MORFOMÉTRICA DA PRESENÇA DA PROTEÍNA ALBUMINA

Estratégia de quantificação

Para cada grupo (experimental/controle) estabelecido, amostras isotrópicas11 _de testículo, compartimentos de epidídimo (segmento inicial, cabeça, corpo e cauda) e compartimentos de ducto deferente (proximal e distal) foram uniformemente, sistematicamente e randomicamente seriadas em micrótomo por coleta de cortes com distância de 150 µm (30 cortes de 5 µm) entre si, de acordo com Princípio de Cavalieri (MANDARIM-DE-LACERDA, 2003)12. Os cortes coletados foram submetidos ao protocolo de imunohistoquímica previamente descrito. Para cada corte, foi documentado registro fotomicrográfico em fotomicroscópio eclipse 800 (Nikon, Japan), utilizando-se câmera digital Coolsnap (Media Cybernetics, USA), em objetiva de 20X, totalizando 30 campos aleatórios/órgão/grupo.

Com a utilização da plataforma de uso livre de análise de imagens científicas ImageJ2 (ImageJ software, http://imagej.net/13) uma malha de 50 pontos (draw line or point grids) foi projetada sobre cada fotomicrografia documentada. A escolha do grid baseou-se na metodologia de MA et al., 2016, descrita especificamente para testículos, epidídimos e ductos deferentes. Cada ponto incidente obedeceu à caracterização das categorias apresentadas na

11 _{A isotropia de amostras não homogêneas em sua orientação foi garantida pelo uso de um recurso de}

orientação (orientator), conforme proposto por MATTFELDT et al., 1990.

12 _{Mandarim-De-Lacerda CA. Stereological tools in biomedical research. Ann Brazilian Acad Sci}

2003;75(4):469–86.

13 _{SCHINDELIN, J. et al. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular}

TABELA 3. O total de pontos contabilizados para cada categoria de cada órgão, nas fotomicrografias analisadas, fundamentou a comparação da distribuição da imunomarcação histológica da proteína albumina entre os grupos experimentais e seus respectivos controles. TABELA 3. Categorias de análise morfométrica.

Ó

rgão Testículo

Epidídimo (segmento inicial, cabeça, corpo e cauda)

Ducto deferente (proximal e distal)

C at ego ri as d e cl as si fi ca ção dos pon tos Interstício ALB + Espermatogônia ALB + Espermatócito ALB + Espermátide ALB + Célula de Sertoli ALB + Espermatozoide luminal ALB +

Interstício ALB + Células epiteliais ALB +

Estereocílio ALB + Espermatozoide luminal ALB +

ALB + = categoria de ponto incidente em região imunomarcada pelo anticorpo anti-albumina.

Análise estatística

A partir do total de pontos contabilizados foi calculada a média e o desvio padrão da frequência de ocorrência de cada categoria. O ranking dos valores obtidos para grupos experimentais versus seus respectivos controles foi comparado por teste estatístico não paramétrico de Kruskal Wallis com pós-teste de Dunn e nível de significância estabelecido em 5% (p<0,05). O teste foi realizado no software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com).

I

Para investigar a possível função da albumina no processo de fecundação, foi conduzido um experimento de fertilização in vitro com espermatozoides pré-incubados com anticorpo anti- albumina.

Fertilização in vitro

• Coleta de ovócitos, remoção de células foliculares e manutenção/remoção da zona pelúcida dos ovócitos

Para a coleta de amostras destinadas à fertilização in vitro, camundongos fêmeas (40 dias pós-parto14) foram superestimuladas por duas injeções intraperitoneais consecutivas de 200 µL/aplicação de gonadotrofina coriônica equina (eCG 5 IU; Syntex S.A., São Paulo, SP, Brazil) e, após 48 horas, gonadotrofina coriônica humana (hCG 5 IU; Calier, Barcelona, Spain).

Imediatamente após a 2ª aplicação, as fêmeas superestimuladas foram colocadas em contato com machos previamente vasectomizados para a estimulação copulatória.

Transcorridas 20 horas da administração hormonal de hCG (5 IU), os camundongos fêmeas foram eutanasiados por deslocamento cervical para a etapa de laparotomia exploratória e coleta do complexo ovário-oviduto (para acesso às ampolas oviductais). Com auxílio de estereomicroscópio (aumento de 6X), foi realizada a dissecção, por instrumental adequado, das ampolas oviductais (isoladas agora do complexo coletado) e foi identificada a região de deposição dos ovócitos liberados. As ampolas oviductais foram então transferidas para placas de cultura plásticas (Corning, Poliestireno Estéril) contendo 100 µL de solução salina fosfato- tamponada Dulbecco15 (DPBS; D8662; Sigma-Aldrich) enriquecida com MgCl2 e CaCl2, sem suplementação de BSA, pré-equilibrado a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2. Procedeu-se com a mesma conduta para o meio utilizado para a lavagem e manutenção fisiológica dos espermatozoides. Procedeu-se então com o rompimento da ampola oviductal e liberação de agrupamentos de ovócitos, transferidos para poços de placas plásticas estéreis (Nunc MicroWell), preenchidos com 400 µL de DPBS nas condições acima descritas. Os agrupamentos de ovócitos foram então submetidos a etapas de separação mecânica (remoção

14 _{Período estabelecido pela entrada na puberdade (iniciada entre 21 e 28 dias), degeneração do tampão vaginal,}

com abertura vaginal (ente os 25 a 40 dias) e início da ovulação (6 semanas) em camundongos fêmeas (Guénet JL,

Benavides F, Panthier JJ, Montagutelli X. Genetics of the Mouse. Berlin: Springer, p.408, 2015 / Braga LMG de M. Controle reprodutivo em biotérios de criação de animais de laboratório com ênfase em roedores. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 41, n.1, p. 105-109, 2017.).

15 _{O protocolo original (baseado em ARROTEIA, K. et al. PLoS ONE, v. 9, n. 8, p. 1–11, 2014a.) previa o uso}

do meio M2 (Sigma-Aldrich), que se trata de uma solução modificada de bicarbonato de Krebs-Ringer e possui 4g/L de albumina em sua constituição (fração bovina V). Para evitar a presença de albumina “contaminante” na solução de cultura, optou-se por padronizar o uso de DPBS, sem adição de BSA. Experimentos rodados paralelamente com meios M2/M16 frente ao uso de DPBS não revelaram diferença estatística significativa para os resultados obtidos para o uso de anticorpo anti-albumina na suspensão de espermatozoides, para ovócitos com ou sem zona pelúcida, mas é notória a observação de arrasto temporal para o processo in vitro de fertilização na metodologia de uso do DPBS.

das células foliculares) por consecutivas aspirações com pipeta Pasteur de vidro afilada artesanalmente, acoplada a um sistema de aspiração bucal (contendo bucal improvisado com 1 Ponteira Tipo Gilson Azul Cral 200-1000ul, conectado por 1 Tubo látex estéril hospitalar a 1 Filtro de seringa Estéril Midisart SRP25 (área de filtração de 1,7 cm2, com membrana em PTFE Hidrofóbico e Poro 0.2μm), conectado via tubo de látex a pipeta Pasteur de vidro afilada artesanalmente para as diferentes dimensões do ovócito ou ovócito+células foliculares associadas).

Para remoção química das células foliculares associadas, os ovócitos foram incubados, por 30 segundos, em 400 µL de solução de hialuronidase testicular (H3506, Sigma- Aldrich), preparada a 0,1% em DPBS. Consecutivas aspirações (média de 10 aspirações/poço) auxiliaram, por via mecânica, o desprendimento das células foliculares ainda persistentes.

Para ensaios que envolviam ovócitos com zona pelúcida, a amostra foi transferida para placas de 4 poços contendo 3 mL de DPBS, e incubada em estufa de cultura estéril por 3 h a 37º C, com atmosfera de 5% de CO2. Para ensaios que envolviam ovócitos sem zona pelúcida, uma etapa adicional de incubação por 10-20 segundos, em 400 µL de solução ácida de Tyrode (pH 2,5; Sigma-Aldrich) foi necessária, procedendo-se com consecutivas aspirações, lavagem em DPBS, transferência para placas de 4 poços contendo 3 mL de DPBS e incubação em estufa de cultura estéril por 3 h a 37º C, com atmosfera de 5% de CO2.

Ovócitos destinados a ambos os ensaios (com e sem zona pelúcida), após período de incubação em estufa estéril, foram considerados maduros se verificada a liberação do primeiro corpúsculo polar.

• Coleta de espermatozoides, capacitação in vitro e incubação com o anticorpo anti-albumina

Para a coleta de amostras destinadas à fertilização in vitro, camundongos machos foram eutanasiados por deslocamento cervical. Uma alta concentração de espermatozoides foi coletada a partir da maceração da cauda do epidídimo, sendo depositada diretamente em placas de cultura plásticas (Corning) contendo 200 µL de DPBS. Com o objetivo de simular a capacitação espermática, os gametas masculinos obtidos foram incubados por 2 h em estufa de cultura estéril a 37º C, com atmosfera de 5% de CO2. A amostra coletada foi transferida para eppendorf inclinado a 45º por 1 hora em estufa de cultura, ambientada a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2. Procedeu-se com a aspiração de 700 µL de DPBS da porção superior do eppendorf por esta fração conter os espermatozoides com melhor motilidade (técnica de swim

up). A repetição do procedimento ocorreu até o ajuste da concentração final de 2x106 espermatozoides/mL mensurados em câmera de Makler.

Para mensuração das taxas de fertilização, espermatozoides foram aliquotados, na concentração proposta, para composição de 3 grupos:

1) controle I, sem adição de anticorpo à amostra (espermatozoides incubados por 3 horas em meio M16);

2) controle II, com a adição de soro normal de coelho na concentração final de 10%16 _e

3) pAb ALB (teste), com adição de anticorpo anti-albumina (ab19196) em concentração final de 400 µg/ml (1:10) de proteínas. Os 3 grupos foram incubados por 1 h em estufa de cultura estéril a 37º C, 5% de CO2 atmosférico.

• Co-incubação de espermatozoides e ovócitos

Para a co-incubação de espermatozoides e ovócitos, os mesmos foram transferidos para 3 aplicações (60 µl / gota) de DPBS em placas de cultura estéril (Cornning, 35 mm de diâmetro) contendo 3 mL de óleo mineral (Sigma-Aldrich). Ovócitos maduros foram transferidos para essas gotas de meio contendo espermatozoides e imersas em óleo mineral, em uma proporção de 3 ovócitos/gota. Cada “gota” continha um dos 3 grupos de espermatozoide para análise (controle I, controle II e pAb ALB). Os ensaios envolvendo ovócitos com e sem zona pelúcida foram conduzidos paralelamente.

Após 5 horas de co-incubação em estufa de cultura, ambientada a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2, os ovócitos e espermatozoides aderidos foram transferidos para novas gotas de DPBS e, após 24 horas, analisadas as taxas de fertilização em microscópio invertido (Nikon Eclipse TS100) seguindo, como indicativos de sucesso, os critérios: presença de dois corpúsculos polares, presença de dois pró-núcleos ou detecção de pré-embrião de dois blastômeros.

Análise estatística

A análise estatística envolveu a comparação do total de ovócitos fertilizados/não fertilizados entre os subgrupos controle I, controle II e pAb ALB através de testes chi-quadrado

16 _{Realizou-se também ensaio com utilização do anticorpo IgG anti-coelho feito em cabra (HRP) (ab97051;}

com nível de significância ajustado por Bonferroni para 3 testes (p=0,016/teste) e executada a correção de Yates em função das comparações exibirem grau de liberdade 1. Os testes foram realizados com a utilização da plataforma de Preacher(2001)17.

17 _{Preacher, K. J. (2001, April). Calculation for the chi-square test: An interactive calculation tool for chi-}

RESULTADOS

A apresentação dos dados obtidos para os grupos experimentais avaliados nessa tese será precedida da caracterização dos grupos controles estabelecidos.

Seguindo, então, o fluxo de análise estabelecido no item 3 (material e métodos), para cada grupo experimental (procedimento cirúrgico/farmacológico), serão apresentados os resultados obtidos para as técnicas de investigação transcricional (englobando as técnicas de RT-PCR e PCR quantitativo) e investigação traducional (englobando as técnicas de immunoblotting, imuno-histoquímica e morfometria). Na sequência, a investigação funcional será apresentada através da técnica de fertilização in vitro.

G

Controles positivo e negativo de expressão/presença da albumina

No fígado, controle positivo da expressão de albumina, foram identificados, qualitativamente, a expressão de transcritos gênicos (APÊNDICE 1A) e a presença da proteína albumina (APÊNDICE 1B). Na cartilagem da cauda, controle negativo de expressão da albumina, não foram qualitativamente identificados a expressão de transcritos gênicos (APÊNDICE 1A) ou da proteína albumina (APÊNDICE 1B). O APÊNDICE 1 é representativo dos controles de reatividade do anticorpo anti-albumina para hepatócitos imunomarcados (controle positivo; APÊNDICE 1C-D) e ausência de reatividade em tecido cartilaginoso (controle negativo; APÊNDICE 1E-F) para todos os grupos experimentais, controles de idade dos tratamentos cirúrgicos e controles dos tratamentos farmacológicos (dados não apresentados).

Controles de idade dos grupos experimentais cirúrgicos e dos grupos controles de veículos dos tratamentos experimentais farmacológicos

Para todos os grupos controles, de idade dos tratamentos cirúrgicos e de veículo dos tratamentos farmacológicos, que correspondem à fase adulta de desenvolvimento pós-natal (80 dpp (com ou sem veículo de administração), 110 dpp (com ou sem veículo de administração) e 170dpp) foram identificados a presença qualitativa dos transcritos gênicos bem como da proteína albumina pelas técnicas de RT-PCR (FIGURA 7A-C; E-F) e immunoblotting (FIGURA 8A-C; E-F), respectivamente, em todos os órgãos estudados: testículos, epidídimos e ductos deferentes.

Para o grupo controle de idade do tratamento cirúrgico da orquidopexia, que corresponde à fase de transição adulto/idoso do desenvolvimento pós-natal (236 dpp) foram identificados bandeamentos menos intensos, tanto no que se refere aos transcritos gênicos como para a presença da proteína albumina (analisados, respectivamente, pelas técnicas de RT-PCR (FIGURA 7D) e immunoblotting (FIGURA 8D) em todos os órgãos estudados: testículos, epidídimos e ductos deferentes.

Para guiar a investigação traducional da albumina pelo procedimento de imuno- histoquímica e, logo, permitir tecer a relação da albumina com o microambiente em questão, optou-se por se utilizar na presente tese, como resultado dos controles de idade, uma prancha representativa, que sintetiza os principais perfis de presença proteica observados para essa molécula nos órgãos analisados. Os perfis evidenciados na FIGURA 9 contemplam padrões comumente encontrados nos estágios de 80 dpp (com ou sem veículo de administração), 110 dpp (com ou sem veículo de administração) e 170dpp. Uma amostra de fotomicrografias representativas de todos os grupos controle analisados, de idade e veículos, pode ser acessada no APÊNDICE 2.

Conforme pode também ser visto no APÊNDICE 2 aos 236 dpp pode ser observada a diminuição na frequência de incidência de alguns desses padrões (principalmente dos perfis associados à atividade secretória no epidídimo; FIGURA 9; G, I, K)

Resultados quantitativos acerca da análise transcricional (APÊNDICE 3-9) e traducional (APÊNDICE 10-16) foram analisados, respectivamente, pelas técnicas de PCR quantitativo e Morfometria., sendo os valores adotados para comparação direta com os grupos experimentais cirúrgicos e farmacológicos analisados.

FIGURA 7. RT-PCR de testículo, epidídimo e ducto deferente para transcritos gênicos de GAPDH (housekeeping) e albumina.

(A) 80 dpp sem veículo de administração; (B) 110 dpp sem veículo de administração; (C) 170dpp; (D) 236 dpp; (E) 80 dpp com veículo de administração para flutamida; (F) 110 dpp com veículo de administração para finasterida.

FIGURA 8. Immunoblotting de testículo, epidídimo e ducto deferente para os anticorpos anti-GAPDH (housekeeping) e anti-albumina.

(A) 80 dpp sem veículo de administração; (B) 110 dpp sem veículo de administração; (C) 170dpp; (D) 236 dpp; (E) 80 dpp com veículo de administração para flutamida; (F) 110 dpp com veículo de administração para finasterida.

FIGURA 9. Imagem representativa dos controles de idade dos tratamentos cirúrgicos e farmacológicos para o procedimento de imunohistoquímica indireta com anticorpo anti-albumina18.

A imagem contendo o repertório completo dos padrões evidenciados em cada controle pode ser acessado como APÊNDICE 1. Essa imagem é uma simplificação que busca evidenciar os principais padrões imunorreativos observados ao longo das idades. Observar, no testículo, (A) a relação da albumina com células somáticas (Sertoli; cabeça de seta), com células germinativas e, portanto, com a progressão do ciclo celular (A-E; setas) e com o espermatozoide luminal (A; asterisco). No epidídimo, com subpopulações celulares epiteliais (F, H, J; cabeça de seta), com mecanismos de secreção luminal (G, I, K; seta), estereocilios (L, asterisco) e espaço pericelular (M). No ducto deferente, observar a presença da albumina no epitélio de revestimento na porção proximal (N) e, na porção distal, integrando os estereocílios e a massa de espermatozoides (O). Controles de reação (sem anticorpo 1ª são mostrados nos detalhes das imagens E, M e O. Barras: (A – O) 15 µm.

Controles de órgãos contralaterais de grupos experimentais de procedimentos cirúrgicos unilaterais

A análise dos órgãos contralaterais dos procedimentos cirúrgicos unilaterais demonstrou, qualitativamente, a presença de transcritos gênicos e da proteína albumina pelas técnicas de RT-PCR e immunoblotting, respectivamente. Para os órgãos contralaterais, a intensidade dos bandeamentos obtidos por ambas técnicas manteve padrão similar ao de seus respectivos controles de idade (ver APÊNDICE 17-20).

Resultados quantitativos acerca da análise transcricional (analisado pela técnica de PCR quantitativo) dos órgãos contralaterais apresentaram oscilações (aumento ou redução) não significativas ou inferiores a 10%, concentradas no epidídimo e ducto deferente contralaterais para as intervenções unilaterais de orquiectomia (APÊNDICE 3), ligadura de túbulos eferentes (APÊNDICE 5) e orquidopexia (APÊNDICE 7). A intervenção de criptorquidismo unilateral (APÊNDICE 6) foi a de maior impacto no órgão contralateral, com redução da expressão da albumina próxima a 20% em testículo e ducto deferente contralaterais.

A imuno-histoquímica indireta dos órgãos contralaterais dos procedimentos de orquiectomia (APÊNDICE 17), ligadura de túbulos eferentes (APÊNDICE 18), criptorquidismo (APÊNDICE 19) e orquidopexia (APÊNDICE 20) revelaram perfis de imunomarcação, a priori, análogos aos dos respectivos controles de idade. De fato, para testículo (APÊNDICE 12A, APÊNDICE 13A e APÊNDICE 14A) e epidídimo (APÊNDICE 10A, APÊNDICE 12B, APÊNDICE 13B e APÊNDICE 14B), a análise morfométrica revelou pouca variação de imunomarcação histológica em tal comparação. À exceção, testículos contralaterais de sujeitos submetidos a orquidopexia unilateral (APÊNDICE 14) apresentaram aumento de espermatogônias (espermatócitos em pré-leptóteno) e espermátides alongadas (ambas células germinativas localizadas em epitélio seminífero em Estágio VIII19) imunorreativas à albumina. A análise do testículo contralateral de sujeitos submetidos à ligadura de túbulos eferentes unilateral (APÊNDICE 12A) apresentou, uma leve redução da proporção de espermátides imunorreativas, assim como, para o criptorquidismo unilateral (APÊNDICE 13A), a proporção de espermatogônias (espermatócitos em pré-leptóteno) imunorreativas também apresentou queda. Em epidídimos contralaterais, a principal variação

19 _{Classificação baseada em: Russell, LD. Histological and histopathological evaluation of the testis. Cache}

identificada ocorreu em sujeitos submetidos ao criptorquidismo unilateral (APÊNDICE 13B), revelando, no compartimento epididimário do segmento inicial, queda da frequência de incidência de pontos categorizados para interstício imunorreativo à albumina em oposição ao sugestivo aumento da imunorreatividade estereociliar nesse mesmo compartimento; no compartimento epididimário da cabeça, redução na proporção de espermatozoides identificados pelo anticorpo anti-albumina e no compartimento de cauda, redução de células epiteliais imunorreativas à albumina, em comparação ao respectivo controle de idade. Ainda se notou sugestão de redução da proporção de espermatozoides imunorreativos à albumina nos órgãos contralaterais de sujeitos submetidos a intervenções de orquiectomia (APÊNDICE 10A) e ligadura de túbulos eferentes (APÊNDICE 12B), nos compartimentos de corpo e cauda epididimários e de sujeitos orquidopéxicos, no compartimento de cabeça epididimária (APÊNDICE 10B).

Ductos deferentes contralaterais às condições unilaterais, por sua vez, tiveram seus componentes epiteliais/luminais afetados no compartimento proximal pelas condições de orquiectomia (APÊNDICE 10B) e ligadura dos túbulos eferentes (APÊNDICE 12C). Nesses sujeitos, observou-se a total ausência de imunorreatividade de corpo celular, contraposta ao aumento da imunorreatividade ao anticorpo anti-albumina em estereocílios e espermatozoides, ocorrendo aumento da imunorreatividade anti-albumina também para os gametas da porção distal. A condição de criptorquidismo unilateral (APÊNDICE 13C) afetou, para o órgão contralateral, apenas a imunomarcação de estereocílios na porção distal. A condição de orquidopexia (APÊNDICE 14C) afeta ambas as regiões do ducto deferente, com queda da proporção de interstício imunorreativo à albumina, queda de estereocílios imunomarcados na região proximal e aumento de corpos celulares e espermatozoides imunorreativos a essa proteína na região distal.

Em uma tentativa de padronização, frente aos resultados apresentados nesse tópico, elegeu-se priorizar, na presente tese, a comparação dos grupos experimentais uni/bilaterais frente aos seus respectivos controles de idade (e não dos respectivos órgãos contralaterais), na pretensão de que todas as análises partissem de um ponto comum de comparação.