FIGURA 25 Investigação

transcricional do procedimento cirúrgico de orquidopexia. (A) Gráficos da mensuração de expressão gênica relativa por PCR quantitativo e (B) apresentação do resultado da corrida eletroforética do produto de albumina obtido por RT PCR nos diferentes órgãos analisados (testículo, epidídimo e compartimentos e ducto deferente). Em (A), procedeu-se com análise de variância de 1 fator seguida de teste de múltiplas comparações de Bonferroni; **p<0,001. U.A. = unidade arbitrária.

FIGURA 26. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquidopexia bilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de orquidopexia bilateral.

(A) Representação esquemática do procedimento seguido de immunoblotting de testículo, epidídimo e ducto deferente para o anticorpo anti-albumina. (B-G) Imunohistoquímica indireta com anticorpo anti-albumina. (B) Testículo. (C) Segmento inicial do epidídimo. (D) Cabeça do epidídimo. (E) Corpo do epidídimo. (F) Cauda do epidídimo. (G) Ducto deferente. Barras: (B-F) 50 µm; (G) 15 µm.

FIGURA 27. Investigação traducional quantitativa do procedimento cirúrgico de orquidopexia. Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a intervenção de orquidopexia.

(A) Testículo; (B) Epidídimo: Si = Segmento inicial, Cab = Cabeça, Cor = Corpo, Cau = Cauda; (C) Ducto deferente: Prox = Região proximal, Dist = Região distal. O ranking dos valores obtidos para grupos experimentais versus seus respectivos controles foi comparado por teste estatístico não paramétrico de Kruskal Wallis com pós- teste de Dunn e nível de significância estabelecido em 5% (p<0,05).

FIGURA 28. Investigação traducional qualitativa do procedimento cirúrgico de orquidopexia unilateral, órgão ipsilateral. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais de procedimento cirúrgico de orquidopexia unilateral.

(A) Representação esquemática do procedimento seguido de immunoblotting de testículo, epidídimo e ducto deferente para o anticorpo anti-albumina. (B-G) Imunohistoquímica indireta com anticorpo anti-albumina. (B) Testículo. (C) Segmento inicial do epidídimo. (D) Cabeça do epidídimo. (E) Corpo do epidídimo. (F) Cauda do epidídimo. (G) Ducto deferente. Barras: (B-F) 50 µm; (G) 15 µm.

• Antiandrógeno flutamida

Não houve indícios de alterações morfológicas qualitativas associadas ao tempo e dosagens adotadas à administração do antiandrógeno flutamida para os órgãos de estudo.

Na análise transcricional quantitativa, a administração de flutamida ocasionou oscilação na resposta da expressão gênica da albumina: ou pela ausência de alteração no testículo ou nos compartimentos de segmento inicial e cabeça do epidídimo, ou pelo aumento nos compartimentos de corpo e cauda (ou o epidídimo como um todo), ou ainda, pela ligeira redução no ducto deferente (FIGURA 29A, APÊNDICE 8). Qualitativamente, os resultados referentes à técnica de RT-PCR (FIGURA 29B) apresentaram forte bandeamento, indicando a presença de transcritos (RNAm) de albumina

Na análise traducional, os ensaios de immunoblotting (FIGURA 30A) com anticorpo anti-albumina confirmaram a presença da proteína em todos os órgãos analisados. Observou-se redução significativa da imunorreatividade dos componentes intersticiais nos testículos (FIGURA 31A, APÊNDICE 15A), compartimento de cauda epididimária (FIGURA 31B; APÊNDICE 15B) e região distal do ducto deferente (FIGURA 31C, APÊNDICE 15C)

No epitélio germinativo dos testículos (FIGURA 30B) houve a observação da presença de todos os típicos perfis de imunorreatividade das células germinativas ao anticorpo anti-albumina observados no respectivo controle de idade, com sugestivo aumento da proporção de espermatócitos imunomarcados21. Destaca-se, para o testículo de sujeitos tratados com flutamida, o significativo aumento da proporção de células de Sertoli contendo albumina (FIGURA 30B). Seja quantitativamente ou qualitativamente (FIGURA 31A, APÊNDICE 15A), a presença de células de Sertoli (testículo) imunorreativas ao anticorpo anti-albumina é notória nas administrações desse antiandrógeno, visto que sua observação é extremamente rara para respectivo órgão controle de idade.

Analogamente, no epitélio de revestimento interno do epidídimo (FIGURA 30C- F), também há a observação da manutenção dos perfis de imunorreatividade das células

21 _{Foram encontrados espermatócitos imunorreativos a albumina em secções de túbulos seminíferos nos}

estágios III (espermatócitos em paquíteno (prófase) da 1ª divisão meiótica), VI/VII (espermatócitos em paquíteno mais avançado) e X (espermatócitos em leptóteno (prófase) e em paquíteno (prófase), ambos na 1ª divisão meiótica).

destaque para a constante presença de grandes estruturas vesiculares (bolhas, ver detalhe representativo FIGURA 30C e FIGURA 30E) emitidas do epitélio interno pseudoestratificado em direção ao lúmen epididimário, imunomarcadas pelo anticorpo anti- albumina, provavelmente relacionadas a mecanismos de secreção. Nos compartimentos de segmento inicial e cabeça epididimários há significativo aumento da proporção de pontos incidentes (FIGURA 31B, APÊNDICE 15B) sobre corpos celulares. Nesses mesmos compartimentos, entretanto, a morfometria aponta diminuição de estereocílios imunorreativos à albumina (FIGURA 31B, APÊNDICE 15B). Verifica-se queda também para a proporção de espermatozoides reativos ao anticorpo anti-albumina nas regiões de cabeça e corpo epididimários na comparação com respectivo veículo (FIGURA 31B, APÊNDICE 15B).

Similar ao observado para o órgão ipsilateral da condição unilateral de orquidopexia, a presença proteica da albumina no ducto deferente (FIGURA 30G) é bastante pronunciada, uma vez que ambas as regiões apresentam a totalidade de seus componentes (corpo celular, estereocílio e espermatozoides luminais) imunorreativos à albumina FIGURA 31C, APÊNDICE 15C).

Investigação transcricional do tratamento farmacológico com flutamida. (A) Gráficos da mensuração de expressão gênica relativa por PCR quantitativo e (B) apresentação do resultado da corrida eletroforética do produto de albumina obtido por RT PCR nos diferentes órgãos analisados (testículo,

epidídimo e

compartimentos e ducto deferente). Em (A), procedeu-se com análise de variância de 1 fator seguida de teste

de múltiplas

comparações de

Bonferroni;

**p<0,001. U.A. = unidade arbitrária.

FIGURA 30. Investigação traducional qualitativa do tratamento farmacológico com flutamida. Resultados obtidos para órgãos de grupos experimentais com tratamento farmacológico com flutamida.

(A) Representação esquemática do procedimento seguido de immunoblotting de testículo, epidídimo e ducto deferente para o anticorpo anti-albumina. (B-G) Imunohistoquímica indireta com anticorpo anti-albumina. (B) Testículo. (C) Segmento inicial do epidídimo. (D) Cabeça do epidídimo. (E) Corpo do epidídimo. (F) Cauda do epidídimo. (G) Ducto deferente. Barras: (B-F) 50 µm; (G) 15 µm.

FIGURA 31. Investigação traducional quantitativa do tratamento farmacológico com flutamida. Representação gráfica da análise morfométrica de órgãos submetidos a

tratamento com Flutamida. (A) Testículo; (B) Epidídimo: Si = Segmento inicial, Cab = Cabeça, Cor = Corpo, Cau = Cauda; (C) Ducto deferente: Prox = Região proximal, Dist = Região distal. O ranking dos valores obtidos para grupos experimentais versus seus respectivos controles foi comparado por teste estatístico não paramétrico de Kruskal Wallis com pós-teste de Dunn e nível de significância estabelecido em 5% (p<0,05).

Não houve indícios de alterações morfológicas qualitativas associadas ao tempo e dosagens adotados à administração do antiandrógeno finasterida para os órgãos de estudo.

Na análise transcricional quantitativa, a administração de finasterida provocou redução da expressão relativa da albumina em todos os órgãos/compartimentos analisados do sistema reprodutor masculino (FIGURA 32A, APÊNDICE 9). Qualitativamente, os resultados referentes à técnica de RT-PCR (FIGURA 32B) apresentaram bandeamento, indicando a presença de transcritos (RNAm) de albumina.

Na análise traducional, os ensaios de immunoblotting (FIGURA 33A) com anticorpo anti-albumina confirmaram, qualitativamente, a presença da proteína em todos os órgãos analisados. Observou-se redução significativa da imunorreatividade dos componentes intersticiais no compartimento de cabeça epididimária (FIGURA 34B, APÊNDICE 16B), e nas duas porções analisadas do ducto deferente (FIGURA 34C, APÊNDICE 16C).

A expressão proteica da albumina no testículo de sujeitos em tratamento com finasterida revelou, quantitativamente, o detrimento (para espermatócitos, espermátides e espermatozoides, FIGURA 34A, APÊNDICE 16A) ou significativa redução (espermatogônias, FIGURA 34A, APÊNDICE 16A) dos perfis típicos de imunomarcação de células germinativas e espermatozoides luminais (observados no controle veículo), à exceção do aumento de imunomarcação de células somáticas (células de Sertoli) epiteliais (detalhe da FIGURA 33B, FIGURA 34A, APÊNDICE 16A).

No epitélio de revestimento interno do epidídimo, há a observação qualitativa do perfil de grânulos supranucleares nos compartimentos do segmento inicial (FIGURA 33C) e da cabeça (FIGURA 33D) epididimários, relacionados a mecanismos de secreção celular. A análise morfométrica (FIGURA 34B, APÊNDICE 16B) revelou aumento da imunorreatividade do corpo de células epiteliais à albumina nos compartimentos de segmento inicial e cabeça, ao contrário do compartimento de corpo que apresentou queda.

No ducto deferente (FIGURA 34C, APÊNDICE 16C), diferentemente dos controles de idade, a região proximal do ducto deferente revelou um padrão de diminuição das células epiteliais imunomarcadas pelo anticorpo anti-albumina em conjunto ao aumento de espermatozoides luminais imunorreativos a essa proteína (ver representativo em FIGURA 33G). A região distal do ducto deferente apresentou queda da proporção de estereocílios contendo albumina.

FIGURA 32.