E VIDÊNCIAS DE EMBASAMENTO

1. A redução da biodisponibilidade de testosterona ocasionada pela orquiectomia bilateral resultou na redução quantitativa (superior a 90%) da expressão relativa do gene da albumina no epidídimo e ducto deferente;

2. A ausência da proteína albumina nas células epiteliais e conteúdo luminal do epidídimo e ducto deferente revela a dependência androgênica dessa molécula;

3. A presença de albumina (alóctone) no interstício do epidídimo e ducto deferente pode ser influenciada pela quebra da homeostase decorrente da queda da biodisponibilidade de testosterona.

O microambiente induzido pela orquiectomia bilateral em camundongos adultos demonstrou, em acordo com a significativa redução (↓90%; FIGURA 10) na expressão relativa do gene da albumina no epidídimo e ducto deferente, alteração nos perfis de imuno- histoquímica indireta (FIGURA 11), evidenciando que o anticorpo anti-albumina, nessa condição, não reconheceu seu antígeno específico expresso nos respectivos epitélios de revestimento interno, estereocílios ou lúmen dos órgãos analisados.

A presença da proteína albumina no interstício (tal qual padrão evidenciado nos sujeitos controles de idade para os componentes epididimários) em detrimento da albumina epitelial/luminal, sugere a presença de uma albumina (provavelmente não sintetizada in loco) cuja etapa de transcrição/tradução não estaria à mercê da presença basal androgênica dos órgãos em questão, uma vez que sua ocorrência então, se restringiria a outros sítios (origem alóctone, por exemplo, no fígado), com posterior transporte para os órgãos aqui analisados. Respaldando essa hipótese, nas fotomicrografias (FIGURA 11E-F) referentes ao procedimento de imuno- histoquímica, é perceptível a forte imunomarcação ao anticorpo anti-albumina no interior de vasos sanguíneos, enquanto que para o ducto deferente (FIGURA 11F), por exemplo, a estratégia morfométrica adotada revela uma redução na frequência de regiões intersticiais imunomarcadas.

É provável que a quebra da homeostase androgênica, advinda do procedimento cirúrgico, sirva de estímulo para o recrutamento de uma albumina alóctone, ingressante no interstício do órgão em uma tentativa de redistribuição (transporte) da testosterona ainda biodisponível. Caso essa premissa seja válida, a percepção quantitativa de um interstício menos reativo ao anticorpo anti-albumina no ducto deferente, mas não no epidídimo, pode ressaltar a

manutenção do epidídimo proximal).

Contrariando a origem alóctone para a albumina imunomarcada no interstício, há a possibilidade de síntese in loco de albumina pelas células epiteliais epididimárias e ductais deferentes, o que poderia explicar a manutenção da produção – ainda que significativamente em queda – dos transcritos do gene da albumina em órgãos nos quais imunomarcações intersticiais são as únicas evidências de presença proteica de albumina.

A síntese e secreção ativa da albumina pelos constituintes intersticiais parece ser menos provável uma vez que, ao longo das análises dessa tese, independente da intervenção sofrida e, portanto, dos contextos diferenciados de indução do microambiente de sinalização, a expressão/presença dessa molécula não parece sofrer interferências tão significativas quanto o contexto epitelial, principalmente no epidídimo. Caso fosse uma possibilidade, entender-se-ia aqui, ainda, uma descontinuidade sistêmica comportamental entre interstício e componentes epiteliais/lúmen, o que tem-se revelado cada vez mais improvável pela literatura pertinente (MOUSSAD; BRIGSTOCK, 2000).

Para os componentes epiteliais/luminais, de acordo com o cenário estabelecido pela orquiectomia bilateral, é provável que, como ressaltado por BROOKS; HIGGINS, (1980), os baixos níveis de testosterona circulantes influenciem diretamente na expressão epitelial in situ da albumina. Esses achados apresentam reforço na análise morfométrica, dada a significativa redução de células epiteliais e estereocílios imunorreativos à albumina ao longo do ducto epididimário/deferente. A hipótese de dependência androgênica para a expressão do gene da albumina nas células epiteliais vai também de encontro aos estudos de LI et al. (2014) e SUGAMORI; BRENNEMAN; GRANT (2011) e a proposta de regulação das regiões promotora e ativadora (enhancer) do gene da albumina por hormônios sexuais.

Como órgão dependente da secreção androgênica para viabilidade e potencial fértil, a extensão do procedimento de orquiectomia resulta, no epidídimo, na redução de sua massa total, dados aqui fornecidos (↓36%) e em concordância com a literatura. Tal perda é explicada, a partir de 7 dias de estabelecimento do procedimento cirúrgico, pela ocorrência de quadros de apoptose, restrição de altura estereociliar e volume das células principais epididimárias (LIU; WANG; LIU, 2015). A percepção qualitativa de ondas de apoptose celular são registradas pelo aparecimento de mudanças morfológicas pautadas na visualização de debris celulares no lúmen, regiões citoplasmáticas supranucleares com pouca afinidade basófila/acidófila e núcleos de formato irregular (LIU; WANG; LIU, 2015; MOORE; BEDFORD, 1979). Assim, em última

e lúmen pode estar especificamente vinculada ao reconhecido processo de apoptose por depleção androgênica, inerente ao procedimento cirúrgico, resultando na degradação proteica in situ com processamento e exposição de antígenos dessas moléculas-alvo para posterior reconhecimento por células fagocitárias (MOORE; BEDFORD, 1979).

O repertório apresentado até aqui para o contexto epitelial/ luminal permite a proposição, como hipótese integrativa, de que o antígeno reconhecido pelo anticorpo anti- albumina, caso ainda esteja, em baixa expressão relativa, sendo sintetizado in loco - evidência de transcrição pela fraca, porém presente, banda de RT-PCR e reduzidas mensurações quantitativas – passa por interferências também nos processos traducional, conformacional e/ou metabólico. Assim, sinalizam-se 4 possibilidades majoritárias que estabelecem o comportamento aqui relatado para a albumina: 1) a de que o processo transcricional esteja potencialmente inibido (atividade gênica residual detectada); 2) a de que o processo traducional esteja também potencialmente inibido (presença proteica residual detectada); 3) caso os processos transcricional/traducional permaneçam minimamente presentes, é provável que a proteína albumina sintetizada in situ (autóctone) sofra desvios no estabelecimento de sua conformação original (estruturas terciária e quaternária), por isso não sendo detectada por seu anticorpo específico ou 4) a de que a albumina esteja sob forte índice de degradação em razão do contexto apoptótico estabelecido pela orquiectomia.

Por fim, funcionalmente, foi destacado por MOORE; BEDFORD (1979) que muitas das alterações estruturais epididimárias primárias após a retirada do androgênio (desaparecimento de vesículas do ápice celular, redução no retículo endoplasmático rugoso, queda no volume das cisternas de Golgi e aumento do conteúdo dos lisossomos) parecem evidenciar, mais proeminentemente, a inibição da função secretora. De fato, a supressão de tal característica pode estar diretamente relacionada à queda da disponibilidade de albumina epitelial (autóctone), uma vez que, como pode ser visto nos sujeitos controles de idade (FIGURA 9 G, I, K; seta), há forte indicativo da associação da albumina com a secreção apócrina pela formação de bolhas celulares (epididimossomos; REJRAJI et al., 2006) que se projetam do ápice da célula, resultando na liberação de vesículas no lúmen dos ductos [posteriormente associadas a espermatozoides] quando as bolhas apicais se quebram.

EVIDÊNCIAS DE EMBASAMENTO

1. Na condição de orquiectomia unilateral, a expressão relativa do gene da albumina apresentou-se, geralmente, intermediária à expressão da albumina nas condições controle (de idade) e bilateral, sendo mantida, nos órgãos ipsilaterais, mesmo na ausência de fatores luminais e/ou de testosterona parácrina, provavelmente por compensação pelo metabolismo androgênico contralateral;

2a. No segmento inicial do epidídimo, o perfil inédito de imunorreatividade de subpopulações de células apicais parece ser uma resposta a fatores endócrinos liberados pelos órgãos contralaterais e/ou um perfil resultante da ausência de fatores luminais de sinalização;

2b. A manutenção da diversidade de perfis de imunodetecção da albumina nas células epiteliais do segmento inicial, cabeça, corpo e cauda do epidídimo, assim como do ducto deferente é dependente de fatores luminais testiculares e/ou testosterona por ação parácrina e, portanto, não estão presentes ipsilateralmente após o estabelecimento cirúrgico;

3. A manutenção de albumina no interstício do epidídimo e ducto deferente sugere a não dependência de fatores luminais e/ou de testosterona parácrina ou ainda, origem alóctone da proteína.

Face à orquiectomia unilateral, mecanismos de hipertrofia intersticial (aumento do número de células de Leydig) e de "enriquecimento somático-tubular" (proliferação das células de Sertoli-base) ocasionam a compensação de volume e peso no testículo remanescente (BERGER; CONLEY, 2014) em apenas 8 horas após o estabelecimento da condição, principalmente em representantes pré-púberes (ORTH; HIGGINBOTHAM; SALISBURY, 1984). Evidências sugerem que tais mecanismos respeitem a sinalização hipofisária LH- testosterona (SCHLATT; EHMCKE, 2014) e restaurem seu equilíbrio sistêmico entre 4-7 dias após a orquiectomia unilateral (ORTH; HIGGINBOTHAM; SALISBURY, 1984).

A ideia da compensação sistêmica que leva o testículo remanescente à hipertrofia por células geradoras de andrógenos (células de Leydig) e células sustentaculares (células de Sertoli) - geradoras de substratos necessários à espermatogênese - salienta o papel vital dos fatores testiculares luminais e da testosterona na manutenção, principalmente, da estrutura e função epididimária (ELMORE, 2007).

Nesse cenário, o aumento da testosterona circulante graças à hipertrofia testicular contralateral, em sua forma livre e, portanto, bioativa, pode ter sido o estímulo preciso para

presença proteica) da atividade de transcrição/tradução da albumina, preservando algumas evidências de interação espontânea albumina-testosterona no epidídimo e ducto deferente, ambos ipsilaterais, ao menos nos segmentos específicos, regulados majoritariamente pelo estímulo hormonal (de origem contralateral).

Fatores testiculares parcialmente conhecidos, presentes no fluido que irriga os túbulos eferentes (e compõem os fatores luminais) participam da regulação gênica do epidídimo de maneiras específicas em cada compartimento do órgão (CORNWALL, 2009). A maioria dos genes específicos do segmento inicial do epidídimo são regulados por esses fatores luminais, que ali atuam como fatores de crescimento (LAN; LABUS; HINTON, 1998), ao passo que os genes específicos ao segmento da cabeça epididimária são predominantemente andrógeno- dependentes (SIPILÄ et al., 2006).

Corroborando a presença de atividade transcricional, dois perfis principais de presença proteica foram observados para o epidídimo ipsilateral. Um deles é a imunomarcação de perfil celular periférico (FIGURA 13C(detalhe)-D), comumente encontrada no compartimento de cauda epididimária (FIGURA 9M) em sujeitos adultos controle (56 dpp), porém, mais frequentemente presente em sujeitos com idade mais avançada (236 dpp) e, nesses, nos diferentes compartimentos epididimários. A frequência e local de presença do perfil evidenciado em associação à idade e, na presente tese, ao contexto da orquiectomia unilateral, pode sinalizar a relação da albumina com mecanismos de estresse tecidual.

Ademais, o padrão de imunomarcação positiva para albumina expresso no segmento inicial (e mais raramente na cabeça) do epidídimo ipsilateral evidenciou, majoritariamente, a reatividade à albumina (perfil inédito, não observado para sujeitos controles de idade, FIGURA 13C) de uma subpopulação de células apicais, sugerindo uma possível dependência endócrina da expressão dessa proteína e/ou um perfil resultante da ausência de fatores luminais de sinalização.

As células apicais são amplamente reconhecidas pela habilidade de endocitose (ver ARROTÉIA et al., 2012) e sua imunomarcação, nesse contexto, incita a sugestão de uma possível rota de reabsorção de albumina – sintetizada ou residual –, seja de origem alóctone ou autóctone, na ausência de estímulos parácrinos de manutenção.

Assumindo a relação da albumina imunomarcada (subpopulações apicais epididimárias) no contexto da orquiectomia unilateral à via de degradação proteica – e, portanto, um comportamento contrário ao padrão usual de síntese da albumina para sequestro

hipotetizar que a privação parácrina de andrógenos/fatores luminais/espermatozoides interfira negativamente na regulação de rotas de secreção/presença da molécula de albumina pelo/no epitélio epididimário no compartimento do segmento inicial.

Essa hipótese explicaria a significativa diminuição/ausência de outros perfis característicos de atividades de secreção nas células epiteliais do epidídimo e ducto deferente, bem estabelecidos em sujeitos controle (de idade). Contrapondo a recuperação de perfis de presença proteica observados para sujeitos tratados farmacologicamente (reposição hormonal) com os resultados obtidos para órgãos ipsilaterais (sem tratamento hormonal), surge a proposição de que a dosagem hormonal de testosterona, fornecida pelo órgão contralateral no contexto unilateral, é menos eficiente (ao menos para a manutenção da expressão de albumina por células epiteliais) do que a fornecida farmacologicamente (possivelmente pelas significativas diferenças quanto à concentração intraórgão do andrógeno natural/sintético).

Assim, com o repertório apresentado para o contexto ipsilateral da orquiectomia unilateral propõe-se, como hipótese integrativa, que 1) embora à compensação hormonal contralateral, é possível que haja o estabelecimento de estresse tecidual nos órgãos ipsilaterais, uma vez que, embora os processos transcricional/traducional estejam presentes, são evidenciados poucos perfis imunoreativos de presença proteica, com depleção de perfis de associação da albumina com mecanismos de secreção; 2) estando os processos transcricional/traducional mantidos (ainda que em queda em relação ao controle de idade), é provável que a proteína albumina sintetizada in situ (autóctone) apresente falhas em sua conformação tridimensional ou esteja destinada à degradação; 3) a presença de imunomarcação da albumina relacionada à subpopulações de células apicais pode ser indicativo do seu envolvimento no contexto da degradação proteica e, por fim, 4) a ausência de outros perfis comumente observados em controles de idade (como os de associação albumina-secreção ou o perfil característico do ducto deferente controle) presume a dependência da albumina por fatores luminais testiculares e/ou testosterona parácrina para sua característica atribuição funcional.

testosterona

EVIDÊNCIAS DE EMBASAMENTO

1. A reposição de testosterona sérica é um estímulo modulatório positivo à transcrição do gene da albumina no epidídimo e ducto deferente;

2a. A reposição hormonal sérica por testosterona sintética restaura os perfis de associação da albumina com mecanismos de secreção nas células epiteliais bem como a relação albumina-estereocílios no epidídimo e ducto deferente;

2b. Nas células epiteliais do segmento inicial do epidídimo outros fatores além da testosterona (como a presença de fatores luminais de sinalização) devem ser necessários para a manutenção da expressão da albumina.

3. A variação quantitativa da imunorreatividade do interstício ao anticorpo anti- albumina no ducto deferente (diminuição) e segmento inicial (aumento) do epidídimo, pode ressaltar a implícita dependência androgênica específica de cada órgão.

É reconhecido que o aumento de peso normal do epidídimo durante a maturação sexual e sua manutenção até a idade adulta são dependentes da oferta de andrógenos (CORNWALL, 2009). Em fato, na presente tese, a disponibilização de hormônio sintético no contexto da orquiectomia bilateral resultou no restabelecimento de ~80% do peso epididimário.

Segundo PATRÃO; SILVA; AVELLAR (2009) ainda são poucos os estudos que exploram os mecanismos pelos quais a administração exógena de andrógenos restaura as funções teciduais de um órgão submetido à depleção androgênica.

Sabe-se, por exemplo, que após a orquiectomia bilateral, a atividade da 5alfa- redutase nuclear (enzima conversora da testosterona em diidrotestosterona) diminui drasticamente, especialmente nas regiões epididimárias proximais ao testículo, sendo, nessas regiões, resgatada apenas parcialmente pela reposição de testosterona, mesmo que em administrações suprafisiológicas – e, portanto, sendo, a atividade da 5alfa-redutase nuclear, regulada também por fatores luminais testiculares (PATRÃO; SILVA; AVELLAR, 2009).

Segundo PODESTÁ et al., (1975), a ligação da diidrotestosterona ao receptor citoplasmático 8S do epidídimo comporta-se do mesmo modo: diminui gradualmente após a orquiectomia bilateral, tornando-se indetectável após 30 dias (quando as concentrações teciduais de testosterona e diidrotestosterona no epidídimo tornaram-se indetectáveis) e depende, ademais à administração de testosterona exógena (cipionato de testosterona; 15 dias;

ligação ao andrógeno mostra-se ausente 4 dias após a orquiectomia, não sendo reintroduzida ao microambiente de atuação mesmo após 3 semanas de administração de testosterona (PODESTÁ et al., 1975).

Para a albumina também é evidente, para o segmento inicial do epidídimo, no qual notou-se ausência da presença da albumina epitelial/luminal (FIGURA 15B), a relevância de outros fatores (i.e., testiculares) além do reestabelecimento da sinalização androgênica.

Para os demais compartimentos do epidídimo e ducto deferente, em fato, a orquestração sistêmica do reestabelecimento da presença proteica da albumina pela reposição hormonal após período de orquiectomia bilateral parece ser responsável pela restauração de perfis de associação da albumina com subpopulações epiteliais (FIGURA 15D, F) com mecanismos de secreção (FIGURA 15C) e estereocílios (FIGURA 15D-F). Qualitativamente, principalmente para o ducto deferente, é percebido a imunorreatividade de pequenos grupos celulares, descaracterizando o padrão de marcação de células lado-a-lado, tipicamente observado para esse órgão. De qualquer forma, é evidente que a capacidade tecidual de responsividade aos andrógenos é mantida após a orquiectomia.

A confirmação por LI et al. (2014) sobre a regulação das regiões promotora e ativadora do gene da albumina por hormônios sexuais respalda os achados da análise transcricional por essa tese, que evidencia porcentagens mais discretas de queda da expressão gênica da albumina para o presente contexto se comparados à condição análoga, sem reposição hormonal.

O repertório apresentado permite a proposição, como hipótese integrativa para o contexto epitelial/ luminal de expressão e presença da albumina após orquiectomia bilateral, que o sucessivo período de reposição de testosterona exógena 1) estimulou a retomada do processo transcricional do gene da albumina; 2) bem como restaurou a presença de perfis de associação da albumina com subpopulações epiteliais, mecanismos de secreção e estereocílios nos compartimentos de cabeça, corpo e cauda epididimários e ducto deferente; 3) dados da morfometria, no entanto, destacam que a restauração provinda do estímulo androgênico não chega a ser plena, uma vez que ainda são observadas oscilações nas quantidades de células epiteliais imunorreativas à albumina; 4) principalmente na região do segmento inicial epididimário, no qual a depleção da presença da albumina epitelial/luminal mesmo após reintrodução androgênica não é estímulo suficiente para a retomada da funcionalidade da albumina.

segmento inicial do epidídimo, houve a descrição de um perfil de imunomarcação da albumina restrito às células apicais, potencialmente atribuída a fatores endócrinos liberados pelos órgãos contralaterais e/ou como um perfil resultante da ausência de fatores luminais de sinalização e que tal observação não foi duplicada para o contexto de reposição hormonal, duas hipóteses se estabelecem: 1) a administração de cipionato de testosterona atingiu caráter suprafisiológico, ocasionando um quadro de retroalimentação negativa e assim inibindo a presença de tal perfil proteico e/ou 2) com o reestabelecimento do estímulo androgênico, o indicativo do envolvimento da albumina no contexto da degradação proteica deixa de ser relevante.

O

MASCULINO NA EXPRESSÃO

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Obstruções congênitas e adquiridas tendem a causar desequilíbrios na pressão hidrostática de porções do trato reprodutor masculino visto a contínua conexão de seus túbulos e ductos constituintes (NISTAL et al., 1999). A resposta varia, a depender do momento e altura da obstrução (ALTAY et al., 2001). A degeneração do epitélio secretório costuma ser a resposta generalista a quadros de obstrução crônica do sistema de túbulos e ductos masculinos, com relatos de aumento de pressão, modificações deletérias e acúmulo de metabólitos, combinação essa que acarreta o aparecimento de danos morfológicos (FLICKINGER et al., 1999).

Obstruções do ducto deferente ou epidídimo per se não costumam desempenhar efeitos morfológicos adversos no epitélio germinativo ou nas células de Leydig em observações primárias, no entanto, RAJALAKSHMI et al. (1993) descrevem anormalidades morfológicas, em alta porcentagem, em espermatozoides oriundos da cauda do epidídimo frente a obstrução do epidídimo ou ducto deferente. Em suas observações, o grupo postula que essas obstruções têm potencial para deturpar o processo de espermiogênese, sendo consequência de severo estresse testicular devido à dificuldade de reabsorção e de circulação do fluido contendo fatores luminais.

Ordinalmente, a amplitude obstrutiva causada pelo evento da orquiectomia não altera o quadro geral de síntese e secreção proteica do epitélio do epidídimo a curto prazo, embora reduza o padrão de expressão regional, comumente observado para esse órgão a longo prazo (ORGEBIN-CRIST et al., 1987).

É a barreira hemato-testicular que controla a composição do fluido que integra o túbulo seminífero, o qual é importante para a nutrição e manutenção coloidosmótica das células germinativas (SETCHELL, 1980). A composição do fluido reflete as condições no interior do

(PILSWORTH; HINTON; SETCHELL, 1981; SETCHELL, 1980). O provável envolvimento do fluido testicular no arrasto da onda espermatogênica foi amplamente sugerido na literatura (PEREY; CLERMONT; LEBLOND, 2005) uma vez que o livre fluxo de fluido no testículo é um fator atrelado à regulação da espermatogênese (PILSWORTH; HINTON; SETCHELL, 1981).

No particular cenário obstrutivo da ligadura de túbulos eferentes, o prejuízo funcional das células de Sertoli é o principal indício destacado na literatura, resultando em um decréscimo da atividade espermática e secretória (REN et al., 2006) do órgão como um todo. De acordo com JOHNSTON et al. (2007) e REN et al. (2006), os níveis circulantes de testosterona após o procedimento são reduzidos e existem relatos de hipersecreção de LH. O aumento na produção de LH resulta na estimulação das células de Leydig, sujeitas à hiperplasia (REN et al., 2006; TURNER et al., 2007).

Em roedores, os túbulos eferentes são finos, longos e tortuosos e juntamente com a rete testis, reabsorvem mais de 90% do fluido dos túbulos seminíferos, secretado principalmente pelas células de Sertoli e de suma importância para o transporte dos espermatozoides ao