UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
EVERTON LIRA FAÇANHA
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO EPITÉLIO SEMINÍFERO: UMA REVISÃO SISTEMÁTICA
NATAL JUNHO/ 2019
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO EPITÉLIO SEMINÍFERO: UMA REVISÃO SISTEMÁTICA
por
EVERTON LIRA FAÇANHA
ORIENTADOR: PROF. DR. CARLOS AUGUSTO GALVÃO BARBOZA.
NATAL JUNHO/2019
Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO EPITÉLIO
SEMINÍFERO: UMA REVISÃO SISTEMÁTICA
elaborada por Everton Lira Façanha
e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de BACHAREL EM BIOMEDICINA Natal, 07 de junho de 2019. BANCA EXAMINADORA _________________________________________ Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
(Departamento de Morfologia – UFRN)
_________________________________________ Prof. Dra. Naisandra Bezerra da Silva
(Departamento de Morfologia – UFRN)
_________________________________________ Prof. Esp. Diego Filgueira Albuquerque
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede Façanha, Everton Lira.
Efeito do laser de baixa intensidade no epitélio seminífero: uma revisão sistemática / Everton Lira Façanha. - 2019.
35f.: il.
Monografia (Graduação)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Biologia Estrutural e Funcional, Natal, 2019.
Orientador: Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.
1. Laserterapia - Monografia. 2. Testículo - Monografia. 3. Espermatogênese - Monografia. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título.
RN/UF/BCZm CDU 612.616
AGRADECIMENTOS
A Deus, pоr tеr mе dado saúde е forças pаrа superar аs dificuldades.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade dе fazer um curso de tamanha qualidade.
À minha família, por ter me dado todo o amor e suporte que precisei durante essa trajetória. Em especial aos meus pais. A meu pai, meu exemplo, meu herói, minha base e a minha mãe, que foi quem me ensinou que amor de verdade não tem preços, não tem limites, não há nada que não possa superar. Obrigado por tudo.
A uma pessoa mais que especial na minha vida, a Diego Campelo, que apesar de só ter passado a fazer parte dessa trajetória no meio do caminho, se tornou um personagem principal, um pilar, um refúgio. Obrigado por existir.
À banca avaliadora, pela ajuda na conclusão dessa jornada.
Ao Prof. Carlos Augusto, mеu orientador, por me acompanhar desde o início da graduação, por todas as oportunidades que me apresentou e pela imensa paciência para comigo.
Ao corpo docente, direção е administração do Centro de Biociências, pelo seu importante papel na minha formação.
Aos meus amigos, que me acompanharam no decorrer dessa trajetória. Aos amigos da minha sala, aos da monitoria, aos que fiz em outras turmas, aos que conheci de outros cursos. De todos, um agradecimento especial à Sayara, Marília, Thays, Bárbara e Lukais. Vocês tornaram meus dias mais felizes e me deram forças nos momentos em que dava vontade de desistir. Não teria sido a experiência incrível que foi sem vocês.
RESUMO
A laserterapia tem se mostrado eficiente no tratamento de diversas lesões teciduais, porém pouco se sabe sobre a influência da sua aplicação no testículo. Este trabalho teve como objetivo revisar na literatura científica estudos que avaliaram o efeito do laser de baixa intensidade no epitélio seminífero. A pesquisa foi realizada nas bases de dados PubMed/MEDLINE, Scopus, Web of Science e LILACS. Das 354 referências encontradas na busca inicial, foram selecionadas cinco que se adequaram aos critérios da revisão. Em geral, os estudos mostraram que a laserterapia promoveu um efeito positivo na população de células germinativas, porém houve variação considerável nos parâmetros do laser, bem como nos modelos experimentais e metodologias de análise tecidual. Assim, conclui-se que há a necessidade de mais estudos nesta área, visando determinar os parâmetros bioestimulatórios da laserterapia no testículo, de modo a embasar sua possível utilização na recuperação do epitélio seminífero humano, o que pode representar uma perspectiva clínica no tratamento de algumas disfunções reprodutivas masculinas.
ABSTRACT
Lasertherapy has been shown to be efficient in the treatment of various tissue damages, but little is known about the influence of its application on the testis. The aim of this study was to review the scientific literature about studies that evaluated the effect of the low intensity laser in the seminiferous epithelium. The research was carried out in PubMed/MEDLINE, Scopus, Web of Science, and LILACS databases. From the 354 references found in the initial search, five fit the review criteria and were selected for this review. In general, studies have shown that laser therapy promoted a positive effect on the germ cell population, but there was considerable variation in the laser parameters, as well as in the experimental models and tissue analysis methodologies. Thus, it is concluded that there is a need for further studies in this area, aiming to determine the biostimulatory parameters of the laser therapy in the testis, in order to justify its possible use in the recovery of the human seminiferous epithelium, which may represent a clinical perspective in the treatment of some male reproductive dysfunctions.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...7
LISTA DE FIGURAS...8 LISTA DE APÊNDICES...9 LISTA DE QUADROS...10 1. INTRODUÇÃO...11 2. OBJETIVOS...14 3. MÉTODOS...15 4. RESULTADOS...17 5. DISCUSSÃO...25 6. CONCLUSÃO...29 REFERÊNCIAS...30 APÊNDICE...34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS TLBI COX FSH LH STZ ATP CAMP ROS
Terapia Laser de Baixa Intensidade Citocromo c Oxidase
Hormônio Folículo Estimulante Hormônio Luteinizante
Estreptozotocina Adenosina Trifosfato
Adenosina Monofosfato Cíclico Espécies Reativas de Oxigênio
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Diagrama do fluxo das pesquisas bibliográficas e critérios de elegibilidade empregados...18
LISTA DE APÊNDICES
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Dados dos experimentos utilizados na revisão...20 Quadro 2 – Parâmetros analisados, intervalos experimentais e principais resultados dos experimentos utilizados na revisão...24
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1. INTRODUÇÃO
De modo geral, a infertilidade conjugal é definida como a incapacidade de um casal para alcançar a concepção ou levar uma concepção a termo após um ano ou mais de relações sexuais regulares, sem proteção contraceptiva. Tal condição atinge, em escala global, cerca de 15% dos casais, sendo o homem a causa raiz em cerca de 20% dos casos e contribui em outros 30% a 40% [1]. De acordo com Agarwal et al [2], pelo menos 30 milhões de homens em todo o mundo são considerados inférteis, havendo uma maior incidência na Europa Oriental e na África. Porém, devido a fatores como a atribuição arbitrária da infertilidade à mulher e a indisponibilidade de muitos homens em se submeter a avaliação de fertilidade, especula-se que tal número trata-se de subestimação da taxa real de infertilidade masculina em nível global.
Diversos fatores estão relacionados ao prejuízo na fertilidade masculina. Dentre eles destacam-se: infecções no trato urinário; obstruções a nível epididimal ou ductal; distúrbios hormonais (FSH/ LH e testosterona); trauma testicular; fatores imunológicos; quimioterapia e radioterapia; e diabetes. A exposição a produtos químicos – em especial nematocidas, organofosfatos, estrogios, benzeno, vapores de soldagem, zinco, chumbo, cádmio e mercúrio – pode ter efeitos anti-espermatogênicos. Várias drogas sociais, incluindo tabaco, álcool, maconha e narcóticos, são potencialmente anti-espermatogênicas, embora em geral se faça necessário um uso frequente para ocorrer a manifestação de efeitos adversos [3,4]. Além disso, estão bem estabelecidas diversas causas genéticas responsáveis por 10% a 15% dos casos de infertilidade [5], incluindo anomalias cromossômicas e mutações unigênicas que influenciam, em diferentes níveis, muitos processos fisiológicos envolvidos na reprodução masculina, como a homeostase hormonal, espermatogênese e qualidade espermática [6]. Por fim, existem casos onde a causa da infertilidade não é identificada, sendo estes classificados como idiopáticos [7].
Aumentos na temperatura escrotal, embora dentro da faixa fisiológica, também pode afetar negativamente a qualidade espermática [8]. Considera-se que 1° C acima da faixa ideal de temperatura já leva a uma queda de 14% na espermatogênese e, consequentemente, numa menor produção de espermatozoides [9]. Existem diversos eventos ambientais e ocupacionais que
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levam ao aquecimento dos testículos [10,11]. Ambientes quentes, roupas apertadas, uso de laptops próximo à região dos testículos, prática do ciclismo, dentre outros, são eventos que causam elevações pontuais da temperatura testicular [12]. Varicocele, criptorquidia, episódios de febre e obesidade são condições que prejudicam a termorregulação testicular, o que a longo prazo pode prejudicar em caráter permanente a espermatogênese. Os efeitos prejudiciais da exposição ao calor nos parâmetros espermáticos e na fertilidade masculina tendem a se acumular com a exposição repetida ao longo de um período de tempo [13].
Diversos estudos confirmam que o diabetes tem efeitos deletérios na microestrutura dos testículos. Ebokaiwe et al [14] mostrou que o diabetes induzido por estreptozotocina (STZ) causa alterações nos testículos, como degeneração do conteúdo tubular seminífero (células da linhagem germinativa) e perda ou atrofia das células de Leydig nas áreas intersticiais adjacentes. Além disso, Khaneshi et al. [15] também mostrou diâmetro tubular reduzido em ratos diabéticos por indução com STZ, bem como conteúdos celulares reduzidos nos túbulos seminíferos e atrofia de células de Leydig.
A laserterapia ou terapia laser de baixa intensidade (TLBI) consiste na aplicação de luz, de forma contínua ou pulsada, dentro da faixa próximo ao infravermelho (entre 600 e 1100 nm), com o objetivo de promover reparo tecidual, diminuir a inflamação e promover analgesia [16]. É uma forma de terapia não invasiva e com densidades de energia e comprimentos de onda capazes de penetrar facilmente nos tecidos, resultando em efeitos de fotobiomodulação em células e tecidos de diversas camadas [17].
Na literatura são descritos diversos mecanismos que levam a respostas em nível molecular, celular e tecidual, que resultam em proliferação celular e reparo tecidual, incluindo aumento do metabolismo, atividade mitocondrial, proliferação, migração, adesão, diferenciação, secreção da matriz extracelular, mineralização e inibição da apoptose [18]. Em nível mitocondrial, diversos experimentos mostram que o estímulo luminoso age principalmente na enzima Citocromo c Oxidase (COX), parte do complexo de enzimas que gerencia a cadeia transportadora de elétrons, resultando no aumento do potencial de membrana mitocondrial, que por sua vez leva a um aumento na síntese de adenosina trifosfato (ATP), adenosina monofosfato cíclico (cAMP) e espécies reativas de oxigênio (ROS) [19]. Em paralelo a isso,
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ocorre um aumento na ativação de diversos fatores de crescimento, na síntese de óxido nítrico, RNA, DNA, síntese protéica, aumento nas concentrações intracelulares de cálcio [20].
As aplicações in vitro da TLBI em células da linhagem germinativa masculina são bem descritas na literatura e concentram-se em promover uma melhora na qualidade dos parâmetros espermáticos em amostras de sêmen. Diversos estudos descrevem, além do já descrito aumento nos níveis de ATP, um aumento no influxo de cálcio via bombas celulares, que por sua vez, tem impacto positivo fundamental na motilidade dos espermatozoides [21, 22].
Por outro lado, as aplicações in vivo do laser de baixa intensidade, diretamente no tecido germinativo, com o objetivo de promover proliferação celular e visando reverter um possível quadro de infertilidade, é um campo com um grande potencial, porém é pouco explorado. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é promover uma revisão sistemática de literatura sobre trabalhos que relatam os efeitos primários e secundários no tecido testicular, evidenciando e promovendo uma análise crítica sobre os principais achados.
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2. OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Promover uma revisão sistemática de literatura sobre trabalhos que relatam os efeitos primários e secundários do uso de laser de baixa intensidade na bioestimulação do tecido testicular, evidenciando e promovendo uma análise crítica sobre os principais achados.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
▪ Identificar os parâmetros da laserterapia utilizados nos estudos experimentais, visando estabelecer um possível protocolo para futuros estudos experimentais;
▪ Promover uma análise comparativa entre as metodologias empregadas, bem como entre os resultados encontrados, para identificar um modelo experimental adequado.
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3. MÉTODOS
3.1. Bases de Pesquisa
A pesquisa bibliográfica computadorizada foi realizada em quatro bases de dados: PubMed/MEDLINE, LILACS (Literatura Latino-americana e do Caribe em Ciências da Saúde), Scopus e Web of Science. Todas as buscas foram finalizadas em 01 de maio de 2019.
3.2. Estratégia de Busca
A revisão sistemática foi elaborada de acordo com os critérios da Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta‐Analyses (PRISMA) [23]. Para a prospecção dos estudos procedeu-se o cruzamento dos principais descritores relacionados aos temas investigados, listados a seguir, de forma combinada por meio dos operadores booleanos “AND” e “OR”: "light therapy", "laser therapy", “photobiomodulation”, "low level laser therapy”, "laser radiation", “spermatogenesis”, “testicle”, “sperm”, “testis”, "male reproduction", "male fertility", "male infertility". Um software de gerenciamento de referências foi empregado para controlar os artigos avaliados e para remover duplicatas (EndNote, Thomson Reuters, Philadelphia, PA, USA).
3.3. Critérios de inclusão
Foram incluídos todos os artigos que constituíam estudos primários, avaliando o arranjo histológico do testículo em animais ou humanos submetidos à irradiação com laser de baixa intensidade, com descrição dos parâmetros da fotobiomodulação e do desenho experimental. Destes, foram selecionados os estudos com experimento in vivo, sem critério de exclusão de modelo experimental, com aplicação de laser de baixa intensidade em testículos, onde foi avaliado as possíveis alterações morfológicas na estrutura interna dos túbulos seminíferos resultantes.
3.4. Critérios de exclusão
Dos artigos selecionados, foram excluídos todos os artigos que estavam em línguas de alfabeto não latino. Além disso, foram eliminados todos os com
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experimento in vitro, os que o laser aplicado não estava na faixa de laser de baixa intensidade, todos os quais o laser não foi aplicado sobre o testículo, os que não mensuravam os efeitos bioestimulatórios do laser no tecido testicular, assim como todas as revisões.
3.5. Coleta de dados
Os dados coletados incluíram: os autores e o ano da publicação; o modelo animal utilizado, bem como o tamanho da amostra; se houve ou não indução de lesão tecidual; o tipo de laser utilizado, sua potência e o comprimento de onda empregado; a dose utilizada; o período de irradiação; o intervalo de tempo entre a irradiação e as análises teciduais; os parâmetros analizados; e os principais resultados obtidos.
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4. RESULTADOS
4.1. Seleção dos estudos
A busca inicial resultou em 102 artigos no banco de dados Pubmed/MEDLINE, 96 no Scopus, 108 no LILACS e 48 no Web of Science, totalizando 354 artigos. O esquema da busca dos artigos e do processo de seleção está demonstrado na Figura 1. Após a eliminação dos artigos duplicados, restaram 163 trabalhos. Após a análise dos títulos e resumos, foram selecionados 17 estudos para triagem dos textos completos. Destes 12 foram excluídos, cinco foram por serem revisões, dois por não estar em idioma latino, dois por avaliarem somente o nível de testosterona após a aplicação do laser e três por avaliarem somente o efeito do laser nos parâmetros espermáticos. As análises foram, portanto, realizadas nos cinco restantes.
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Figura 1 – Diagrama do fluxo das pesquisas bibliográficas e critérios de seleção
adotados, adaptado do Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta‐ Analyses (PRISMA) [23].
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4.2. Características dos estudos
No quadro 1, os dados apresentados nos estudos mostram uma significativa variação nos modelos animais utilizados nos trabalhos, tendo três deles usado ratos
Sprague Dawley albino [24-26], um usado carneiros [27] e um camundongos sírios
[28]. A preferência por animais de maior porte pode ser justificada quando o estudo objetiva avaliar também os efeitos da TLBI no ejaculado [27]. Três estudos foram realizados em tecido testicular íntegro [24-26], enquanto os outros dois avaliaram o efeito da laserterapia em animais submetidos a um modelo de lesão por exposição a calor [26] ou em animais com diabete induzida [28].
O tipo de laser utilizado em todos os trabalhos foi do tipo diodo utilizado com comprimentos de onda no espectro infravermelho variando de 808 nm a 904 nm e com potências variando de 1.08 mW a 6.5 W. A quantidade total de energia depositada no tecido alvo foi comum em três artigos (doses de 28 e 46 J/cm²) [24-26], porém nos outros dois trabalhos houve uma variação de dosagem, sendo a de Alves et al [27] com doses de 28 e 56 J/cm2 e a de Dadras et al [28] com doses 0,2
J/cm² e0,03 J/cm². A preferência por usar pequenas doses em intervalos fixos ao invés de uma única dose maior foi a estratégia empregada em todos os casos. Nos trabalhos de Bermúdez et al [24-25] e Taha and Valojerdi [26] foram aplicadas doses de, respectivamente, 1,87 J/cm² (G2 - 28,05 J/cm²) e 3,12 J/cm² (G3 - 46,80 J/cm²), uma vez ao dia, por 15 dias. Já no estudo de Alves et al [27] as doses passaram a ser decrescentes (de 5 J/cm2 a 2 J/cm² em um grupo e 10 J/cm2 a 4 J/cm2 no outro),
com uma irradiação a cada 48h, por 15 dias. Por fim, no trabalho de Dadras et al [28] as doses aplicadas voltam a serem fixas (0,2 J/cm² e 0,03 J/cm², respectivamente), três vezes por semana, por três semanas.
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Quadro 1 – Dados dos experimentos utilizados na revisão.
Autor (ano) Modelo animal (n) Lesão (tempo) Tipo de
Laser (composição)
Comprimento de
onda Potência Dose Período de irradiação
Bermúdez et al. [24] Ratos (45) Sem lesão
Laser diodo infravermelho (nd) 904 nm 6,5 W G2 – Dose diária = 1,87 J/cm2 e Dose Total = 28,05 J/cm2 G3 – Dose diária = 3,12 J/cm2 e Dose Total = 46,80 J/cm2 G2 = 15 dias, 1 vez ao dia, por 3 minutos G3 = 15 dias, 1 vez ao
dia, por 5 minutos
Bermúdez et al. [25] Ratos (45) Sem lesão
Laser diodo infravermelho (nd) 904 nm 6,5 W G2 – Dose diária = 1,87 J/cm2 e Dose Total = 28,05 J/cm2 G3 – Dose diária = 3,12 J/cm2 e Dose Total = 46,80 J/cm2 G2 = 15 dias, 1 vez ao dia, por 3 minutos G3 = 15 dias, 1 vez ao
dia, por 5 minutos.
Taha and Valojerdi [26] Ratos (nd) Sem lesão
Laser diodo infravermelho (GaAlAs) 830 nm 30 mW G2 – Dose diária = 1,87 J/cm2 e Dose Total = 28,05 J/cm2 G3 – Dose diária = 3,12 J/cm2 e Dose Total = 46,80 J/cm2 G2 = 15 dias, 1 vez ao dia, por 67 segundos. G3 = 15 dias, 1 vez ao dia, por 117 segundos.
Alves et al [27]
Carneiros White Dorper
(6) Aquecimento por calor (72 horas) Laser diodo infravermelho (GaAlAs) 808 nm 30 mW INS28 = 5 J/cm2 (D1 e D2), 4 J/cm2 (D3 e D4), 3 J/cm2 (D5 e D6) e 2 J/cm2 (D7 e D8) INS56 = 10 J/cm2 (D1 e D2), 8 J/cm2 (D3 e D4), 6 J/cm2 (D5 e D6) e 4 J/cm2 (D7 e D8)
EXP1 = 15 dias, 1 vez a cada 48hs Carneiros White Dorper (20) 5 J/cm2 (D1 e D2), 4 J/cm2 (D3 e D4), 3 J/cm2 (D5 e D6) e 2 J/cm2 (D7 e D8)
EXP2 = 15 dias, 1 vez a cada 48hs
Dadras et al [28] Camundongos sírios (15) Diabetes 1 induzida por estreptozotoc-ina (xx dias) Laser diod o infravermelho (nd) 890 nm 1.08mW G2 – 0.03J/cm2 G2 – 30s por dia, 3x na
semana, por 3 semanas. G3 – 0.2J/cm2 G3 – 200s por dia, 3x na
semana, por 3 semanas. D: dia do experimento; EXP1: experimento 1; EXP2: experimento 2; G2: grupo 2; G3: grupo 3; INS28: grupo com dose total de 28 J/cm²; INS56: grupo com dose total de 56 J/cm²; nd: dado não determinado.
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O quadro 2 mostra os parâmetros de análise, os intervalos experimentais e os principais achados de cada estudo. Os dois artigos de Bermúdez et al [24 e 25] apresentam similaridades metodológicas, tanto em termos de metodologia aplicada quanto em termos de parâmetros analisados, diferenciando-se apenas nos tempos experimentais. Ambos mensuraram o conteúdo de DNA dos grupos experimentais, inferindo o efeito do laser em tecido sadio após 24h [24] e 15 dias [25]. Ambos usaram 45 ratos Sprague Dawley albinos machos, dividido em três grupos de 15 animais cada, onde o grupo 1 não foi irradiado e serviu como controle, os grupos 2 e 3 foram expostos às doses laser: 28,05 e 46,80 J/cm2, respectivamente. Os dados
de ambos os estudos revelaram aumento no conteúdo de DNA de células germinativas expostas ao TLBI in vivo, em especial no grupo que de 28,05J. A sensibilidade das células germinativas ao laser pareceu estar relacionada ao seu estágio de diferenciação e à energia de radiação aplicada, tendo sido as espermatogônias as mais sensíveis. Em todos os casos, a dosagem mais baixa induziu a maior alteração.
No trabalho de Taha and Valojerdi [26] foi investigado os efeitos imediatos do laser nas características quantitativas e qualitativas do epitélio seminífero e na ultraestrutura das células germinativas e de Sertoli nos testículos irradiados. Foi usado a mesma metodologia dos trabalhos de Bermúdez et al. [24 e 25], sendo nesse trabalho feito uma análise morfométrica, assim como uma análise quantitativa e uma qualitativa dos tipos de células. Foi observado que o número de células germinativas, especialmente os espermatócitos paquíteos e espermátides alongadas, aumentaram após a radiação laser de 28,05 J/cm2. As características
ultraestruturais das células germinativas e de Sertoli nesse grupo foram semelhantes às do grupo controle, enquanto que a irradiação de 46,80 J/cm2 teve efeito deletério
sobre o epitélio seminífero, como a dissociação de espermátides imaturas e alterações ultraestruturais evidentes nas mesmas.
Alves et al [27] adicionou um novo fator às metodologias anteriores. Diferente dos três trabalhos anteriores, nesse houve indução de degeneração do tecido germinativo por calor nos modelos animais usados. O estudo foi dividido em duas etapas. Foi feito termografia escrotal e avaliação de imagens assim como análise histopatológica. Na primeira etapa, seis carneiros saudáveis da raça White Dorper foram submetidos a sacos aquecidos aderidos à região escrotal durante 72 h, para
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induzir degeneração testicular. Após um intervalo de três dias, os animais foram divididos em três grupos: INS, sem tratamento (grupo controle; n = 2); INS28, tratado por TLBI usando 28 J/cm2 (n = 2); e INS56, tratados por TLBI usando 56 J/cm2 (n =
2). O grupo INS28 apresentou menor proporção de área da luz e menor grau de degeneração. Na segunda etapa foi utilizado a metodologia do grupo INS28. 20 carneiros saudáveis foram divididos em 4 grupos experimentais. O grupo CC, não submetido ao aquecimento escrotal e não tratados com TLBI (grupo controle; n = 5), o CL, não submetido ao aquecimento escrotal e tratado com TLBI (n = 6), o IC, submetido ao aquecimento escrotal e não tratado com TLBI (n = 3) e o IL, submetido ao aquecimento escrotal e tratado com TLBI (n = 6). Não foi observada diferença significativa entre os grupos. Por outro lado, observou-se que a dose aplicada (28 J/cm2) pode aumentar a quantidade de células no túbulo seminífero em carneiros
bem como acarretar efeitos deletérios nos parâmetros seminais.
Por fim, o trabalho de Dadras et al [28] avaliou o efeito do laser de baixa intensidade em tecidos testiculares em modelos de diabetes tipo 1 induzida por estreptozotocina (STZ), avaliando os parâmetros estereológicos, incluindo números de espermatogônias, espermatócitos primários, espermátides, Sertoli e, células de Leydig, túbulos seminíferos, e volume testicular e volume do testículo intersticial, assim como fatores de análise espermática. Nesse trabalho, 15 camundongos sírios machos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos, albergando cinco animais cada: (1) grupo controle; (2) primeiro grupo laser (890nm; 80Hz; 0,03 J/cm2; 3 vezes
por semana; 3 semanas); e (3) segundo grupo laser (mesmos parâmetros, alterando a dose para 0,2 J/cm2). Um aumento significativo foi observado na contagem de
células de Sertoli em ambos os grupos irradiados, em comparação com o grupo controle, sendo o do G3 significativo maior em comparação com o G2. Ambos os grupos irradiados mostram um aumento significativo na contagem de células de Leydig, em comparação com o grupo controle. Houve um aumento significativo na espessura dos túbulos seminíferos em ambos os grupos irradiados, em comparação com o grupo controle, sendo o do G3 grupo irradiado significativamente maior em comparação com o G2. Além disso, a densidade de energia de 0,2J/cm2 foi
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Dois estudos [27 e 28] avaliaram também os efeitos da TLBI nos parâmetros seminais. Todavia, por não estarem incluídos no objetivo do presente estudo, estes dados não foram considerados na nossa análise.
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EX1: experimento 1; EX2: experimento 2; INS28: grupo com dose de 28 J/cm²; nd: dado não determinado.
Quadro 2 – Parâmetros analisados, intervalos experimentais e principais resultados dos experimentos utilizados na revisão.
Autor Parâmetros de análise
Intervalos experimentais (após irradiação)
Principais resultados
Bermúdez et al. [24] Análise do conteúdo de DNA 24 horas Aumentos no conteúdo de DNA de células germinativas após 24hs, em especial no grupo que de 28,05J. Bermúdez et al. [25] Análise do conteúdo de DNA 15 dias Aumentos no conteúdo de DNA de células germinativas após 15 dias, em especial no grupo que de 28,05J.
Taha and Valojerdi [26]
Análise morfométrica; Análise quantitativa; Análise qualitativa.
nd
O número de células germinativas, especialmente os espermatócitos paquíteos e espermátides alongadas, aumentaram após a radiação laser de 28,05 J/cm2;
As características ultraestruturais das células germinativas e de Sertoli nesse grupo foram semelhantes às do grupo controle;
A irradiação de 46,80 J/cm2 teve efeito deletério sobre o epitélio seminífero, como a dissociação de
espermátides imaturas e alterações ultraestruturais evidentes nas mesmas.
Alves et al [27]
Termografia escrotal e avaliação de imagens; Avaliação seminal; Histopatologia.
EXP1 = 14 dias O INS28 apresentou menor proporção de área da luz e menor grau de degeneração; No experimento 2, não houve diferença entre os grupos;
A TLBI com energia de 28 J/cm2 (808 nm de comprimento de onda e 30 mW de potência) pode induzir os
danos espermáticos e aumentar a quantidade de células no túbulo seminífero em carneiros. EXP2 = 56 dias
Dadras et al [28] Análise histopatológica
Avaliação seminal 3 semanas
Um aumento significativo foi observado na contagem de células de Sertoli em ambos os grupos TLBI, em comparação com o grupo controle, sendo o do segundo grupo significativo maior em comparação com o primeiro;
Ambos os grupos irradiados mostram um aumento significativo na contagem de células de Leydig, em comparação com o grupo controle;
Houve aumentos significativos na espessura dos túbulos seminíferos em ambos os grupos irradiados, em comparação com o grupo controle, sendo o do segundo grupo irradiado significativamente maior em comparação com o primeiro;
Além disso, o PBM com densidade de energia de 0,2 J/cm2 foi estatisticamente mais eficaz, comparado
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5. DISCUSSÃO
Na medicina, a terapia com laser de baixa intensidade já tem aplicações bem estabelecidas, das quais as mais comumente usadas são: aplicação do laser em locais lesionados para promover a cicatrização, remodelação e/ou redução da inflamação; em nervos para induzir analgesia; nos gânglios linfáticos, a fim de reduzir edema e inflamação; e em pontos de gatilho (um único de até 15 pontos) para promover o relaxamento muscular e reduzir a sensibilidade. Uma vez que não é invasivo, o TLBI é muito útil para pacientes com fobia por agulha ou para aqueles que não podem tolerar terapias com medicamentos anti-inflamatórios não esteroides [29].
Anteriormente, pensava-se que a terapia a laser de baixa intensidade era apenas de natureza auxiliar, sendo prescrita em conjunto com a terapia medicamentosa ou na fase final do tratamento tradicional [30], mas estudos posteriores refutam completamente essa visão. Por seu efeito bioestimulador ser bem estabelecido na literatura [31], é intuitivo aferir que a terapia a laser deveria também ser usada no tratamento de homens com algum grau de infertilidade. Tal possibilidade mostra-se ainda mais atrativa perante o fato de ser um método de baixo custo, não invasivo, indolor e praticamente livre de efeitos colaterais. Já existem estudos e aplicações clínicas do laser no tocante a reprodução masculina [32], mas na literatura ocidental ainda pouco se sabe sobre os efeitos bioestimulatórios do laser de baixa intensidade na morfologia do tecido testicular.
Nos trabalhos de Bermúdez et al. [24 e 25] foi observado que a radiação laser IR produziu um aumento no conteúdo de DNA das células germinativas tanto após 24h da última aplicação do laser quando após um ciclo do epitélio seminífero, que Clermont e Harvey [33] mostram ser 12,9 dias (menos do que o período de repouso de 15 dias do presente estudo). Este aumento foi dependente da dose aplicada e também foi relacionado com o estágio de diferenciação de células germinativas. Quinze dias após a irradiação, a proporção de espermatogônias com um conteúdo de DNA 4c aumentou em comparação com a dos controles, enquanto a proporção com o conteúdo de DNA 2c diminuiu, especialmente após a dose de 28,05 J/cm2.
Tal fato pode ser decorrente a uma modificação induzida pelo laser nas fases do ciclo celular das espermatogônias e, subsequentemente, do ritmo mitótico [34].
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No trabalho de Taha and Valojerdi [26] observou-se que nos animais irradiados a 28,05 J/cm2 comparados com outros dois grupos, o número médio de
espermatócitos paquíteos aumentou, enquanto o das espermatogônias diminuiu significativamente. Em contrapartida, foi observado nos animais irradiação a 46,80 J/cm2 efeitos deletérios sobre o epitélio seminífero, como a dissociação de
espermátides imaturas e alterações ultraestruturais evidentes nas mesmas. No caso da dose de 28,05 J/cm2, isso pode ser explicado pela aceleração do ritmo meiótico
que significa a estimulação da espermatogênese por baixas doses de luz laser. Além disso, o número médio de espermátides arredondadas imaturas a 28,05 J/cm2,
comparado com outros dois grupos, diminuiu significativamente e o de espermátides maduras alongadas aumentou. Estas alterações também podem ser explicadas pela aceleração no processo de maturação das espermátides que resultou em realce espermático alongado. Já no de 46.8 J/cm2, a mais provável explicação é que a
partir de um limiar de dose, o laser passa a apresentar efeitos negativos no tecido. Também foi observado que não houve degeneração ou diminuição das células de Sertoli após a radiação laser, tendo o laser, em ambas as doses utilizadas, resultado na hipertrofia das células de Sertoli. Essa mudança pode ser devido ao suporte de células de Sertoli necessário para o aumento de células germinativas a 28,05 J/cm2
ou aumento da atividade fagocítica de células séricas após a irradiação de 46,80 J/cm2.
Como pode ser observado, esse estudo também conclui que baixas doses de laser podem acelerar o ritmo meiótico e mitótico na espermatogênese e podem resultar em aumento do número de células germinativas, especialmente espermatócitos primários e espermátides alongadas, o que está de acordo com os resultados obtidos por Bermudez et al. [24 e 25] e Porras et al. [34], sugerindo que TLBI provavelmente modifica os comprimentos de fase do ciclo celular das espermatogônias e acelera o ritmo mitótico.
O trabalho de Alves et al [27], diferente dos anteriores, adicionou aos modelos animais usados, que diferente dos outros, eram animais de grande porte (Carneiros), um parâmetro de degeneração de tecido alvo, induzida por exposição ao calor. O primeiro experimento teve como objetivo estabelecer um protocolo de tratamento de TLBI que seria usado no segundo experimento, visando determinar qual a melhor dose de energia para aplicar nos testículos de carneiros. Os resultados das
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características histopatológicas da proporção do lúmen e do grau de degeneração sugerem que o TLBI com 28 J/cm2 foi melhor que o TLBI com 56 J/cm2. Assim, este
protocolo foi eleito no segundo experimento. Com o estimulo na síntese de ATP, o laser promove a proliferação de células e esta proliferação foi observada nas características histopatológicas dos testículos no experimento 1.
A proporção de área do lúmen do túbulo seminífero é menor no grupo tratado pelo TLBT com 28 J/cm2 do que no grupo não tratado e tratado por TLBI com 56
J/cm2, como observado por Taha e Valojerdi [26]. Consequentemente, denota que o
número de células era maior no grupo que tiveram menor proporção de área luminal. Embora o mesmo efeito não tenha sido observado no experimento 2, é possível notar que, aparentemente, a proporção de luz no grupo isolado tratado com TLBT foi menor do que no grupo isolado e não tratado. Essa diferença entre os padrões de histopatologia no experimento 1 e no experimento 2 pode ser explicada pelos diferentes tempos de avaliação.
O trabalho de Dadras et al [28], assim como o de Alves et al [27], introduz um parâmetro de degeneração nos modelos animais usados. Nesse caso, o parâmetro escolhido foi o diabetes tipo 1 induzida por estreptozotocina (STZ), condição conhecida na literatura por diminuir contagem de espermatozóides e sua motilidade, assim como aumentar o número de espermatozóides com morfologia anormal. Foram observados aumentos significativos na espessura dos túbulos seminíferos em ambos os grupos irradiados, em comparação com o grupo controle, sendo o do segundo grupo irradiado significativamente maior em comparação com o primeiro. Além disso, o irradiado com densidade de energia de 0,2 J/cm2 foi estatisticamente
mais eficaz, comparado ao 0,03J/cm2 modulou os fatores de análise espermática,
em comparação ao grupo controle no modelo experimental para o DM1 induzido por STZ.
Os autores concluíram que os efeitos do TLBI em vários tecidos e células não dependem da densidade de energia. Para testar essa afirmação, foi examinado o efeito de duas densidades de energia de TLBI em testículos de DM1 e posteriormente observado que a maior densidade de energia provoca melhorias significativas nos parâmetros estereológicos e nos fatores de análise espermática, em comparação com os grupos de menor densidade de energia e controle. Tal conclusão vai no caminho oposto aos achados de Taha and Valojerdi [26], cujos
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dados evidenciam efeitos deletérios do laser na morfologia do tecido, quando em doses elevadas. Vale salientar que devido ao fato do trabalho de Taha and Valojerdi [26] não apresentar modelo de lesão, diferente do de Dadras et al [28], onde a arquitetura testicular estava prejudicada pelo quadro de diabetes, a comparação entre os dois é no mínimo controversa.
A diversificação dos parâmetros dificulta uma correlação de resultados, em especial entre os modelos com e sem lesão tecidual. Mas os dados, mesmo que de forma pontual, evidenciam bioestimulação celular, que teve efeito direto na morfologia do tecido testicular. Tais efeitos em geral foram presentes nos grupos expostos a uma dose total de cerca de 28 J/cm2, o que nos permite presumir tal faixa
como ideal para bioestimulação. Grupos expostos a doses totais maiores apresentaram efeitos pouco satisfatórios, chegando em alguns casos a serem deletérios, o que nos permite delimitar um limiar entre os efeitos positivos e negativos do laser no tecido. O fato de ambos os grupos do trabalho de Dadras et al [28], com doses abaixo da faixa dos 28 J/cm2,terem apresentados efeitos positivos
apenas reforça tal faixa teórica.
Além do exposto, faz-se necessário também pontuar que a falta de padronização nos parâmetros da laserterapia abre vieses de questionamentos quanto à comparação dos resultados citados acima, o que só reforça a necessidade de uma melhor padronização metodológica, que resultaria em maior confiabilidade nos protocolos propostos para o uso da laserterapia no tecido testicular.
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6. CONCLUSÃO
Como foi possível observar, o campo da laserterapia de baixa intensidade aplicado ao tecido germinativo masculino, em especial em casos onde existe algum grau de lesão tecidual que esteja prejudicando a fertilidade do indivíduo, é bastante promissor. Porém, vale pontuar que, embora os resultados atuais sugiram sua possível utilização na terapia da infertilidade masculina, ainda há muito a ser esclarecido. Os dados publicados são escassos e não há padronização nos parâmetros da laserterapia e nos modelos experimentais, assim como há uma carência de dados quanto à avaliação morfológica do testículo submetido a este tratamento. São necessários mais estudos, mais dados, uma melhor padronização e, com dados mais sólidos em mãos, testes clínicos. Essa é uma área extremamente promissora e, com o avançar dos estudos, com potencial para se estabelecer como um tratamento em diversos casos de infertilidade masculina
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APÊNDICE
I. Descritores de pesquisa utilizados nas bases de dados
PubMed /Medline
("light therapy" OR "laser therapy" OR "photobiomodulation" OR "low level laser therapy" OR "laser radiation")) AND (spermatogenesis OR testicle OR sperm OR testis OR "male reproduction" OR "male fertility" OR "male infertility")
Scopus
((TITLE-ABS-KEY ("light therapy" OR "laser therapy" OR "photobiomodulation" OR "low level laser therapy" OR "laser radiation")) AND
((spermatogenesis OR testicle OR sperm OR testis OR "male reproduction" OR "male fertility" OR "male infertility))
Web of Science
("light therapy" OR "laser therapy" OR "photobiomodulation" OR "low level laser therapy" OR "laser radiation") AND
(spermatogenesis OR testicle OR sperm OR testis OR "male reproduction" OR "male fertility" OR "male infertility")
LILACS
(("light therapy" OR "laser therapy" OR "photobiomodulation" OR "low level laser therapy" OR "laser radiation")) AND ((spermatogenesis OR testicle OR sperm OR testis OR "male reproduction" OR "male fertility" OR "male infertility")).
