UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
MAINARA FERREIRA BARBIERI
ESTUDO FUNCIONAL DA REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL
E TRADUCIONAL DA ALBUMINA NO TRATO REPRODUTOR
MASCULINO E NA FERTILIDADE
CAMPINAS (2018)
MAINARA FERREIRA BARBIERI
ESTUDO FUNCIONAL DA REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL E
TRADUCIONAL DA ALBUMINA NO TRATO REPRODUTOR
MASCULINO E NA FERTILIDADE
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.
Orientador: PROF. DR. LUIS ANTONIO VIOLIN DIAS PEREIRA
Co-Orientadora: PROFA. DRA. LÚCIA ELVIRA ALVARES
CAMPINAS (2018) ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MAINARA FERREIRA BARBIERI E ORIENTADA PELO PROF. DR. LUIS ANTONIO VIOLIN DIAS PEREIRA.
Campinas, 31 de agosto de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Antonio Violin Dias Pereira
Profa. Dra. Maria Christina Werneck de Avellar Profa. Dra. Juliana Elaine Perobelli
Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder
Profa. Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Tio Terêz não tinha se despedido dele. Onde estava agora o Tio Terêz? Um dia, tempos, Tio Terêz o levara à beira da mata, ia tirar taquaras. A gente fazia um feixe e carregava. '- Miguilim, este feixinho está muito pesado para você?'. '- Tio Terêz, está não. Se a gente puder ir devagarinho como precisa, e ninguém não gritar com a gente para ir depressa demais, então eu acho que nunca que é pesado...'
- João Guimarães Rosa, da novela "Campo Geral", em "Manuelzão e Miguilim" No livro 'Corpo de Baile'. Rio de janeiro: Nova fronteira, 2001.
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GRADECIMENTOSA todos que contribuíram para que eu me tornasse uma pessoa melhor, minha eterna gratidão!
À minha família. Por todo o suporte e compreensão. Sei de todo o amor. Sou grata por todas as memórias que construímos juntos – cada uma deu-me a força necessária para continuar trilhando esse caminho. À memória de meus pais, todo o meu amor, admiração e infinita saudade. À Andresa, minha irmã, com quem aprendi cumplicidade e com quem, não importa o tempo, as risadas e piadas nunca se tornam obsoletas.
Aos meus tios e tias, Tio Nardo e Tia Cristina, Tio Berto e Tia Zezé e aos meus primos, Jacques, Melissa e Fernanda. Conto nos dedos até o reencontro a cada festividade ou acaso e sempre sei dos sorrisos que me esperam.
À Marilia, que se tornou família, amiga e parceira profissional - não há felicidade maior que saber de sua companhia em todas as etapas – todo o meu amor, sempre! À Maria Fernanda, Benedito, Fabiano, Julia, Rafael e Joaquim por terem se constituído como uma segunda família desde o primeiro momento em que me mudei para Campinas. Obrigada por toda a ajuda, por todo incentivo e todo o socorro. Sei de toda a alegria que guardo de todos os momentos partilhados com vocês.
À Ana Carolina e Hebert, os “afilhados baianos”, que tanto admiro e amo, gratidão pela confiança, pelos aprendizados, pela rotina e sincronicidade. Vocês revolucionaram a minha vida. À Fabíola, por toda a amizade e por me contaminar com o frescor que os sonhos trazem. Gratidão, queridos, por permitirem meu crescimento profissional. Ao Decola Beta, por me permitir ressignificar ciência e exercer algo em que acredito.
Aos amigos. Em especial, à Jéssica - desde os tempos de Itápolis, colégio e uniforme. A possibilidade de, através de você, acessar minhas infinitas versões forneceu-me coragem e perseverança. Toda a cumplicidade do mundo à amiga que, mesmo quando longe, sempre caminhou juntinho. À Ângela, Renata, Daiana, Andréia e Elson, desde os primeiros minutos de aulas na graduação. Gratidão por todos os estudos, viagens e sonhos compartilhados. À Débora, Patrick, Bianca, Marcos, Leonardo e Iuri, meus refúgios desde o início da pós-graduação na Unicamp, gratidão pelo acolhimento, pelas mãos dadas e por toda a alegria. Obrigada a todos pela prova de que o tempo e a distância não são medidas inversas à amizade. Particularmente, obrigada pela insistência através de telefonemas, redes sociais e e-mails. A felicidade que sinto a cada notícia de vocês me faz perceber o quão sortuda sou.
A todos os Professores que guiaram minhas ideias. Aos Professores de ensino básico, em especial às professoras Neide, Regina e Márcia, por me transmitirem tanto e me estimularem desde o primeiro momento em que decidi que prestaria vestibular. Gratidão pelas conversas infinitas sobre todas as profissões que almejei. Aos Professores de graduação, que me provavam a cada aula, toda a beleza que a biologia carrega. Em especial, à Suzana, Célia e Daniela, espero que eu nunca me desvencilhe da Ciência à qual vocês me apresentaram. Sei de todo o carinho e do empenho em equilibrar meus primeiros passos. Aos Professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual (DBBT)/UNICAMP que distribuíram boas recomendações e explicações nos corredores, particularmente aos Professores Paulo Joazeiro, Áureo Yamada e Sarah Arana cujas constantes orientações metodológicas fundamentaram muitos dos protocolos aqui estabelecidos.
À UNICAMP (Universidade Estadual de Campinas), ao Instituto de Biologia e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, gratidão pela base. À Liliam, por todo suporte, por todo cuidado e toda a dedicação, independente da data ou horário. Obrigada por nunca descuidar dos detalhes e mesmo por se antecipar na orientação de tudo o que precisei. Ao Sappe (Serviço de assistência psicológico e psiquiátrico ao estudante) UNICAMP, pelo amparo nos momentos em que todas as perspectivas pareciam nulas, em especial às Dras. Valéria e Tânia.
A todos os alunos que me permitiram experienciar a monitoria, gratidão pelo aprendizado, constante apoio e por todos os momentos felizes compartilhados. A todos os alunos de iniciação científica, mestrandos e doutorandos do DBBT. Obrigada pelos sorrisos nos corredores, mãos extras na bancada, por todo o conhecimento compartilhado, e, principalmente, por terem feito meus dias de trabalho tão mais prazerosos. Em especial à Brunna, Letícia, Daniela, Ricardo, Renata, Patrícia e Bianca - gratidão por tornarem tudo mais leve! A todos os funcionários e ex-funcionários do DBBT, em especial à Cintia e à Natália - obrigada pela excelência com que vocês realizaram, ao meu lado, cada minúcia do trabalho de bancada, oferecendo suporte a todos, sempre, sem diferenças! Gratidão pelas palavras que me fizeram perseverar e por extravazarem a torcida a cada conquista. À D. Neusinha, por todo comentário de encorajamento e sorriso - seus abraços sempre foram um bálsamo.
À Elisângela, Priscila e Cinthia - a amizade que nasceu em congressos e cursos da área extrapolou e eu não poderia ser mais feliz por contar com vocês na vida profissional e pessoal.
Aos meus orientadores, pelo precioso tempo partilhado. Ao Professor Luis Violin, por me acolher em seu laboratório e compartilhar comigo tantas experiências profissionais, permitindo assim meu crescimento não somente no tema específico desse projeto. Por ter me permitido acessar o tripé pesquisa, extensão e ensino e entender o significado de uma vívida experiência acadêmica. Gratidão por toda a honestidade com que conduz nossa relação, pela paciência e por continuar a me orientar mesmo nos momentos em que as perspectivas pareciam se anular. Meu eterno carinho. À Professora Lúcia, por ter iniciado meu aprendizado na biologia do desenvolvimento. Obrigada pelos sorrisos e pela constante garantia de suporte, confiança e cuidado. Guardo todo o tempo em que tive a oportunidade de compartilhar bancada com a Professora com o máximo respeito.
Gratidão a todos. Prometo continuar me esforçando.
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ESUMOA albumina e sua família gênica desempenham importantes funções de manutenção no organismo, não sendo alvos comuns da seleção natural. O provável envolvimento dessa molécula na reprodução de mamíferos, no entanto, parece destoar dessa premissa. Testando sua condição constitutiva, esse estudo priorizou a análise de abordagens integrativas do sistema testículo-epidídimo-ducto deferente e se propôs a realizar, em camundongos adultos C57Bl6, via experimentações cirúrgicas (orquiectomia, ligadura de túbulos eferentes, criptorquidismo e orquidopexia) e intervenções farmacológicas (flutamida e finasterida) a indução de microambientes, os quais permitiram a emersão de cenários de sinalização e da expressão de fatores vinculados ao contexto da fertilidade. Tais interpretações foram mensuradas via investigação transcricional (RT-PCR e PCR quantitativo), traducional (imuno-histoquímica, morfometria e immunoblotting) e funcional (fertilização in vitro; FIV). O cenário induzido pela interferência da orquiectomia evidenciou que os aqui descritos eventos de síntese e secreção da albumina no epidídimo e ducto deferente são regulados pela disponibilidade de testosterona bioativa, ainda que, isoladamente, esse estímulo não seja suficiente para manutenção do padrão total de expressão gênico e proteico da albumina nas orquidectomias unilaterais (estímulo androgênico endógeno) ou nas bilaterais com reposição de cipionato de testosterona injetável (estímulo androgênico exógeno), sinalizando provável dependência de fatores luminais testiculares e/ou testosterona por ação parácrina. Outros metabólitos, além da testosterona, influenciaram na síntese e secreção de albumina, como a diidrotestosterona (cenário de modulação hormonal por finasterida), principalmente em epidídimo e ducto deferente. Houve falha no papel antagonista exercido pela flutamida, no cenário da expressão/presença da albumina. Evidenciado pelo contexto da ligadura (unilateral) de túbulos eferentes, sinalizou-se a responsividade da albumina à presença ipsilateral de fluido luminal advindo do testículo, principalmente pela alteração da expressão/presença de albumina no segmento inicial do epidídimo. Soma-se a esse cenário de dependência, a presença de espermatozoides (ausentes no contexto do criptorquidismo) e/ou estresse térmico (hipertermia), nos quais, apesar da manutenção de estímulos androgênicos, testículo e fatores luminais, a expressão/presença de albumina mostra-se alterada em todos os órgãos analisados, sendo somente parcialmente restaurada após o retorno da espermatogênese à normalidade (orquidopexia). Ademais à orquestração dos eventos de espermatogênese, experimentos de FIV demonstraram a capacidade da albumina de relacionar-se à interação espermatozoide-zona pelúcida (possivelmente via reação acrossômica), operando como agente potencializador mesmo em
contextos de variação androgênica. Com seu evidente papel carreador e a caracterização da modulação da expressão gênica e presença proteica frente aos cenários testados nessa tese, desperta-se o interesse para estudos futuros que busquem a compreensão da integração de estímulos autócrinos, parácrinos e endócrinos na espermatogênese, projetando-se uma perspectiva de uso futuro da albumina para a dispensabilidade de fármacos de ação específica no contexto da aquisição de capacidade fértil. Ademais, ao se relacionar a processos espécie-específicos, cria-se um vínculo entre a evolução da albumina de vertebrados e a perpetuação gênica desse grupo.
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BSTRACTAlbumin and its gene family perform important maintenance functions in the body, not being common targets of natural selection. The probable involvement of this molecule in mammals’ reproduction, however, seems to run counter to this premise. Testing its constitutive condition, this study prioritized the analysis of integrative approaches of the testis-epididymis-vas deferens system and proposed to carry out in adult C57Bl6 mice, through surgical experiments (orchiectomy, efferent tubule ligation, cryptorchidism and orchidopexy) and pharmacological interventions (flutamide and finasteride), the induction of microenvironments, which allowed the emergence of signaling scenarios and the expression of linked factors in the context of fertility. These interpretations were measured through transcriptional (RT-PCR and quantitative PCR), translational (immunohistochemistry, morphometry and immunoblotting) and functional (in vitro fertilization, IVF) investigations. The scenario induced by the orchiectomy showed that the albumin synthesis and secretion events, described here, in the epididymis and vas deferens are regulated by the availability of bioactive testosterone, although this single stimulus is not sufficient to maintain the total pattern of gene and protein expression in unilateral orchiectomy (endogenous androgenic stimulus) or bilateral orchiectomy with replacement of injectable testosterone cypionate (exogenous androgenic stimulus), signaling a probable dependence of testicular luminal factors and/or testosterone by paracrine action. Other metabolites, in addition to testosterone, influenced the synthesis and secretion of albumin, such as dihydrotestosterone (scenario of hormonal modulation by finasteride), especially in the epididymis and vas deferens. Flutamide exerted an antagonistic role in the albumin expression/presence scenario. The albumin dependence on the ipsilateral presence of luminal fluid coming from the testis was evidenced in the context of efferent tubule ligation, mainly by the alteration of expression/presence of albumin in the initial segment of the epididymis. It is added to this scenario of dependence, the presence of spermatozoa (absent in cryptorchidism) and/or thermal stress (hyperthermia), in which, despite the maintenance of androgenic stimuli, testis and luminal factors, albumin expression/presence was altered in all analyzed organs, being only partially restored after the return of spermatogenesis to normality (orchidopexy). In addition to the orchestration of spermatogenesis events, IVF experiments demonstrated the ability of albumin to transcend its usual constitutive attribution, relating to the spermatozoa-zona pellucida interaction (possibly via acrosome reaction) and operating as a potentiating agent even in contexts of androgenic variation. With its evident carrier role and the characterization of the dependence of its gene expression and protein presence against the scenarios tested in
this thesis, draws out the interest for future studies that seek the understanding of the integration of autocrine, paracrine and endocrine stimuli in spermatogenesis, to the prospect of future albumin use for the dispensability of specific drugs’ action in the context of the acquisition of fertile capacity. In addition, when relating to species-specific processes, a link is created between the evolution of vertebrate albumin and the genetic perpetuation of this group.
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ISTA DE FIGURASFIGURA 1. Filogenia da família gênica da albumina. ... 25 FIGURA 2. Representação esquemática da maturação epididimária... 32 FIGURA 3. Representações esquemáticas ilustrando modelos espécie-específica de controle
hormonal na função testicular. ... 34 FIGURA 4. Complexidade de fatores envolvidos na regulação endócrina e parácrina do
testículo. ... 35 FIGURA 5. Diagrama dos estágios e planos anestésicos baseados no esquema de Guedel. ... 42 FIGURA 6. Ilustrações esquemáticas da configuração morfológica pós-cirúrgica dos modelos
propostos. ... 44 FIGURA 7. RT-PCR de testículo, epidídimo e ducto deferente para transcritos gênicos de
GAPDH (housekeeping) e albumina. ... 64 FIGURA 8. Immunoblotting de testículo, epidídimo e ducto deferente para os anticorpos anti-GAPDH (housekeeping) e anti-albumina. ... 65 FIGURA 9. Imagem representativa dos controles de idade dos tratamentos cirúrgicos e
farmacológicos para o procedimento de imunohistoquímica indireta com anticorpo anti-albumina. ... 66 FIGURA 10. Investigação transcricional do procedimento cirúrgico de orquiectomia unilateral
(órgãos ipsilaterais) e bilateral. ... 71 FIGURA 11. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquiectomia
bilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico bilateral de orquiectomia. ... 72 FIGURA 12. Investigação traducional quantitativa do procedimento cirúrgico de orquiectomia. ... 73 FIGURA 13. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquiectomia
unilateral, órgão ipsilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico unilateral de orquiectomia; órgão ipsilateral... 74 FIGURA 14. Investigação transcricional do procedimento cirúrgico de orquiectomia bilateral
com reposição hormonal. ... 76 FIGURA 15. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquiectomia
FIGURA 16. Investigação traducional quantitativa do procedimento cirúrgico de orquiectomia bilateral com reposição hormonal. Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a intervenção de orquiectomia bilateral com reposição hormonal. ... 78 FIGURA 17. Investigação transcricional do procedimento cirúrgico de ligadura dos túbulos
eferentes. ... 82 FIGURA 18. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de ligadura
bilateral dos túbulos eferentes. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de ligadura dos túbulos eferentes. ... 83 FIGURA 19. Investigação traducional quantitativa do procedimento cirúrgico de ligadura dos
túbulos eferentes. Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a intervenção de ligadura de túbulos eferentes. ... 84 FIGURA 20. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de ligadura
unilateral dos túbulos eferentes, órgão ipsilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de ligadura dos túbulos eferentes. ... 85 FIGURA 21. Investigação transcricional do procedimento cirúrgico de criptorquidismo... 89 FIGURA 22. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de
criptorquidismo bilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de criptorquidismo bilateral. ... 90 FIGURA 23. Investigação traducional quantitativa do procedimento cirúrgico de
criptorquidismo. Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a intervenção de criptorquidismo. ... 91 FIGURA 24. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de
criptorquidismo unilateral, órgão ipsilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de criptorquidismo unilateral. . 92 FIGURA 25. Investigação transcricional do procedimento cirúrgico de orquidopexia. ... 96 FIGURA 26. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquidopexia
bilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de orquidopexia bilateral. ... 97 FIGURA 27. Investigação traducional quantitativa do procedimento cirúrgico de orquidopexia.
Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a intervenção de orquidopexia. ... 98
FIGURA 28. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquidopexia unilateral, órgão ipsilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de orquidopexia unilateral. ... 99 FIGURA 29. Investigação transcricional do tratamento farmacológico com flutamida. ... 102 FIGURA 30. Investigação traducional qualitativa do tratamento farmacológico com flutamida.
Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais com tratamento farmacológico com flutamida. ... 103 FIGURA 31. Investigação traducional quantitativa do tratamento farmacológico com flutamida.
Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a tratamento com Flutamida. ... 104 FIGURA 32. Investigação transcricional do tratamento farmacológico com finasterida. ... 106 FIGURA 33. Investigação traducional qualitativa do tratamento farmacológico com finasterida.
Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais com tratamento farmacológico com finasterida. ... 107 FIGURA 34. Investigação traducional quantitativa do tratamento farmacológico com
finasterida. Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a tratamento com Finasterida. ... 108
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ISTA DE TABELASTABELA 1. Delineamento amostral submetido e aprovado pelo CEUA/UNICAMP referente aos grupos experimentais cirúrgicos e farmacológicos. ... 40 TABELA 2. Delineamento amostral submetido e aprovado pelo CEUA/UNICAMP referente
aos controles de idade dos grupos experimentais cirúrgicos e controles dos tratamentos experimentais farmacológicos por administração de veículo. ... 41 TABELA 3. Categorias de análise morfométrica. ... 57 TABELA 4. Apresentação dos dados brutos referentes à amostra total de ovócitos fertilizados
e não fertilizados/por grupo com cálculo de percentis referentes à taxa de sucesso observada nos procedimentos de fertilização in vitro para os grupos analisados. ... 111 TABELA 5. Resumo das averiguações estatísticas por comparação performadas pelo teste de
chi-quadrado com correção de Yates e Bonferroni para ovócitos com e sem zona pelúcida, para validação dos controles de reação adotados. ... 112
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ISTA DE APÊNDICESAPÊNDICE 1. Controles positivo (fígado) e negativo (cartilagem da cauda) da albumina. . 165 APÊNDICE 2. Imunohistoquímica indireta com anticorpo anti-albumina dos controles de idade
(tratamentos cirúrgicos e farmacológicos)... 166 APÊNDICE 3. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção de orquiectomia. ... 167 APÊNDICE 4. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção de orquiectomia bilateral com reposição hormonal. ... 168 APÊNDICE 5. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção de ligadura de túbulo eferente. ... 169 APÊNDICE 6. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção de criptorquidismo. ... 170 APÊNDICE 7. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção de orquidopexia. ... 171 APÊNDICE 8. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção farmacológica com flutamida. ... 172 APÊNDICE 9. Resultados da análise de PCR quantitativo de testículos, epidídimos e ductos
deferentes submetidos a intervenção farmacológica com finasterida... 173 APÊNDICE 10. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina
para órgãos submetidos a intervenção de orquiectomia. ... 174 APÊNDICE 11. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina
para órgãos submetidos a intervenção de orquiectomia bilateral com reposição hormonal. ... 176 APÊNDICE 12. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina
para órgãos submetidos a intervenção de ligadura de túbulos eferentes. ... 178 APÊNDICE 13. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina
para órgãos submetidos a intervenção de criptorquidismo. ... 181 APÊNDICE 14. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina
para órgãos submetidos a intervenção de orquidopexia. ... 184 APÊNDICE 15. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina
APÊNDICE 16. Resultados da quantificação morfométrica da presença da proteína albumina para órgãos submetidos tratamento com finasterida. ... 190 APÊNDICE 17. Investigação transcricional e traducional qualitativa do procedimento cirúrgico
de orquiectomia unilateral, órgão contralateral. ... 193 APÊNDICE 18. Investigação transcricional e traducional qualitativa do procedimento cirúrgico
de ligadura de túbulos eferentes unilateral, órgão contralateral. ... 194 APÊNDICE 19. Investigação transcricional e traducional qualitativa do procedimento cirúrgico
de criptorquidismo unilateral, órgão contralateral. ... 195 APÊNDICE 20. Investigação transcricional e traducional qualitativa do procedimento cirúrgico
de orquidopexia unilateral, órgão contralateral. ... 196 APÊNDICE 21. Detalhamento do teste estatístico de chi-quadrado para os experimentos de
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ISTA DE ANEXOSANEXO 1. Estimativa do tamanho amostral ... 201
ANEXO 2. Termo de bioética. ... 205
ANEXO 3. Termo de bioética. ... 206
ANEXO 4. Declaração de direitos autorais. ... 207
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UMÁRIOINTRODUÇÃO ... 25
Enunciado do problema ... 25
A família de genes albuminoides ... 25
O paralelo albumina e reprodução ... 27
A biologia da (in)fertilidade masculina ... 30
Justificativa da abordagem desse estudo ... 37
OBJETIVOS ... 38
Objetivo geral ... 38
Objetivos específicos ... 38
MATERIAL E MÉTODOS ... 39
Sujeitos de pesquisa ... 39
Estabelecimento dos procedimentos cirúrgicos ... 42
Orquiectomia ... 43
Ligadura dos túbulos eferentes ... 45
Criptorquidismo ... 45
Orquidopexia ... 46
Procedimentos pós-cirúrgicos... 47
Estabelecimento dos procedimentos farmacológicos ... 47
Antiandrógeno flutamida ... 47
Antiandrógeno finasterida ... 48
Reposição hormonal com cipionato de testosterona... 48
Análise do perfil transcricional para RNAm de albumina ... 48
Reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) ... 48
• Coleta das amostras ... 48
• Extração de RNA total ... 49
• Amplificação para transcritos de albumina ... 50 • Reações de controle do RT-PCR ... 50 • Reações de PCR quantitativo ... 51 Detecção imunoquímica da proteína albumina ... 52 Immunoblotting ... 52 • Coleta das amostras ... 52 • Obtenção dos Homogenados ... 53 • Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS ... 53 • Western Blotting ... 54 Determinação da imunolocalização histológica da proteína albumina ... 55 Imunohistoquímica indireta ... 55 • Coleta das amostras ... 55 • Exposição do epítopo e bloqueio dos sítios inespecíficos. ... 55 Imunolocalização histológica e quantificação morfométrica da presença da proteína albumina ... 56 Estratégia de quantificação ... 56 Análise estatística ... 57 Investigação do papel da albumina na fecundação ... 57 Fertilização in vitro ... 58 • Coleta de ovócitos, remoção de células foliculares e manutenção/remoção da zona pelúcida dos ovócitos ... 58 • Coleta de espermatozoides, capacitação in vitro e incubação com o anticorpo anti-albumina ... 59 • Co-incubação de espermatozoides e ovócitos ... 60 Análise estatística ... 60 RESULTADOS ... 62 Grupos controles ... 62
Controles positivo e negativo de expressão/presença da albumina ... 62 Controles de idade dos grupos experimentais cirúrgicos e dos grupos controles de veículos dos tratamentos experimentais farmacológicos ... 62 Controles de órgãos contralaterais de grupos experimentais de procedimentos cirúrgicos unilaterais ... 67 Grupos experimentais ... 69 Procedimento cirúrgico... 69 • Orquiectomia bilateral ... 69 • Orquiectomia unilateral: órgãos ipsilaterais ... 70 • Orquiectomia bilateral com reposição de cipionato de testosterona ... 75 • Ligadura de túbulos eferentes bilateral ... 79 • Ligadura de túbulos eferentes unilateral: órgãos ipsilaterais ... 80 • Criptorquidismo bilateral ... 86 • Criptorquidismo unilateral: órgãos ipsilaterais ... 87 • Orquidopexia bilateral ... 93 • Orquidopexia unilateral: ipsilaterais ... 94 Tratamentos farmacológicos... 100 • Antiandrógeno flutamida... 100 • Antiandrógeno finasterida ... 105 Ensaios de fertilização in vitro ... 109 DISCUSSÃO ... 114 Prólogo ... 114 Interferência dos fatores de sinalização em órgãos contralaterais por procedimentos unilaterais na expressão/presença da albumina ... 114 Hipóteses acerca da modulação androgênica na expressão/presença da albumina ... 116 Considerações sobre a orquiectomia bilateral ... 118 Considerações sobre a orquiectomia unilateral ... 121
Considerações sobre a orquiectomia bilateral com reposição de cipionato de testosterona .. 124 Outras consequências de obstruções do trato reprodutor masculino na expressão/presença da albumina ... 126 Considerações sobre a ligadura de túbulos eferentes bilateral ... 128 Considerações sobre a ligadura de túbulos eferentes unilateral ... 130 O papel da temperatura sobre a espermatogênese e sua influência na expressão/presença de albumina ... 131 Considerações sobre o criptorquidismo uni e bilateral induzido ... 133 Considerações sobre a orquidopexia uni e bilateral ... 135 Hipóteses acerca da ação de antiandrógenos na expressão/presença da albumina ... 136 Considerações sobre o antiandrógeno Flutamida ... 137 Considerações sobre o antiandrógeno Finasterida... 139 Sobre os ensaios de fertilização in vitro (FIV) envolvendo a albumina. ... 141 Considerações finais ... 149 CONCLUSÕES ... 151 REFERÊNCIAS ... 154 APÊNDICES ... 165 ANEXOS ... 201
INTRODUÇÃO
E
NUNCIADO DO PROBLEMAA família de genes albuminoides
Os genes albuminoides - cuja família compreende a proteína de ligação à vitamina D, a alfa-fetoproteína, a afamina e a albumina - empiricamente são conhecidos por desempenharem funções de manutenção (housekeeping functions) no organismo, não sendo, portanto, alvos comuns da seleção natural (NISHIO et al., 1996). Destoa, no entanto, dessa premissa, o provável envolvimento dos albuminoides na reprodução (MOZZI et al., 2014).
O alinhamento cromossômico linear e as similaridades estruturais desses quatro genes albuminoides evidenciam sua ancestralidade comum (NISHIO et al., 1996). Começando com o primeiro evento de duplicação, o gene ancestral do grupo deu origem ao seguimento de DNA que codifica a proteína de ligação à vitamina D e ao precursor da albumina/alfa-fetoproteína/afamina. Um segundo evento de duplicação originou o gene da albumina e um gene ancestral da alfa-fetoproteína/afamina, o qual mais recentemente se duplicou in tandem para originar o gene da alfa-fetoproteína e o da afamina (MOZZI et al., 2014; NISHIO et al., 1996).
FIGURA 1. Filogenia da família gênica da albumina.
Eventos de duplicação gênica que originaram os quatro genes albuminoides, evidenciando sua ancestralidade comum. Imagem retirada de: Nishio et al. Tandem arrangement of the human serum albumin multigene family in the sub-centromeric region of 4q: evolution and chromosomal direction of transcription. J Mol Biol. 1996. p.117.
A albumina humana é uma macromolécula monomérica consistindo em 585 aminoácidos alinhados em cadeia polipeptídica, contendo 17 pontes dissulfeto e uma cisteína livre (posição 34). A estrutura proteica da albumina é altamente conservada nos mamíferos, possuindo três domínios homólogos em alfa-hélice (10 hélices), com sua estrutura secundária revelando dois subdomínios (A e B) conectados, contendo seis e quatro hélices, respectivamente (PETERS, 1996; BUJACZ, 2012). Quando uma molécula de albumina interage com diferentes substâncias, sua estrutura tridimensional é suficientemente flexível para produzir efeitos de cooperatividade e modulação alostérica, geralmente inerentes às proteínas multiméricas (BUJACZ, 2012).
No atual cenário molecular da fertilidade1, a representatividade dos albuminoides os têm realocado como prováveis genes alvos regulados, ativados em fases específicas do desenvolvimento em resposta a estímulos específicos (MOZZI et al., 2014), expressos majoritariamente pelo tecido hepático e secretados na corrente sanguínea (LIU; REN; SPEAR, 2011).
De toda a família dos albuminoides, a proteína de ligação à vitamina D tem sido o membro mais estudado e correlacionado à infertilidade masculina (JENSEN, 2014). O hormônio esteroide 1α,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D3) é a forma biológica mais ativa da vitamina D e sua deficiência em ratos machos mostrou ter relação direta com a queda das taxas de fertilidade e sucesso de acasalamento (ZANATTA et al., 2011). De fato, ratos mutantes VDR−/− (receptor de vitamina D−/−) apresentam baixa contagem e motilidade espermáticas, além de distúrbios da espermatogênese. Tais alterações são reforçadas pelas ações genômicas e não-genômicas da 1,25D3, sendo esse hormônio capaz de modular a atividade de quinases e o fluxo de íons (como o Ca2+ e o Cl-) pela membrana plasmática das células de Sertoli dos túbulos seminíferos (MIZWICKI; NORMAN, 2009).
Interessantemente, relatos clínicos também destacam a afamina com funções reprodutivas, uma vez que a molécula está presente em níveis relativamente altos em fluido folicular humano (JERKOVIC et al., 2005), com concentração crescente no soro materno durante a gravidez (HUBALEK et al., 2014). Não obstante, camundongos fêmeas Afp−/− (alfa-fetoproteína −/−) são inférteis devido à uma disfunção do eixo pituitário-hipotalâmico levando ao quadro de anovulação (DE MEES et al., 2007; GABANT et al., 2002). Uma vez que a
1 A fertilidade é definida pela capacidade natural de uma espécie em gerar descendência (BONGAARTS,
presença de alfa-fetoproteína em humanos só é descrita no desenvolvimento intraútero e na primeira infância (SHARONY; ZADIK; PARVARI, 2004) ainda se questiona se a alfa-fetoproteína é relevante para a análise da fertilidade em humanos.
O paralelo albumina e reprodução
A relevância da albumina na reprodução poderia, a priori, ser objetivamente investigada através de estudos de fertilidade de indivíduos analbuminêmicos (i.e., indivíduos com ausência completa de albumina). A analbuminemia congênita, um traço autossômico recessivo, tem sido associada a um período pós-natal com sintomas clínicos leves a moderados incluindo hipercolesterolemia e infecções do trato respiratório (NAGASE; SHIMAMUNE; SHUMIYA, 1979). No que concerne à reprodução, há relatos de disfunção placentária, restrição de crescimento intrauterino e prematuridade dos recém-nascidos, se comparados aos parâmetros da população geral (KOOT et al., 2004; TOYE et al., 2012). Extremamente inquietante para a categorização da albumina como gene constitutivo são os relatos de pacientes humanos com analbuminemia (70 casos listados até a atualidade - reported cases; www.albumin.org) sem a presença de qualquer distúrbio clínico relatado (14 casos listados - reported cases; OHNO, 1981).
Contrário à consideração de dispensabilidade da albumina, categorizando-a como proteína essencial, BAKER (2002) destaca que tanto em humanos como na linhagem de ratos Sprague-Dawley NAR (Nagase Analbuminemic Rats; NAGASE; SHIMAMUNE; SHUMIYA, 1979) descritos originalmente com ausência completa de albumina (NAGASE; SHIMAMUNE; SHUMIYA, 1979), há a detecção plasmática de, ao menos, 1/1000 dos níveis normais da proteína (BAKER, 2002), tendo os autores relatado essa condição como imprescindível para a sobrevida. Há relatos de imunomarcação albumina-positivo em hepatócitos isolados de NAR e em hepatócitos de humanos “analbuminêmicos”, característica que aumenta em número e frequência com o avançar da idade ou em tratamento com carcinógenos hepáticos (BARBIERI, 2014; OGAWA; INAGAKI, 2012).
A relevância evolutiva da conservação de polipeptídeos específicos na sequência codificante da albumina tem sido reafirmada graças à recente atualização e reclassificação dos padrões de mutação evidenciados pelos quadros de analbuminemia como fatores de risco ao desenvolvimento pós-natal, uma vez que sua rara incidência na população tem sido atribuída ao fato de que poucos indivíduos analbuminêmicos possivelmente sobrevivem ao período neonatal (CARIDI et al., 2014).
Nos indivíduos sobreviventes, a prevalência da “analbuminemia”, como um defeito alélico heterogêneo (ver Analbuminemia causing mutation; www.albumin.org) causado por uma variedade de mutações pontuais no domínio gênico da albumina em homozigose ou heterozigose (CARIDI et al., 2014), poderia vir a estabelecer uma provável ação de barreira, determinante para o fluxo gênico entre populações mutantes e selvagens (WILSON; CARLSON; WHITE, 1977). Essa hipótese explicaria alguns poucos indivíduos analbuminêmicos heterozigotos nos quais os parâmetros de fertilidade encontram-se levemente reduzidos, frente outros que demonstram uma compensação pelo aumento indiscriminado de outras proteínas séricas como globulinas, transferrinas e fatores de coagulação (ESUMI; SUGIMURA, 2007).
De acordo com OHNO (1981), se atentarmos que não há registro de nenhuma espécie na qual a analbuminemia tenha se tornado uma característica própria em toda a história evolutiva de 500 milhões de anos ou mais dos vertebrados, o escape mais provável ao dilema da existência dessa condição (analbuminemia), deve centrar-se na possibilidade do "efeito carona gênico" (hitchhiking effect) no qual uma porção do gene da albumina possuiria uma dupla finalidade, especificando, por exemplo, também para uma porção de um outro polipeptídeo distante, de funcionalidades tão ou mais críticas, por exemplo.
Funcionalmente, a proteína albumina destaca-se pela sua capacidade de ligação a uma ampla variedade de compostos lipofílicos, incluindo esteroides e demais hormônios, vários fitoquímicos e xenobióticos, carreando o transporte até receptores específicos.
Muito embora à menor afinidade da albumina a ligantes (Kd ~ 10-6M a 10-4M) frente
a outros transportadores, a alta concentração plasmática e versatilidade de sítios ligantes torna a albumina o maior carreador hormonal e regulador de acesso a receptores e proteínas celulares específicos, fundamentando a atribuição à albumina de agente protetor do sistema biológico a disruptores endócrinos. BAKER (2002) propõe que tais propriedades da albumina foram muito importantes em protocordados e vertebrados basais, como os agnatas, há ~ 600-530 milhões de anos, período no qual receptores adrenais e hormônios esteroides sexuais (andrógenos, estrógenos, glicocorticoides, mineralocorticoides e progesteronas) ancestrais provavelmente surgiram em animais multicelulares. Por esse prisma, nesse momento, a albumina teve por função regular o acesso de esteroides aos seus receptores e proteger animais de disruptores endócrinos, i.e., fitoquímicos, fenóis fúngicos e outros produtos químicos formados em fontes hidrotermais por processos geoquímicos.
A associação de hormônios androgênicos/estrogênicos com a albumina tem sido pauta atual de investigação de SUGAMORI; BRENNEMAN; GRANT (2011), em uma
proposta de regulação das regiões promotora e ativadora (enhancer) do gene da albumina exercida por hormônios sexuais. Mais recentemente, LI et al. (2014) avaliaram, em camundongos transgênicos, a expressão do gene da albumina como agente introdutório à expressão gênica preferencial associada à determinação sexual. De fato, a sequência transgênica promotor-ativador do gene da albumina usada por estes autores demonstrou estar sob forte controle sistêmico de hormônios sexuais, fato comprovado pela dramática redução da expressão da albumina transgênica sintetizada pelo fígado de camundongos machos, tanto em grupos submetidos à manipulação estrogênica quanto em animais castrados, mas sem efeitos significativos para a administração pontual de testosterona em camundongos fêmeas.
A convergência das relações genômicas e proteômicas entre albumina e hormônios sexuais guia uma gama de estudos sobre a participação dessa proteína na fertilidade, envolvendo desde seu histórico de associação ao desenvolvimento gonadal (GELLY; RICHOUX; GRIGNON, 1994) e eventos meióticos (KRISHNA; SPANEL-BOROWSKI, 1990) até eventos moleculares associados à maturação epididimária (ARROTEIA et al., 2014; FOURNIER-DELPECH et al., 1997) e a composição seminal (ORLANDO et al., 1988). Quanto a sua versatilidade funcional, a proteína albumina, no trato reprodutor masculino, é relacionada à promoção de proliferação celular e mudanças estruturais de biomembranas (SHAMAY et al., 2005), interferindo assim na ocorrência da reação acrossômica (DAVIS, 1976); à atividade antioxidante (BARAKA-VIDOT et al., 2013); ao carreamento e encapsulamento de esteroides (CHANPHAI et al., 2015); ao sequestro de íons metálicos e óxido nítrico (FASANO et al., 2005); à regulação metabólica de células de Leydig (DAVIS, 1976) e à proteção contra disrupções endócrinas (BAKER, 2002). Estudos recentes (GONCHAROV et al., 2017) têm focado em entender ainda a participação enzimática ativa da albumina em processos fármaco e toxicocinéticos, explorando, por exemplo, a provável atividade esterase da albumina (i.e., catalizando a reação de hidrólise de ligações éster).
Clinicamente, como indicadora de prognóstico, a albumina estabelece-se como proteína de síntese negativa na fase aguda de inflamação clínica (CABRAL, CARVALHO E MISZPUTEN, 2001) e encontra-se intimamente relacionada na regulação do equilíbrio da pressão osmótica uma vez que é o maior constituinte proteico do plasma (PETERS, 1996). No caso da varicocele (i.e., dilatação anormal das veias testiculares), por exemplo, o parâmetro de avaliação da albumina modificada por isquemia é proposto como um biomarcador de estresse oxidativo, uma vez que modificações que alteram a capacidade de ligação da albumina podem surgir durante a isquemia como resultado de acidose, redução da tensão de oxigênio e geração de radicais livres (ALIYAZICIOGLU et al, 2013). Processos inflamatórios relacionados ao
trato reprodutor, ademais, resultam em altas taxas de albumina/zinco dosadas no fluido seminal (LINDHOLMER, CARLSTRÓM e ELIASSON, 1974), sendo a relação entre tal concentração significativamente menor em amostras com boa motilidade e viabilidade espermática.
É notório, no trato reprodutor masculino, ainda, a observação de glicoproteínas cuja porção peptídica apresenta similaridades com a albumina, com ocorrência usualmente atrelada aos estágios finais da espermatogênese e à interação espermatozoide-ovócito. A testibumin (CHENG et al., 1987) corresponde ao primeiro relato de glicoproteína que compartilha regiões imunocompatíveis com a albumina, sendo responsiva ao hormônio folículo estimulante (FSH) e à testosterona (T). Ademais, há evidências de decréscimo na fertilidade e motilidade espermática em ratos imunizados com uma glicoproteína epididimária denominada PES (prealbumin epididymal-specific; FOURNIER-DELPECH; COUROT; DUBOIS, 1985). Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa reportou a inibição da taxa de fertilização de ovócitos com zona pelúcida intacta em experimentos de fertilização in vitro conduzidos na presença do anticorpo monoclonal TRA 54, obtido através da imunização de ratos com células germinativas testiculares de camundongos, o qual reconhece um complexo glicoproteico de alto peso molecular com domínio albuminoide (ARROTEIA et al., 2014).
A biologia da (in)fertilidade masculina
A infertilidade humana, ou a inabilidade de um casal sexualmente ativo em conceber após um ano de relações sexuais regulares sem contracepção, afeta, aproximadamente, 15% dos casais em idade reprodutiva (JUNG; SEO, 2014). Desse total, o comprometimento da fertilidade atrelado a fatores masculinos é a causa em 20%-50% dos casos (IRVINE, 1998; GNOTH et al., 2005; JUNG; SEO, 2014) e apesar de todos os avanços tecnológicos, a real causa da infertilidade masculina é conhecida em, no máximo, 25% das ocorrências (JUNG; SEO, 2014). A infertilidade sem causas conhecidas é classificada em infertilidade masculina idiopática e em infertilidade sem causa aparente (JUNG; SEO, 2014). A primeira indica que o homem possui uma redução inexplicável da qualidade do sêmen. A segunda é atrelada a esterilidade do casal (e.g., ESCA) pois, embora os parâmetros espermáticos estejam normais, o quadro de infertilidade masculina se estabelece por razões completamente desconhecidas (COCUZZA; AGARWAL, 2007; JUNG; SEO, 2014).
Em fato, causas toxicológicas, genéticas e estruturais integram a principal vertente dos estudos que se propõem a entender pontos falhos nos mecanismos capazes de afetar os
parâmetros de eficiência da produção diária de espermatozoides, destoando aos padrões de normalidade e qualidade seminal atualmente validados (COOPER et al., 2010).
Quantitativamente, a fertilidade masculina de mamíferos depende da produção diária, contínua, de milhões de espermatozoides (SCHLATT; EHMCKE, 2014). O espermatozoide de mamíferos é o resultado de um extensivo processo de diferenciação celular, o qual transforma o mais jovem estágio haploide (espermátide redonda) em uma célula altamente polarizada e totalmente móvel (o espermatozoide; AMANN, 2008; ROBB; AMANN; KILLIAN, 1978). Complexos eventos bioquímicos, fisiológicos e morfológicos ocorrem no testículo durante a espermatogênese (GRISWOLD, 1998; WEINBAUER et al., 2010). Alguns desses eventos ocorrem graças à regulação genômica do gameta, porém, quando seu DNA começa a se condensar (no estágio de espermátide), a atividade de transcrição decai.
O espermatozoide testicular liberado no interior do túbulo seminífero, não é móvel ou fértil e requer discretos, porém essenciais passos de diferenciação pós-gonadal antes que estes sejam funcionalmente capazes de participar da fertilização (CHENG; DOLORES, 2010; CORNWALL, 2009). Esses passos finais de diferenciação ocorrem durante o trânsito espermático, ao longo do extenso e único ducto epididimário, o qual une o testículo ao ducto deferente (CORNWALL, 2009). Durante esse trânsito, modificações proteicas sequenciais ocorrem na superfície dos espermatozoides em maturação (ARROTÉIA et al., 2012; CORNWALL, 2009), havendo remoções e modificações progressivas das proteínas testiculares que integravam o espermatozoide imaturo frente ao ganho de novas proteínas (transientes ou permanentes) em seus bem organizados domínios de membrana (ver FIGURA 2; ARROTEIA et al., 2012; COWAN et al., 1997).
FIGURA 2. Representação esquemática da maturação epididimária.
Representação das distintas modificações na membrana celular externa do espermatozoide em maturação durante sua passagem pelo ducto epididimário. Imagem retirada de: Arrotéia K.F., Garcia P.V., Barbieri M.F., Justino M.L., Pereira L.A.V. (2012). The epididymis: embryology, structure, function and its role in fertilization and infertility, Embryology - Updates and Highlights on Classic Topics, Prof. Luis Violin Pereira (Ed.), ISBN: 978-953-51-0465-0. InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/embryology-updates- and-highlightson-classic-topics/the-epididymis-embryology-structure-function-and-its-role-in-fertilization-and-infertility.
Uma vez que todos os estágios citados são essenciais aos espermatozoides para a aquisição de motilidade e capacidade de fertilização, o estabelecimento de um processo funcional de espermatogênese in vitro ainda esbarra em obstáculos que permeiam a dinâmica, a identidade de moléculas e de fatores atuantes nesses microambientes (DACHEUX et al., 2012). Dentre esses, destaca-se a interação extraordinária de fatores autócrinos, parácrinos e endócrinos que supervisionam a coordenada série de divisões meióticas e mitóticas, os elaborados passos de cito-diferenciação e as constantes modificações via interações intercelulares que regem o processo de espermatogênese de mamíferos, que necessita de 6-9
semanas para conclusão (HELLER; CLERMONT, 1963), e é tido, por todo o exposto, como um dos eventos biológicos da mais extrema complexidade (SCHLATT; EHMCKE, 2014).
A regulação endócrina da espermatogênese é um tema de discussão recorrente a longas datas (com 622 revisões para o termo “Regulation of spermatogenesis” pela plataforma PubMed, de acordo com SCHLATT; EHMCKE, 2014) sendo controlada através de um interruptor principal (um pulso gerador de GnRH2) que atua na regulação de dois sistemas de feedback distintos e independentes: o controle da produção de espermatozoides (FSH-inibina) e o dos andrógenos (LH-testosterona; FIGURA 3A; SCHLATT; EHMCKE, 2014).
Segundo o modelo canônico, na primeira via, o FSH atua especificamente sobre as células de Sertoli, regulando a produção de espermatozoides no epitélio seminífero ao controlar a expansão pré-meiótica de células germinativas (SCHLATT; EHMCKE, 2014; SIMORANGKIR; MARSHALL; PLANT, 2009). Co atuando como um sinal endócrino, a Inibina-B, garante a integridade e atividade do sistema de células-tronco testiculares (SCHLATT; EHMCKE, 2014). Na segunda via, o LH atua diretamente nas células de Leydig estimulando a liberação de andrógenos que, responsáveis pela indução ou manutenção do fenótipo masculino, atuarão nos órgãos sexuais ou em caracteres periféricos (SCHLATT; EHMCKE, 2014; SIMORANGKIR; MARSHALL; PLANT, 2009). Ao mesmo tempo, andrógenos também funcionam como hormônios de feedback no hipotálamo, o que ocorre via sinalização pelo neuropeptídio kisspeptina em subpopulações especializadas de neurônios (SCHLATT; EHMCKE, 2014).
2 GnRH: Hormônio liberador de gonadotrofinas. A liberação de gonadotrofinas pela hipófise é controlada pelo
Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (GnRH) cujo pulso secretor, no hipotálamo, é considerado o principal interruptor (ON/OFF) do eixo reprodutivo. LH: Hormônio Luteinizante; FSH: Hormônio Folículo Estimulante. Os dois hormônios gonadotróficos (FSH e LH) desempenham papel central no eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG-axis). O pulso de GnRH controla duas vias de regulação independentes que são responsáveis pela espermatogênese (FSH-Inibina) ou pela esteroidogênese (LH-Testosterona).
FIGURA 3. Representações esquemáticas ilustrando modelos espécie-específica de controle hormonal na função testicular.
(A) Modelo “hipotético universal” e (B) Modelo específico para camundongos e ratos. Imagem retirada de: Schlatt S, Ehmcke J. Regulation of spermatogenesis: an evolutionary biologist's perspective. Semin Cell Dev Biol. 2014 May;29: pp. 11(A) e 13(B).
Evidências evolutivas, no entanto, têm sugerido que alguns grupos de mamíferos apresentam vias alternativas à canônica, como é o caso de camundongos e ratos. Nesses representantes, a espermatogênese apresenta-se sempre em estado máximo de estimulação resultando, pela maior parte da vida, em altas taxas de sucesso reprodutivo (SCHLATT; EHMCKE, 2014). Para tanto, o epitélio seminífero apresenta-se sempre carregado com o número máximo de células germinativas, criando uma produção espermática constante e não-modulável (HELLER; CLERMONT, 1963; SWIERSTRA; FOOTE, 1963).
Em casos como o citado, em que nenhuma modulação é necessária para a produção espermática, o feedback pela Inibina-B torna-se dispensável (SCHLATT; EHMCKE, 2014). Por ser constante, a produção espermática também não requer a modulação pelo FSH ou ativação sincrônica da esteroidogênese, sendo o eixo LH-Testosterona suficiente para controlar tanto a androgenização periférica por via endócrina quanto a atividade do epitélio seminífero por via parácrina. Nesse cenário, o FSH não apresenta papel regulatório na via hipotálamo-hipófise gonadal (FIGURA 3B; SCHLATT; EHMCKE, 2014).
A flexibilidade sugerida pelo cenário endocrinológico atual da espermatogênese e da esteroidogênese abre fundamento para incontáveis adaptações quanto à otimização de demandas próprias a diferentes espécies (SCHLATT; EHMCKE, 2014), gerando um leque de interpretações quanto ao real e necessário envolvimento dos mais complexos fatores na regulação testicular (FIGURA 4), incluindo a albumina.
FIGURA 4. Complexidade de fatores envolvidos na regulação endócrina e parácrina do testículo.
Imagem retirada de: Schlatt S, Ehmcke J. Regulation of spermatogenesis: an evolutionary biologist's perspective. Semin Cell Dev Biol. 2014 May;29: p. 3.
A ocorrência da sinergia entre FSH e testosterona resultando no aumento da eficiência da espermatogênese, clássica via relatada na literatura para a maioria dos animais (MAGUIRE; TRIBLEY; GRISWOLD, 1997), tem sido, atualmente (SCHLATT; EHMCKE, 2014), considerado pauta de revisão uma vez que esse padrão de resposta varia entre indivíduos. Mesmo em primatas, nos quais o receptor para FSH é especificamente expresso em células de Sertoli e parece ser crucial para uma espermatogênese quantitativamente normal, a importância dessa gonadotrofina para manutenção ou não da fertilidade tem sido alvo de debate por mais de uma década (PLANT; MARSHALL, 2001).
No homem, apesar do variado padrão de respostas individuais aos tratamentos de reposição hormonal, evidências moleculares atrelam o FSH à fertilidade uma vez que mutações de baixa frequência no gene que codifica a subunidade β do FSH, quando em homozigose, resultam em infertilidade (PHILLIP et al., 1998). Por outro lado, adicionando incertezas a esse cenário, indivíduos homozigotos para alelos mutantes do gene receptor de FSH apresentam-se férteis. A reunião dessas informações simplesmente demonstra a diversidade sobre o papel regulatório do FSH na função testicular - o qual parece ter traços adaptativos às necessidades das diferentes espécies (SCHLATT; EHMCKE, 2014).
Focando no ainda limitado entendimento do cenário endócrino, é possível encontrarmos o palpável motivo da existência de tão poucos tratamentos efetivos para a infertilidade masculina frente à feminina, ou, em outras palavras, compreendermos a restrição teórico-clínica ainda existente no entendimento da complexidade dos fatores masculinos relacionados à reprodução (SCHLATT; EHMCKE, 2014): embora à incerteza do papel do FSH na produção de espermatozoides, o aumento da produção desses gametas pelos testículos através de um simples estímulo hormonal é ineficiente e/ou com temporalidade e consequências pouco replicáveis frente à atual “facilidade” de estímulo hormonal para produção de ovócitos pelos ovários.
Na atualidade, tratamentos eficazes à infertilidade masculina estão bem estabelecidos para condições como o hipogonadismo hipogonadotrópico, quadros de infecção das glândulas acessórias masculinas, casos de ejaculação retrógrada e mesmo em resultados positivos para detecção de anticorpos anti-espermatozoide (JUNG; SEO, 2014). Salvo tais exemplos, o tratamento apropriado para a infertilidade masculina idiopática não é claro. A forma empírica de tratamento médico empregada nesses casos é dividida em duas categorias com base no modo de ação (GHANEM; SHAMLOUL, 2009): tratamentos hormonais (administração de gonadotropinas, andrógenos, bloqueadores do receptor de estrogénio, e inibidores da aromatase) e a suplementação com antioxidantes (vitaminas, zinco e carnitinas). Em 2014, uma revisão conduzida através da Plataforma Cochrane3 mostrou relevância do tratamento com antioxidantes frente ao hormonal, com repercussão significativa na taxa de nascidos vivos em comparação aos grupos controles (SHOWELL et al., 2014).
É em paralelo à orquestração hormonal/ suplementação com antioxidantes, que o papel de moléculas comuns envolvidas no modelo da capacitação do espermatozoide maduro de mamíferos tem sido explorado em observações recentes sobre a infertilidade de AITKEN; BAKER; NIXON (2015). Segundo essas observações, a albumina desempenharia sua função além do trato reprodutor masculino, durante a capacitação iniciada no trato reprodutor feminino, atuando diretamente na remoção de oxiesteroides recém produzidos da superfície do espermatozoide.
3 A plataforma Cochrane (Cochrane Database of Systematic Reviews) é um dos principais recursos atualmente
acessados para revisões sistemáticas na área da saúde, fundamentando-se como uma rede global independente de pesquisadores, profissionais, pacientes, cuidadores e pessoas interessadas em saúde.
J
USTIFICATIVA DA ABORDAGEM DESSE ESTUDOSeguindo à recente retomada do estudo dos membros albuminoides e sua interação com o trato reprodutor masculino (AITKEN; BAKER; NIXON, 2015; BAKER, 2002; MOZZI et al., 2014), este projeto segue o enfoque funcional por assim permitir o estudo das interações entre os componentes de um sistema biológico e como essas interações fazem emergir funções e comportamentos do sistema (propriedades emergentes; NOBLE, 2013).
Neste contexto, a presente tese sumariza os resultados obtidos sobre a investigação da regulação transcricional e traducional da albumina no trato reprodutor masculino (testículos, epidídimos e ductos deferentes) e sua importância no processo da fecundação. Para tanto, são apresentadas as abordagens experimentais cirúrgicas e farmacológicas em camundongos machos (C57Bl6) adultos, com o objetivo de avaliar se a expressão da albumina nos órgãos do sistema reprodutor masculino:
a) é dependente de hormônios androgênicos (orquidectomia sem reposição hormonal);
b) é dependente da presença do testículo (orquidectomia com reposição hormonal); c) é dependente da presença ipsilateral de fluido luminal advindo do testículo (ligadura dos ductos eferentes);
d) é alterada na ausência de espermatozoides, ocasionada pela hipertermia do sistema; (criptorquidismo);
e) é restaurada após o retorno da espermatogênese à normalidade (orquidopexia); f) é alterada frente à inibição competitiva de hormônios androgênicos (tratamento farmacológico com Flutamida®) e
g) é responsiva à alteração do balanço androgênico testosterona/diidrotestosterona (tratamento farmacológico com Finasterida®).
Ademais, experimentos com fertilização in vitro, envolvendo o bloqueio da proteína albumina em espermatozoides, permitem a avaliação da função dessa proteína no processo de fertilização.
OBJETIVOS
O
BJETIVO GERALUtilizando uma abordagem cirúrgica e farmacológica experimental investigar, no trato reprodutor masculino de camundongos C57Bl/6 adultos, a regulação transcricional e traducional da albumina e sua função no processo da fecundação.
O
BJETIVOS ESPECÍFICOSi. Avaliar os níveis de expressão de mRNAs da albumina no testículo, epidídimo e ducto deferente dos diferentes modelos cirúrgico-experimentais e farmacológicos por RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)/PCR quantitativo (real-time polymerase chain reaction).
ii. Avaliar os níveis de proteína albumina no testículo, epidídimo e ducto deferente nos diferentes modelos cirúrgico-experimentais e farmacológicos por immunoblotting. iii. Localizar a distribuição da proteína albumina no testículo, epidídimo e ducto
deferente nos diferentes modelos cirúrgico-experimentais e farmacológicos por imuno-histoquímica.
iv. Quantificar a variação da expressão e da imunolocalização histológica da proteína albumina no testículo, epidídimo e ducto deferente nos diferentes modelos cirúrgico-experimentais e farmacológicos por morfometria baseada em imuno-histoquímica. v. Investigar a função da albumina na fecundação por fertilização in vitro com uso do
MATERIAL E MÉTODOS
S
UJEITOS DE PESQUISAO delineamento experimental do tamanho amostral proposto nessa tese é coerente com a revisão da literatura correlata, sendo também sustentada por experimentos preliminares realizados por nosso grupo de pesquisa (ARROTEIA et al., 2004; GARCIA et al., 2011) e planejamento estatístico baseado na inferência do tamanho amostral através de simulações no “NCSS PASS Sample Size Software” (HINTZE, 2011), as quais revelaram poder do teste de 0,8 e na estimativa do tamanho amostral para estudos de comparação de variáveis contínuas (ANEXO 1), conforme descrito por ENG (2003). Os grupos experimentais (TABELA 1) e os grupos controle (TABELA 2) do projeto e respectivas propostas amostrais foram submetidas e aprovadas pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Instituto de Biologia da UNICAMP sob o protocolo Nº 4095-1 (ANEXO 2), em continuidade ao protocolo Nº 2855-1A (ANEXO 3), encerrado em dezembro de 2014.
Camundongos machos e fêmeas da linhagem isogênica C57BL/6/JUnib foram obtidos do CEMIB (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório). Todos os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual (DBBT) – Bloco H, Instituto de Biologia (IB), UNICAMP, sob condições ambientais controladas em ciclos de 12 h claro/12 h escuro e temperatura média de 22±2º C. Em razão do grau de invasividade ‘3’ dos procedimentos cirúrgicos, padronizou-se que todos os micro isoladores fospadronizou-sem rotineiramente tratados com solução de hipoclorito de sódio 2% e a maravalha esterilizada autoclavada ou fornecida pela empresa Granja R.G. (estabelecimento credenciado pelo MAPA - código nº 35525020120) na forma de maravalha de pinus (Pinus elliottii) classe A, com lascas de madeira de espessura ≤ 1mm, já esterilizada por radiação gama. Para dieta dos camundongos foi fornecida ração Nuvilab CR1-Nuvital e água filtrada e clorada, ambos ad libitum.
As condições experimentais dos grupos cirúrgicos e farmacológicos atenderam à investigação de dois blocos técnicos (transcricional e traducional). A investigação transcricional englobou a técnica de RT-PCR/qPCR e a investigação traducional englobou as técnicas de imuno-histoquímica e immunoblotting.
Conforme detalhado a seguir, as TABELA 1 e TABELA 2 fornecem os dados referentes ao tamanho amostral, idades e grau de invasividade a que foram submetidos os camundongos utilizados para composição das investigações transcricionais, traducionais e funcionais.
farmacológicos.
GRUPO LINHAGEM
(ISOGÊNICA)
“N”/
SEXO IDADE (DIAS PÓS-PARTO)
G.I. ♂ ♀ ENTRADA NO BIOTÉRIO INÍCIO DO TRATAMENTO SACRIFÍCIO/ COLETA Grupos Experimentais: Inves ti gaç õ es t ra nsc ri ci on al e tr aduc ion al
Orquiectomia sem reposição
hormonal (unilateral) C57BL/6JUnib 20 0 30 56 (Pc) 86 3
Orquiectomia sem reposição
hormonal (bilateral) C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Pc) 86 3
Orquiectomia bilateral com
reposição hormonal C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Pc) / 86 (Tf) 116 3
Ligadura dos ductos eferentes
(unilateral) C57BL/6JUnib 20 0 30 56 (Pc) 71 3
Ligadura dos ductos eferentes
(bilateral) C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Pc) 71 3
Criptorquidismo (unilateral) C57BL/6JUnib 20 0 30 56 (Pc) 146 3
Criptorquidismo (bilateral) C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Pc) 146 3
Orquidopexia (unilateral) C57BL/6JUnib 20 0 30 56 (Pc1) 146 (Pc2) 236 3
Orquidopexia (bilateral) C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Pc1) 146 (Pc2) 236 3
Finasterida C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Tf) 112 3 Flutamida C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Tf) 86 3 Inves ti gaç ão func iona
l Fêmeas (obtenção ovócito) C57BL/6JUnib 0 252 25 40 (Tf) 42 1
Machos (obtenção sptz) C57BL/6JUnib 28 0 30 56 56 1
Machos (vasectomia) C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Pc) - 3
cirúrgicos e controles dos tratamentos experimentais farmacológicos por administração de veículo.
GRUPO LINHAGEM
(ISOGÊNICA)
“N”/ SEXO IDADE (DIAS PÓS-PARTO)
G.I. ♂ ♀ ENTRADA NO BIOTÉRIO INÍCIO DO
TRATAMENTO SACRIFÍCIO/ COLETA
Inve sti ga çõe s tr ansc ri cional e tra duc ion al
Grupos controles de idade dos procedimentos cirúrgicos Controle de idade dos
procedimentos de:
Orquiectomia sem reposição hormonal; Ligadura dos ductos eferentes
C57BL/6JUnib 0 0 30 - 80 1
Controle de idade do procedimento de:
Orquiectomia com reposição hormonal C57BL/6JUnib 10 0 30 - 110 1 Controle de idade do procedimento de: Criptorquidismo C57BL/6JUnib 10 0 30 - 170 1 Controle de idade do procedimento de: Orquidopexia C57BL/6JUnib 10 0 30 - 236 1
Grupos controles dos tratamentos farmacológicos Controle farmacológico
proposto ao tratamento com Flutamida
C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Tv) 80 2
Controle farmacológico proposto ao tratamento com Finasterida
C57BL/6JUnib 10 0 30 56 (Tv) 110 2
Para detalhamento do cálculo do tamanho amostral, consultar ANEXO 1. Esse projeto previu o uso de um tamanho amostral total (n) de 500 camundongos da linhagem isogênica C57BL/6JUnib.
E
STABELECIMENTO DOS PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOSPara a execução dos procedimentos cirúrgicos propostos nessa tese levou-se em consideração o adequado estabelecimento de dose anestésica e analgésica indicada à massa corporal de cada animal (100 mg/kg cetamina, i.p. (intraperitoneal) e 10 mg/kg xilasina, i.p.; veiculados em associação na mesma seringa) submetido à condição experimental em idade adulta (56 dias pós-parto). A escolha anestésica baseou-se no período de latência (5 minutos) e no tempo de analgesia (60 - 100 minutos) suficiente para a execução do procedimento cirúrgico.
A profundidade anestésica foi cuidadosamente avaliada por meio da ausência de sinais como reflexo da cauda, reflexo palpebral e corneal além de alterações das frequências cardíaca e respiratória, conforme detalhado por MASSONE (2011), respeitando-se o patamar fisiológico evidenciado pelo 2º plano de aprofundamento anestésico (estágio III;FIGURA 5).
FIGURA 5. Diagrama dos estágios e planos anestésicos baseados no esquema de Guedel. Estágio I: Analgesia e perda da consciência; Estágio II: Fase de excitação ou delírio; Estágio III: Anestesia cirúrgica, de 1º a 4º planos de aprofundamento; Estágio IV: Choque tubular e morte. A. Pupila concêntrica: homem, cão, suíno, coelho, rato e camundongo – em destaque nas colunas azuis. B. Pupila transversal: felinos e felídeos. C. Pupila longitudinal: equinos, pequenos e grandes ruminantes. Imagem retirada de: Massone, F. Anestesiologia veterinária. 6ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011.
