ENI MARIA DE SOUZA
Avaliação da expressão do vírus de Epstein-Barr e metaloproteinase 9 nas células de Hodgkin-Reed-Sternberg e correlação com os parâmetros clínicos e evolutivos em pacientes com Linfoma de
Hodgkin clássico no Brasil
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina -, para obtenção do título de Doutor em Ciências pelo programa de pós-graduação em Hematologia.
ENI MARIA DE SOUZA
Avaliação da expressão do vírus de Epstein-Barr e metaloproteinase 9 nas células de Hodgkin-Reed-Sternberg e correlação com os parâmetros clínicos e evolutivos em pacientes com Linfoma de
Hodgkin clássico no Brasil
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina -, para obtenção do título de Doutor em Ciências pelo programa de pós-graduação em Hematologia.
Orientador: prof. dr. José Salvador Rodrigues de Oliveira.
Souza, Eni Maria
Avaliação da expressão do vírus de Epstein-Barr e metaloproteinase 9 nas células de Hodgkin-Reed-Sternberg e correlação com os parâmetros clínicos e evolutivos em pacientes com Linfoma de Hodgkin clássico no Brasil . / Eni Maria de Souza. – São Paulo, 2010.
xx, 168f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em Hematologia
Título em inglês: Matrix Metalloproteinase-9 is consistently expressed in Hodgkin-Reed-Sternberg cells and has no impact on survival in patients with Epstein-Barr virus (EBV) related and non-related Hodgkin lymphoma in Brazil. 1. Linfoma de Hodgkin clássico 2. Vírus de Epstein-Barr 3. Metaloproteinase
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ONCOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA
Chefe do Departamento: prof. dr. José Orlando Bordin
iv
Eni Maria de Souza
Avaliação da expressão do vírus de Epstein-Barr e metaloproteinase 9 nas células de Hodgkin-Reed-Sternberg e correlação com os parâmetros clínicos e evolutivos em pacientes com Linfoma de
Hodgkin clássico no Brasil
PRESIDENTE DA BANCA:
PROF. DR. JOSÉ SALVADOR RODRIGUES DE OLIVEIRA
BANCA EXAMINADORA
TITULARES:
PROF. DR. EDMIR BOTURÃO NETO PROF. DR. EURÍPIDES FERREIRA
PROF. DR. MARCELLO FABIANO DE FRANCO PROFA. DRA. VALERIA BUCCHERI
SUPLENTES:
v Dedicatória
Ao meu marido Flavio, pelo amor, incentivo e paciência,
principalmente nestes últimos anos, quando da
realização desta tarefa.
Aos meus pais Benedito e Nair, que estiveram ao meu
vi
Agradecimentos
Ao prof. dr. José Salvador Rodrigues de Oliveira, pela competência, dedicação e paciência com que orientou este trabalho. Agradeço particularmente a confiança em mim depositada, assim como as palavras de incentivo para que eu pudesse levar avante esta jornada.
Ao prof. dr. Antonio Corrêa Alves, pelo acolhimento profissional e apoio pessoal a mim dedicados, sempre gentilmente disponível para revisão, reclassificação e leitura do material deste trabalho.
À profa. dra. Cristine Dobo, grande amiga, que, com grande competência, realizou as reações de imuno-histoquímica e hibridação in situ utilizadas nesta tese.
À profa. dra. Celina Tizuko Fujiyama Oshima, pesquisadora dedicada do Departamento de Patologia, UNIFESP/EPM, que não mediu esforços, colocando toda a sua experiência e o seu conhecimento à minha disposição para que este trabalho fosse realizado.
À profa. dra. Maria Aparecida Zanichelli, chefe do Serviço de Hematologia do Hospital Brigadeiro, quem primeiro visualizou a possibilidade de esta tarefa ser levada adiante como mais um desafio profissional.
Aos docentes da disciplina de Hematologia e Hemoterapia, pela receptividade, amizade e colaboração nesta etapa profissional.
Aos colegas do curso de pós-graduação e residentes da disciplina de Hematologia e Hemoterapia, pela amizade e carinho a mim dispensados.
vii
Aos docentes e funcionários do Departamento de Patologia, UNIFESP/EPM, pela valorosa ajuda na realização desta pesquisa.
Aos meus colegas da cidade de Santos prof. dr. José Carlos Medina Carvalho, prof. dr. José Eduardo Nicolau e prof. dr. Edmir Boturão Neto, pela sua valiosa contribuição na casuística deste trabalho.
Aos meus colegas Otavio Baiocchi e Mariane Gennari, pelas palavras de incentivo, apoio profissional e companheirismo que tiveram para mim durante a execução desta tarefa.
viii
SUMÁRIO
Dedicatória ... v
Agradecimentos ... vi
Lista de figuras ... x
Lista de quadros e tabelas ... xi
Lista de abreviaturas...xiii
Resumo ...xvi
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Objetivos ... 4
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 5
2.1 Conceito ... 6
2.2 Histórico ... 6
2.3 Epidemiologia e etiologia ... 7
2.4 Classificação ... 8
2.4.1 Linfoma de Hodgkin Predominância Linfocitária Nodular (LHPLN) ... 9
2.4.2 Linfoma de Hodgkin Clássico (LHC)... 10
2.5 Aspectos funcionais das células de HRS ... 12
2.5.1 Papel do vírus de Epstein-Barr ... 14
2.5.2 As metaloproteinases ... 17
2.6 Estadiamento ... 18
2.7 Tratamento ... 20
2.7.1 Tratamento da doença localizada... 20
2.7.1.1 Fatores prognósticos na doença localizada ... 20
2.7.1.2 Tratamento da doença localizada com prognóstico favorável ... 21
2.7.1.3 Tratamento da doença localizada com prognóstico desfavorável ... 22
2.7.2 Tratamento da doença avançada ... 23
2.7.2.1 Fatores prognósticos na doença avançada ... 25
2.7.2.2 Novos protocolos de tratamento ... 26
2.7.2.3 Papel da radioterapia na doença avançada ... 27
2.7.3 Doença refratária e recidivada ... 27
2.7.3.1 Tratamento para recidivas após RXT (exclusiva) para doença localizada ... 28
2.7.3.2 Tratamento da doença primariamente progressiva e recidivada após QT ... 28
ix
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 31
3.1 Método – imuno-histoquímica ... 34
3.2 Método da hibridação in situ ... 36
3.3 Avaliação das reações ... 37
3.4 Interpretação da positividade do EBV ... 40
3.5 Análise estatística... 40
4 RESULTADOS ... 41
4.1 Resultados gerais ... 42
4.2 Resultados relacionados ao EBV ... 51
4.3 Resultados relacionados à expressão de MMP-9 ... 56
5 DISCUSSÃO ... 62
6 CONCLUSÕES ... 75
7 ANEXOS ... 77
8 REFERÊNCIAS ...101
Abstract Apêndice
x
Lista de figuras
Figura 1. Reação de imuno-histoquímica para a LMP-1 em corte histológico de linfonodo com LH ... 39
Figura 2. Reação de imuno-histoquímica para a MMP-9 em corte histológico de linfonodo com LH ... 39
Figura 3. Hibridação in situ para EBER do EBV em corte histológico de
linfonodo com LH ... 39
Figura 4. Probabilidade de sobrevida global estimada pelo método de
Kaplan-Meier de acordo com o subtipo histológico ... 46
Figura 5. Probabilidade de sobrevida global estimada pelo método de Kaplan-Meier versus tempo de segmento em meses, de acordo com a
expressão de CD20 ... 49
Figura 6. Probabilidade de sobrevida livre de eventos estimada pelo método de Kaplan-Meier versus tempo de segmento em meses, de acordo com a expressão de CD20. ... 50
Figura 7. Porcentagem de pacientes EBV positivo e negativo, de acordo com a resposta ao tratamento ... 53
Figura 8. Probabilidade de sobrevida global estimada pelo método de
Kaplan-Meier, de acordo com a positividade para o EBV ... 54
Figura 9. Probabilidade de sobrevida livre de eventos estimada pelo método de Kaplan-Meier, estratificada de acordo com a positividade para o EBV ... 55
Figura 10. Probabilidade de sobrevida global estimada pelo método de
Kaplan-Meier, de acordo com a reatividade MMP-9.. ... 58
Figura 11. Probabilidade de sobrevida livre de eventos estimada pelo método de Kaplan-Meier, estratificada de acordo com a reatividade MMP-9... 59
Figura 12. Probabilidade de sobrevida global estimada pelo método de
Kaplan-Meier, de acordo com a variável EBV+MMP-9 ... 60
xi
Lista de quadros e tabelas
Quadro 1. Principais características clínicas dos quatro subtipos
histológicos do LHC... 11
Quadro 2. Estadiamento segundo Costswolds ... 19
Quadro 3. Sobrevida livre de progressão e sobrevida global em 5 anos, de acordo com o número de fatores prognósticos para doença avançada ... 25
Tabela 1. Número e porcentagem de pacientes nos diferentes grupos etários ... 42
Tabela 2. Número e porcentagem de pacientes com diferentes estádios ... 43
Tabela 3. Número e porcentagem de pacientes agrupados com doença
localizada (I e II) e doença avançada (III e IV) ... 43
Tabela 4. Resultados referentes ao teste de log rank para a comparação da sobrevida livre de eventos ... 44
Tabela 5. Resultados referentes ao teste de log rank para a comparação da sobrevida global ... 44
Tabela 6. Distribuição segundo os subtipos histológicos ... 45
Tabela 7. Número e porcentagem de acordo com os resultados da imuno-histoquímica ... 46
Tabela 8. Associação entre a expressão de CD20 e os dados demográficos, clínicos e histológicos ... 47
Tabela 9. Cálculo estatístico para SG e SLE em relação à expressão de CD20 ... 51
Tabela 10. Número e porcentagem de acordo com os resultados da IH para LMP-1 e HIS para EBER ... 51
Tabela 11. Número e porcentagem de pacientes agrupados de acordo com detecção do EBV ... 52
Tabela 12. Associação entre o status do EBV e os dados demográficos, clínicos e patológicos ... 52
Tabela 13. Número e porcentagem de pacientes agrupados quanto à
expressão da MMP-9. ... 56
Tabela 14. Associação entre a expressão de MMP-9 e os dados
xii
xiii
Lista de abreviaturas
ABMTR Registro de transplante autólogo de sangue e medula óssea
ABVD Adriamicina, Bleomicina, Vimblastina e Dacarbazina
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AP-1 Ativador de proteína-1
BEACOPP Bleomicina, Etoposídeo, Doxorrubicina, Ciclofosfamida, Vincristina, Procarbazina e Predinisona
BCL2 Linfoma de células B 2
BCR Co-receptores dos receptores de células B
BOB1 Fator de transcrição de células B
CALGB Grupo B de câncer e leucemia
CM Celularidade mista
CTAR Carboxi-terminal proximal
DEXA-BEAM DL
Dexametazona, Carmustine, Etoposídeo, Citarabina e Melfalan Depleção linfocitária
DNA Ácido desoxirribonucleico
EBER RNA de transcrição codificado por EBV
EBMT Grupo Europeu de Transplante de Medula Óssea
EBNA Antígeno nuclear do EBV
EBV Vírus de Epstein-Barr
EBVP Epirrubicina, Bleomicina, Vimblastina e Prednisona
EMA Antígeno de membrana epitelial
EN Esclerose nodular
EORTC Organização europeia para pesquisa e tratamento do câncer
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
FISH Hibridação in situ por fluorescência
GHSG Grupo alemão para estudo do Hodgkin
GM-CSF Fator estimulador de granulócitos e macrófagos
Gy Gray
H Células de Hodgkin
xiv
HRS Células de Hodgkin e Reed Sternberg
ICAM Molécula de adesão intracelular
IFN Interferon
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
ITAM Efetor de ativação de imunorreceptor de tirosina
LCLs Linhagem de células linfoblastoides
L&H Células variantes linfocítica e histiocítica das células HRS
LFA Antígeno associado à função linfocitária
LH Linfoma de Hodgkin
LHC Linfoma de Hodgkin Clássico
LHPLN Linfoma de Hodgkin com Predominância Linfocitária Nodular
LNH Linfomas não Hodgkin
LMP1 Proteína de membrana latente 1
LP Células com predominância linfocitária
MARK p-38 mitógeno ativado proteinoquinase
MMP Metaloproteinases
MOPP Mecloretamina, Vincristina, Procarbazina e Prednisona
MUC Mucina
NFκB Fator de transcrição nuclear κB
OCT2 Proteína 2 de ligação de octameros
OMS Organização Mundial da Saúde
PCNA Antígeno de proliferação nuclear
PCR Reação em cadeia da polimerase
PNA Ácido peptideonucleico
REAL Revised European American Lymphoma
RL Rico em linfócitos
RNA Ácido ribonucléico
RS Células de Reed-Sternberg
SEER Surveillance Epidemiology End Results of NCI
SMD Síndrome mielodisplásica
xv
TBS Tristamponado salino
TGF Fator transformador de crescimento
TIMPS Inibidores de proteinases teciduais
xvii
O Linfoma de Hodgkin (LH) é um linfoma de células B que, mais precisamente, compreende, pelo menos, duas entidades desses linfomas: o Linfoma de Hodgkin Predominância Linfocitária Nodular (LHPLN) e o Linfoma de Hodgkin Clássico (LHC). O que esses linfomas têm em comum é a presença das células de Hodgkin-Reed-Sternberg (HRS) e uma resposta imune intensa. No LHPLN existem evidências acentuadas de sua natureza de células B e suas células neoplásicas, conhecidas como células Predominância Linfocitária (células LP), anteriormente chamadas de células L&H (variante linfocítica e/ou histiocítica das células de HRS); são consideradas células neoplásicas originárias do centro germinativo. A natureza dessas células no LHC é muito mais ambígua, pois genotipicamente elas expressam rearranjos de gene de imunoglobulina, mas fenotipicamente lhes falta a maioria das características de células B e podem apresentar genes de células T, macrófagos e células dendríticas. Quando comparadas com células B normais, as células de HRS clássicas assemelham-se aos linfócitos B ativados, portanto, de origem pós-centro germinativo (Poppema S, 2005).
A suspeita de etiologia viral no LH foi aventada baseando-se em dados epidemiológicos e sorológicos de positividade ao vírus de Epstein-Barr (EBV). No Ocidente, 20-40% dos casos de Linfoma de Hodgkin (LH) são EBV positivos, contrastando com mais de 70% na Ásia e América do Sul, o que favorece a hipótese de etiologia viral, em especial nesses continentes (Poppema S, 2005).
O EBV comporta-se como agente transformador extremamente eficiente ao acometer primariamente os linfócitos B e células epiteliais, originando infecções em forma lítica e/ou latente. A infecção latente é dividida em 3 tipos (I, II, III), de acordo com o perfil de expressão viral. A latência tipo II é observada no carcinoma de nasofaringe e no LH e é caracterizada pela expressão do antígeno nuclear do EBV 1 (EBNA1), proteínas de membrana latente (LMPs)1, 2A, 2B, RNAs de transcrição codificados do EBV (EBERs) e transcritos Bam HI-A (Rickinson, Kieff, 2001).
um prognóstico mais favorável quando são EBV positivos (Glavina-Durdov et al., 2001). No idoso (Clarke et al., 2001) e em crianças (Flavel et al., 2001) a presença do EBV está associada com pior prognóstico.
A LMP-1 comporta-se como um oncogene clássico por apresentar capacidade transformadora quando inoculada em fibroblastos de roedores (Wang et al., 1985). Em linfócitos B, a LMP-1 é capaz de controlar um número de genes celulares, incluindo o gene inibidor de apoptose bcl-2 (Wang et al., 1996), assim como antígenos associados a vias de ativação (CD23, CD30, CD39), moléculas de adesão como ICAM-1 (molécula de adesão intracelular-1) e antígeno associado à função linfocitária-3 (LFA-3) (Humel et al., 1995). A LMP-1 sinaliza receptores do TNF (fator de necrose tumoral) (Luftig et al., 2004).
As síndromes linfoproliferativas associadas ao EBV são caracterizadas por uma capacidade de invasão de tecidos, podendo ocorrer tumores cerebrais ou retroperitoneais como achado inicial da doença. Em ambas as condições, a expressão da LMP-1 está invariavelmente presente (Willians, Crawford, 2006).
Flavell et al. (2000) correlacionaram a presença da LMP-1 com a expressão da MMP-9 em LH, concluindo que a MMP-9 é expressa nas células HRS e pelas linhagens celulares de Linfoma de Hodgkin L428 e KMH2. Entretanto, essa expressão parece não estar relacionada com a positividade do EBV ou com a sobrevida dos pacientes.
1.1 Objetivos
1. Verificar a expressão do EBV no LHC na população estudada por meio da pesquisa da LMP-1 por método imuno-histoquímico e do EBER (1/2) pelo método de hibridação in situ.
2. Correlacionar a expressão dos referidos marcadores com os aspectos clínicos de apresentação no LHC como: idade, sexo, tipo histológico e estadiamento.
3. Correlacionar a expressão dos referidos marcadores com as variáveis de resposta ao primeiro tratamento: remissão completa, remissão parcial, refratariedade.
4. Verificar se a expressão da metaloproteinase 9 por método imuno-histoquímico no LHC tem correlação com o status do EBV.
2.1 Conceito
Linfoma de Hodgkin (LH) é uma neoplasia linfoide monoclonal composta de células mononucleares de Hodgkin (H) e multinucleadas de Reed-Sternberg (RS) dispersas em um infiltrado, contendo uma mistura variável de células não neoplásicas como linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, histiócitos, plasmócitos, fibroblastos e fibras de colágeno. As células tumorais são frequentemente circundadas por linfócitos, configurando aspecto de rosetas. Os LH perfazem aproximadamente 30% de todos os linfomas. Ao contrário dos Linfomas Não Hodgkin (LNH), cuja incidência absoluta vem aumentando, o LH tem se mantido estável (Stein et al., 2008).
2.2 Histórico
Thomas Hodgkin descreveu pela primeira vez, em 1832, uma doença caracterizada pelo aumento de linfonodos e baço, achados em exames pós mortem de seis pacientes. Seus dados sugeriam doença primária de linfonodos e não alterações reacionais.
Em 1865, Sir Samuel Wilks adotou definitivamente o nome de Doença de Hodgkin, descrevendo com mais detalhes casos semelhantes àqueles citados por Thomas Hodgkin.
A célula gigante típica do LH foi reconhecida pela primeira vez por Greenfield em 1878; entretanto, foram Sternberg (1898) e Reed (1902) que procederam à descrição e sua histopatologia definitiva, e daí ela foi denominada de célula de Reed-Sternberg (Bonadonna, 2000).
2.3 Epidemiologia e etiologia
Aproximadamente 7500 novos casos de LH são diagnosticados anualmente nos Estados Unidos. A incidência de LH é ligeiramente maior em homens do que em mulheres (1,4:1). Nos países desenvolvidos existe uma distribuição etária bimodal do LH, com um pico ocorrendo na 3ª década de vida e outro após 50 anos de idade (Diehl et al., 2008).
Diferentes autores sugeriram que há uma predisposição genética para LH. Sua incidência é aumentada em judeus, em determinadas famílias e em parentes de primeiro grau de portadores da doença (Diehl et al., 2008). O LH é uma das primeiras enfermidades descritas em associação com HLA, sendo a forma familiar associada a antígenos HLA classe I, particularmente os alelos B5, B8, B18 e A1 (Hors, Dausset,1983), e a antígenos HLA classe II os antígenos DRB1*1501, DQA1*0102 e DQB1*0602 (Harty et al., 2002).
A etiologia infecciosa da doença foi aventada desde as primeiras descrições, sendo o Mycobacterium tuberculosis o primeiro agente suspeito (Stein, Morgan, 2004).
O EBV foi proposto como causa do LH. A incidência de LH é elevada em pacientes com história de mononucleose infecciosa (MI), sendo a manifestação clínica típica de infecção primária pelo EBV na adolescência (Glaser et al., 1997). Fragmentos do genoma do EBV podem ser demonstrados em células HRS em 40-50% dos pacientes. O LH que ocorre na infância e em adultos mais velhos são mais frequentemente associados ao EBV que os que ocorrem no adulto jovem. O DNA do EBV encontrado nas células de HRS tem demonstrado ser monoclonal, estabelecendo que o EBV precedeu o aparecimento de LH (Stein, Morgan, 2004).
2.4 Classificação
Histopatologicamente, o LH é caracterizado pela presença de células RS, que são células gigantes, multinucleadas, ou com núcleos multilobulados, cujos nucléolos são caracteristicamente exuberantes e eosinofílicos, circundados por um halo claro resultante de depósito de cromatina junto à membrana nuclear. Células semelhantes, porém, com um único núcleo, são as células de Hodgkin (H). Células HRS apresentam-se em ambiente peculiar, constituído por linfócitos, granulócitos, neutrófilos, eosinófilos, plasmócitos e células histiocitárias em proporções variáveis. As células de HRS são necessárias, porém não são suficientes para o diagnóstico histológico. Elas podem estar presentes em LNH, MI e linfoadenomegalia secundária ao uso de anticonvulsivantes, especialmente hidantoinatos (Stein, Morgan, 2004).
imunoglobulina na célula neoplásica, assim como na composição dos elementos celulares de fundo. O LHC divide-se em quatro subgrupos: Esclerose Nodular, Celularidade Mista, Rico em Linfócitos e Depleção Linfocitária.
2.4.1 Linfoma de Hodgkin Predominância Linfocitária Nodular (LHPLN)
para Linfoma de grandes células B pode ocorrer em aproximadamente 3-5% dos casos (Hansmann et al., 1989). Tem sido descrita uma relação clonal entre o Linfoma de grandes células B difuso associado ao LHPLN (Greiner et al., 1996).
2.4.2 Linfoma de Hodgkin Clássico (LHC)
O LHC é uma neoplasia linfoide monoclonal composta de células HRS, de permeio a um infiltrado contendo uma mistura variável de células não neoplásicas, como pequenos linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, histiócitos, plasmócitos, fibroblastos e fibras de colágeno. Baseados nas características do infiltrado reacional e na morfologia das células de HRS, são descritos quatro subtipos: LHC rico em linfócitos (RL), LH esclerose nodular (EN), LH celularidade mista (CM) e LH depleção linfocitária (DL). Os achados genéticos e de imunofenótipo das células HRS são idênticos nesses subtipos histológicos, enquanto diferem na apresentação clínica e associação com EBV (Stein et al., 2008). Eles correspondem a 95% dos casos de LH, têm a típica incidência bimodal com pico entre 15-35 anos e outro acima de 50 anos. Cerca de 75% dos casos se apresentam com envolvimento cervical. Destaca-se que é extremamente raro o comprometimento de linfonodos não axiais, como os mesentéricos e epitrocleares. A doença é localizada (estádios I e II) em 55% dos casos ao diagnóstico, 60% têm doença mediastinal, sobretudo o tipo histológico EN, 20% têm envolvimento esplênico que, geralmente, se associa ao envolvimento extranodal e 5% apresentam-se com medula óssea infiltrada. Os clássicos sintomas B (febre, emagrecimento e sudorese noturna) estão presentes em 40% dos casos (Stein et al., 2008).
neoplásicas (Schmid et al., 1991); 90% apresentam positividade para a proteína ativadora específica de linfócitos B (PAX5/BSAP) (Foss et al., 1999).
A LMP-1 do EBV está expressa em número variável de casos, dependendo do tipo histológico e de fatores epidemiológicos (Glasser et al.,1997). O Antígeno de Membrana Epitelial (EMA) é positivo em menos de 5% dos casos. Enfatizamos que o OCT2 e/ou BOB1 são negativos em 90% dos casos.
As células HRS expressam, de forma variada, as seguintes citoquinas: Interferon- (IFN), interleucinas (IL) 1α e 1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF (fator estimulador de crescimento de granulócitos e macrófagos), Linfotoxina-a, TGF- (fator transformador de crescimento), TNF-α e bFGF (fator de crescimento de fibroblastos) (Kadin et al., 1999). Tais células contêm rearranjos clonais de imunoglobulina em praticamente 100% dos casos, e o rearranjo clonal para receptores de células T é bastante raro. A citogenética convencional e os estudos por hibridação in situ por fluorescência (FISH) não demonstram alterações cromossômicas específicas e recorrentes no LHC.
Abaixo mostramos as principais características dos quatro subtipos histológicos do LHC.
Quadro 1. Principais características clínicas dos quatro subtipos histológicos do LHC
EN CM RL DL
Incidência 70% 20-25% 5% 5%
Idade média 28 anos 37 anos > 37 anos 37 anos
sexo M = F 70% masculino 70% masculino 75% masculino
Comprometimento ao diagnóstico
Mediastino (80%)
Bulky (54%) MO: 3% Periférico: comum Mediastino: incomum Baço: 30% MO: 10% Periférico: comum Mediastino: (15%) Bulky: 11%
MO: comum Extranodal:
comum
Stein et al., 2001b EN: Esclerose nodular
RL: Rico em linfócitos DL: Depleção linfocitária MO: Medula óssea Bulky: Doença extensa
2.5 Aspectos funcionais das células de HRS
As células HRS são consideradas representantes do substrato maligno da doença no LHC. Acredita-se que, na grande maioria dos casos, as células de HRS derivam de células B ativadas pós-centro germinativo (Kuppers et al., 1998). Importante evidência dessa conclusão é o achado uniforme da expressão de um número de genes normalmente encontrados em células plasmáticas, como o CD138 e MUM1/IRF4 (Carbone et al., 2001). Em raros casos, as HRS são derivadas de células T, confirmadas pela presença de receptor de células T por meio do emprego de técnica de micromanipulação (Muschen et al., 2000).
As células HRS parecem ser fortemente dependentes do seu microambiente, uma vez que seu crescimento in vitro é extremamente difícil. A maioria das linhagens de células derivadas do LH foi demonstrada a partir da cultura de células do sangue periférico, derrame pleural, derrame pericárdico ou medula óssea, sugerindo uma adaptação in vivo a uma fase de cultura em líquido no curso da progressão da doença. (Wolf et al., 1996)
apresentam-se frequentemente triplicados. Translocações ou deleções cromossômicas são observadas em 2/3 dos pacientes (Tilly et al., 1991).
O método de FISH revela aberrações cromossômicas numéricas em 100% dos LH analisados em células HRS CD30+ (Weber-Matthiesen et al., 1995). Essas alterações demonstraram ser clonais ou diferentes de metáfase para metáfase, o que pode indicar uma instabilidade cromossômica (Inghirami, Frizzera, 1994). A pesquisa por alterações no genoma ou expressão desregulada dos oncogenes MYC, JUN, RAF e RAS não evidenciaram padrão característico (Steenvoorden et al., 1998). O Antígeno de Proliferação Nuclear (PCNA) é uma proteína presente somente em células em proliferação, e sua expressão está aumentada no LH (Smolewski et al.,1998; Pinheiro et al., 2007).
O gene p53 parece não funcionar nas células de HRS como gene supressor de crescimento tumoral. Destacam-se o baixo índice de mutações e o paradoxal aumento da proteína p53; proteína esta que geralmente não corresponde à forma “p5γ mutada” (Maggio et al., 2001; Pinheiro et al., 2007).
Uma característica das células HRS é sua incapacidade de transcrever Imunoglobulina (Ig) apesar da presença habitual de rearranjos funcionais de genes de Ig (Marafioti et al., 2000). Como as células B normais sofrem apoptose se perdem a capacidade de expressar receptores de Ig em sua superfície, a inabilidade das células HRS para a expressão de Ig deveria encaminhá-la para morte celular. Isso não ocorrendo, é indicativo de uma alteração na via de apoptose dessas células.
se presume contribuir para a evasão das células HRS dos centros germinativos, é regulado pelo NFB, como demonstrado em linhagens celulares de LH (Hinz et al., 2001). Uma das proteínas envolvidas na prevenção das células em sofrer apoptose é a Bcl-2. Bcl-2 está expressa em proporção significativa de células HRS, que parece ter impacto negativo no prognóstico (Sarris et al., 2001). A proteína pré-apoptotica Bax é expressa nas células HRS (Brousset et al., 1996).
A “família” STAT de transdutores de sinais e ativadores de transcrição está funcionante no LHC. Dentre elas, STAT3, STAT6 e STAT5 estão particularmente ativos no LHC e parecem ter grande importância na proliferação das células HRS (Kube et al., 2001).
2.5.1 Papel do vírus de Epstein-Barr
O EBV infecta primariamente os linfócitos B e células epiteliais, podendo dar origem à infecção tanto na forma lítica quanto na forma latente. A infecção lítica pode ocorrer em células B ou células epiteliais e resulta na duplicação do DNA viral com a reunião e liberação de virions. A infecção latente está tipicamente associada à infecção de células B e é caracterizada pela expressão limitada do gene viral. A infecção latente é dividida em três tipos (I, II, III), de acordo com o perfil de expressão viral. Na latência tipo I, que é típica do Linfoma de Burkitt, o produto do gene viral expresso é o EBNA-1, em associação com os EBERs e transcritos Bam HI-A. A latência tipo II é encontrada no carcinoma de nasofaringe e Linfoma de Hodgkin e é caracterizada pela expressão de EBNA-1, LMPs-1, -2A, -2B, EBERs e transcritos Bam HI-A. Na latência tipo III são expressos os EBERs, EBNA-1, -2, -3A, -3B, -3C, transcritos Bam HI-A e LMP-1, -2A e -2B; ela é característica das LCLs transformadas pelo EBV in vitro e na doença linfoproliferativa pós-transplante in vivo (Rickinson, Kieff, 2001).
O envolvimento do EBV na patogênese do LH tem sido sugerido indiretamente por estudos sorológicos e epidemiológicos (Levine et al., 1971; Gutensohn, Cole, 1980; Mueller et al., 1989). Evidências diretas da presença do EBV nos tecidos foram estabelecidas pelo método de Southern blot (Weiss et al., 1987) e pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) (Shibata et al., 1991), embora nenhum desses métodos tenha sido capaz de localizar o EBV dentro da célula HRS. Posteriormente, o desenvolvimento da técnica de “Hibridação in situ” (HIS) permitiu a detecção de EBER (Glickman et al., 1988; Wu et al., 1990) e a imuno-histoquímica (IH) para LMP-1 (Murray et al., 1992), mostrando a localização do EBV nas células malignas HRS. Embora o EBV possa ser encontrado nos linfócitos adjacentes, é a detecção do EBV dentro das células de HRS que faz o diagnóstico do “Linfoma de Hodgkin associado ao EBV”. Em uma porcentagem variável de casos, a infecção latente pelo EBV é detectada nas células HRS do LHC.
aproximadamente 60% dos casos (Vassalo et al., 2001). Com poucas exceções, o EBV está presente em cada uma das células tumorais do paciente em todos os sítios da doença, tanto na apresentação como na recidiva.
A diversidade clínica e epidemiológica dos subtipos do LH sugere diferença na etiologia e evolução dos pacientes EBV positivos e negativos. O EBV está geralmente associado com a forma celularidade mista. Pacientes com idade acima de 55 anos e crianças são comumente EBV positivos (Armstrong et al., 1998). Pacientes com AIDS que apresentam LH são na sua maioria EBV positivos (Uccini et al., 1990). Adultos jovens parecem ter um prognóstico mais favorável quando são EBV positivos (Glavina-Durdov et al., 2001). No idoso (Clarke et al., 2001) e em crianças (Flavel et al., 2001), a presença do EBV está associada com pior prognóstico.
Como descrito anteriormente, um número limitado de moléculas induzidas pelo EBV tem sido identificado no LHC, a chamada latência tipo II, que inclui EBNA-1, LMP-1 e LMP-2, EBERs-1 e -2. A EBNA-1 inicia a replicação do epissoma do EBV antes da mitose e “ancora” o epissoma viral aos cromossomos mitóticos durante a divisão celular. Esse fato assegura a persistência do DNA do EBV, em células em proliferação, e assim mantém os genes RNA codificados do EBV (Yajima et al., 2005).
O domínio citoplasmático da LMP-2 contém um ITAM (efetor de ativação de imunorreceptor de tirosina) que também é encontrado nos co-receptores dos receptores de células B (BCR) (Allber et al.,1993). Nos BCR, esse efetor faz a mediação da transdução de sinal ligando quinases, que são subsequentemente ativadas. Como as células B normais dependem da expressão dos BCR para sobreviverem, o ITAM é também essencial para esse sinal de sobrevivência (Kraus et al., 2004). Há evidências de que a LMP-β é capaz de “imitar” a presença de um BCR funcional, porque em modelos de ratos transgênicos LMP-2, células B expressando LMP-2, mas com falta de BCR funcionais, são geradas na medula óssea e são capazes de sobreviver na periferia (Caldwell et al.,1998; Casola et al., 2004).
carboxiterminal da LMP-1, que está no domínio citoplasmático da proteína, contém dois domínios funcionantes. A região de ativação carboxiterminal proximal, CTAR-1, interage com fatores associados aos receptores do TNF, que produz o fator de transcrição NFB (Kaye et al., 1996). A CTAR-2 distal se associa ao domínio inativo do receptor do TNF e faz a mediação da sinalização para NFB (Izumi, Kieff, 1997). A CTAR-2 também induz a atividade do fator de transcrição AP-1 (ativador de proteína-1) por meio da via de sinalização que envolve a c-jun N-terminal kinase-1 (JNK1) (Kieser et al., 1997). A LMP-1 ativa a via MAPK (p38-mitógeno ativado proteinoquinase) por meio dos domínios CTAR-1 e CTAR-2 (Elipoulos et al., CTAR-1999). A LMP-CTAR-1 estimula a angiogenese por meio do Fator de Crescimento de Fibroblastos–2 (FGF-2) via sinalização NFB (Wakisaka et al., 2002). A LMP-1 induz a expressão de MUCINA 1 (MUC-1), fator importante no desprendimento e liberação de células tumorais por indução de fatores angiogênicos e invasivos, por meio das vias de sinalização STAT-1 e STAT-3. (Kondo et al., 2007)
2.5.2 As metaloproteinases
A invasão da MB pelas células tumorais é considerada um dos estágios mais importantes no aparecimento das metástases (Liotta, 1986). Muitas enzimas proteolíticas degradam componentes do EEC e MB e, entre elas, as MMP estão envolvidas no processo metastático.
As expressões da MMP-2 e MMP-9 não estão necessariamente ligadas, o que sugere um padrão de expressão independente de ambas as proteinases (Netzel-Arnett et al., 1993). Há diferença acentuada em promotores para 2 e MMP-9, pois os promotores para MMP-9 têm sítios de ligação para o AP-1 e NF-B, mas que não são encontrados nos promotores de MMP-2 (Sato, Seiki, 1993). A pró-MMP-2 é ativada em MMP-2 pela MMP tipo-membrana (Takino et al.,1995), no entanto, não há descrição de ativadores de expressão ou atividade da MMP-9. Yoshizaki et al., (1998) demonstraram que a expressão da MMP-9, mas não da MMP-2, foi induzida pela oncoproteína do EBV, a LMP-1. Esse estudo revela que ambos os sítios de ativação da LMP-1, CTAR-1 e CTAR-2, contribuem para a ativação completa dos promotores da MMP-9 e induzem sua atividade enzimática pela ativação dos fatores de transcrição NFB e AP-1.
2.6 Estadiamento
Quadro 2. Estadiamento segundo Costswolds
Estádio Definição
I Envolvimento de região única de linfonodos ou estrutura linfoide (baço, timo)
II Envolvimento de 2 ou + regiões linfonodais, no mesmo lado do diafragma (o mediastino é sítio único; os linfonodos hilares são lateralizados)
III Envolvimento de regiões linfonodais ou estruturas em ambos os lados do diafragma
III1 Com ou sem comprometimento esplênico e linfonodos hilar, celíaco ou portal
III2 Com linfonodos para-aórtico, ilíaco ou mesentérico
IV Envolvimento de sítios extranodais, além daqueles diagnosticados como E
Lister et al., 1989. A = sem sintomas
B = febre, sudorese noturna, perda de peso
X = doença Bulky = mediastino > 1/3 ou massa tumoral > 10 cm
2.7 Tratamento
2.7.1 Tratamento da doença localizada
As crescentes preocupações com as consequências em longo prazo do tratamento levaram muitos investigadores a reexaminar os procedimentos agressivos, desenvolvidos para o estadiamento e tratamento da doença localizada nos anos 1970 e 80. Muitos dos estudos em andamento, ou recentemente completados, foram desenvolvidos na intenção de reduzir as complicações em longo prazo sem aumentar a mortalidade pelo LH (Mauch, 1999).
2.7.1.1 Fatores prognósticos na doença localizada
Desde 1982, o EORTC (Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer) definiu os pacientes nos estádios I e II como de prognóstico desfavorável quando um dos seguintes fatores estava presente: idade superior a 50 anos; pacientes assintomáticos com VHS maior que 50 mm, pacientes apresentando sintomas B com VHS maior que 30 mm; grande massa mediastinal e doença localizada em mais de três regiões (Tubiana et al., 1989).
2.7.1.2 Tratamento da doença localizada com prognóstico favorável
Até o início dos anos 1990, a Radioterapia (RXT) de Campo Estendido (CEs) ou irradiação linfonodal subtotal foi o tratamento de escolha para a doença localizada. Com dose de irradiação de 40 Gy, foi alcançado índice de remissão de 95%. No entanto, cerca de 30% dos pacientes recidivaram após tratamento radioterápico exclusivo. Embora esses pacientes tenham obtido excelente resposta ao tratamento quimioterápico de salvamento, o que resultou em uma SG de 90%, apresentavam grande risco de toxicidades de longo prazo, como segundas neoplasias e complicações cardíacas e pulmonares. Na tentativa de reduzir o índice de recidiva dos casos tratados com RXT exclusiva, o GHSG introduziu ciclos de quimioterapia (QT) em número reduzido, associados a RXT de CEs. Esse estudo demonstrou que o número de recidivas pode ser reduzido pela adição de dois ciclos de QT, assim como aumentada a sobrevida livre de falhas de tratamento (SLFT) (Tesch et al., 1998).
Apesar da excelência no resultado do tratamento da doença localizada com RXT de CEs associada ou não a QT, as complicações de longo prazo e o risco de óbito por segunda neoplasia aumentaram com o tempo de observação. Algumas complicações fatais estavam associadas com a extensão e a dose de irradiação (Henry-Amar et al., 1990).
A irradiação do mediastino aumenta o risco de morte por doença cardíaca (Hancock et al., 1993), o câncer de pulmão e de mama estão relacionados à irradiação tipo “manto” (Van Leeuwen et al., 1994). Pela presença dessas e de outras complicações, foram propostos protocolos de terapêutica combinada de QT e RXT com doses reduzidas de RXT.
excelente nos dois braços (98% versus 96%, respectivamente; p = 0.156). A partir daí, a terapêutica combinada de seis ciclos de EBVP com RXT de CEn passou a ser o protocolo padrão para o EORTC no manuseio da doença localizada com prognóstico favorável (Carde et al., 1997).
O protocolo do GHSG HD10 (encerrado em janeiro de 2003) comparou dois ou quatro ciclos de ABVD com RXT de CEn de 20 GY ou 30 GY. A análise preliminar realizada em 2003 com 807 pacientes mostrou que, depois de 28 meses de seguimento, não houve diferença entre dois ou quatro ciclos de ABVD nem diferença entre RXT de CEn com 20 ou 30 GY - com SLE de 97% e SG de 99%. Esse trabalho demonstrou que dois ciclos de QT, seguidos de RXT de CEn de 20 GY, são suficientes para controlar doença eventualmente não detectada pelo estadiamento clinico (Diehl et al., 2005).
2.7.1.3 Tratamento da doença localizada com prognóstico
desfavorável
que a RXT de CEn, quando combinada com QT, foi capaz de controlar a doença oculta (Engert et al., 2003). A necessidade, ou não, da RXT em todos os pacientes com doença localizada de prognóstico desfavorável é objeto de estudo em andamento, do Instituto Nacional do Câncer do Canadá; pacientes com estádios I e II com prognóstico desfavorável são randomizados para receber terapêutica combinada (dois ciclos de ABVD e RXT de CEs) ou QT exclusiva (quatro a seis ciclos de ABVD) (Hoppe et al., 2007b).
2.7.2 Tratamento da doença avançada
ABVD pode ser considerado o tratamento de escolha para pacientes com LH em nossa população (Souza et al., 2009).
2.7.2.1 Fatores prognósticos na doença avançada
A Base de Dados Internacional em Doença de Hodgkin forneceu resultados de mais de 5.000 pacientes para análise de fatores prognósticos. Esse estudo foi coordenado por Hasenclever e Diehl (1998). Sete fatores prognósticos foram identificados. Cada fator contribui para um decréscimo de 7% na SLP em cinco anos, de acordo com a análise de 1.618 pacientes. Somente o grupo com quatro a sete fatores, que representou menos de 20% dos pacientes, teve SLP menor que 50% em cinco anos. Embora seja imperfeito, o sistema internacional de score facilitou a comparação de grupos nos estudos e pode ser usado como avaliação dos dados, como mostra o Quadro 3. Os sete fatores de risco são: albumina sérica menor que 4 g/dl, hemoglobina menor que 10,5 g/dl, sexo masculino, estádio IV, idade acima de 45 anos, contagem de leucócitos maior ou igual a 15.000/mm3, contagem de linfócitos menor ou igual a 600/mm3 e/ou contagem linfocitária inferior a 8% (Hasenclever, Diehl, 1998).
Quadro 3. Sobrevida livre de progressão e sobrevida global em 5 anos, de acordo com o número de fatores prognósticos para doença avançada
SCORE % SLP EM 5 ANOS % SOBREVIDA TOTAL EM 5
ANOS 0 1 2 3 4 ≥ 5 84 77 67 60 51 42 90 90 81 78 61 56
2.7.2.2 Novos protocolos de tratamento
O ABVD tornou-se o protocolo padrão para tratamento do LH avançado, no entanto a toxicidade pulmonar da bleomicina, que é especialmente pronunciada em crianças ou quando combinada com a RXT mediastinal, tornou-se a maior preocupação nesse esquema. O inibidor de topoisomerase, etoposídeo, ganhou o interesse de vários grupos como droga ativa no tratamento do LH (Hough, Hancock, 2007).
O protocolo com cinco drogas, Stanford V, contém as drogas do MOPP/ABVD, sem a procarbazina e a dacarbazina, com adição do etoposídeo e fator de crescimento GCSF. As drogas são aplicadas semanalmente em um total de 12 semanas com consolidação com RXT nos sítios de doença volumosa inicial. Resultados de cinco anos em estudo de fase II, com 142 pacientes, mostraram SLP de 89% e SG de 96% (Horning et al., 2002).
ABVD. O BEACOPP também apresentou maior toxicidade hematológica com maior ocorrência de leucemia e síndrome mielodisplásica (Diehl et al., 2003).
2.7.2.3 Papel da radioterapia na doença avançada
Questão importante no tratamento do LH em estádios avançados é o benefício da adição da RXT em relação a eficácia e efeitos colaterais tardios, quando são usados esquemas quimioterápicos contendo antraciclinas. Em publicação relevante, o EORTC mostrou que pacientes com resposta completa depois de seis ou oito ciclos de MOPP/ABV foram randomizados para receber RXT de CEn ou nenhum tratamento posterior. A análise de 739 pacientes mostrou que RXT CEn não melhorou a sobrevida livre de recaída ou a SG nos pacientes que entraram em remissão com MOPP/ABV. No entanto, aqueles que obtiveram resposta parcial com a QT e foram tratados com RXT posteriores tiveram SG em cinco anos de 85-90%, resultado comparável ao daqueles pacientes que obtiveram remissão completa com tratamento quimioterápico exclusivo (Aleman et al., 2003). Por meio desse estudo, conclui-se que somente pacientes em remissão parcial após QT poderão ser beneficiados pela RXT de CEn complementar, enquanto os pacientes que entraram em remissão com QT não terão esse beneficio.
2.7.3 Doença refratária e recidivada
2.7.3.1 Tratamento para recidivas após RXT (exclusiva) para doença
localizada
Hoje o tratamento para recidivas após RXT é raro, pois a RXT como tratamento único é pouco utilizada. A sobrevida de pacientes tratados com QT convencional após recidiva de doença localizada tratada com RXT é, pelo menos, igual a do paciente com doença avançada inicialmente tratada com QT. A SG e SLD variam de 57 a 71% (Canellos, Josting, 2007).
2.7.3.2 Tratamento da doença primariamente progressiva e recidivada
após QT
Fundamentados em trabalhos envolvendo análise das falhas do esquema MOPP ou suas variações, podemos dividir as falhas do tratamento quimioterápico em três grupos: LH primariamente refratário (cerca de 10% dos casos) envolve aqueles pacientes que nunca alcançam RC; recidivas precoces (aproximadamente 15% dos casos), pacientes que recidivam com menos de um ano de RC; recidivas tardias (mais ou menos 15% dos casos), pacientes que apresentam recidiva com RC que dura mais de um ano (Fisher et al., 1979).
O tratamento com radioterapia exclusiva na doença refratária/recidivada tem indicação rara para pacientes identificados como aqueles com doença localizada, sem fatores adversos como sintomas B que não foram irradiados anteriormente (Diehl et al., 2004).
reportou a análise de 175 pacientes com doença progressiva primária que receberam QTAD com TACT. A SLP e a SG em cinco anos foi de 32 e 36% respectivamente (Sweetenham et al., 1999). O ABMTR (Registro de Transplante Autólogo de Sangue e Medula Óssea) reportou SLP de 38% e SG de 50% em três anos em 122 pacientes com falhas primárias de indução (Lazarus et al., 1999). Outros trabalhos foram relatados com resultados ressaltando a superioridade do QTAD com TACT, os quais nos levaram à conclusão que esse tipo de tratamento deva ser considerado para pacientes com falhas primárias de indução (Canellos, Josting, 2007).
Pacientes com recidivas precoces são candidatos a QTAD com TACT. Em trabalho de Stanford no qual foi usado um controle histórico, encontrou-se SLE de 56% em quatro anos para pacientes com recidiva precoce, comparados com 19% em pacientes que receberam QT convencional (Yuen et al., 1997). Dados semelhantes foram encontrados nos resultados do protocolo HDR-1 do GHSG, em que pacientes com recidiva precoce, submetidos a QTAD, apresentaram melhor SLFT que aqueles com tratamento com QT convencional (Schmitz et al., 1999).
2.7.3.3 Papel do transplante alogênico (AloTCT)
Durante dois anos foram analisados prontuários de 368 pacientes diagnosticados com LH entre 1993 e 2004 em quatro instituições distintas: Hospital São Paulo (223 casos), Hospital Brigadeiro (121 casos), Hospital Ana Costa de Santos (10 casos) e Santa Casa de Misericórdia de Santos (14 casos), no intuito de selecionar aqueles que tinham dados completos de diagnóstico e estadiamento, que foram submetidos a protocolos de tratamentos semelhantes (MOPP/ABV ou ABVD), sorologia negativa para HIV e seguimento de, pelo menos, um ano (exceto óbitos no período). A partir desses dados iniciou-se o resgate dos blocos de parafina do diagnóstico inicial. Foram selecionados 113 pacientes portadores de LH, que foram objeto desse estudo.
Após revisão histológica das lâminas coradas pela hematoxilina e eosina (H/E) e reclassificadas de acordo com os critérios da OMS, foram excluídos 16 pacientes: um por ser diagnosticado com Linfoma de Hodgkin Predominância Linfocitária Nodular e 15 com material inadequado e/ou insuficiente para análise.
Dessa forma, fizeram parte desse estudo 97 pacientes com LHC, com idade entre 13 e 75 anos (mediana de 30 anos). Desses, 58 (59,7%) eram do sexo masculino e 39 (40,2%) do sexo feminino. Foram classificados como: EN 81 (83,5%), CM 14 (14,4%), DL 1 (1%) e não classificado 1 (1%), e não foi encontrado nenhum caso de RL.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UNIFESP/EPM sob o número CEP 0724/06 (Anexo 6).
Foram realizadas reações de imuno-histoquímica para CD3, CD20, CD30 E CD15 para confirmação do diagnóstico de LHC. Foram realizados testes imuno-histoquímicos para pesquisa da LMP-1 e MMP-9 e hibridação in situ para EBER (1/2) em todos os blocos.
Dados de identificação (sexo, idade), estadiamento clínico, tratamento realizado, resposta ao tratamento inicial, recidivas, sobrevida total, sobrevida livre de falhas e situação atual referentes a 15 de janeiro de 2008 foram extraídos de prontuário médico.
de região cervical. A avaliação de infiltração da medula óssea foi realizada a partir dos resultados obtidos de biópsias.
Os pacientes foram considerados A quando assintomáticos e B quando apresentavam febre (igual ou acima de 38ºC), emagrecimento, perda ponderal nos últimos seis meses superior a 10% do peso inicial e/ou sudorese noturna.
Os estádios foram classificados como I, II, III e IV, de acordo com os critérios de Ann Arbor e Cotswolds (Lister et al., 1989).
A resposta terapêutica foi caracterizada como remissão completa (RC), quando houve ausência de sintomas e sinais da doença, detectáveis pelo exame físico e por métodos de imagem após o término do esquema proposto; critérios esses mantidos por tempo mínimo de três meses.
A redução de cerca de 50% ou mais do volume inicial da massa tumoral, após o término do esquema proposto, foi tido como remissão parcial (RP). Os casos nos quais se observaram aumento da massa tumoral, durante ou após três ciclos de quimioterapia, e aqueles com redução de massa tumoral inferior a 50% após o término do tratamento inicial, ou que recidivaram com menos de 3 meses de RC, foram tidos como exemplos de “doença refratária” (DR). Pacientes classificados como DR foram encaminhados para esquemas alternativos de tratamento.
O tratamento dos pacientes incluídos nesse estudo foi baseado em protocolos admitidos internacionalmente para Linfoma de Hodgkin, à época do diagnóstico. O MOPP/ABV híbrido foi o protocolo usado de 1993 a 1998 (Klimo, Connors, 1985) e o ABVD, após 1998 (Bonadonna et al., 1975) até a presente data. Os pacientes tratados nesses protocolos foram considerados em conjunto, uma vez demonstrado em estudo comparativo entre o ABVD e o MOPP/ABV similaridade no índice de RC, SG e SLD em ambos os protocolos (Souza et al., 2009). Não foram analisados dados referentes à toxicidade imediata e tardia, assim como segunda neoplasia em ambos os protocolos.
consolidação de remissão em doença com grandes massas tumorais ao diagnóstico.
Dados foram obtidos sobre a resposta ao tratamento inicial, presença, ou não, de recidiva, sobrevida total, sobrevida livre de eventos, analisados em 15 de janeiro de 2008 ou na data do último retorno em ambulatório ou na data do óbito por qualquer causa.
Foram obtidos termos de consentimento escrito dos pacientes vivos e dos que tiveram seguimento periódico ou com paradeiro conhecido (Anexo 7).
3.1 Método – imuno-histoquímica
Para a técnica de Imuno-histoquímica (IH), foram obtidos cortes histológicos de 4 m de espessura depositados em lâminas previamente tratadas com o adesivo 3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma, EUA, código 3648) (Madox, Jenkins, 1987).
As lâminas com os cortes foram dispostas em estufa a 60ºC por um período de 24 horas para melhor adesão do tecido e desparafinização.
Inicialmente realizamos a desparafinização em três banhos de xilol à temperatura ambiente por cinco minutos cada uma e passagem por três banhos de etanol absoluto por um minuto cada uma.
As lâminas foram lavadas em água corrente por cinco minutos e os cortes histológicos foram submetidos à recuperação antigênica por calor em panela de pressão por 3 minutos. Após fervura, foram submersos em tampão citrato 10nM pH 6,0 para os anticorpos CD3, CD20, CD30, LMP-1 e MMP-9 e TRIS/EDTA pH 9,0 para o anticorpo CD15.
As lâminas foram resfriadas por 20 minutos à temperatura ambiente, e posteriormente lavadas em água corrente por 5 minutos.
Foram utilizados os anticorpos primários CD3 (clone F7.2.38) – Dakocyto– M7254-1, CD15 (clone C3D-1) – Dakocyto–M0733-1, CD30 (clone Ber-H2) – Dakocyto–M0751-1, CD20 (clone L26) – Dakocyto–M0755-1, LMP-1 (clone CS1-4) – Dakocyto-M0897-1 e MMP-9 (92kDa Collagenase IV ab 9 – policlonal) – Labvision-RB-1539 nas suas respectivas diluições.
A incubação foi realizada em câmara úmida à temperatura de 4ºC por um período mínimo de 12 horas.
Após as incubações com os anticorpos primários, as lâminas foram lavadas com solução tampão PBS pH 7,2 a 7,6 em três trocas de cinco minutos cada uma.
Foi utilizado o método da estreptavidina ligada à biotina (LSAB-Dako, Glostrup, Dinamarca), seguindo com incubação com anticorpo secundário biotinilado (kit LSAB-Dako, Glostrup, Dinamarca) em câmara úmida à temperatura ambiente por 30 minutos.
Lavagens foram feitas com solução tampão PBS pH 7,2 a 7,6, com três trocas individuais de cinco minutos e revelação das lâminas com 60 mg de diaminobenzidina (DAB – Sigma, EUA, código 05637) diluído em 100 ml de PBS pH 7,2 a 7,6, acrescido de 2 ml de peróxido de hidrogênio a 3% à temperatura ambiente por cinco minutos. Seguiu-se lavagem em água corrente por três minutos e contracoloração utilizando-se hematoxilina de Harris por um minuto.
As lâminas foram desidratadas com passagens em três banhos de etanol absoluto e três banhos de xilol para serem montadas com lamínulas e resina Entellan (Merck) para análise em microscopia ótica comum.
3.2 Método da hibridação in situ
A hibridação in situ (HIS) se realizou com cortes de parafina; foi utilizado o kit de detecção PNA HIS da marca Dakocyto de código K5201 e a sonda complementar aos transcritos RNA de EBER-1 e EBER-2 do vírus de Epstein-Barr marcada com fluoresceína – Dakocyto – Y5200. Por se tratar de kits, o procedimento foi seguido como indicado pelo fabricante.
Inicialmente foi realizada a reidratação dos tecidos por meio da desparafinização em dois banhos de xilol com duração individual de cinco minutos; dois banhos de álcool absoluto por três minutos; dois banhos de álcool 96% por três minutos e três banhos com água milli-q por três minutos.
Após a reidratação, as lâminas foram incubadas com proteinase K pré-diluída 1:10 em TBS (Tris Tamponado Salino pH 7,5) (PNA-HIS Dakocyto) na câmara úmida em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Esse pré-tratamento com a enzima proteinase K foi realizado para promover o acesso da sonda de hibridação às sequências de ácidos nucleicos alvos, uma vez que as biópsias foram preparadas com fixador de ligação cruzada como a formalina.
Cada uma das lâminas foi lavada com dois banhos de água milli-q por três minutos, para remoção da proteinase K residual. Em seguida, foram imersas em banho de álcool 96% por dez segundos e posteriormente secas em ar ambiente por aproximadamente cinco minutos.
A hibridação propriamente dita foi realizada com a incubação das lâminas com a sonda PNA (ácido peptideonucleico) conjugada com a fluoresceína em câmara úmida por 1 hora e 30 minutos à temperatura de 55ºC (estufa). Seguiu-se a lavagem pós-hibridação com solução estringente (PNA) pré-diluída 1:60 em água milli-q à temperatura de 55ºC por 25 minutos e depois lavagem com TBS por 10 segundos.
Posteriormente, as amostras foram incubadas com substrato (5-bromo-4-cloro-3 indolilfosfato/BCIP tetrazólio nitroazul/NTB, levamizol, um inibidor da fosfatase alcalina endógena-PNA) em câmara úmida por 30 a 60 minutos, seguindo-se lavagem com água milli-q. O anti-Fit/AP, o substrato e o tampão TBS fizeram parte do kit de detecção PNA HIS.
As lâminas foram contracoradas com hematoxilina de Meyer e, finalmente, foram montadas em Glycergel (Dako-EUA) com lamínulas e esmalte.
A coloração positiva foi reconhecida no microscópio pelas cores azul- escura/preta nos sítios de hibridação no núcleo das células HRS.
Em cada reação foi corada simultaneamente uma lâmina com controle positivo externo e outra com controle negativo (a mesma lâmina do controle positivo sem a sonda EBER).
3.3 Avaliação das reações
As reações foram avaliadas por dois observadores independentes, após a codificação do material. A leitura das lâminas foi feita em microscópio óptico comum e avaliada de forma qualitativa para os marcadores CD3, CD20, CD15, CD30 e LMP-1, em reações de IH, e para EBER, em reação de HIS. Nas reações de IH, o critério de positividade foi estabelecido de acordo com o antígeno pesquisado. Existem vários padrões de positividade, entre os quais:
a - Padrão de membrana: a membrana celular apresenta-se desenhada pela cor marrom da peroxidase.
b - Padrão citoplasmático: o citoplasma da célula apresenta-se corado de marrom.
Apenas as reações que ocorreram nas células HRS foram consideradas positivas e com os seguintes padrões:
CD15 e CD30: foram consideradas positivas as reações com padrão de membrana e/ou citoplasmático com ou sem a presença de “dot”, em qualquer intensidade.
CD20: foram consideradas positivas as reações com padrão de membrana, em qualquer intensidade.
CD3: foram consideradas positivas as reações com padrão de membrana e/ou citoplasmático em qualquer intensidade.
LMP1: foram consideradas positivas as reações, quando presente o padrão membrana e/ou citoplasmático em qualquer intensidade
(Figura 1).
A reação de IH para MMP-9 foi avaliada de maneira semiquantitativa. Foram consideradas positivas as reações com padrão citoplasmático (Figura 2) e elas foram divididas em três grupos conforme o número de células HRS coradas, a saber:
0 quando a expressão do marcador ocorreu em 10% ou menos das células HRS;
1+ quando a expressão ocorreu entre 10 e 50% das células HRS;
2+ quando mais de 50% das células HRS expressaram o marcador.
Figura 1. Reação da imuno-histoquímica para a LMP-1 em corte histológico de linfonodo com LH.
Figura 2. Reação da imuno-histoquímica para a MMP-9 em corte histológico de linfonodo com LH.
3.4 Interpretação da positividade do EBV
A interpretação da positividade do EBV seguiu a padronização segundo Gulley et al. (2002) cuja detecção da expressão do LMP-1 e/ou do EBER nas células HRS foi considerada resultado positivo.
3.5 Análise estatística
Para comparação entre frequências e proporções, foram utilizados os Teste de Qui-Quadrado e o Teste Exato de Fisher. Para análise da curva de sobrevida utilizou-se o Teste de Kaplan-Meier com comparação por meio do teste log-rank. As análises foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS – Statistical Package for Social Sciences (v.16.0).
4.1 Resultados gerais
O estudo incluiu 97 pacientes tratados de maneira similar para LHC. Desses, 58 eram do sexo masculino (59,8%) e 39 (40,2%) do sexo feminino. A idade mediana era de 30 anos, variando entre 13 e 75 anos, e os pacientes foram subdivididos em grupos etários classificados em: menores de 20 anos, entre 21 a 40 anos e acima de 41 anos, encontrando-se as seguintes proporções (Tabela 1):
Tabela 1. Número e porcentagem de pacientes nos diferentes grupos etários
Idade Nº %
< 20 anos 26 26,8
21-40 anos 38 39,2
> 41 anos 33 34,0
Total 97 100,00
O tempo médio de acompanhamento foi de 69,4 meses, com variação de 4 a 174 meses e com mediana de 71 meses.
A maioria dos pacientes apresentava sintomas B ao diagnóstico (73,2%), mas esse parâmetro não influenciou a SG (p = 0,08) ou a SLE (p = 0,08).
Em relação ao estadiamento clínico (EC), encontraram-se 36 pacientes com doença localizada (EC I e II) (37,1%) e 61 com doença avançada (EC III e IV) (62,9%) (Tabelas 2 e 3).
Tabela 2. Número e porcentagem de pacientes com diferentes estádios
EC Nº %
IA 1 1,03
IB 1 1,03
IIA 18 18,56
IIB 15 15,46
IIBE 1 1,03
IIIA 5 5,15
IIIB 24 24,74
IIIBE 1 1,03
IVA 2 2,06
IVB 29 29,90
Total 97 100,00
Tabela 3. Número e porcentagem de pacientes agrupados com doença localizada (I e II) e doença avançada (III e IV)
As Tabelas 4 e 5 mostram os resultados da aplicação do teste de log rank para comparação da SLE e SG nas variáveis: sexo, idade, estadiamento e presença de sintomas B.
Nº %
Doença localizada 36 37,1
Doença avançada 61 62,9
Tabela 4. Resultados referentes ao teste de log rank para a comparação da sobrevida livre de eventos
Sobrevida livre de eventos
Qui-quadrado P
Sexo 0,71 0,40
Idade 1,67 0,43
Estádio 0,94 0,33
Sintomas 4,36 0,08
Tabela 5. Resultados referentes ao teste de log rank para a comparação da sobrevida global
A Tabela 6 mostra a distribuição dos pacientes em relação ao subtipo histológico. Encontramos o subtipo EN em 81 pacientes, o que corresponde a 83,6% dos casos. Apenas um paciente não pôde ser classificado (NC), por se tratar de biópsia hepática. Também não foram observados pacientes com subtipo rico em linfócitos (RL).
Sobrevida global
Qui-quadrado p
Sexo 1,19 0,28
Idade 4,52 0,10
Estádio 1,41 0,24
Tabela 6. Distribuição segundo os subtipos histológicos
TH Nº %
CM 14 14,4
DL 1 1,0
EN 81 83,6
NC 1 1,0
Total 97 100,00
CM (celularidade mista) DL (depleção linfocitária) EN (esclerose nodular) NC (não classificado)
Figura 4. Probabilidade de sobrevida global estimada pelo método de Kaplan-Meier de acordo com o subtipo histológico.
Quanto ao imunofenótipo, encontramos que o CD3 foi expresso em apenas um dos 97 pacientes. O CD15 foi expresso em 85 (87,6%) e o CD30 em 83 (85,5%) pacientes (Tabela 7).
Tabela 7. Número e porcentagem de acordo com os resultados da imuno-histoquímica
IH Nº %
CD3 negativo
positivo
96 1
99,0 1,0
CD20 negativo
positivo
73 24
75,3 24,7
CD 15 negativo
positivo
12 85
12,4 87,6
CD30 negativo
positivo
14 83
O imunofenótipo típico do LHC, isso é, CD20(-), CD15(+) e CD30(+), foi encontrado em 37,1% dos casos (36/97).
A expressão de CD20 ocorreu em 24,7% dos casos (24/97). As características clínico-patológicas dos pacientes com LHC com relação à expressão de CD20 estão na Tabela 8. Não houve diferença estatística na expressão de CD20 em relação ao sexo (p = 0,48), ao tipo histológico (p = 0,13), à idade (p = 0,26), à presença de sintomas B (p = 0,07) e ao estadiamento (p = 0,47).
Tabela 8. Associação entre a expressão de CD20 e os dados demográficos, clínicos e histológicos
CD 20
Variável Categoria Negativo
nº (%) Positivo nº (%)
Total nº (%)
p*
Idade (anos) <20 21 (28,8) 5 (20,8) 26 (100) 0,26 21-40 25 (34,2) 13 (54,2) 38 (100)
> 41 27 (37,0) 6 (25,0) 33 (100)
Sexo Masculino 42 (57,5) 16 (66,7) 58 (100) 0,48 Feminino 31 (42,5) 8 (33,3) 39 (100)
Tipo histológico CM 13 (17,8) 1 (4,2) 14 (100) 0,13 DL - - 1 (4,2) 1 (100)
EN 59 (80,8) 22 (91,7) 81 (100) NC 1 (1,4) - - 1 (100)
Sintomas B Não 16 (21,9) 10 (41,7) 26 (100) 0,07 Sim 57 (78,1) 14 (58,3) 71 (100)
Estádio Doença localizada 29 (39,7) 7 (29,2) 36 (100) 0,47 Doença avançada 44 (60,3) 17 (70,8) 61 (100)
Quando estratificamos os pacientes em faixas etárias de < 20 anos, 21 a 40 anos e > 41 anos, também não encontramos diferenças na expressão do CD20.
Sobrevida global – CD20
