and esterified cholesterol (−14.7%) to HDL from nanoemulsions was reduced, but other lipids transfers were unchanged. Cholesterol efflux to HDL was also diminished by 8.5% (p=0.04) on D5 compared to D1. It was more pronounced in patients above the 75th percentile of C-reactive protein. In general, HDL-C above median (35mg/dL) was associated with higher peak CKMB [255(145-415) vs. 136(84-287)UI/L; p=0.02], higher MI mass [17(9-21) vs. 10(6-14)g; p<0.01] and lower left ventricular ejection fraction [51(43-59)vs. 47(34-53);p=0.02], than their counterparts. In restricted cubic spline and multivariate linear regression, HDL-C was directly associated with peak CKMB (p<0.01) and MI mass (p<0.01) only in reperfused patients with time to reperfusion <4h. Reperfusion with healthy HDL, but not from MI patients, reduced MI mass (p<0.01) and improved dP/dt max (p=0.02) in animal model.
CONCLUSIONS: After an MI, a simultaneous decrease in lipid transfer to HDL and in the capacity of HDL to efflux cholesterol from cells occurs. In MI patients submitted to early coronary reperfusion, HDL-C levels at admission are directly associated with MI size. In contrast to healthy HDL, reperfusion with HDL from MI patients do not reduce MI area in ex vivo animal model. Thus, the HDL system generated after a MI is dysfunction impairing its potential benefic functions during reperfusion.
KEYWORDS: MYOCARDIAL INFARCTION; LIPOPROTEINS, HDL; LIPID METABOLISM; ACUTE PHASE REACTION; MYOCARDIAL REPERFUSION INJURY; MAGNETIC RESONANCE IMAGING; CREATINE KINASE, MB FORM
A Deus que antes de tudo propiciou a nossa existência e todas as nossas vivências
Ao amor da minha vida Lívia Munhoz Soares que sempre me apoiou plenamente com seu amor e me inspira com suas conquistas, caminhando juntos
A meus pais Telma e Edson que proporcionaram todo o amor e meios para que pudesse chegar até aqui
Ao meu irmão André com seu amor e companheirismo incondicional
Agradeço, especialmente, ao meu orientador Prof. Andrei Sposito, um exemplo ímpar de orientador e professor, que inspira a todos que tem a honra de receber seus ensinamentos, os quais foram fundamentais tanto em minha carreira como médico quanto como pesquisador.
Agradeço ao Prof. Wladimir Magalhães de Freitas e Prof. José Carlos Quinaglia e Silva que me incentivaram e proporcionaram o desenvolvimento, juntamente com o Prof. Andrei Sposito, das Coortes GEROS e Brasília, nas quais desenvolvi minhas pesquisas. Agradeço o Prof. Raul Maranhão e a Profa. Eliana Cotta de Faria os quais cederam gentilmente seus laboratórios e os meios para realizar meus experimentos. Agradeço também aos professores que compuseram minha banca de tese e qualificação reservando um tempo precioso para me ouvir e compartilhar suas experiências (Profs. José Roberto Matos, Antonio Laurinavicius, Rodrigo Bueno, Thiago Quinalgia e Wilson Nadruz-Jr, Profas. Adriana Bertolami e Helena Coutinho).
Em conjunto agradeço, meus colegas pesquisadores da Coorte Brasília, GEROS e Aterolab, os quais formam um time de peso com capacidade de impactar a pesquisa brasileira; meus amigos e professores do Objetivo, UnB, Hospital das Clínicas e INCOR, que foram definitivos para a minha formação; meus colegas de hospitais nos quais trabalhei, também me ensinado muito; meus primos, tios e avós, com todo o seu amor e carinho; a família da minha esposa, que me acolheu verdadeiramente; meus gatos companheiros das madrugadas; e especialmente a todos os pacientes que participaram de cada um dos estudos. Agradeço a CAPES e FAPESP por terem ajudado a financiar a presente tese.
Muito obrigado a todos e continuarei sempre os honrando nas carreiras de médico e cientista.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 10 2 OBJETIVOS ... 19 2.2 OBJETIVO GERAL ... 19 2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19 3 METODOLOGIA ... 20 3.1 CASUÍSTICA ... 203.2 COMITÊ DE ÉTICA E TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO . 21 3.3 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 21
3.3.1 Coleta de Material Biológico ... 22
3.3.2 Análises Bioquímicas ... 22
3.3.3 Isolamento da HDL ... 22
3.3.4 Composição Química da HDL ... 23
3.3.5 Efluxo de colesterol de macrófagos para HDL ... 23
3.3.6 Transferência de Lípides de uma nanoemulsão doadora para HDL in vitro ... 24
3.3.7 Atividade de CETP e PLTP plasmáticas ... 24
3.3.8 Ressonância nuclear magnética cardíaca (RNMC) ... 24
3.3.9 Modelo experimental de reperfusão ex-vivo ... 26
3.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 27 4 RESULTADOS ... 29 4.1 CAPÍTULO 1 ... 30 3.1 CAPÍTULO 2 ... 36 5 DISCUSSÃO GERAL ... 58 6 CONCLUSÃO ... 63 7 REFERÊNCIAS ... 64 8 ANEXOS ... 76
ANEXO 1 – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA SECRETARIA DE SAÚDE DO DISTRITO FEDERAL ... 76
ANEXO 2 – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS ... 83
ANEXO 3 – PERMISSÃO DE REPRODUÇÃO DO ARTIGO 1 ... 84
1 INTRODUÇÃO
O século XX foi considerado o século da doença cardiovascular (DCV) no mundo pelo seu aumento expressivo, atingindo o posto de maior causa de mortalidade do período. Por exemplo, nos Estados Unidos, as DCVs foram responsáveis por mais mortes do que qualquer outra causa em todos os anos desde 1919. Houve aumento progressivo até a década de 80, atingindo mais de 1 milhão de mortes por ano. Esses números começaram a diminuir lentamente a partir de 2010, mas as DCVs ainda foram responsáveis por 30,8% (807.775) de todos os óbitos em 2016 (1). As DCVs também são a principal causa de morte no mundo, com aproximadamente 17,6 milhões de mortes por ano em 2016 (32% dos óbitos) (2).
A principal causa de mortes atribuídas às DCVs no mundo é a doença arterial coronariana (DAC) (53%), seguida das doenças cerebrovasculares (31%) e da doença cardíaca hipertensiva (4,5%). As mortes por doenças cardiovasculares aumentaram globalmente em 14,5% de 2006 a 2016 em números absolutos, apesar da taxa de mortalidade corrigida pela idade ter diminuído, ao contrário dos Estados Unidos e outros países desenvolvidos. A responsável é justamente a mortalidade por DAC que aumentou 19% nesse período (2). Este padrão se repete no Brasil e é agravado pelas grandes discrepâncias entre as regiões do país (3).
A apresentação mais letal da DAC é o infarto do miocárdio (IM). Sua fase aguda é momento crítico para definição de seu desfecho, já que 50% das mortes por eventos coronarianos ocorrem em 28 dias dos sintomas, sendo 50% na primeira hora (4). A reperfusão precoce mantém sendo medida central para reduzir a mortalidade por IM. No entanto, a reperfusão coronária leva inexoravelmente a mecanismos de lesão celular no tecido originalmente afetado pela isquemia. A lesão por isquemia/reperfusão (I/R) é responsável por cerca de 50% da massa final do IM e, assim, tem papel determinante em sua morbidade e mortalidade (5).
A lipoproteína de alta densidade (HDL) é uma plataforma nanométrica onde numerosas proteínas (até 96 diferentes) (6), centenas de micro-RNAs (7) e mais de 200 espécies de lípides (8) interagem mutuamente. Na corrente sanguínea, a HDL se interconverte em distintos fenótipos como resposta às demandas fisiológicas e patológicas, um processo chamado de remodelamento intravascular (9). Este processo pode ser desencadeado por respostas inflamatórias e metabólicas crônicas ou agudas que podem gerar mudanças de diâmetro, composição e carga elétrica das partículas (10). Estas mudanças vão determinar a performance da HDL em suas diversas funções como: transporte reverso de colesterol, ação antioxidante,
antiagregante plaquetária e, particularmente no IM, proteção contra lesão de I/R. Além disso, o fato do remodelamento não ocorrer de forma homogênea em todas as partículas determina a coexistência de partículas de HDL com composições, densidades e tamanhos variados formando subpopulações, como: HDL2b, HDL2a, HDL3a, HDL3b e HDL3c (11). Evidências sugerem que estas subpopulações podem apresentar funções distintas. Por exemplo, as partículas pequenas e densas de HDL3c parecem ter funções antioxidantes e anti-inflamatórias mais potentes(12).
Apesar do colesterol ser apenas um dos componentes da lipoproteína, a HDL e os níveis séricos de colesterol na HDL (HDL-C) são comumente considerados sinônimos e referidos como “o colesterol bom”. Isso se deve aos primeiros estudos epidemiológicos que demonstraram associação inversa (forte, independente e consistente em diversas populações) entre HDL-C e o risco de DCVs (13). Em seguida, os métodos para dosagem sérica de HDL-C por precipitação foram padronizados com boa acurácia e difundidos com baixo custo. De fato, os níveis de HDL-C assim dosados têm alta correlação com a massa total da HDL (r=0,88, medido por espectroscopia de ressonância nuclear magnética) (14), mas não refletem os aspectos funcionais da partícula. Assim, bilhões foram investidos em estratégias farmacológicas para aumentar os níveis de HDL-C, porém sem sucesso em reduzir morbidade ou mortalidade cardiovascular(15, 16). A avaliação das características funcionais da HDL e sua relação com as DCVs então se tornou novo foco de estudo (17).
No IM, a capacidade da HDL de proteger células miocárdicas da lesão de reperfusão foi revelada em modelos animais ex-vivo (18) e in-vivo (19). Em contraste, em humanos, a associação entre os níveis HDL-C e desfechos clínicos após síndromes coronarianas agudas (SCA) é controversa (20-23). Confirmar em humanos os achados em modelo animal do papel protetor da HDL na lesão de I/R do IM é um desafio. Nessa condição, a HDL disponível na corrente sanguínea foi exposta à resposta inflamatória de fase aguda e longo período de fatores de risco precedentes ao evento. A HDL do paciente que manifesta um IM já possui atividades anti-inflamatórias e antioxidantes reduzidas (24-26). Além disso, a resposta inflamatória/oxidativa desencadeada para promover reparo tecidual da área infartada pode afetar a maioria das funções da HDL, inclusive transformando-a em uma partícula pró-inflamatória (27). A duração da oclusão coronária e a extensão da injúria miocárdica podem justificar variações no grau de disfunção encontrados (21, 28); oclusões prolongadas resultando em infartos extensos hipoteticamente modificariam mais as características funcionais da HDL. No entanto, múltiplos aspectos e implicações desta interação bidirecional entre HDL e IM ainda não foram esclarecidos, o que motivou a presente Tese.
Mudanças fenotípicas da HDL após o IM
A primeira descrição de mudança da HDL após IM foi a redução na concentração sérica dos níveis de HDL-C durante os primeiros dias do evento seguido por recuperação progressiva nas próximas semanas. Esta redução resulta tanto de uma diminuição do número de partículas quanto do conteúdo de colesterol livre e éster. Pela redução da atividade da lecithin-cholesterol acyltrasnferase (LCAT) durante a fase aguda do IM, o declínio do conteúdo de colesterol éster parece ser maior do que o de colesterol livre (27, 29).
Existem relatados tanto de diminuição quanto de aumento nos triglicerídeos plasmáticos após IM. Esta divergência se deve em parte às características clínicas dos pacientes. Em voluntários saudáveis, a infusão de triglicérides aumenta agudamente o seu conteúdo na HDL e impede a ação anti-inflamatória da partícula (30). Assim, é possível que a mudança do conteúdo de triglicérides na HDL durante fase aguda do IM possa ter implicações fisiopatológicas.
Os fosfolípides em determinadas situações podem se tornar o maior componente lipídico da HDL e possuem papel fundamental nas funções da partícula. Entre as espécies de fosfolípides, a sphingosine-1-phosphate (S1P) merece atenção especial no contexto do IM. A S1P se eleva nas primeiras 12h do evento contribuindo para ativação inflamatória sistêmica e local (31). No entanto, a S1P pode se ligar a HDL e ter este efeito atenuado. Assim, o enriquecimento da HDL com S1P na fase aguda do IM pode constituir uma estratégia intrínseca para limitar a intensidade da resposta inflamatória (31). Como um dos objetivos da presente Tese, as modificações do conteúdo dos quatro principais grupos lipídicos constituintes da HDL (colesterol éster e livre, triglicérides e fosfolípides) serão abordadas com mais profundidade nas próximas seções.
A fração proteica da HDL também é modificada quantitativa e qualitativamente com alteração significativa em mais de 50 proteínas associadas a HDL(32). Durante a fase de resposta inflamatória aguda, a mudança de diâmetro e conteúdo lipídico da HDL favorece adaptações conformacionais na estrutura terciária da apolipoproteína A-I (apoA-I), sua principal proteína de superfície. Esta mudança estrutural altera as propriedades de ligação da HDL a receptores celulares, enzimas e transportadores. Além disso, processos inflamatórios e metabólicos também podem modificar a composição da HDL, favorecendo a substituição da apoA-I, da transtirentina por proteínas pró-inflamatórias, como a serum amyloid A (SAA) e a lipopolysaccharide-binding protein (LBP) (33). De fato, na primeira semana pós-IM, a SAA pode se tornar o maior componente proteico da HDL. Estas mudanças pró-inflamatórias podem alterar profundamente as funções da HDL chegando até a transforma-la de partícula protetora
em patogênica.
Macrófagos da área infartada produzem interleucina 1 (IL1) e interleucina 6 (IL6) as quais sinergicamente induzem a produção de SAA nos hepatócitos. Como o estímulo para a produção de SAA vem da área infartada, o grau de enriquecimento da HDL com SAA está necessariamente ligado à extensão do IM e, consequentemente, a desfechos clínicos desfavoráveis. Assim, o enriquecimento da HDL com essa proteína pode ser apenas um marcador de gravidade clínica do IM. No entanto, a SAA livre na corrente sanguínea pode atuar como mediador pró-inflamatório e pró-trombótico por meio da ativação do nuclear fator-κB (NFκB) nas células endoteliais (34), podendo aumentar a área infartada. Desta forma, é aceitável que o aumento plasmático de SAA após o IM possa tanto ter uma relação causal com desfechos desfavoráveis quanto ser um marcador de gravidade.
Neste sentindo, o deslocamento da apoA-I da superfície da HDL pela SAA pode ter uma função biológica protetora. Ligada à HDL, a ação pró-inflamatória da SAA é profundamente atenuada, assim como acontece com a S1P (35). A contrapartida desfavorável desta troca é o declínio das funções da HDL em si, já que reduções das atividades antioxidante e de efluxo de colesterol são esperadas por serem mediadas pela apoA-I. A disfunção da HDL relacionada à ligação da SAA ainda não foi adequadamente explorada para um entendimento completo dos efeitos adversos desta função de “tamponamento” da HDL. Estudos experimentais que induziram o enriquecimento da HDL com SAA por meio de injeção de endotoxinas reportaram tanto aumento (36) quanto diminuição (34) do efluxo celular de colesterol para a lipoproteína. A capacidade da HDL de inibir inflamação das células endoteliais, avaliada pela secreção de moléculas de adesão, não parece ser afetada pelo aumento de conteúdo de SAA (37). Isto mostra a complexidade e a necessidade de aprofundamento no tópico.
Outras mudanças na composição proteica da HDL após IM foram identificadas por meio de análises proteicas e de ontologia genética. Por exemplo, a apoA-II e, consequentemente, as partículas contendo tanto apoA-I quanto apoA-II (LpAI:AII) diminuem após 48h de um evento coronariano, particularmente em paciente com grande resposta inflamatória (38).
Após o IM, o conteúdo de apoC-III na HDL está aumentado, o que estimula sinais pró-apoptóticos por meio da fosforilação da p38-mitogen-activated protein kinase (MAPK) e aumenta a expressão endotelial de proteínas reguladoras pró-apoptóticas(39). A clusterina ou apoJ é uma chaperona ativada por estresse ATP-independente normalmente carreada no plasma pela HDL e desempenha um papel importante na inibição de mecanismos de morte celular,
além da modulação de sinais pró-sobrevivência e redes de transcrição (40). Em um modelo animal ex-vivo de IM como o utilizado na presente Tese, a reperfusão coronária com clusterina reduziu a massa infartada em 75%, indicando a relevância do seu efeito antiapoptótico no IM (41). Em estudos observacionais em pacientes com IM, o conteúdo de clusterina na HDL diminui, enquanto o conteúdo de apoC-III aumenta, causando assim um desbalanço em favor do aumento de apoptose dos cardiomiócitos na zona peri-infarto (39).
Por fim, as partículas de HDL são potenciais transportadoras de microRNAs (miRs), que são pequenas sequencias de RNA reguladoras capazes de controlar inúmeros processos metabólicos. Frações purificadas de HDL de indivíduos saudáveis contém diversos miRs sendo os mais abundantes: miR-135a, miR-188-5p e miR-877 (7). Em modelos animais e celulares, vários miRs (incluindo: miR-144, miR-451 e miR-494) foram considerados capazes de reduzir lesão por I/R, já o miR-320 foi associado com incremento de lesão por I/R (42, 43). Em um modelo em camundongos de I/R, o miR-1 agravou a morte de miócitos por meio da inibição da PKC(44). Por outro lado, o miR-146 é capaz de atenuar a lesão miocárdica e a apoptose de miócitos dependente de Scr4, assim como os miR-103 e 107 protegem o miocárdio de morte celular por necrose modulando as proteínas associadas ao Fas(45). Em indivíduos com SCA, o painel de miRs que é predominantemente transportado pela HDL e o seu real impacto na extensão da lesão do IM não está claro. Então, apesar de ser plausível que exista papel dos miRs (transportados ou não pela HDL) na evolução do IM, ele ainda deve ser descoberto.
Mudanças funcionais da HDL após o IM
A transferência de lípides de outras lipoproteínas e células para HDL são processos essenciais para a homeostase do colesterol no organismo e que afetam diversas funções protetoras desempenhadas pela HDL (46, 47). Ela ocorre tanto por meio de difusão aquosa quanto facilitada por proteínas transportadores de lípides. Modificações destas transferências são necessárias para o remodelamento intravascular da HDL direcionado para uma demanda biológica específica. A avaliação destes processos serão objetos da presente Tese com principal foco nas suas modificações no decorrer da fase aguda do infarto do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST (IMCSST).
A cholesteryl ester transfer protein (CETP) é uma proteína central no remodelamento da HDL, mediando a troca molar de triglicérides por colesterol éster entre a HDL e lipoproteínas que contém apoB. Ela faz parte de uma família de proteínas transportadoras de lípides, mas que também são capazes de ligar a lipopolissacarídeos, juntamente com phospholipid transfer protein (PLTP), lipopolysaccharide binding protein
(LBP) e bactericidal permeability increasing protein (BPI). Enquanto as três primeiras estão predominantemente ligadas a HDL, a BPI normalmente está ligada à superfície dos grânulos secretórios de neutrófilos. Como a CETP compartilha essa capacidade de neutralização de endotoxinas bacterianas, existem estudos demonstrando um papel protetor da CETP na sepse, inclusive mostrando associação em humanos de níveis reduzidos de CETP e mortalidade (48). Durante outras condições clínicas que desencadeiam resposta de fase aguda, como a cirurgia cardíaca e IM, a atividade da CETP também diminui de forma inversa e proporcional à atividade inflamatória sistêmica (29). No entanto, na ausência de endotoxinas, o principal mecanismo pelo qual ela exerce o seu papel protetor não pode existir e outras atividades prejudiciais da CETP podem sobressair.
Existe evidência substancial indicando que a CETP tem efeito trombótico e pró-inflamatório. Em alguns pacientes após IM, atividade aumentada de CETP pode ser encontrada, o que está independentemente associado à disfunção endotelial e recorrência de eventos coronarianos (29). Nestes indivíduos, a geração de HDL oxidado é significativamente ampliada e pode ser um reflexo da transferência de lípides oxidados de lipoproteínas que contém apoB para HDL. Além disso, estudos in vitro demonstraram que a CETP é capaz de transferir da LDL para HDL formas não-oxidadas de linoleato de colesterol (C18:2), mas que são mais vulneráveis ao estresse oxidativo. Desta forma, a atividade da CETP pode prolongar a exposição das células endoteliais a produtos de oxidação transferindo lípides oxidados para as partículas de HDL. Não está claro se a atividade de transferência de lípides e outras ações da CETP são proporcionais ou reguladas de forma distinta. Embora, associação positiva já tenha sido documentada entre atividade de troca lipídica da CETP e ativação dos fatores de coagulação VII e XI; ambos relacionados à incidência e recorrência de IM
A PLTP é uma proteína associada à HDL que promove a acepção de fosfolípides principalmente das lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Existem evidências de sua atividade anti-inflamatória, mas principalmente por sua capacidade de neutralizar lipopolisacarídeos (LPS) e facilitar o seu transporte para a HDL (49) prevenindo sua exposição no plasma capaz de ativar resposta inflamatória sistêmica. Não existem estudos sobre o impacto do enriquecimento da HDL com LPS em suas funções protetoras e a capacidade da PLTP de transportar outros mediadores pró-inflamatórios. Em indivíduos com resposta inflamatória aguda acentuada, pode haver um aumento da atividade da PLTP (50). No entanto, as modificações de sua atividade após IM ainda não foram investigadas.
O efluxo celular de colesterol pela HDL atualmente é visto como um preditor importante de carga aterosclerótica e de incidência de DCV tanto no cenário de prevenção
primária quanto secundária(17, 51). Do ponto de vista mecanístico, o efluxo celular de colesterol é chave para função de proteção da HDL contra a formação de células espumosas (52). Além disso, existe uma relação mútua entre o efluxo de colesterol, o número de partículas de HDL na corrente sanguínea e a função endotelial coronariana, sugerindo um papel da habilidade de acepção de colesterol da HDL na manutenção da função endotelial (53).
Uma grande quantidade de dados indicam que o acumulo de colesterol livre nas membranas da células endoteliais pode alterar a sinalização e promover disfunção da vasomotricidade coronariana (24). Por outro lado, partículas de HDL com alta capacidade de acepção de colesterol podem estimular a proliferação e recuperação da função do endotélio (54). O efeito proliferativo da HDL pode ser particularmente relevante nos pacientes com SCAs que passam por angioplastia com stent, pois a taxa de re-endotelização pode determinar o desfecho clínico (55).
O efluxo celular de colesterol pela HDL e a consequente depleção de colesterol livre da membrana celular conseguem atenuar a transdução de sinais pró-inflamatórios mediada por lípides (56). Em pacientes com SCA comparados com controles, tanto a capacidade de efluxo quanto as ações anti-inflamatórias da HDL estão reduzidas (24), as duas mudanças podem afetar negativamente o manejo do colesterol, a intensidade de sua oxidação e estimular a resposta inflamatória nas células endoteliais e macrófagos.
As mudanças do tamanho da HDL e sua composição após o IM podem favorecer a redução do efluxo celular de colesterol. Alterações de lipidômica e proteômica induzidas pela atividade inflamatória sistêmica desencadeadas pelo IM são parcialmente responsáveis pela diminuição do efluxo. Após a indução experimental de resposta inflamatória aguda por meio da injeção de baixas doses de endotoxinas em voluntário saudáveis, foi verificado uma associação entre o aumento da ligação de SAA à HDL e redução do efluxo de colesterol (34). No IM, essa atividade inflamatória atinge o seu pico dias após o evento (57) podendo representar o momento de maior influência nas propriedades funcionais da HDL.
Em pacientes com IMCSST, os quais habitualmente apresentam uma grande área infartada, o efluxo de colesterol pela HDL de macrófagos THP-1 se mostra reduzido independentemente do níveis de HDL-C (25) comparados com controles. Essa função se mostra menos prejudicada em indivíduos com IM sem supradesnivelamento do segmento ST ou angina instável nos quais a massa de necrose/apoptose miocárdica é menor do que no IMCSST (25). Estas variáveis devem ser levadas em consideração para entender os achados aparentemente contraditórios das modificações do efluxo celular de colesterol após IM (58-60).
experimentais, a HDL é capaz de reduzir a apoptose de cardiomiócitos induzida por lesão de I/R (19). Em modelos murinos, a infusão intravenosa de apoA-I ativa as vias da reperfusion injury signaling kinase (RISK) e do survivor activating fator ehancement (SAFE), reduzindo apoptose (61). Em modelos de coração isolado de ratos, a reperfusão com partículas de HDL evitou a abertura de mitochondrial permeability transition pores (MPTP), indicando o potencial da HDL com um agente de pós-condicionamento isquêmico (62).
A HDL necessita ativar tanto o tumor necrosis fator-α (TNF-α) quanto a STAT3 para acionar a via SAFE (63, 64). A sinalização SAFE parece estar condicionada à ativação da cascata da S1P pelo complexo HDL/S1P: (i) a S1P intracelular é capaz de regular a via SAFE acionada pelo TNF-α (65); (ii) S1P precisa da presença da sinalização do TNF-α para proteger contra lesão de I/R (66); (iii) a via SAFE é ativada pela HDL, S1P, ou HDL recombinante por meio do receptor S1P2 (67); e (iv) animais deficientes em STAT3 perdem esta capacidade protetora induzida pela S1P. Além disso, a sinalização Akt e extracellular-regulated kinase (ERK) também é acionada pela ativação do receptor de S1P e está envolvida na via RISK, o que favorece o pós-condicionamento isquêmico.
O complexo HDL/S1P é capaz de fosforilar a STAT3 em dois resíduos diferentes: serina 727 e tirosina 705. A STAT3 ativada na serina se transloca para o espaço mitocondrial pela unidade transportadora Tom20 e se integra ao complexo mitocondrial I por meio da união com a proteína moduladora de morte GRIM19. Os efeitos mitocondriais da STAT3 são: preservar a integridade mitocondrial; inibir a abertura de MPTP e favorecer a produção de ATP. Em paralelo, a STAT3 ativada na tirosina é translocada para o núcleo pela importina α5, se liga ao sítio de ativação do interferon-γ e promove a síntese de proteínas antiapoptóticas (p. ex. Mcl-1, Bcl-xL, c-FLIPL, c-FLIPS) e cardioprotetoras (p. ex. HO-1 e COX-2) (68, 69). Vale mencionar que é necessário mais de uma hora para STAT3 fosforilada na tirosina ativar a via transcricional SAFE e aproximadamente 24h para produzir as proteínas necessárias para essa ação protetora. Assim, o efeito de pós-condicionamento da HDL acontece por meio de um efeito precoce nos primeiros minutos de reperfusão baseado na interação mitocondrial e de um feito tardio de sinalização transcricional.
A ativação da via RISK pela HDL também pode proteger o miocárdio de forma dependente da mitocôndria. A Akt dessensibiliza MPTP interagindo com a hexoquinase II e GSK3β, além de inibir a apoptose suprimindo proteínas pró-apoptóticas, como a caspase 9 (70). Em paralelo, a ERK estimula a proteína antiapoptótica Bcl2 e também dessensibiliza MPTP por meio da GSK3β e da ciclofilina D. O resultado é salvamento miocárdico, como visto na isquemia em camundongos ERK2+/- e em experimentos com inibidores de Akt (71).
A lesão de reperfusão é parcialmente atribuída ao edema celular e ruptura da membrana que sucede a abertura dos canais hemi nos cardiomiócitos. A permeabilidade destes canais é modulada pelo status de fosforilação da sua principal proteína, conexina 43 (Cx43), a qual é um canal de junção gap presente nos cardiomiócitos que também pode mediar a cardioproteção pela HDL (72). A infusão de HDL saudável ou S1P durante os primeiros minutos de reperfusão leva à fosforilação do resíduo serina 368 da Cx43 (73). Quando este protocolo é aplicado em camundongos com mutações não-fosforiláveis desse resíduo ou na presença de inibidores dos receptores S1P2 e S1P3, o condiciomaneto pela HDL/S1P é prejudicado. A ativação da PKC parece ser exercer efeito sobre à HDL pela a Cx43 (74).
Além dos efeitos diretos da HDL já citados, sua propriedade antioxidante também pode interferir com a lesão por I/R. A atividade do complexo mitocondrial é um importante alvo intracelular do estresse oxidativo agudo. A atividade do complexo I é reduzida em 25% após isquemia e em 48% após I/R (75). Constituintes da membrana mitocondrial, particularmente a cadiolipina, são altamente susceptíveis à ação peroxidativa. A cadiolipina exerce função essencial na bioenergética mitocondrial, pois é necessária para a transferência de elétrons no complexo I da cadeia respiratória (75). Assim, a I/R compromete, pelo menos em parte por meio das alterações oxidativas na cardiolipina e outros constituintes da membrana, a cadeira respiratória mitocondrial. Logo, as múltiplas e potentes ações antioxidantes da HDL poderiam atenuar o estresse oxidativo no momento da reperfusão.
Entretanto, uma das características funcionais da HDL afetadas em pacientes com IM é sua capacidade antioxidante (26) o que deixa o estresse oxidativo da reperfusão livre atuar na cadeia respiratória mitocondrial. Um dos motivos é a redução da atividade de uma de suas principais enzimas antioxidante associada à HDL, a paroxonase-1 (PON1), já presente em pacientes com fatores de risco cardiovascular ou DAC crônica e que é intensificado nas primeiras 48h após o IM (24, 58, 59). Como já citado, também ocorre um desbalanço no conteúdo da HDL com aumento de apoC-III em detrimento da clusterina após o IM, o que favorece mecanismos pró-apoptóticos (39-41). As alterações na transferência de lípides nesse contexto por modificarem o tamanho e composição lipídica podem afetar outras funções da HDL, inclusive a de atenuação da lesão por I/R.
Desta forma, a hipótese que será abordada na presente Tese de que a interação da HDL de pacientes com IM interaja com os mecanismos de lesão de I/R de forma diferente do que a HDL de pacientes saudáveis se torna plausível. Assim, a associação entre a massa de HDL e do IM será avaliada levando em consideração a influência da reperfusão, momento em que as características funcionais da HDL podem influenciar diretamente o resultado do IM.
2 OBJETIVOS
2.2 OBJETIVO GERAL
Avaliar as alterações das características fenotípicas e funcionais da HDL na fase aguda do infarto do miocárdio.
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A. Capítulo 1: Investigar o impacto da fase aguda do IM na transferência de lípides de outras lipoproteínas e de células para a HDL.
i. Avaliar a transferência simultânea de colesterol livre e esterificado, triglicérides e fosfolípides de uma nanoemulsão artificial doadora para a HDL no primeiro (D1) e quinto (D5) dia após IM por meio de um ensaio in vitro;
ii. Estimar por meio de outro ensaio in vitro a capacidade da HDL em realizar efluxo de colesterol de macrófagos J744 carregados com LDL acetilada no D1 e D5;
iii. Mensurar a composição dos principais lípides presentes na HDL (colesterol livre e esterificado, triglicérides e fosfolípides) e sua principal proteína, apoA-I, em D1 e D5;
iv. Verificar o impacto da magnitude da resposta inflamatória sistêmica nesses processos de transferência de lípides.
B. Capítulo 2: Investigar o papel da reperfusão na associação entre a HDL e a massa infartada em pacientes com IMCSST e se há diferença na interação entre a HDL de pacientes pós-IMCSST e HDL de voluntários saudáveis com lesão de I/R.
i. Verificar a associação entre os níveis de HDL-C na admissão de pacientes com IMCSST e o tamanho da massa infartada medida por ressonância magnética cardíaca (RNMC) ou pico dos níveis do fragmento MB da creatino kinase (CKMB);
ii. Analisar a influência da presença e do tempo para reperfusão na associação entre HDL-C e a massa infartada;
iii. Comparar em um modelo experimental ex vivo de IM o efeito da infusão durante reperfusão de HDL obtida de pacientes pós-IMCSST e de HDL de voluntários saudáveis.
3 METODOLOGIA
3.1 CASUÍSTICA
A população estudada é composta de pacientes participantes da Coorte Brasília / Brasilia Heart Study (Clinical Trial.gov Identifier: NCT02062554) (57). O estudo é uma coorte prospectiva de pacientes admitidos com IMCSST admitidos no Hospital de Base do Distrito Federal desde maio de 2006 até os dias atuais, arrolados e acompanhados por dois anos em consultas regulares onde são feitas avaliações médicas.
São critérios de inclusão: (i) menos de 24 horas desde o início dos sintomas do IM, (ii) supradesnivelamento do segmento ST de pelo menos 1 mm (plano frontal) ou 2 mm (plano horizontal) em duas derivações contíguas, e (iii) comprovação de necrose miocárdica pela elevação da CK-MB (>25 UI/L) e/ou troponina (>0.04 ng/ml). Estes dois projetos são parte dos objetivos secundários do projeto geral da Coorte Brasília / Brasilia Heart Study. A partir de 599 pacientes admitidos desde 2006, 87 foram excluídos da coorte geral por critérios diversos, como cineangiocoronariografia sem lesões ateroscleróticas, transferência inter-hospitalar ou retirada do consentimento antes de completar dados admissionais. Dois subgrupos de pacientes foram selecionados. Para o Capítulo 1 da presente Tese, 41 pacientes consecutivos de 2011 foram selecionados para coleta de maior volume de plasma para isolamento da HDL e realização dos ensaios de transferência de lípides. Para o Capítulo 2, foram selecionados os 393 pacientes com dados completos de curva enzimática de CKMB e valores de HDL-C na admissão, além de um subgrupo de 94 pacientes que aceitaram ser submetidos e compareceram a RNMC no período de 2011 a 2012.
Para o estudo experimental desenvolvido no Capítulo 2, um grupo controle para extração de HDL saudável (n=11) foi selecionado a partir de base de dados do Centro de Pesquisa Clínica (CPC) da UNICAMP. Os voluntários deveriam possuir de 20 a 30 anos de idade, livres de fatores de risco cardiovascular, doenças infecciosos, inflamatórios ou autoimunes, insuficiência renal ou hepática e neoplasias. Foram utilizados também ratos adultos machos Wistar (n=22), pesando de 300 a 400g fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP).
3.2 COMITÊ DE ÉTICA E TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO
O estudo foi aprovado pela Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Ensino e Pesquisa em Ciências da Saúde (FEPECS) da Secretaria de Estado de Saúde do Distrito Federal (SES-DF) sob o Certificado de Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) 47145515.6.0000.5553 constante na Plataforma Brasil (ANEXO 1). Todos os pacientes admitidos no estudo foram previamente instruídos sobre os procedimentos e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, conforme a Declaração de Helsinque e a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUA/UNICAMP) sob no 4418-1/2016 (ANEXO 2). Todos os animais receberam os cuidados de acordo com os procedimentos para o uso científico de animais editados pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA) e recomendações do Committee on Care and Use of Laboratory Animals - Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR) - National Research Council, United States.
3.3 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Após consentimento livre e esclarecido, os participantes foram inicialmente avaliados nas primeiras 24 horas após início do IAM (D1). Nesta avaliação, foram realizados: (i) exame clínico e histórico médico em geral, (ii) antropometria, (iii) eletrocardiograma, (iv) coletas de sangue a cada 6 horas para curva enzimática de CKMB, e (v) coletas de sangue para análises bioquímicas e separação de plasma para congelamento a -80ºC após 12 horas de jejum.
Os pacientes foram reavaliados diariamente até o 5º dia (D5) quanto ao quadro clínico, medicações utilizadas e procedimentos realizados. O tratamento foi instituído pela equipe assistente sem qualquer interferência dos pesquisadores. A segunda coleta de sangue ocorreu no 5º dia (D5) após início do IM. No momento da alta hospitalar, os pacientes foram convidados a retornar para realização RNMC em até 2 semanas da alta.
3.3.1 Coleta de Material Biológico
Para cada indivíduo admitido no estudo foi coletado sangue venoso periférico retirado da veia antecubital mediana, em tubos estéreis a vácuo com EDTA (plasma), e em tubos com gel separador (soro). Cerca de 4 ml foram coletados para a dosagem de CK-MB a cada 6 horas nas primeiras 24h, 20 mL no D1 e D5 para bioquímica geral e 20 mL adicionais no subgrupo de pacientes do Capítulo 1. Após a coleta, o plasma e o soro foram imediatamente separados por centrifugação a 3500 rpm por 15 minutos (min). Posteriormente foram aliquotados em criotubos devidamente identificados e armazenados em ultrafreezer a -80ºC para realização das análises de HDL.
3.3.2 Análises Bioquímicas
As dosagens realizadas para todos os pacientes no D1 e D5 foram: glicose (Glucose GOD-PAP, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), colesterol total (CHOD-PAP, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), triglicérides (GPO-PAP, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), HDL-C (HDL cholesterol without sample pre-treatment, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), proteína C reativa (PCR) de alta sensibilidade (Cardiophase, Dade Bering) e Hemoglobina Glicada (Variant II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), essa apenas no D1. O LDL-C foi calculado pela fórmula de Friedewald. A CKMB foi medida com o analisador Immulite Automated Analyzer (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA) com coletas na admissão e a cada 6 horas até sua normalização, conforme protocolo institucional. A taxa de filtração glomerular foi estimada com a fórmula MDRD (mL/min): 186 x (creatinina/88,4)-1,154 x (idade)-0,203 x (0,742, se mulher) x (1,210, se homem) x (1,210, se negro).
3.3.3 Isolamento da HDL
A HDL foi isolada a partir 4 mL de plasma sanguíneo, de cada indivídu do Capítulo 1 no D1 e D5, por ultracentrifugação para verificação de sua composição química, tamanho e capacidade de realizar efluxo de colesterol de macrófagos. O plasma foi adicionado em tubos ultra-clear (Beckman) e a densidade ajustada para 1,21 g/mL com brometo de potássio (KBr) (0,325 g/mL de plasma). Posteriormente foram realizados gradientes de densidade com soluções salinas de KBr adicionadas com auxílio de uma mini bomba peristáltica, a fim de formar 4 diferentes fases [4 mL de plasma; 3 mL de solução salina (1,063 g/mL); 3 mL de solução salina (1,019 g/mL) e 2,5 mL de solução salina (1,006 g/mL)]. O gradiente formado foi
ultracentrifugado a 40000 rpm por 24 horas a 4ºC. Após a ultracentrifugação as frações de lipoproteínas na sequência VLDL, IDL, LDL e HDL foram extraídas nos volumes 1 mL, 2 mL, 3,7 mL e 2 mL. Finalmente as frações de lipoproteínas foram submetidos a diálise para remoção do KBr, com tampão fosfato salino (PBS) sem EDTA pH 7,4, durante 48h a 4ºC no escuro (76). Todos os ensaios foram realizados em lipoproteínas isoladas a menos de 15 dias e sempre mantidas no máximo a 4ºC.
3.3.4 Composição Química da HDL
A composição química da HDL isolada por ultracentrifugação foi realizada usando testes enzimáticos comercialmente disponíveis usando o leitor de microplacas Power Wave XS (BioTek). Os conteúdos de proteína total (Thermo Scientific), colesterol total (CHOD-PAP, Roche Diagnostics reagents), colesterol livre (Free Cholesterol E, Wako Chemicals), fosfolípides (Phospholipids C, Wako Chemicals), triglicérides (TG GPO-PAP, Roche) e ApoA-I (Tina Quant APO A1 V2, Roche) foram medidos, enquanto os valores de colesterol esterificado calculados por meio da razão da diferença entre o colesterol total e colesterol livre divido por 1,67 (76). O tamanho da partícula de HDL foi determinado usando técnica de light scattering utilizando o Nanotrac Particle Size Analyzer 250 (Microtrac Inc.).
3.3.5 Efluxo de colesterol de macrófagos para HDL
O efluxo de colesterol de células para HDL foi medido usando macrófagos murinos J774A.1 comprados da Coleção Americana de Tipos de Cultura (77). Esse ensaio quantifica o efluxo total resultante das formas mais relevantes de efluxo de colesterol de macrófagos (ATP-binding cassette transporter subfamily A member 1 (ABCA1), ATP-(ATP-binding cassette subfamily G member 1 (ABCG1), scavenger receptor class B member 1 (SR-BI) e difusão aquosa). Após chegarem à confluência, células J774 foram enriquecidas com LDL acetilado (50mcg/mL) e colesterol-C14 (0,3mcCi/mL). Depois de 48h, as células foram lavadas com PBS contendo FATTY ACID – FREE ALBUMIN (FAFA), e incubadas com DMEM + FAFA por 24h. As células são lavadas então 2 vezes com PBS + FAFA e incubadas com HDL (50 mcg proteína/ml) por 8h. O meio foi coletado e a radioatividade medida em um contador de cintilação beta. As células foram enxaguadas com salina gelada e os lípides extracelulares foram extraídos com hexano:isopropanol (3:2, v/v). O solvente foi evaporado e a radioatividade medida. O percentual de efluxo de colesterol-C14 foi calculado pela fórmula: (colesterol-C14 no meio / colesterol-C14 nas células mais a metade) x 100.
3.3.6 Transferência de Lípides de uma nanoemulsão doadora para HDL in vitro
A habilidade da HDL in vitro de receber triglicérides, fosfolípides, colesterol livre e colesterol esterificado de nanoemulsão artificial foi avaliada nos pacientes do Capítulo 1 conforme descrito por Maranhão et al (78). A nanoemulsão é composta de: 40mg de oleato de colesterol, 20mg de fosfatidilcolina de ovo, 1mg de trioleína e 0,5mg de colesterol (Sigma Chemical Co.) e dos isótopos fosfolípide-C14, colesteril éster-H3, colesterol-H3 e triglicérides-C14 (79). Plasma com EDTA foi incubado com as nanoemulsões marcadas e após um banho com agitação, sulfato dextran/MgCl2 foi adicionado para precipitar as lipoproteínas contendo apoB e o sobrenadante centrifugado foi misturado a solução cintilante (Packard BioScience). Um Analisador de Cintilação Líquida modelo Packard 1600 TR mediu a radioatividade. As amostras brancas consistiam de solução TRIS com nanoemulsões marcadas e o agente de precipitação após incubação. Os resultados foram expressos em percentual de toda a radioatividade incubada.
3.3.7 Atividade de CETP e PLTP plasmáticas
A atividade da CETP foi determinada no plasma por um ensaio exógeno como descrito por Lagrost et al. (80), baseado na transferência de éster de colesterol-C14 de partículas de HDL para partículas de VLDL e LDL. Os resultados foram expressos como um percentual da transferência do colesterol éster. A atividade da PLTP também foi determinada por um ensaio exógeno como descrito por Jauhianein et al. (81), baseado na transferência de fosfatidilcolina-C14 de lipossomos para partículas receptoras HDL3. Os resultados foram expressos como a taxa de fosfolípides transferidos para HDL por hora.
3.3.8 Ressonância nuclear magnética cardíaca (RNMC)
Nos pacientes do Capítulo 2 que puderam comparecer para a realização de RNMC (n=94), os exames foram realizados até 2 semanas após a alta hospitalar em aparelho com campo magnético principal de 1,5 T (Signa CV/i, General Electric Medical Systems, Waukesha, MN, EUA), equipado com sistema de gradientes com intensidade de 40 mT/m e taxa de ascenção (slew rate) de 150 T/m/s. Foi utilizada bobina de superfície, composta de quatro elementos, para exames cardíacos, comercialmente disponível. Para a monitorização e sincronização eletrocardiográficas, foram acoplados quatro eletrodos na parede anterior do hemitórax esquerdo do paciente. Todos os exames foram obtidos com pausa expiratória, a fim
de se minimizar os artefatos decorrentes dos movimentos respiratórios.
Inicialmente, foram feitas aquisições nos três planos ortogonais (transversal, sagital e coronal), para localização do coração, usando uma sequência convencional de gradiente-eco. A partir dessas imagens preliminares, planejou-se a prescrição das sequências de cine-ressonância e realce tardio miocárdico.
Para a avaliação da contratilidade miocárdica global e regional, foi realizada aquisição de imagens dinâmicas de cine-ressonância, empregando sequência de gradiente-eco com processamento livre e em estado de equilíbrio (FIESTA – Fast Imaging Employing Steady Technique Acquisition). As imagens foram geradas em planos de corte de eixo curto e eixo longo do VE. Os cortes de eixo curto foram adquiridos com 8 mm de espessura e 2 mm de espaçamento, em número suficiente (8 a 12) para a cobertura de toda a extensão do VE. Os cortes de eixo longo foram planejados a partir das imagens de eixo curto, com 8 mm de espessura e a intervalos radiais de 45, sendo em número de quatro, no total. As dimensões de cada voxel foram, em média, de 1,4 x 2,5 x 8,0 mm.
Para a avaliação das áreas de necrose e fibrose miocárdicas, foi empregada sequência específica de gradiente-eco rápido, com pulso preparatório de inversão-recuperação. As imagens foram adquiridas cerca de 10 a 20 minutos após a administração intravenosa de 0,2 mmol/kg de contraste à base de gadolínio (ácido gadotérico, Dotarem, Guerbet, Aulnay Sous Bois, França), através de acesso venoso periférico, a cada dois batimentos cardíacos (intervalos RR) e o tempo de inversão foi meticulosamente ajustado, com o objetivo de anular o sinal do miocárdio normal. Os planos de corte foram prescritos exatamente nas mesmas posições da cine-ressonância, de forma a garantir a correspondência entre as imagens dinâmicas e as de realce tardio miocárdico.
Os dados obtidos da RNMC foram analisados por um consenso de dois cardiologistas experientes cegos em relação a qualquer variável clínica ou laboratorial. A massa do ventrículo esquerdo (VE) foi determinada por meio do traçado das bordas endocárdicas e epicárdicas em localizações correspondentes no eixo curto no final da sístole (82, 83). A fração de ejeção do VE foi medida por meio da regra de Simpson usando a somatória das localizações do eixo curto. Um método previamente descrito full-width half-maximum (84) para determinar a massa infartada total usando um algoritmo de detecção semiautomático baseado na intensidade do sinal da área remota de miocárdio normal e da área infartada. O núcleo do IM foi definido como o miocárdio com intensidade de sinal > 50% da máxima observada no miocárdio remoto. Áreas de IM prévio foram excluídas do cálculo de massa infartada.
3.3.9 Modelo experimental de reperfusão ex-vivo
Os ratos machos Wistar (n=22), pesando 300-400g no momento do experimento, foram mantidos em ciclos de 12h em luminosidade e 12h no escuro, sob temperatura constante de 23ºC, ar circulando e com livre acesso à água. Para preparação da infusão de HDL, o sangue coletado de pacientes da Coorte Brasília (n=3, no D1 e D5) e de 11 voluntários saudáveis foi utilizado. A HDL foi isolada por ultracentrifugação conforme já descrito e foi utilizada no experimento com menos de 10 dias do único descongelamento do plasma.
No dia do experimento, os animais receberam, por via intraperitoneal, tiopental sódico (80 mg/Kg) como agente anestésico, seguido de heparina sódica (3.000 UI/Kg). Após a anestesia, o animal foi submetido a toracotomia bilateral para exposição e isolamento do coração. O coração foi rapidamente excisado e a aorta foi canulada iniciando-se a perfusão do coração por meio de bomba peristáltica de rolete (Masterflex) com fluxo aproximado de 10 mL/min. Após poucos minutos, a perfusão do coração começou a ser realizada com pressão constante média de 100 cmH20 retrogradamente no sistema de Langendorff (Radnoti). A solução de perfusão foi a de Krebs e Henseleit, composta de NaCl 118,5 mM/L, NaHCO3 25 mM/L, KCl 4,7 mM/L, MgSO4 1,2 mM/L, KH2PO4 1,2 mM/L, Glicose 11,0 mM/L e CaCl2 1,4 mM/L equilibrada por meio do borbulhamento de carbogênio (5% CO2 e 95% O2) para manter um pH entre 7,35 e 7,45, a 37°C.
O átrio direito foi removido para permitir o escoamento do fluxo coronário. No VE, foi inserido cateter com balão de látex através da válvula mitral, conectado a um transdutor de pressão para manter uma pressão diastólica entre 5-10 mmHg durante todo o experimento e permitir a monitorização contínua das pressões de VE. Após um período de 10 minutos de estabilização, o coração foi submetido a 35 minutos de isquemia regional seguido de reperfusão por 90 min. A isquemia regional foi realizada por meio da ligação da artéria coronária descendente anterior. Nos primeiros 7 minutos de reperfusão, a HDL obtida dos voluntários saudáveis e dos pacientes com IMCSST no D1 e no D5 foi infundida por meio de uma bomba lateral em uma concentração de (200 mcg/mL de proteína), como previamente descrito (85). Os controles (n=5) receberam solução PBS, aquela com a qual a HDL foi dialisada.
Durante todo o experimento foi utilizado o sistema de captura de dados analógico/digital (ADInstruments) para aquisição e gravação das pressões diastólicas e sistólicas do VE, assim como derivada da pressão sistólica do VE sobre a derivada do tempo (dP/dt máxima), uma medida do inotropismo cardíaco. O percentual da recuperação da dP/dt máxima depois de 30 minutos do término da isquemia em relação ao basal foi usado para
comparar os grupos. No final da reperfusão, a artéria descendente anterior foi ocluída para infusão do corante Evans Blue (0,25%) para diferenciar a região remota da área sob risco de IM. Depois, o coração foi retirado do aparato e cortes de aproximadamente 2 mm de espessura foram corados com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) 1% aquecido a 37ºC durante 20 minutos para avaliação do tamanho da área de infarto. O tamanho do infarto foi determinado como uma razão da área não viável sobre a área sob risco usando planimetria computadorizada (Digimizer, MedCalc Software, Ostend, Bélgica).
3.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados estão apresentados como médias ± desvio padrão para variáveis com distribuição normal ou mediana (intervalo interquartil) para aquelas com distribuição não-normal. Análises de correlação foram realizadas usando o teste de Pearson ou Spearman para variáveis paramétricas e não-paramétricas respectivamente. Para compaçõ entre grupos independentes, foram utilizados os testes: teste-t independente (variáveis com distribuição normal), Mann-Whitney (variáveis não-paramétricas) e o teste qui-quadrado de Pearson (variáveis categóricas).
No Capítulo 1, as diferenças entre D1 e D5 após IM foram comparadas pelo teste-t para amostras pareadas e o teste Wilcoxon signed para amostras pareadas. Para melhor avaliar a relação entre a magnitude da resposta inflamatória e a transferência de lípides para a HDL, a mudança aguda na PCR (PCR do D5 – PCR do D1) / PCR do D1 foi calculada, assim como a mudança aguda na transferência de lípides para HDL. Os participantes também foram divididos em 2 grupos acima e abaixo do percentil 75 da PCR no D5, e comparados usando um modelo de regressão linear ajustado para sexo e idade.
No Capítulo 2, os pacientes também foram divididos em grupos de acordo com a mediana de HDL-C. Uma transformação logarítmica do pico de CKMB foi feita para realizar análise de covariância (ANCOVA) e confirmar as diferenças entre os grupos de HDL-C e o pico de CKMB ajustada para idade, sexo, LDL-C e triglicerídeos. Modelos de restricted cubic spline foram usados para verificar a associação linear ou potencialmente não-linear entre os níveis de HDL-C e a massa infartada. A associação também foi confirmada por meio de regressão linear modelo não ajustado (modelo 1) e progressivamente ajustados para idade, sexo, LDL-C, triglicérides, hipertensão e tabagismo (modelos de 2 a 4). Os pacientes que foram submetidos a reperfusão coronariana foram divididos em 5 (cinco) grupos, a cada 2 horas (exceto o último grupo por restrição de tamanho amostral): < 2h (n=11), 2 a 4h (n=26), 4 a 6h
(n=14), 6 a 8h (n=14) e ≥ 8h (n=10). Regressão linear simples foi realizada em cada grupo para avaliar a influência do tempo para reperfusão na relação entre HDL-C e massa infartada pela RNMC. Um modelo polinomial de terceira ordem de superfície de mínimos quadrados (third order polynomial least squares surface fit) foi gerado pela ferramenta Surface Fitting Tool do Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) para explorar visualmente a associação entre o pico de CKMB, HDL-C e tempo para reperfusão.
Significância estatística foi definida como p < 0,05. As análises foram realizadas com os softwares IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM, Armonk, NY, USA) e SAS 9.2 (SAS Institute, 197 Cary, NC, USA).
4 RESULTADOS
Os resultados desta tese são apresentados em dois capítulos, o primeiro composto por artigo publicado e o segundo por artigo submetido para publicação:
Capítulo 1 – HDL acceptor capacities for cholesterol efflux from macrophages and lipid transfer are both acutely reduced after myocardial infarction
Publicado em 2018 na Clinica Chimica Acta. Qualis B1 Medicina I Quadriênio 2013/2016.
Capítulo 2 – Adverse Interaction between HDL and the Mass of Myocardial Infarction
4.1 CAPÍTULO 2
Adverse Interaction between HDL and the Mass of Myocardial Infarction
Alexandre A. S. Soaresa,b, Luiz Sergio F. Carvalhoa,b, Isabella Bonilhaa,b, Vitor W Virginioa,b, Wilson Nadruz Juniora, Otavio Rizzi Coelho-Filhoa, Jose C. Quinaglia e Silvac, Orlando
Petrucci Juniord, Andrei C. Spositoa,b; on behalf of Brasilia Heart Study Group
aCardiology Division, State University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
b Laboratory of Atherosclerosis and Vascular Biology, State University of Campinas, Campinas, São
Paulo, Brazil
c Hospital de Base do Distrito Federal, Brasilia, Distrito Federal, Brazil.
d Cardiac Surgery Division, State University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
Figures: 4 Tables: 1 Supplementary: Tables 4
Corresponding author
Professor Andrei C. Sposito, M.D. Ph.D.
Laboratory of Atherosclerosis and Vascular Biology (AteroLab) Cardiology Department, State University of Campinas (Unicamp) 13084-971, Campinas, SP, Brazil
Phone: +55 19 3521 9590 Fax: +55 19 3289 4107
ABSTRACT
Background and aims: Coronary reperfusion with HDL from healthy volunteers attenuates ischemia and reperfusion injury in animal models. In myocardial infarct (MI) patients, such an interaction is unclear. Hence, we verify if there is interaction between HDL-C and MI mass in patients and, if so, if coronary reperfusion is required. Further, we investigated whether this cardioprotective effect differs between HDL obtained from healthy participants or from those with MI.
Methods: HDL-C was measured in first day after MI and MI mass was quantified by Cardiac Magnetic Resonance (n=94) and peak CKMB (n=393). In an ex-vivo rat heart model, we compared MI area and dP/dt max after coronary reperfusion with HDL from the MI patients or healthy volunteers.
Results: In general, HDL-C above median (35mg/dL) was associated with higher peak CKMB [255(145-415) vs. 136(84-287)UI/L; p=0.02], higher MI mass [17(9-21) vs. 10(6-14)g; p<0.01] and lower left ventricular ejection fraction [51(43-59) vs. 47(34-53);p=0.02], than their counterparts. In restricted cubic spline and multivariate linear regression, HDL-C was directly associated with peak CKMB (p<0.01) and MI mass (p<0.01) only in reperfused patients with time to reperfusion <4h. Reperfusion with healthy HDL, but not from MI patients, reduced MI mass (p<0.01) and improved dP/dt max (p=0.02).
Conclusions: In MI patients submitted to early coronary reperfusion, HDL-C levels at admission are directly associated with MI size. In contrast to healthy HDL, reperfusion with HDL from MI patients do not reduce MI area in ex vivo animal model.
Keywords: Myocardial infarction, High-Density Lipoprotein, Ischemia-Reperfusion Injury, Cardiac Magnetic Resonance, MB Creatine Kinase
INTRODUCTION
Early reperfusion stands as a main goal for patients presenting with ST segment elevation myocardial infarction (STEMI) and the reason for the substantial reduction in lethality in the last decades [1]. Still, mechanisms of cellular injury are triggered by reperfusion and may result in up to 50% of the final mass of myocardial infarction (MI) adversely affecting the prognosis of the patients [2]. Hence, attenuation of ischemia/reperfusion (I/R) injury has become the new frontier for further declines in short- and long-term mortality after STEMI.
Recently, coronary reperfusion with high-density lipoprotein (HDL) reduced myocardial I/R injury in ex vivo [3] and in-vivo [4] animal models. In contrast, in patients, the association between plasma HDL-cholesterol (HDL-C) levels and clinical outcome after acute coronary syndromes is controversial [5-8] with few studies focusing in STEMI population [6, 9]. The duration of coronary occlusion and the extent of myocardial injury seem to justify the inconsistency in these findings [6, 10]; prolonged occlusions resulting in extensive MI mass hypothetically minimize the protective role of HDL. However, in animal models using permanent ligation of left descending coronary artery, higher HDL levels were still associated with smaller scars, better LV function and survival at long term [11]. Thus, we defined as the first objective for this study the investigation of the role of reperfusion in the interaction between HDL and MI mass.
Confirming in humans the animal model findings of a protective role of HDL in MI is challenging because, in this condition, available HDL is exposed to the acute phase inflammatory response and over a long period to risk factors that preceded the coronary event. Indeed, HDL in patients who manifest MI is often dysfunctional with reduced antioxidant and anti-inflammatory activities [12, 13]. In addition, the acute inflammatory and oxidative response elicited to promote tissue repair after MI affects most of HDL capabilities, such as lipid transfer [14], antioxidant and anti-inflammatory actions [15]. The changes in HDL composition and structure not only attenuate HDL protective functions, but also can turn HDL into a dysfunctional pro-inflammatory particle [15]. Therefore, HDL particles from MI patients may interact differently with mechanisms of I/R injury during acute phase of STEMI. Testing this hypothesis is the second objective of this study.
In this sense, the present study was designed to verify if the association between the mass of HDL and infarcted mass in STEMI patents is influenced by the presence and time to coronary reperfusion and, if so, if the effect on the I/R lesion may differ when the infusion is made from healthy HDL or HDL from patients with MI.
