UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
YARA PEREIRA CERCEAU ALVES
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR UTILIZANDO NANOFILTRAÇÃO
CAMPINAS - SP 2018
YARA PEREIRA CERCEAU ALVES
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR UTILIZANDO NANOFILTRAÇÃO
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Engenharia de Alimentos
Orientador: Prof. Dr. Marcus Bruno Soares Forte
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA YARA PEREIRA CERCEAU ALVES E
ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCUS BRUNO SOARES FORTE
CAMPINAS – SP 2018
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 0535/2018 ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3375-174
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816 Alves, Yara Pereira Cerceau, 1992-
AL87p Produção e purificação de xilitol a partir de bagaço da cana-de-açúcar utilizando nanofiltração / Yara Pereira Cerceau Alves. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Alv Orientador: Marcus Bruno Soares Forte.
Alv Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
v 1. Xilitol. 2. Biomassa. 3. Purificação. 4. Filtração por membranas. I. Forte, Marcus Bruno Soares. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Xylitol production from sugarcane bagasse and purification by nanofiltration Palavras-chave em inglês: Xylitol Biomass Purification Membrane filtration
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestra em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:
Marcus Bruno Soares Forte [Orientador] Adriano Pinto Mariano
Juliano Lemos Bicas
Data de defesa: 14-11-2018
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________ Prof. Dr. Marcus Bruno Soares Forte
FEA / UNICAMP Orientador
______________________________________________ Prof. Juliano Lemos Bicas
FEA / UNICAMP Membro titular
______________________________________________ Prof. Adriano Pinto Mariano
FEQ / UNICAMP Membro titular
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna.
AGRADECIMENTOS
Ninguém constrói nada sozinho. É com esse sentimento que finalizo meu mestrado. Sou imensamente grata por todos aqueles que contribuíram com meu trabalho.
Agradeço à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp, por possibilitar a realização deste trabalho.
Ao meu orientador, prof. Marcus, pelos ensinamentos, orientação, confiança e disponibilidade para realização deste trabalho.
Aos meus pais, Márcio e Bárbara, que sempre apostaram nos meus sonhos e me deram todos os incentivos e apoio necessário. Ao meu irmão Iago, pelo companheirismo de sempre. A todos os meus familiares, por constituírem meu alicerce.
Aos amigos e colegas da pós-graduação, por tornarem meus dias mais alegres. Aos meus companheiros de laboratório, por compartilharem seus conhecimentos sempre com muita disponibilidade. Agradecimento especial à Guta, Suéllen, Carla, Pamela e Bia por estarem sempre presentes e me ajudando no que fosse possível. Aos técnicos do laboratório, Luciano e Priscila, pelo apoio diário.
Ao Laboratório de Bioprocessos e Produtos Sustentáveis, pertencente à Escola de Engenharia de Lorena, USP, por permitir a realização de parte dos experimentos em suas dependências. Em especial ao Prof. Silvio Silverio da Silva e ao pesquisador Felipe Antunes.
Ao Laboratório de Genômica e Expressão, por ceder a levedura crucial para realização do trabalho. Ao Laboratório de Engenharia de Processos, da Unicamp, por tornar possível a realização de análises de cor.
A todos os meus amigos, por se fazerem presentes mesmo de longe.
A todos que de alguma forma tornaram possível a realização deste sonho, muito obrigada! Essa conquista é nossa.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
RESUMO
A produção de materiais lignocelulósicos chega a 181,5 bilhões de toneladas no mundo anualmente. A biomassa pode ser utilizada na produção de compostos de elevado valor agregado, como o xilitol, um poliol de ocorrência natural, com poder adoçante semelhante ao da sacarose e apenas dois terços das calorias. É comumente produzido por uma via química, mas também há a possibilidade de produção a partir de biomassa. Para a viabilização deste processo biotecnológico, a etapa de purificação persiste como obstáculo. A nanofiltração surge como opção, por ser capaz de separar moléculas de baixa massa molar. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo a produção de xilitol por fermentação a partir do hidrolisado de bagaço da cana-de-açúcar e a determinação de uma estratégia para purificação de xilitol biotecnológico utilizando a nanofiltração. Visando a produção de xilitol, o hidrolisado foi pré-tratado, concentrado e destoxificado. A fermentação foi realizada em incubadora de movimentos rotatórios a 200 rpm, sendo obtidas eficiências de conversão de xilose em xilitol de 63,0% e 60,4% para a fermentação em caldo sintético e em hidrolisado, respectivamente. A nanofiltração foi realizada em célula de aço inox sem saída, com agitação magnética. Quatro membranas de nanofiltração foram comparadas (NP010, NP030, NF e NF90). A membrana NF foi selecionada devido ao elevado fator de separação de xilitol em relação a proteínas, menor tendência a entupimento e maior diferença de cor total entre o permeado e a alimentação. A membrana selecionada foi utilizada para otimização dos fatores pH, temperatura e pressão por meio de planejamento fatorial. O fluxo de permeado e o parâmetro de cor a* foram afetados significativamente pelo pH e pressão. A produtividade e a variação de luminosidade foram afetadas também pela temperatura. Foram selecionadas as condições de nanofiltração de 40 bar, 40 °C e pH 5,4 com a membrana NF. Tais condições foram utilizadas para a nanofiltração do hidrolisado hemicelulósico fermentado, sendo obtido purificação do xilitol na fração permeada com fator de separação entre xilitol e proteínas de 8,4 e fator de purificação de 3,3. A remoção de proteínas foi de 84,0% e de turbidez de 96,0%, o que contribui para a formação de cristais homogêneos nas etapas posteriores de purificação. Com intuito de minimizar o efeito de Fouling, foram realizadas etapas de microfiltração e ultrafiltração anteriormente à nanofiltração. Em conclusão, este trabalho permitiu a obtenção de xilitol pelo processo biotecnológico e a determinação de uma estratégia utilizando a nanofiltração para purificação de xilitol. Uma estratégia integrada de purificação deve ser implementada visando atingir purezas elevadas de xilitol e, certamente, a nanofiltração pode ser utilizada como etapa prévia à cristalização para purificação de xilitol biotecnológico.
ABSTRACT
The world’s production of lignocellulosic biomasses reaches 181.5 billion tons annually. This biomass can be converted into valuable products as xylitol, a naturally occurring polyol. It has one-third fewer calories than sucrose. It is used as a sucrose substitute for diabetics patients and it has anticariogenic properties. It is usually produced by a chemical route, but there is also the possibility of production from lignocellulosic biomass. For this biotechnological process to become technically viable, the purification steps remain as an obstacle. In this context, nanofiltration should be considered as an option since it has the capability of separating low molar mass molecules. This study aimed at producing xylitol from sugarcane bagasse and developing a strategy for xylitol purification by nanofiltration. The purification steps include membrane selection, process conditions optimization by surface response methodology and application of the optimized process in the bagasse hydrolysate. For xylitol production, sugarcane bagasse was pre-treated, concentrated and detoxified. The fermentation was carried out in a rotary incubator, and xylitol conversion efficiencies of 63.0% and 60.4% were obtained for the fermentation in synthetic and hydrolyzed broth, respectively. The nanofiltration was carried out in a stirred dead-end cell. Four nanofiltration membranes (NP010, NP030, NF, and NF90) were compared. NF membrane was selected since it had the highest xylitol–protein separation factor, the lowest fouling tendency, and the highest total color difference between feed and permeate. The selected membrane was used to optimize the factors pH, temperature and pressure by response surface methodology, which revealed that permeate flux and color parameter a* were significantly affected by pH and pressure. Process productivity and lightness difference were also affected by temperature. Optimum nanofiltration conditions were 40 bar, 40 °C, and pH 5.4. These conditions were used for the fermented hydrolysate nanofiltration. The xylitol purification was reached in the permeate fraction, with a xylitol-protein separation factor and a purification factor of 8.4 and 3.3, respectively. Protein and turbidity removals were 84.0% and 96.0% by the selected strategy. It facilitates the formation of homogeneous crystals in the next downstream steps. In order to minimize the Fouling effect, microfiltration and ultrafiltration steps were performed prior to nanofiltration. An integrated strategy of purification should be implemented in order to attain a high purity in xylitol. Certainly, nanofiltration can be used prior to crystallization as an alternative process to purify xylitol obtained by fermentation of sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 10
2. ESTRATÉGIAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO ... 13
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 16
3.1. O xilitol ... 16
3.1.1. Propriedades e aplicações ... 16
3.1.2. Ocorrência do xilitol ... 18
3.1.3. Toxicidade e tolerância ao xilitol ... 19
3.1.4. Mercado de xilitol ... 20 2.2. Produção de xilitol ... 21 2.2.1. Via química ... 22 2.2.2. Via biotecnológica ... 23 2.2.3. Materiais lignocelulósicos ... 23 2.2.4. Bagaço da cana-de-açúcar ... 27
2.2.5. Obtenção de hidrolisados hemicelulósicos a partir do bagaço da cana-de-açúcar 29 2.2.6. Destoxificação do hidrolisado hemicelulósico ... 30
2.2.7. Bioconversão da xilose em xilitol ... 32
2.3. Purificação de xilitol produzido a partir de hidrolisados hemicelulósicos ... 33
2.4. Técnicas de separação por membrana... 37
2.5. Nanofiltração ... 38
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 43
3.1. Produção de xilitol a partir de meio de cultura sintético ... 43
3.1.1. Micro-organismo e preparo do inóculo ... 43
3.1.2. Processo fermentativo submerso ... 44
3.2. Produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos ... 45
3.2.1. Bagaço da cana-de-açúcar ... 45
3.2.2. Destoxificação do hidrolisado hemicelulósico ... 46
3.2.3. Micro-organismo e preparo do inóculo ... 47
3.2.4. Processo fermentativo submerso ... 47
3.3. Determinação dos parâmetros de bioconversão ... 47
3.3.1. Rendimento de xilose em xilitol (Yp/s) ... 47
3.3.2. Eficiência de conversão ... 48
3.3.4. Rendimento de xilose em biomassa celular (Yx/s) ... 48
3.3.5. Produtividade volumétrica em biomassa (Qx) ... 49
3.4. Nanofiltração ... 49
3.5. Membranas de nanofiltração ... 50
3.6. Meios de filtração ... 50
3.6.1. Solução modelo ... 51
3.6.2. Caldo fermentado – Meio sintético ... 51
3.6.3. Caldo fermentado - Hidrolisado hemicelulósico ... 52
3.7. Estratégia para seleção da membrana de filtração ... 52
3.8. Estratégia de purificação de xilitol biotecnológico ... 55
3.9. Considerações matemáticas ... 56
3.10. Purificação com carvão ativo ... 57
3.11. Métodos analíticos... 58
3.11.1. Determinação da concentração celular ... 58
3.11.2. Determinação da concentração de açúcares, xilitol, etanol, glicerol e ácido acético 58 3.11.3. Massa seca ... 58
3.11.4. Determinação de proteínas ... 59
3.11.5. Análise de cor ... 59
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 61
4.1. Produção de xilitol a partir de meio de cultura sintético ... 61
4.2. Hidrolisado hemicelulósico ... 64
4.2.1. Caracterização do hidrolisado hemicelulósico ... 64
4.2.2. Processo fermentativo do hidrolisado hemicelulósico ... 65
4.3. Seleção de membrana ... 70
4.3.1. Solução modelo ... 71
4.3.2. Caldo sintético ... 75
4.4. Otimização das condições de nanofiltração ... 80
4.5. Estratégias de purificação do caldo hidrolisado ... 101
4.5.1. Microfiltração e ultrafiltração ... 101
4.5.2. Nanofiltração ... 104
4.6. Purificação com carvão ativo ... 115
5. CONCLUSÃO ... 118
1. INTRODUÇÃO
No cenário econômico atual, as indústrias alimentícias estão constantemente em busca de novas formas de atrair consumidores, conferindo pouca atenção aos potenciais danos provocados pelo consumo acentuado de determinados alimentos ou ingredientes. Há vários anos já é consenso na medicina e literatura específica que o consumo excessivo de açúcar é capaz de causar efeitos adversos em seres humanos, favorecendo a obesidade e aumentando a propensão à diabetes e hipertensão. Nesse sentido, desde o século XIX os edulcorantes vêm ganhando espaço na dieta humana, visando a redução no consumo de açúcares (BOLES; KANDIMALLA; REDDY, 2017; CAI et al., 2017; CAROCHO; MORALES; FERREIRA, 2017; DINICOLANTONIO; O’KEEFE, 2016; MOHAMAD et al., 2016; MOORADIAN; SMITH; TOKUDA, 2017).
Nos últimos anos, a aplicação de edulcorantes de baixa caloria em alimentos vem ganhando ainda mais importância, em função do aumento da demanda por produtos saudáveis, de baixa caloria e com baixo teor de carboidratos. Assim, o xilitol tem destaque e vem atraindo a atenção dos consumidores (CAI et al., 2017; CAROCHO; MORALES; FERREIRA, 2017). Nesta conjuntura, o mercado de xilitol passa por um período de demanda crescente. A previsão para 2020 é que a demanda de xilitol seja 50% superior ao consumo do ano de 2013 (DASGUPTA et al., 2017).
Tecnicamente, o xilitol é um poliol classificado como edulcorante devido à sua capacidade adoçante semelhante ao da sacarose, com apenas dois terços das calorias deste açúcar. Além do consumo compatível a pacientes diabéticos em função de seu metabolismo independente de insulina, o xilitol apresenta benefícios como propriedades anticariogênicas e potencial para contribuir no tratamento de osteoporose e infecções de ouvido (GHAFFAR et al., 2017; IRMAK et al., 2017; PETERSON, 2013; SILVA; CHANDEL, 2012). Foi considerado pelo US Department of Energy como um entre os 12 produtos de maior valor agregado produzidos a partir de biomassa lignocelulósica, sendo utilizado como matéria-prima nas indústrias alimentícias, farmacêuticas e odontológicas.
Este poliol é naturalmente encontrado em frutas e vegetais, mas sua extração destas fontes não é viável economicamente em função das baixas concentrações presentes. Atualmente, o xilitol comercial é produzido por um processo químico ou termoquímico, envolvendo a redução da D-xilose, que deve ser previamente purificada para apresentar elevada pureza, na presença do catalisador níquel sob altas pressões e temperaturas. Por isso, trata-se
de um processo de custo elevado, o que implica em perda de competitividade em relação a outros polióis, além da dificuldade operacional de purificação da xilose e da utilização de níquel e condições drásticas de operação, que acarretam em poluição ambiental pesada e limitam o processamento de xilitol em larga escala (MUSSATTO, 2012; PAL; MONDAL; SAHOO, 2016; QI et al., 2016; ZHANG et al., 2018).
Como alternativa, tem-se a produção biotecnológica de xilitol, que envolve a fermentação de hidrolisados hemicelulósicos obtidos a partir de biomassa lignocelulósica. Esse processo apresenta menor custo energético e caráter poluidor. A biomassa lignocelulósica é atualmente vista como uma alternativa de fonte de carbono bastante promissora em função principalmente da sustentabilidade ambiental inerente à sua utilização (EVANGELISTA et al., 2018; SILVA; CHANDEL, 2012; WEI et al., 2010; ZHANG et al., 2018). Em meio à vasta diversidade de biomassas lignocelulósicas, o bagaço da cana-de-açúcar tem destaque no cenário nacional, em função da enorme disponibilidade e baixo custo (TROMBETA; CAIXETA FILHO, 2017).
Entretanto, a via biotecnológica de produção de xilitol ainda tem sua utilização restrita industrialmente, devido à limitada eficiência operacional em função da baixa produtividade e de problemas com os processos de separação e purificação (downstream) (RAFIQUL; SAKINAH, 2013; SILVA; CHANDEL, 2012). Grande parcela dos trabalhos que abordam o xilitol focam na obtenção e tratamento dos hidrolisados hemicelulósicos e na fermentação e conversão metabólica. Atualmente, pouca informação sobre a purificação deste bioproduto a partir de meios fermentados está disponível (GUIRIMAND et al., 2016; MARTÍNEZ et al., 2007).
A recuperação de produtos obtidos pela fermentação de biomassa é um passo fundamental no processo de obtenção do mesmo, e depende da natureza e das características físicas e químicas do produto e dos contaminantes. Geralmente, são necessárias diversas etapas para a purificação de produtos que exigem pureza elevada para sua comercialização e que possuem estrutura química complexa. Isto implica em custos bastante elevados, por vezes superiores ao de produção propriamente dito. Além disso, os produtos biotecnológicos se encontram em meios bastante complexos, o que torna a etapa de recuperação bastante complicada (FANEER; ROHANI; MOHAMMAD, 2018; MISRA et al., 2011; SAMPAIO et al., 2006).
Dentre os métodos já propostos para a recuperação de xilitol biotecnológico, a cristalização prevalece devido à simplicidade e facilidade de operação, mas exige uma solução previamente purificada e concentrada. Assim, outras etapas anteriores à mesma são necessárias,
como adsorção em carvão ativo e concentração a vácuo (MISRA et al., 2011; RIVAS et al., 2006), tratamento com resinas de troca iônica (CANILHA et al., 2008; GURGEL et al., 1995; MARTÍNEZ et al., 2007) e adsorção em sílica gel (MUSSATTO et al., 2006).
Como alternativa a estas operações, de custo elevado para utilização industrial, tem-se as técnicas de membrana, que proporcionam um baixo consumo energético, boa eficiência de separação aliado a um número reduzido de etapas necessárias, além de boa qualidade do produto final (HE et al., 2012; JIRAGE; MARTIN, 1999; LI et al., 2016).
Dentre as técnicas de membrana, a nanofiltração é uma operação que se destaca, por ser capaz de separar moléculas de baixa massa molar. A separação ocorre por complexos mecanismos, em função do tamanho efetivo dos poros, da distribuição de cargas, além de propriedades dos componentes a serem separados, como hidrofobicidade, constante de ionização e massa molar (CARVALHO, 2011; LUO; WAN, 2013; QI et al., 2012). Esta operação oferece vantagens em relação à concentração a vácuo proposta por Misra et al. (2011), uma vez que a concentração apresenta elevado consumo de energia.
Assim sendo, a avaliação da nanofiltração como alternativa para a purificação de xilitol obtido por fermentação é de extrema relevância, uma vez que pode contribuir para mitigar os obstáculos do processamento microbiológico de xilitol e inclusive tornar a tecnologia de viável técnica e economicamente.
Este trabalho teve como objetivo a produção de xilitol a partir do bagaço da cana-de-açúcar e a determinação de uma estratégia de purificação utilizando-se a nanofiltração, envolvendo a seleção de uma membrana e otimização de condições operacionais por meio de planejamento fatorial.
2. ESTRATÉGIAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO
Este trabalho teve como principal objetivo estabelecer um processo de purificação de xilitol obtido a partir de biomassa lignocelulósica, de modo a alcançar uma recuperação eficiente do xilitol, com pureza e rendimento elevados. A determinação de um processo de recuperação do xilitol a partir do hidrolisado hemicelulósico fermentado permite uma destinação dessa biomassa para um produto de elevado valor agregado.
Nesse sentido, para avaliar a purificação, foi necessário inicialmente produzir o xilitol a partir do bagaço da cana-de-açúcar, biomassa escolhida devido à enorme disponibilidade no Brasil. Em um primeiro momento, o trabalho teve como foco principal, portanto, a produção do xilitol.
Primeiramente, a produção por fermentação foi avaliada em meio sintético preparado em laboratório, com o intuito de validar a levedura selecionada para o processo. Uma vez avaliada a fermentação em caldo sintético, a etapa seguinte foi a fermentação do hidrolisado hemicelulósico obtido do bagaço da cana. Foram aplicados todos os tratamentos necessários ao bagaço, para sua posterior fermentação. Assim, a primeira parte do trabalho ficou concentrada com os resultados obtidos para a produção do xilitol.
Paralelamente à produção de xilitol por fermentação, foram realizados ensaios preliminares de purificação. Para tal, utilizou-se uma solução modelo reproduzindo a composição do caldo fermentado. Esses ensaios com a solução modelo dão entrada à segunda parte do trabalho, de purificação. As membranas NF, NF90, NP010 e NP030 foram avaliadas nesta etapa, na qual foi possível a exclusão de uma delas para o prosseguimento dos estudos, a membrana NF90. Os estudos de purificação avançaram com as membranas NF, NP010 e NP030.
Dando continuidade à segunda parte do trabalho, focado nas etapas de purificação, o caldo sintético fermentado foi utilizado para seleção de uma membrana de nanofiltração, dentre as três avaliadas. A membrana NF foi selecionada. Vale ressaltar que a membrana foi selecionada para purificação do xilitol em sua fração permeada. Isso significa dizer que o material retido pela membrana contém compostos proteicos, coloridos e outros de elevada massa molar, enquanto que o permeado contém o xilitol e outros compostos de baixa massa molar.
Em uma etapa seguinte, as condições de nanofiltração foram otimizadas por meio de planejamento fatorial utilizando-se a membrana selecionada (NF). Com essa otimização, buscou-se encontrar condições experimentais que fossem mais propícias à separação do xilitol
das demais impurezas. Assim sendo, neste ponto do trabalho houve a definição das condições adequadas de operação (pH, temperatura e pressão).
Posteriormente, a membrana NF foi utilizada para purificação do xilitol produzido a partir da fermentação do hidrolisado do bagaço, nas condições otimizadas com o caldo sintético fermentado.
Na aplicação de tecnologias de membrana para recuperação de produtos biotecnológicos, entende-se que a utilização de nanofiltração diretamente em um meio fermentado apresentará um fluxo de permeado demasiadamente pequeno, implicando negativamente na produtividade do processo. Nesse sentido, para alavancar o fluxo de permeado da nanofiltração, foi avaliada a utilização de membranas de microfiltração e ultrafiltração precedentes à etapa de nanofiltração. Esta estratégia foi comparada à estratégia de nanofiltração realizada diretamente no hidrolisado fermentado.
Finalmente, também foi avaliada a purificação por meio de adsorção em carvão ativo do xilitol produzido a partir de hidrolisado hemicelulósico. Estes experimentos foram realizados para comparação com a estratégia de purificação por nanofiltração, uma vez que alguns dos poucos trabalhos publicados neste tema sugerem o uso de carvão ativo como meio de recuperação de xilitol.
Para melhor compreensão e visualização dos experimentos realizados neste trabalho, apresenta-se o esquema da Figura 1.
Figura 1. Fluxograma representativo das estratégias utilizadas para purificação de xilitol biotecnológico neste trabalho. Meio de cultura sintético
Fermentação Bagaço da cana-de-açúcar Hidrólise ácida Concentração a vácuo Destoxificação: Overliming e Carvão ativo Fermentação Inóculo Hidrolisado hemicelulósico P ro d u çã o P u ri fi ca çã o Solução modelo Nanofiltração NF NP010 NP030 NF90
Caldo sintético fermentado
Centrifugação Nanofiltração NF NP010 NP030 Hidrolisado fermentado Centrifugação Nanofiltração Microfiltração Ultrafiltração Nanofiltração Permeado
Planejamento fatorial: Otimização das condições experimentais
NF
NF
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. O xilitol
3.1.1. Propriedades e aplicações
Xilitol (C5H12O5) é um poliol de cinco carbonos (Figura 2) amplamente utilizado como substituto de sacarose na indústria alimentícia e farmacêutica, para atender às necessidades de pessoas que sofrem de diabetes e obesidade (DASGUPTA et al., 2017).
O xilitol também é popularmente conhecido por ser um açúcar-álcool, substituto de açúcar ou carboidrato hidrogenado, mas vale ressaltar que os polióis não são classificados como açúcares pela legislação (RDC nº 360, de 23 de dezembro de 2003). É considerado um adoçante livre de açúcar, fazendo parte de um grupo mais abrangente de polióis, também constituído por outros compostos como sorbitol, maltitol e manitol. O xilitol vem sendo utilizado como edulcorante pela indústria alimentícia desde a década de 1960, mas sempre esteve presente na dieta humana, visto que é um constituinte natural de alguns alimentos (MUSSATTO, 2012; ZACHARIS, 2012).
Figura 2. Estrutura química do xilitol, contendo cinco átomos de carbono e cinco grupamentos hidroxilas.
O xilitol eventualmente faz parte do metabolismo de carboidratos em mamíferos e está relacionado à via das pentoses fosfato, que independe da insulina. É encontrado naturalmente em diversas frutas e vegetais, como morango, ameixa amarela, amora, couve-flor e espinafre (ALIAKBARIAN et al., 2012). Possui propriedades físicas e químicas de importância econômica e industrial (Tabela 1) e valor calórico reduzido, não causando flutuações nos níveis de glicose no sangue e tem potencial para contribuir no tratamento de infecção de ouvido e controle de halitose (MARTÍNEZ et al., 2007; MISRA et al., 2011).
A molécula de xilitol configura uma estrutura aberta, contendo cinco grupamentos hidroxila conectados aos átomos de carbono presentes. O número ímpar de carbonos dificulta
a ação de enzimas microbiológicas na molécula e a respectiva obtenção de energia pelos micro-organismos por meio de reações de oxidação. Possui elevada afinidade pela água e baixa solubilidade em etanol (1,2 g /100 g) e metanol (6,0 g /100 g). Trata-se de um composto bastante estável, não sofrendo alterações em função do pH e temperatura e resistente microbiologicamente (MUSSATTO, 2012; SILVA; CHANDEL, 2012).
Massa molar 152,15 g/mol
Temperatura de fusão 94 °C (cristais ortorrômbicos, com etanol/metanol); 61 °C (cristais monoclínicos, sem solvente)
Densidade 1,52 g/cm³
Solubilidade a 20 °C 169 g/100 g água
pH na água Entre 5,0 e 7,0
Valor calórico 2,4 cal/g
Entalpia de solução 36,61 cal/g; endotérmico
Doçura relativa Semelhante à sacarose, superior a manitol e sorbitol Rotação específica Inativo opticamente
Reação de Maillard Não reage
Apresentação Pó cristalino branco
Tabela 1. Propriedades físicas, químicas, nutricionais e sensoriais do xilitol. Fonte: ARRUDA (2011); ALIAKBARIAN et al. (2012); MARTÍNEZ et al. (2015); MURTHY et al. (2005); UR-REHMAN et al. (2013).
O xilitol possui um caráter refrescante quando em contato com as papilas gustativas, uma vez que se dissolve rapidamente na boca e absorve o calor local, por seu elevado calor de solução, na ordem de 35 cal/g. Essa característica é um ponto forte para sua utilização em cremes dentais e em algumas ervas e pimentas (MUSSATTO, 2012).
Possui propriedades anti-cariogênicas, sendo por isso importante também na indústria odontológica. Uma vez que os açúcares de um modo geral sempre estiveram intimamente relacionados com a incidência de cáries dentárias, a substituição dos mesmos pelo xilitol traz benefícios significativos à saúde bucal. Os estudos foram iniciados na década de 1960 por pesquisadores finlandeses da Dental School of the University of Turku, e atualmente inúmeras pesquisas ao redor do mundo continuam demonstrando a eficiência do xilitol na prevenção das cáries (GUIRIMAND et al., 2016; MARTÍNEZ et al., 2015; ZACHARIS, 2012).
O xilitol é empregado como matéria-prima para a produção de diversos produtos químicos relevantes à indústria farmacêutica, como glicerol, lactato e alguns furanos, o que o torna um produto de elevado valor agregado (GUIRIMAND et al., 2016; MARTÍNEZ et al., 2015; WERPY; PETERSEN, 2004).
O poder adoçante é um fator importante na avaliação de um edulcorante e é determinante na percepção pelo consumidor do sabor e qualidade dos alimentos. Neste quesito, o xilitol possui o maior poder adoçante dentre todos os polióis, sendo o único com capacidade adoçante semelhante à da sacarose (Figura 3). Comparando-se uma solução de concentração de 10% de sólidos, o xilitol possui poder adoçante equivalente à sacarose, mas quando essa concentração é elevada a 20% de sólidos, o xilitol supera em até 20% a doçura da sacarose. Além disto, o xilitol apresenta um perfil de tempo e intensidade de doçura bastante semelhante ao da sacarose. Combinado com outros polióis, pode-se obter uma sinergia positiva na doçura, contribuindo para uma maior semelhança com a sacarose (ZACHARIS, 2012).
A conversão de xilitol em glicose no fígado ocorre em velocidades baixas e não impactam significativamente o nível de glicose e insulina no sangue, diferentemente de mono- e dissacarídeos. Por isto, o xilitol é tido como adoçante adequado para uso em dietas controlada em carboidratos e para diabéticos (ZACHARIS, 2012).
Este poliol também é utilizado em nutrição parenteral e testes em animais demonstraram que uma dieta contendo xilitol pode aumentar a absorção de cálcio e prevenir a osteoporose, o que ocorre devido à capacidade do mesmo em formar interações fracas com o cálcio em solução (ALIAKBARIAN et al., 2012).
Figura 3. Doçura relativa dos polióis mais comuns e da sacarose. Fonte: Zacharis (2012).
3.1.2. Ocorrência do xilitol
O xilitol foi inicialmente descoberto pelo químico alemão Emil Fischer, em 1891, sendo encontrado na natureza (Tabela 2). A produção industrial de xilitol, entretanto, só teve
D oç ur a re la ti va
início na década de 1940, quando pesquisadores concentraram esforços no desenvolvimento de um processo que isolava o xilitol da xilose. Na década de 1960, um processo químico economicamente viável foi elucidado para a produção de xilitol industrialmente (ARRUDA, 2011; ZACHARIS, 2012).
O xilitol é um metabólito intermediário no metabolismo humano e de mamíferos, decorrente da assimilação de carboidratos pela via das pentoses fosfato, sendo a concentração comumente encontrada na corrente sanguínea na faixa de 0,03 mg/mL a 0,06 mg/mL. O xilitol ocorre principalmente no fígado, onde pode ser convertido a glicose a uma taxa lenta, conforme necessidade do organismo. Isso permite a assimilação do xilitol pela microbiota natural do intestino (ARRUDA, 2011).
Produto Concentração de xilitol (mg/100g)
Ameixa amarela 935 Morango 362 Couve-flor 300 Framboesa 268 Endívias 258 Beringela 180 Alface 131 Espinafre 107 Cebola 89 Cenoura 86
Tabela 2. Concentração de xilitol em frutas e vegetais. Fonte: (ALIAKBARIAN et al., 2012; ZACHARIS, 2012).
3.1.3. Toxicidade e tolerância ao xilitol
O xilitol é um edulcorante bem tolerado pelo organismo humano, aprovado pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), pela RDC nº 18 de 24 de março de 2008, e pelo FDA (Food and Drug Administration), cujo entendimento é de que toda a informação toxicológica do composto é conhecida e atualizada, sendo por isso aceito como GRAS (Generally recognised as safe).
Recomenda-se que a ingestão diária de xilitol não exceda 60 g, sendo que o consumo em quantidades elevadas pode acarretar em efeito laxativo, com diarreia osmótica e transitória, porém em menor grau do que a promovida pelos demais polióis, como sorbitol e manitol (ANDRADE, 2005; TAPIAINEN et al., 2004). Apesar da elevada tolerância em
humanos, o xilitol não deve ser ingerido por cães, de acordo com o FDA. Diferentemente dos homens, em cães, a insulina é liberada rapidamente quando o xilitol entra na corrente sanguínea, provocando uma redução muito rápida de glicose no sangue e causando hipoglicemia.
Desde 1984 a European Economic Community (EEC) considera o xilitol um composto seguro para a alimentação. Em 1994, a FDA o reconheceu como “seguro para os dentes” (ARRUDA, 2011). A situação legal do xilitol em diversos países foi sintetizada por Sarrouh et al. (2009) (Tabela 3).
País Situação legal
Brasil Permitido pela ANVISA em quantum satis, RDC nº18 de 24 de março de 2008
Estados Unidos Aprovado pelo FDA, permitido em quantum satis Canadá Permitido em gomas de mascar desde 1976 Argentina Utilização em alimentos permitida por lei
México Permitido como substituto de açúcar para diabéticos Suíça Mencionado nas legislações de alimentos desde 1936, deve
estar declarado em produtos dietéticos França Utilização em alimentos permitida por lei
Tabela 3. Situação legal do xilitol em alguns países ao redor do mundo. Fonte: Sarrouh et al. (2009).
3.1.4. Mercado de xilitol
O mercado de xilitol passa por um período de demanda muito elevada. No início da década de 1990, uma produção anual de apenas 5000 toneladas de xilitol foi relatada em todo o mundo. A maior conscientização de vida saudável, fortalecendo o crescimento do mercado de açúcares alternativos, e o maior conhecimento por parte da população do xilitol como um açúcar natural e de baixa caloria, o tornam um produto atrativo e de alto valor agregado e contribuem para a demanda crescente em nível mundial (ALBUQUERQUE et al., 2014; BRANCO, 2010; DASGUPTA et al., 2017).
Em 2013, a demanda mundial de xilitol foi de 161,5 milhões de toneladas métricas, o que corresponde a US$670 milhões. A previsão para 2020 é de 250 milhões de toneladas e valor de mercado de US$1 bilhão, 50% superior ao consumo do ano de 2013. O líder global de produção de xilitol é a empresa DuPont Danisco, que possui plantas de fabricação nos Estados Unidos, Finlândia e China, seguida pela Xylitol Canada Inc., DFI Corp., nos Estados Unidos e
Novagreen Inc, também no Canadá. Alguns produtores chineses estão surgindo, como a Shandong Futaste (DASGUPTA et al., 2017; RAVELLA et al., 2012).
O preço do xilitol se encontra na faixa de US$4 a 5/kg, e varia em função do custo da matéria-prima utilizada, da logística de distribuição e da localização da planta industrial e do estoque. Apesar disso, o preço do xilitol vem aumentando em função do aumento da demanda (RAVELLA et al., 2012).
A maior parte do xilitol produzido é destinada à fabricação de gomas de mascar, sendo que no mercado asiático, entre 80% e 90% das gomas de mascar contém xilitol em sua formulação (ARRUDA, 2011).
2.2. Produção de xilitol
A extração de xilitol a partir de frutas e vegetais não é viável economicamente, devido principalmente à baixa concentração encontrada nos mesmos (WEI et al., 2010; ALIAKBARIAN et al., 2012). Dessa forma, o xilitol é comumente produzido industrialmente a partir de madeira por um processo químico, mas a rota bioquímica envolvendo a fermentação de biomassa lignocelulósica por micro-organismos vem sendo amplamente estudada (Figura 4).
Figura 4. Esquema da produção de xilitol por vias química e biotecnológica. Fonte: Adaptado de Martínez et al. (2015).
2.2.1. Via química
Atualmente, a produção de xilitol em escala industrial é feita principalmente por um processo químico, no qual hidrolisados de madeira contendo xilose são submetidos a um processo de hidrogenação na presença de níquel sob altas pressões (até 50 atm) e temperaturas (70 °C a 140 °C). Vale ressaltar que a purificação de xilitol obtido pelo processamento químico é comumente realizada por cristalização. Esta necessidade de etapas de purificação nas fases de upstream e downstream, bem do catalisador químico, tornam os custos deste processo bastante elevados, encorajando a busca por novos meios de produção. (ALBUQUERQUE et al., 2014; ARRUDA, 2011; BRANCO, 2010; WEI et al., 2010).
Hidrólise da madeira rica em pentoses
Resinas de troca iônica e descoloração Solução de xilose purificada Hidrogenação catalítica Biomassa lignocelulósica Pré-tratamento: ácido diluído Hidrolisado hemicelulósico Purificação do hidrolisado Processo fermentativo Purificação do xilitol Cristais de xilitol Cristalização Isotérmica Resfriamento Evaporação
Adsorção em carvão ativo Resinas de troca iônica Ajuste de pH Extração líquido-líquido Precipitação Fracionamento cromatográfico Combinação de métodos Fungos, leveduras ou bactérias Resinas de troca iônica Carvão ativo Overliming Bagaço da cana-de-açúcar Espiga de milho Palha de trigo Rota biotecnológica Rota química
2.2.2. Via biotecnológica
Como alternativa à via química de produção do xilitol, há uma busca por processos economicamente viáveis e ambientalmente sustentáveis. Dentre elas, tem-se a via biotecnológica de obtenção, que implica na utilização de materiais lignocelulósicos (ARRUDA et al., 2017; MARTÍNEZ, 2005; SARROUH, 2009; SU et al., 2013).
O processo biotecnológico é relativamente simples e tem como vantagens o menor consumo energético, menor caráter poluidor, maior simplicidade de operação, além de representar alternativa para a utilização de subprodutos da agroindústria (ALBUQUERQUE et al., 2014; WEI et al., 2010).
Neste processo, os materiais lignocelulósicos são secos e passam por um pré-tratamento que deslignifica e hidrolisa a biomassa, originando o hidrolisado hemicelulósico. Além de moléculas de xilose, o hidrolisado contém compostos inibidores do metabolismo microbiano, devendo por isso passar por uma etapa de destoxificação para posterior fermentação por leveduras capazes de converter a xilose em xilitol. Uma vez sintetizado, o xilitol presente no meio fermentado dever ser purificado até a obtenção em sua forma cristalina (ALBUQUERQUE et al., 2014; ARRUDA et al., 2017; SILVA; CHANDEL, 2012).
Na China, o xilitol é produzido a partir de espigas de milho, devido à enorme geração de resíduos durante o beneficiamento destes materiais. Nos Estados Unidos, a produção se dá principalmente a partir de madeira, por meio da utilização de hidrolisado gerado como resíduo na indústria de papel e celulose. A Danisco, principal fornecedora de xilitol no mundo, produz xilitol a partir de madeira dura. Recentemente, a companhia desenvolveu um processo que alega ser mais sustentável por utilizar sabugo de milho como matéria-prima. Entretanto, a produção ainda ocorre por um processo químico (SILVA; CHANDEL, 2012).
2.2.3. Materiais lignocelulósicos
O conceito de biorrefinaria vem sendo amplamente discutido na academia e implica na completa utilização da biomassa disponível visando a recuperação de produtos de interesse social e econômico. Surgiu como alternativa às refinarias de petróleo, com o intuito de mitigar as incertezas no fornecimento de energia, as emissões de dióxido de carbono na atmosfera e favorecer a substituição de fontes de carbono não renováveis por renováveis (ARRUDA et al., 2017; KELLOWAY; DAOUTIDIS, 2014).
A maior diferença entre o petróleo e a biomassa vegetal reside no fato de que apenas átomos de carbono e hidrogênio são encontrados no petróleo, enquanto que as moléculas presentes na biomassa vegetal também contêm átomos de oxigênio. Sendo assim, a hidrólise da biomassa vegetal resulta na obtenção de um número muito superior de compostos quando comparado ao craqueamento do petróleo. Tais moléculas que compõe a biomassa consistem basicamente de polímeros, sendo sua separação mais complexa (CHIRAT, 2017).
Material lignocelulósico é um termo genérico utilizado para descrever os principais constituintes na maioria dos vegetais. Tais materiais constituem uma das biomassas mais abundantes na biosfera, como resíduos florestais e agrícolas, gramíneas e plantas aquáticas, e correspondem a cerca de 50% da biomassa vegetal (ARRUDA, 2011; MARTÍNEZ, 2005). Consistem de fontes de compostos orgânicos com grande potencial de utilização como matéria-prima pelas indústrias alimentícias, químicas, de combustíveis, insumos químicos e de bens de consumo diversos (ANWAR; GULFRAZ; IRSHAD, 2014; BRANCO, 2010; MUSSATTO; SANTOS; ROBERTO, 2004; OGEDA; PETRI, 2010; SARROUH, 2009).
Ainda persistem restrições técnicas e econômicas na utilização de biomassa lignocelulósica, gerada como resíduo na agricultura em grandes quantidades. Por isso, se acumulam no ambiente em grandes quantidades e geram impactos ambientais negativos, além de representar perdas de recursos valiosos. Visando minimizar tais impactos, surge a necessidade de aproveitamento dessa biomassa para geração de produtos de valor agregado e de desenvolvimento tecnológico que viabilize o uso da mesma. Dentre as biomassas mais utilizadas no conceito de biorrefinaria, tem-se o bagaço da cana-de-açúcar, o sabugo de milho, a palha de trigo, a palha de centeio, entre outros (ARRUDA et al., 2017; BRANCO, 2010).
A composição química destes materiais lignocelulósicos é complexa, sendo constituídos basicamente por celulose, hemicelulose, lignina, compostos extrativos e sais minerais. A concentração de cada um desses componentes varia em função do tipo de biomassa. Na Tabela 4, tem-se a composição de algumas biomassas lignocelulósicas (ARRUDA, 2011; RAVELLA et al., 2012).
Material lignocelulósico Celulose (% m/m) Hemicelulose (% m/m) Lignina (% m/m) Bagaço de cana-de-açúcar 43,0 26,0 21,9 Palha de cana-de-açúcar 38,1 29,2 24,2 Sabugo de milho 45,0 35,0 15,0 Aparas de eucalipto 40,2 15,7 26,9 Palha de arroz 43,5 22,0 17,2 Palha de trigo 33,8 31,8 20,1 Palha de sorgo 34,0 44,0 20,0 Palha de cevada 38,6 21,4 19,9
Tabela 4. Composição de materiais lignocelulósicos. Fonte: Ravella et al., 2012; Arruda, 2011).
A celulose é um carboidrato e constitui a fonte renovável de maior abundância no planeta, classificada como homopolissacarídeo em função de sua composição por monômeros de glicose altamente ordenados. O grau de polimerização da celulose varia entre 1000 e 50000 Da em função do material de origem. As moléculas de glicose se unem por meio de ligações glicosídicas β1-4, o que torna a celulose uma molécula de baixíssima solubilidade em água e não digerível pelos seres humanos (OGEDA; PETRI, 2010).
As ligações do tipo β1-4 entre as moléculas de D-glicose conferem à celulose uma estrutura linear, de alta massa molar e insolúvel em água. Tal arranjo linear resulta em distribuição homogênea de grupamentos hidrolixa, o que torna propício a formação de ligações de hidrogênio intra e intermoleculares. Os feixes de celulose que se conectam pelas interações de hidrogênio se agregam na forma de microfibrilas, na qual regiões de elevada cristalinidade de alternam com regiões amorfas, ou seja, menos ordenadas (OGEDA; PETRI, 2010; TAIPINA, 2012).
Em função da elevada cristalinidade e baixa solubilidade das moléculas de celulose, há a necessidade de enzimas para a degradação e hidrólise da mesma, como as celulases, ou de tratamentos químicos, mediante o uso de ácidos. A celulose é a base para a fabricação de papel, fibras, aditivos e fraldas (MARTÍNEZ, 2005; SARROUH, 2009).
A hemicelulose é um polímero composto principalmente por pentoses, como xilose e arabinose, e por hexoses como glicose, galactose e manose, além de apresentar pequenas concentrações de ácidos, como acético e urônicos. Pode representar entre 15% e 35% do material da parede celular vegetal e atua como composto de reserva energética e de sustentação. De um modo geral, as plantas de madeira dura contém maior fração de pentoses, enquanto que as hexoses predominam em vegetais de madeira macia (MARTÍNEZ, 2005; RAVELLA et al., 2012; SARROUH, 2009). Diferentemente das moléculas de celulose, a hemicelulose não
apresenta cristalinidade em função da configuração irregular dos diversos monômeros que a compõem (ARRUDA, 2011). As moléculas de hemicelulose formam ligações de hidrogênio com as moléculas de celulose, ligações covalentes com a lignina e ligações éster com unidades de acetil e ácidos hidroxicinâmicos, o que contribui para restringir a liberação de polímeros de hemicelulose da parede celular (BIAN et al., 2012).
A terceira fração mais abundante na parede celular dos vegetais é a lignina, que possui uma estrutura complexa e amorfa, composta por polifenóis, principalmente por unidades de fenilpropano, e álcoois cumarílico, coniferílico e sinapílico. A lignina também é insolúvel em água e está associada às moléculas de celulose e hemicelulose, conferindo rigidez e baixa reatividade às fibras do complexo vegetal. Dessa forma, os tecidos lignificados são resistentes às atividades microbiana e enzimática (RAVELLA et al., 2012; SARROUH, 2009).
Na parede celular dos vegetais, esses polímeros se organizam de maneira regular, sendo observada uma cadeia central de microfibras celulósicas envoltas por moléculas de hemicelulose. Estas são, por sua vez, organizadas em estruturas de fita, com a lignina preenchendo os espaços vazios entre as moléculas de hemicelulose (RAVELLA et al., 2012).
A parede celular vegetal é composta também por outros componentes em menor concentração, como proteínas, amidos e pectinas (RAVELLA et al., 2012). A Figura 5 mostra um esquema da biomassa vegetal.
Figura 5. Esquema da biomassa lignocelulósica e sua composição. Fonte: (SILVA; CHANDEL, 2012)
Biomassa
lignocelulósica Fibra de celulose Hemicelulose
Celulose Lignina Microfibrila Celulose (34%~50%) Hemicelulose (19%~34%) Lignina (11%~30% ) Pectina, proteínas, extrativos e cinzas
2.2.4. Bagaço da cana-de-açúcar
Dentre os materiais lignocelulósicos mais abundantes no Brasil, tem-se o bagaço da cana-de-açúcar, co-produto da indústria de açúcar e álcool. Trata-se de um recurso renovável de baixo custo e grande disponibilidade no Brasil. O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, responsável por cerca de 40% da produção total em 2016. Outros grandes produtores são Índia, China, Tailândia e Paquistão (Figura 6; CONAB, 2017).
Figura 6. Produção de cana-de-açúcar em 2016 por país. Fonte: Food and Agricultural Organization (2018).
Em 1977, o Brasil produzia anualmente 88 milhões de toneladas de cana-de-açúcar. Para a safra 2017/2018, estima-se uma produção de 635,6 milhões de toneladas CONAB (2017), sendo a região centro-sul responsável por 90% da produção na safra 2013/2014. A produção é concentrada no estado de São Paulo, em função de fatores climáticos e econômicos. A evolução da produção de cana-de-açúcar em toneladas e a área plantada entre 1994 e 2016 são apresentados na Figura 7.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 P roduç ão (m il hõe s de t one la da s)
Figura 7. Progressão da produção (milhões de toneladas) e área plantada (hectares) de cana-de-açúcar em todo o mundo entre 1994 e 2016. Fonte: Food and Agriculture Organization.
Uma tonelada de colmo de cana-de-açúcar gera 140 kg de açúcar, que pode ser convertido a álcool, e como co-produtos tem-se de 260 a 280 kg de bagaço úmido e 280 kg de palha, ambos com cerca de 50% de umidade (CANILHA et al., 2012; GABOV et al., 2017; LINERO, 2015). Isso resultou em cerca de 170 milhões de toneladas de bagaço nas safras de 2014/2015.
O bagaço e a palha vem sendo utilizados na cogeração de energia da indústria sucroalcoleira, mas aplicações mais nobres podem ser empregadas. Além disto, há um excedente de bagaço, entre 10% e 20%, que também pode ser utilizado em diversos processos industriais (ARRUDA, 2011).
Visando a produção biotecnológica de xilitol, o bagaço da cana-de-açúcar merece atenção especial, já que sua fração hemicelulósica pode conter 80% de xilose em relação ao total de açúcares presentes (SARROUH, 2009). Em um processo de hidrólise completa do bagaço de cana-de-açúcar, a fração hemicelulósica deveria liberar entre 50% e 70% de D-xilose (m/m) e entre 5% e 15% (m/m) de L-arabinose. Estudos anteriores indicam que a razão entre arabinose e xilose e entre xilose e ácido glicurônico podem variar entre 0,019 a 0,247 e 7,4 a 100, respectivamente (LAVARACK; GRIFFIN; RODMAN, 2002). A hemicelulose contém como grupos substituintes em suas moléculas o arabinosil e acetil, que originam compostos acéticos e arabinóicos (ácido acético, arabinose, etc) após a hidrólise (BRIENZO, 2010). Estudos de ressonância magnética da hemicelulose do bagaço da cana-de-açúcar levantados por
0 400 800 1200 1600 2000 0 5 10 15 20 25 30 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 P roduç ão (m il hõe s de t one la da s) Á re a pl ant ada ( m il hõe s de ha )
Brienzo (2010) indicam que sua estrutura é composta por L-arabino-(4-O-metil-D-Glicorono)-D-xilana, com ácido ferúlico e cumárico quimicamente ligados.
2.2.5. Obtenção de hidrolisados hemicelulósicos a partir do bagaço da cana-de-açúcar
Para utilização do bagaço da cana-de-açúcar na obtenção de xilitol biotecnológico, faz-se necessário um pré-tratamento deste material lignocelulósico, uma vez que sua rigidez confere grande resistência a ataques químicos, microbiológicos e enzimáticos. Esse pré-tratamento deve envolver a ruptura da estrutura formada pela celulose, hemicelulose e lignina, e também a deslignificação da mesma (ALBUQUERQUE et al., 2014; RAO et al., 2016; SARROUH, 2009).
A estrutura recalcitrante conferida pela lignina na biomassa lignocelulósica deve sofrer ruptura no pré-tratamento, aumentando a porosidade e acarretando em redistribuição das moléculas de lignina, permitindo o acesso de enzimas e liberação de açúcares fermentescíveis. Assim, um pré-tratamento ideal deve ser capaz de aumentar a superfície de contato da biomassa e promover uma descristalinização e despolimerização da celulose, deve solubilizar a lignina e/ou a hemicelulose e deve provocar uma modificação da estrutura da lignina. Adicionalmente, a operação deve ter baixo custo e investimento (CANILHA et al., 2012; MOHAPATRA et al., 2017).
A efetividade do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é crucial para uma elevada liberação de açúcares monoméricos e, consequentemente, para a competitividade da biomassa como fonte de produtos de interesse econômico. Por isso, esta etapa é um dos obstáculos industriais da utilização da biomassa (RAVELLA et al., 2012).
Os pré-tratamentos podem ter ação física, por meio de pirólise, moagem ou micro-ondas, físico-química, por explosão a vapor, expansão da fibra em amônia, explosão em dióxido de carbono ou explosão em água quente e apenas química, em meio ácido, alcalino, ozonólise, organosolv e delignificação oxidativa. Há ainda pré-tratamentos biológicos, com a utilização de micro-organismos. Geralmente, a combinação de um ou mais métodos se faz necessário (CANILHA et al., 2012; MOHAPATRA et al., 2017; SANTOS et al., 2008; SINDHU et al., 2016).
Os tratamentos físicos visam, principalmente o aumento da porosidade e da superfície de contato, sendo sua efetividade otimizada à medida que são aplicados em conjunto com outros tipos de tratamentos. Os tratamentos químicos são mais eficientes na solubilização
da lignina e da hemicelulose e os físico-químicos são ainda mais eficazes, dentre eles os tratamentos com ultrassom e térmicos, uma vez que promovem a degradação da estrutura cristalina ao mesmo tempo da ruptura das células (ALBUQUERQUE et al., 2014; CANILHA et al., 2012; SINDHU et al., 2016)
Dentre os diversos métodos de pré-tratamento, a hidrólise em ácido diluído se mostrou mais eficiente na hidrólise total das moléculas de hemicelulose, em curtos períodos de tempo. A utilização de ácido sulfúrico diluído em condições brandas, por sua vez, tem sido amplamente utilizada pela academia, devido à facilidade de operação, baixo custo e à confiabilidade do método. Como vantagem em relação ao método de ácido concentrado, tem-se a menor corrosão de equipamentos (RAVELLA et al., 2012).
2.2.6. Destoxificação do hidrolisado hemicelulósico
Durante o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, ocorre a liberação de açúcares fermentescíveis e, como consequência das condições aplicadas, há a formação de outros compostos, como furfural, hidroximetilfurfural, ácidos fenólicos e vanilina. Esses compostos surgem da degradação excessiva de componentes da biomassa e afetam a fermentação pelos micro-organismos, uma vez que retardam o metabolismo e o crescimento celular e impedem o consumo da fonte de carbono por danificar a parede celular e portanto a assimilação de glicose (ALBUQUERQUE et al., 2014; CANILHA et al., 2008; SWAIN; KRISHNAN, 2015; WANG et al., 2015)
Os compostos inibitórios podem ser classificados em alguns tipos, sendo eles: substâncias liberadas pela estrutura hemicelulósica, como ácido acético; compostos derivados da degradação parcial da lignina, como os fenólicos e aromáticos; derivados da degradação de pentoses e hexoses, como furfural e 5-hidroximetilfurfural; compostos metálicos, oriundos do próprio equipamento de hidrólise, como cobre, ferro e níquel. Estes compostos podem agir individual ou sinergicamente na inibição do metabolismo microbiano (CANILHA et al., 2012). Para a fermentação dos açúcares da biomassa e produção de produtos de interesse econômico, faz-se necessário reduzir a concentração destes compostos inibidores a tal nível que o metabolismo microbiológico não seja afetado. Dessa forma, pode-se obter produtividade elevada na conversão dos açúcares. Na fermentação de xilitol a partir da xilose, o composto com maior efeito inibitório encontrado foi a vanilina (CANILHA et al., 2012; RAVELLA et al., 2012).
Assim como há uma gama de pré-tratamentos possíveis de serem utilizados, também há grande diversidade de métodos de remoção destes compostos inibidores. Podem ser por evaporação, neutralização, usando membranas ou resinas de troca iônica, por adsorção em carvão ativo, overliming, extração com solventes orgânicos, além de métodos biológicos e enzimáticos (CANILHA et al., 2012; RAO et al., 2016; RAVELLA et al., 2012; SWAIN; KRISHNAN, 2015). Em se tratando do pré-tratamento com ácido diluído, tem-se como vantagem a menor geração de compostos inibidores, possibilitando que métodos mais brandos de destoxificação sejam necessários (RAVELLA et al., 2012). Apesar de cada método possuir suas vantagens e desvantagens, devido à grande divergência entre os compostos inibidores, faz-se necessário a aplicação de métodos combinados, estabelecendo-faz-se uma estratégia de destoxificação (RAVELLA et al., 2012).
No caso do bagaço da cana-de-açúcar tratado com ácido diluído e altas temperaturas e pressões, o uso da combinação de métodos alcalinos, ácidos e adsorção em carvão ativo tem se mostrado vantajoso (RAO et al., 2016).
Os hidrolisados hemicelulósicos são fortemente ácidos, sendo, portanto, necessária uma etapa de neutralização. Geralmente são usados hidróxido de sódio ou de cálcio, pela grande disponibilidade e baixo custo dos mesmos. Variando-se o pH do meio, compostos se precipitam e podem ser isolados facilmente por filtração. Analogamente, os tratamentos ácidos podem ser aplicados e os compostos removidos por filtração. O ácido mais comumente empregado é o ácido fosfórico (RAO et al., 2016; RAVELLA et al., 2012)
A destoxificação por adsorção em carvão ativo é bem estabelecida e ganha força em função do baixo custo e simplicidade de operação. O método é capaz de remover em grande parte os compostos fenólicos sem maiores efeitos nas concentrações de açúcares, e deve ser otimizado quanto à temperatura, pH, tempo de contato e razão de concentração entre sólidos e hidrolisado (CANILHA et al., 2012; RAO et al., 2016).
Recentemente, micro-organismos vem sendo utilizados também na remoção destes compostos inibidores. Existem alguns micro-organismos capazes de assimilar os inibidores e degradar a lignina ou pode-se utilizar da engenharia genética ou evolutiva para aumentar a resistência dos micro-organismos fermentadores a esses compostos (CANILHA et al., 2012; PARAWIRA; TEKERE, 2011). Os autores Hou-Rui et al. (2009) isolaram e identificaram duas leveduras da indústria de xilose e papel e celulose, Issatchenkia orientalis e Issatchenkia occidentalis capazes de degradar ácido acético e furfural. Outros autores também já conseguiram isolar leveduras capazes de degradar os inibidores (NICHOLS et al., 2008;
OKUDA et al., 2008) e utilizaram cepas mutantes para destoxificação de hidrolisados hemicelulósicos (SCHNEIDER, 1996).
2.2.7. Bioconversão da xilose em xilitol
Os açúcares presentes no hidrolisado hemicelulósico destoxificado podem ser fermentados pelas leveduras. Diversas cepas de leveduras vêm sendo utilizadas para a fermentação e produção de xilitol, destacando-se as do gênero Candida e Debaryomyces. Dentre elas Candida tropicalis, Candida pelliculosa, Candida guilliermondii e Debaryomyces hansenii, capazes de expressar a enzima xilose redutase e inibir a ação da xilitol desidrogenase em condições de microaeração, permitindo o acúmulo de xilitol (SAMPAIO et al., 2006; UR-REHMAN et al., 2013; WANG et al., 2011).
O metabolismo da xilose ocorre em duas etapas. Em um primeiro momento, a xilose é reduzida a xilitol na presença da enzima xilose redutase (XR). Em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (XDH; Figura 8). Essas duas reações limitam a velocidade da reação de conversão de xilose a xilitol. A enzima xilulose quinase (XK) age em sequência, convertendo a xilulose em xilulose-5-fosfato, que pode então migrar para a via das pentose-fosfato. Nessa via, há a formação do piruvato, que pode ser convertido a etanol e dióxido de carbono (RAO et al., 2016).
Figura 8. Via metabólica para utilização da xilose e produção de xilitol por leveduras. Fonte: Adaptado de Ur-Rehman et al. (2013).
Xilitol desidrogenase (XDH) Xilose Isomerase (XI) NAD+ Xilulose quinase (XK) NADH Xilose Xilitol Xilulose Xilulose-5P NADPH NADP+
Via das Pentose Fosfato / Glicólise
Etanol
Xilose redutase (XR)
A enzima xilose redutase é NADPH-dependente, enquanto a xilitol desidrogenase necessita de NAD+ para apresentar atividade. No caso de leveduras do gênero Candida capazes de sintetizar xilitol, a disponibilidade de oxigênio é fator crucial para o acúmulo do mesmo. Em concentrações limitadas de oxigênio, a fosforilação oxidativa não é capaz de reoxidar todo o NADH gerado. Assim, a concentração de NADH intracelular aumenta, acarretando em acúmulo de xilitol (ALBUQUERQUE et al., 2014). Apesar disso, parte dos co-fatores precisam ser regenerados para permitir o crescimento celular, que depende de alguns metabólitos. Deste modo, a concentração de oxigênio deve ser bem balanceada, equilibrando-se a concentração de xilitol, uma vez que parte deste deve prosseguir na via metabólica para devido crescimento celular (KIM et al., 2002; RAVELLA et al., 2012).
A xilulose gerada a partir do xilitol pela enzima xilitol desidrogenase é usada para o crescimento celular e regeneração de NADPH por meio da via das pentoses fosfato. Essa via é iniciada após sua conversão à xilulose-5-fosfato pela enzima xilulose quinase, na presença de ATP como co-fator. Nesse sentido, esse fluxo de xilitol para xilulose precisa ser controlado, o que é feito com o balanceamento de oxigênio (KIM et al., 2002).
Segundo Yablochkova et al. (2003), a levedura Candida tropicalis apresenta maior atividade específica de xilose redutase, sendo por isso ótima produtora de xilitol. Apesar das dificuldades inerentes ao gênero Candida em função da patogenicidade de algumas espécies, as leveduras deste gênero são consideradas as ideais e superiores em relação a cepas modificadas de Saccharomyces cereviseae para produção biotecnológica de xilitol, uma vez que são consumidores natos de xilose e por sua capacidade de manutenção do ambiente redox necessário ao acúmulo de xilitol (ALBUQUERQUE et al., 2014; YABLOCHKOVA et al., 2003).
2.3. Purificação de xilitol produzido a partir de hidrolisados hemicelulósicos
A fermentação da biomassa lignocelulósica para conversão de moléculas de xilose em xilitol resulta em um caldo fermentado bastante complexo, devido à presença de diversos compostos oriundos do metabolismo microbiano. Além disso, muitos destes compostos são semelhantes estruturalmente e possuem características físicas e químicas similares ao xilitol, como as pentoses e arabitol. Por isso, a purificação se torna um processo demasiadamente complicado tecnicamente.
A purificação de xilitol biotecnológico pode apresentar custos inclusive superiores ao de produção propriamente dita e, por isso, constitui etapa fundamental para viabilização do processo biotecnológico de produção de xilitol (GUIRIMAND et al., 2016; MISRA et al., 2011).
O método de purificação a ser utilizado deve depender da pureza desejada para o produto, das características do xilitol produzido e da composição do meio fermentado, que pode conter fragmentos de leveduras, substratos residuais, como xilose e arabinose, e subprodutos formados durante a fermentação (MARTÍNEZ et al., 2015).
Algumas estratégias já foram propostas para a recuperação de xilitol biotecnológico, sendo que a cristalização prevalece como etapa final, mas exige uma solução já com pureza elevada. Assim, outras etapas anteriores à mesma são necessárias, como adsorção em carvão ativo e concentração a vácuo (MISRA et al., 2011; RIVAS et al., 2006), tratamento com resinas de troca iônica (CANILHA et al., 2008; GURGEL et al., 1995; MARTÍNEZ et al., 2007) e adsorção em sílica gel (MUSSATTO et al., 2006).
Em 1995, Gurgel et al. estudaram a purificação de xilitol produzido a partir de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar por Candida guilliermondii, usando adsorção em carvão ativo, resinas de troca iônica e cristalização como última etapa. As melhores condições para o tratamento com carvão ativo foram de 25 % (m/v), a 80 ºC e pH 6,0 por 60 min, para as quais 19,1 % do xilitol permaneceu retido no carvão. As resinas de troca iônica não acarretaram em aumento da pureza e a formação de cristais só foi possível após a adição de pequenos cristais de xilitol comercial, sendo que os cristais formados ainda possuíam impurezas coloridas. Os autores observaram que a permanência de compostos coloridos presentes naturalmente no caldo fermentado afetou negativamente a cristalização.
Martínez et al. (2007) também avaliaram o uso de resinas de troca iônica e obtiveram menor perda de xilitol durante as etapas de recuperação e cristais de pureza entre 92% e 94%. As resinas utilizadas eliminaram 17,5% da arabinose presente no caldo e a cristalização foi feita por precipitação em etanol, sendo necessária a adição de finos cristais de xilitol comercial.
Resinas de troca iônica também foram avaliadas como método de purificação de xilitol biotecnológico por Canilha et al. (2008) e Wei et al. (2010). Os primeiros autores avaliaram três resinas combinadas de diversas formas para recuperação de xilitol a partir da fermentação de hidrolisado de palha de trigo por C. guilliermondii e alcançaram redução de 99% de cor e de 97-100% de impurezas. A concentração a vácuo posterior resultou em uma
solução viscosa e colorida que inibiu a formação dos cristais, que só foi possível com a adição de uma solução de xilitol pura em proporção de 70%. Nessas condições, o rendimento da cristalização foi de 43,5%, com pureza superior a 95,9%.
Já os autores Wei et al. (2010) avaliaram o uso de carvão ativo em batelada, de resinas de troca iônica e cristalização para recuperação de xilitol a partir da fermentação do hidrolisado da espiga de milho por C. tropicalis. O melhor resultado foi com a proporção de 4% de carvão ativo no caldo fermentado, a 60 °C por 50 min e 165 rpm, seguido de tratamento com duas resinas para dessalinização e outra resina catiônica para separação dos açúcares residuais. Obteve-se redução de 98% da cor e 70% de sais, atingindo-se pureza de 95% após a cristalização, que foi realizada por resfriamento (-20 ºC/48 h) e precipitação em etanol, com adição de finos cristais de xilitol na concentração de 1 %.
De Faveri et al. (2002) estudaram a cristalização de xilitol em misturas binárias de xilitol/xilose e em hidrolisados de hemicelulose obtidos de madeira dura, fermentado por Debaryomyces hansenii. Como etapa anterior à cristalização, foi utilizado evaporação a baixa pressão até atingir a supersaturação, quando finos cristais de xilitol foram adicionados ao caldo purificado, para cristalização por resfriamento. O melhor resultado em rendimento de cristalização (56%) e pureza (100%) foram obtidos para soluções sintéticas muito concentradas em xilitol a uma temperatura constante de -5 °C. Para o caldo fermentado, os resultados não foram tão relevantes, sendo o melhor rendimento de 29% e a pureza de 92%, ressaltando a interferência negativa de impurezas do caldo fermentado na formação de cristais. Apesar do rendimento não tão elevado, os autores recomendam a utilização da cristalização como passo final de recuperação de xilitol a partir de caldos fermentados.
Rivas et al. (2006) avaliaram a purificação de xilitol fermentado por D. hansenii a partir de hidrolisados hemicelulósicos de espiga de milho. A concentração de carvão ativo selecionada pelos autores foi de 1 kg para 15 kg de caldo fermentado, permitindo considerável eliminação de contaminantes com perda de apenas 3,2% do xilitol inicial. Em seguida, o caldo foi evaporado a baixa pressão e a adição de etanol possibilitou a eliminação de resíduos como proteínas, cinzas e outros compostos não-voláteis por precipitação. A cristalização permitiu obtenção de um produto de pureza de 98,9%, mas com perdas de 43,7% de xilitol.
A purificação de xilitol produzido por D. hansenii também foi estudada por Sampaio et al. (2006), que avaliaram diferentes concentrações de carvão ativo e a cristalização em presença e ausência de xilose. Considerando também aspectos econômicos, os autores recomendaram utilização de concentração de carvão ativo em 20 g/L a 25 °C por 60 min. No
