SIMONE JACOVACI COLLETA
"Análise comparativa dos padrões de proliferação e
morte celular na próstata ventral de gerbilos sob os
efeitos do bisfenol A e cádmio em condições androgênicas
normais e após orquiectomia”
"Comparative analysis of proliferation and cell death
patterns in the ventral prostate of gerbils under the effects
of bisphenol A and cadmium in androgenic normal
conditions and after orchiectomy"
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
SIMONE JACOVACI COLLETA
"Análise comparativa dos padrões de proliferação e
morte celular na próstata ventral de gerbilos sob os
efeitos do bisfenol A e cádmio em condições androgênicas
normais e após orquiectomia”
"Comparative analysis of proliferation and cell death
patterns in the ventral prostate of gerbils under the effects
of bisphenol A and cadmium in androgenic normal
conditions and after orchiectomy"
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural, na área de Histologia.
Dissertation presented to the Cellular and Structural Biology Postgraduate Programme in the Institute of Biology, the State University of Campinas, required for the completion of a Master degree, in the areas of histology.
RESUMO A próstata é uma glândula acessória do sistema reprodutor que apresenta desenvolvimento e manutenção regulados por andrógenos e estrógenos. Interferências na ação desses hormônios podem predispor esta glândula a desenvolver doenças como hiperplasia prostática benigna e câncer. O bisfenol A (BPA) e cádmio (Cd) são poluentes ambientais que possuem atividade estereogênica. O BPA e Cd entram no corpo humano, principalmente através da ingestão oral. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar se a exposição ao BPA e ao Cd durante a puberdade pode causar alterações na morfologia, proliferação e morte celular na próstata ventral de gerbilos normais e castrados. Para cumprir estes propósitos foram realizadas técnicas morfológicas, serológicas e immunocitoquímicas (PCNA para detecção de células proliferativas e TUNEL/ caspase-3 para a detecção de células apoptóticas). Os resultados demonstraram que 7 dias depois da exposição ao BPA e Cd, individualmente ou em combinação sob condições androgênicos normais, houve um aumento na altura do epitélio e na espessura da camada muscular lisa (SML). O BPA e Cd individualmente induziram o aumento expressão celular de PCNA e caspase-3. Em associação, o BPA e Cd causam aumento das células imunomarcados por TUNEL. Nos animais castrados, o Cd, individualmente ou em associação com o BPA causou aumento na altura do epitélio, na espessura SML, na área e perímetro nuclear, além da redução no numero de células epiteliais imunomarcadas com PCNA. Além disso, o BPA e Cd combinados, causaram redução das células imunomarcadas por caspase-3. Após 75 dias depois da exposição ao BPA e Cd individualmente ou em combinação, nos animais não castrados, foi observado um aumento na altura epitelial e na espessura da SMC. Todos animais com 120 dias de idade apresentaram focos de lesões intraepitelial prostática (PIN). O BPA promoveu redução da expressão de PCNA nas células do estroma. O Cd, individualmente ou associado com o BPA, causou um aumento das células epiteliais imunomarcadas por PCNA. Além disso, Cd aumentou o numero de células imunomarcadas por TUNEL e diminuiu as células imunomarcadas por caspase-3. Nos animais castrados, a administração BPA e Cd, individualmente ou em combinação, promoveu aumento das células imunomarcadas por TUNEL. Desta forma, podemos concluir que o BPA e o Cd são importantes desreguladores das atividades normais do tecido prostático, alterando os padrões morfológicos, de proliferação e morte celular.
ABSTRACT The prostate is an accessory reproductive system gland presenting the development and maintenance regulated by androgens and estrogens. Interference in the action of these hormones may predispose this gland to develop diseases such as benign prostatic hyperplasia and cancer. The Bisphenol A (BPA) and cadmium (Cd) are environmental pollutants that have estrogenic activity. The BPA and Cd enter in human body, mainly through oral ingestion. Thus, the aim of this study was to evaluate whether exposure to BPA and the Cd during puberty can cause alterations in morphology, proliferation and cell death in normal and castrated gerbils’ ventral prostate. For this, morphological, serological and immunocitochemical (PCNA for proliferating cells detection and TUNEL/ caspase-3 for apoptotic cells detection) methods were used. The results demonstrated that 7 days after the exposure to BPA and Cd, individually or in combination under androgenic normal conditions, there was an increase in epithelium height and in smooth muscle layer (SML) thickness. The BPA and Cd individually induced increased in PCNA and caspase-3 cellular expression. In association, the BPA and Cd cause increase in TUNEL immunostained cells. In castrated animals, the Cd, individually or in association with the BPA caused an increase in epithelium height, in SML thickness, in area and nuclear perimeter, in addition caused reduction in PCNA immunostained epithelial cells number. In addition, BPA and Cd combined, caused reduction in caspase-3 immunostained cells. Seventy-five days after BPA and Cd exposure, individually or in combination, in non-castrated animals, we observed an increase in epithelial height and the SMC thickness. All animals with 120 days of age had occurrences of lesions prostatic intraepithelial (PIN). The BPA caused a reduction in PCNA stromal cells expression. The Cd, individually or associated with BPA, caused an increase in PCNA immunostained epithelial cells. In addition, Cd increased the number of immunostained cells by TUNEL and decreased the immunostained cells by caspase-3. In castrated animals, the administration BPA and Cd, individually or in combination, increased the immunostained cells by TUNEL. We can conclude that the BPA and Cd are are important agents in endocrine activities changing of normal prostatic tissue patterns, altering the morphological, proliferation and cell death patterns.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO...1
A próstata masculina ... 1
A Próstata do gerbilo ... 3
Regulação hormonal da próstata ... 5
Desreguladores endócrinos ... 6
Metabolismo do bisfenol A e Cádmio ... 9
Proliferação e Morte Celular ... 10
PROBLEMÁTICA DO ESTUDO ... 13
OBJETIVO ... 17
RESULTADOS ... 16
ARTIGO: High dosages of Bisphenol A and cadmium cause changes in morphology of gerbil ventral prostate and promote alterations in proliferation and cell death on androgen dependence………...17
CONCLUSÕES GERAIS ... 68
REFEÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 69
“Tudo deve ser apresentado da
maneira mais simples possível,
porém não mais simples do que isso.”
Albert Einstein
Agradecimentos
Agradeço ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga, por acreditar na minha capacidade profissional, aceitando-me como sua aluna no Mestrado em Biologia Celular e Estrutural e por toda paciência e apoio.
A todos os membros da banca examinadora Prof. Dr. Prof. Dr. Sérgio Luis Felisbino, Prof. Dr. Alexandre Bruni Cardoso, Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço e Profa. Dra.Taize Machado Augusto pela disponibilidade, participação e sugestões.
À Marianna Zanatelli, por ter me ensinado muitas coisas, por também ter acreditado no meu trabalho desde o início. Obrigada pelo carinho, paciência, conselhos, dedicação, ensinamento, e acima de tudo por ser uma mãe na minha vida científica.
À Bianca, por todos os ensinamentos durante o estágio básico e por todo apoio durante minha primeira iniciação científica.
Ao técnico do Laboratório de microscopia e microanálises, por todas suas piadas, pelo suporte e auxílio técnico e acima de tudo por sua amizade.
Aos docentes e ao Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Estrutural pela imensa contribuição para minha formação profissional e aperfeiçoamento pessoal.
Aos membros da banca de qualificação, Profa. Dra. Shirlei Maria Recco-Pimentel, Prof. Dr. Edson Rosa Pimentel e Profa Dra. Cristina Pontes Vicente, pelo compartilhamento de suas experiências profissionais e sugestões.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da Bolsa de Estudos CNPq de março a junho de 2013 e ao auxílio financeiro.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo suporte financeiro concedido (Processo nº 2013/05115-0).
À Líliam Alvez Senne Panagio, secretária do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, por sua imensa competência e disponibilidade, por todo auxílio prestado durante esses 2 anos de metrado, mesmo a longas distâncias.
A todos os meus amigos de laboratório: Profa. Dra. Patricia Vilamaior e Prof. Dra. Rejane Góes, Ana Paula, Bianca, Bruno Sanches, Bruno Zani, Bruno Corte, Camila, Carol Chistante, Carol Frandsem, Carol Negrin, Cássia, Cíntia, Diego, Douglas, Egon, Eloísa, Ellen, Guilherme, Juliana, Luiz Henrique, Maê, Manoel, Mariana Marcielo, Marina, Mateus, Nayara, Ricardo, Silvana e Viviane. Muito obrigada por todas as risadas e momentos que passamos juntos, pela companhia, e ajudas com os problemas da vida laboratorial.
As minhas companheiras, Julia e Vanessa, pelos momentos de estudo para o processo seletivo do mestrado. Pela companhia durante as viagens para cursar as disciplinas. E acima de tudo por todos os momentos de desespero que passamos juntas, era muito bom saber que eu não estava sozinha. Obrigado por terem se tornado minhas amigas.
A Julia, Fernanda, Luiz Henrique, Marô, Kito, Patricia, Fábio, Nathalia, Maressa, Aline, Tamirez e Bruna por todos os momentos de amizade, por todos os “churras” sem carne, pelas festas, pela companhia e amizade. Obrigado pelos momentos de distração que foram muito importantes pra aliviar a tensão. Tenho que agradecer especialmente a Ju e a Fer por me apresentarem o interunesp e por todos os rodeios que fomos juntas, valeu meninas, vocês são demais!!!
A todas minhas amigas que passaram pela república, especialmente a Paula, por ser minha família de Rio Preto, pelos anos de convivência e amizade, por todo companheirismo, conselhos, troca de ideias e claro, descontração.
Aos meus gatos Phoebe e Dexter pela companhia durante as longas noites de estudo.
Aos meus pais Silvana e Hipólito, pelo amor incondicional, pelo carinho, pelos exemplos que me deram e por serem o alicerce de quem sou hoje. Especialmente a minha mãe, agradeço por todas as orações, por ter me ensinando a ter fé, por acreditar na minha capacidade, pelas palavras que me acalmaram. Muito obrigada Mãe, sem você eu nada seria.
A meu irmão Leandro, por toda torcida, por ser maior companheiro e amigo.
Aos meus avós, tios, tias e primos, pelos os momentos que passamos juntos nos finais de semana, pelas discussões sem nenhum fundamento. Obrigado pela torcida, por vibrarem com minhas vitórias e por saber que posso contar com todos sempre que precisar.
Enfim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho.
INTRODUÇÃO
A próstata masculina
A próstata é uma das glândulas sexuais acessórias responsável pela produção da maior parte do fluido seminal (Marker et al., 2003); secreta várias proteínas que ajudam a neutralizar a acidez do trato vaginal e contribuem com a capacitação e sobrevivência dos espermatozóides (Changamma et al., 2014). O grande interesse em se compreender a biologia desta glândula deve-se tanto ao seu fascinante processo de desenvolvimento, quanto à alta incidência de doenças prostáticas, como adenocarcinoma e hiperplasia prostática benigna (HPB) nos homens (Marker et al., 2003).
Estima-se que em 2014 o câncer de próstata foi responsável por 27% dos casos de incidência de câncer em homens, e a segunda causa de morte por câncer em homens (Siegel
et al., 2014) . É uma doença altamente relacionada à idade, a fatores hereditários e
andrógeno dependentes, além de também ser influenciada por hormônios esteróides sexuais endógenos, fatores ambientais, dietas, repostas imunes e inflamatórias (Huynh et al., 2001; Carruba, 2006; De Marzo et al., 2007).
Essa glândula é encontrada na maioria dos mamíferos, entretanto, sua morfologia varia significantemente entre as classes. A próstata de um humano adulto é compacta, sem distinção em lobos. Este tipo de organização determina o aparecimento de três zonas diferentes: zona central, de transição e periférica (Fig. 1A) (McNeal, 1983). A zona periférica constitui cerca de 70% da massa prostática e está localizada na face lateral e posterior da próstata, ao redor da zona central e de transição. A zona central, representada por aproximadamente 25% da massa do tecido, envolve o ducto ejaculatório, compreendendo o espaço onde o ducto se conecta com a uretra. Já a zona de transição, com apenas 5% da massa prostática, está localizada ao redor da uretra proximal, sendo contornada totalmente pelas zonas central e periférica (Roy-Burman et al., 2004).
Em roedores, observa-se um complexo prostático formado por quatro pares de lobos bilateralmente simétricos, que circundam a uretra e se posicionam estrategicamente sobre o ístmo da bexiga, sendo designados como anterior (ou glândula coaguladora), ventral, lateral e dorsal (Fig. 1B) (Jesik et al., 1982). Os lobos prostáticos diferem entre si em diversos aspectos, como o padrão de ramificação ductal, a histologia, a sensibilidade hormonal e o
conteúdo secretado (Aumüller & Seitz, 1990). O lobo ventral é geralmente o mais utilizado para investigações relativas à histofisiologia e patologia da próstata por ser sensível aos tratamentos hormonais e apresentar respostas mais semelhantes à próstata humana (Prins et al., 1992). Em termos de homologia, nota-se que os lobos ventral e dorsal da próstata de rato correspondem, respectivamente, à zona de transição e à zona periférica da próstata humana (McNeal, 1983).
Figura 1: (A) Divisões morfológicas da próstata humana (McNeal, 1983) e (B) da próstata de camundongo
(Thomson & Marker, 2006).
Histologicamente a próstata é composta por uma parte epitelial e outra estromal que em conjunto formam os túbulos secretores e ácinos da glândula. A camada epitelial consiste de três tipos de células: basal, secretora e neuroendócrina (Fig. 2) (Rumpold et al., 2002). As células basais situam-se entre o epitélio secretor e a membrana basal, e são células-fonte para manutenção do crescimento prostático. As células neuroendócrinas podem ser notadas na camada epitelial, tanto da próstata em desenvolvimento quanto na adulta e acredita-se que estejam envolvidas na regulação das secreções autócrinas e parácrinas das células epiteliais e no crescimento da glândula (Rodriguez et al., 2003; Marker et al., 2003). As células secretoras apresentam um citoplasma rico em organelas envolvidas nos processos de síntese e secreção de glicoproteínas. Este epitélio é sustentado por um estroma composto principalmente por células musculares lisas e fibroblastos, imersos em uma matriz extracelular (MEC) onde se encontram mastócitos, macrófagos, nervos e vasos sanguíneos (Tuxhorn et al., 2001).
Figura 2: Esquema ilustrativo de um ácino prostático em corte transversal. As setas indicam os tipos
celulares presentes (Adaptado de Marker et al., 2003).
A próstata do gerbilo
O gerbilo da Mongólia (Meriones unguiculatus), também conhecido como esquilo da Mongólia, é um pequeno roedor da família Muridae, subfamília Gerbillinae (Fig. 3). No início da década de 60 foram introduzidos como animais de laboratório, tornando-se importantes como modelos biológicos para pesquisas científicas (Rich, 1968). Atualmente, a utilização de gerbilos é cada vez maior na pesquisa científica das áreas da imunologia (Jeffers et al., 1984; Nawa et al., 1994), fisiologia (Nolan et al., 1990), culturas de células (Moritomo et al., 1991) e de morfologia (Jones et al., 1997; Santos & Taboga, 2006; Campos et al., 2010). É considerado um bom modelo para estudos de morfofisiologia da próstata sob diferentes condições experimentais (Corradi et al , 2004; Cordeiro et al, 2008 ; Scarano et al, 2008).
Histologicamente, a próstata dos gerbilos jovens (45 dias) é formada por ácinos secretores pequenos e ainda em formação, apresentando epitélio simples, com pequenos dobramentos em sua extensão. Este compartimento é delimitado por estroma não muscular, de tecido conjuntivo frouxo, adjacente ao epitélio acinar e, adjacente a este, há uma espessa camada de musculatura lisa (Fig. 4A) (Rochel et al., 2007). Nos gerbilos adultos (120 dias), a próstata apresenta ácinos com epitélio prismático simples e altamente secretor. Entre as porções glandulares, há estroma conjuntivo vascularizado, com poucas fibras conjuntivas e elásticas, além de células musculares lisas bem compactadas, dispostas ao redor de cada ácino (Fig. 4B) (Rochel et al., 2007).
Figura 4: Fotomicrografia da próstata ventral de gerbilo adulto. A) Corte histológico mostrando o
aspecto estrutural da glândula de um gerbilo jovem. Em maior aumento, detalhe de um epitélio acinar monstrando células secretoras (seta preta), células basais (seta branca) e camada muscular lisa adjacente (cml). B) Corte histológico mostrando o aspecto estrutural da glândula de um gerbilo adulto. Em maior aumento, detalhe de um epitélio acinar prismático monstrando células secretoras (seta preta), células basais (seta branca) e camada muscular lisa adjacente (cml). (Ep) Epitélio, (St) Estroma, (L) Lúmen. Coloração H&E. Fotos de arquivo pessoal.
Em estudos recentes verificou-se que a próstata de gerbilos desenvolve espontaneamente lesões pré-malignas e malignas em decorrência da idade (Pegorin de Campos et al., 2006; Campos et al., 2008, 2010; Gonçalves et al., 2010, 2013), fato que não pode ser constatado em ratos e camundongos (Zanetoni & Taboga, 2001). Essa característica favorece o uso desses animais em situações experimentais que procuram entender o desenvolvimento de doenças prostáticas.
CML CML L ep st A B L ep st
Regulação Hormonal da Próstata
Os hormônios esteróides são essenciais para o desenvolvimento e homeostase da próstata. O crescimento, a diferenciação e as funções da próstata são primariamente controlados por andrógenos. Entretanto, a próstata também é sensível aos compostos estrogênicos (Risbridger & Taylor, 2006).
Os andrógenos desempenham um papel central na regulação do crescimento da próstata, na capacidade para estimular a proliferação celular e inibir a morte das células epiteliais (Isaacs, 1984; Kyprianou & Isaacs, 1988). A testosterona (T) é o principal andrógeno atuante na próstata, produzida principalmente pelos testículos, é convertida em diidrotestosterona na próstata, através da ação da enzima 5-α redutase (Andersson et al., 1999; Mahendroo et al., 2001). A diidrotestosterona possui maior afinidade ao receptor de andrógeno (AR) do que a testosterona propriamente dita (Aggarwal et al., 2009).
A ação destes hormônios é mediada via receptores hormonais específicos (Cunha et al., 1996; Hsing et al., 2002). O receptor de andrógenos (AR) é um membro da família dos receptores nucleares e funciona como um fator de transcrição ativado por ligante. O AR é responsável pela mediação dos efeitos fisiológicos dos andrógenos por meio da sua ligação a sequências específicas de DNA, influenciando a transcrição de genes responsivos a andrógenos (Gelmann, 2002).
Os andrógenos mantêm a morfologia e a função no tecido prostático, controlando a circulação sangüínea, bem como atuando em mecanismos de proliferação e morte celular (Kyprianou & Issacs, 1988; Marker et al., 2003). O bloqueio da produção de andrógeno por orquiectomia é responsável por redução da glândula prostática, principalmente em resposta a diminuição do fluxo sanguíneo (Shabisigh et al., 1999), à morte por apoptose das células epiteliais e redução das vesículas e organelas de secreção (Heyns, 1990). Além disso, a privação androgênica promove a diminuição da proliferação de células epiteliais da próstata ventral de ratos.
Apesar dos andrógenos serem os principais hormônios atuantes na próstata, atualmente diversos estudos descrevem a importância dos estrógenos, no desenvolvimento e na homeostase normal do tecido prostático (Chen et al., 2008; McPherson et al., 2008; Scarano et al., 2008; Ellem e Risbridger, 2009). Os estrógenos agem através dos receptores nucleares ERα (receptor de estrógeno alfa) e ERβ (receptor de estrógeno beta). Sendo o
ERα localizado principalmente nas células estromais e o ERβ expresso mais acentuadamente no epitélio da próstata (Prins & Korach, 2008).
O ERα tem ação proliferativa, e quando ativado pode desencadear diversos efeitos adversos na próstata de roedores, como proliferação aberrante do epitélio, inflamação e desenvolvimento de lesões pré-malignas. Por outro lado, o ERβ está relacionado à quiescência e atua na sinalização celular epitélio-estroma e na regulação dos efeitos anti-proliferativos responsáveis por modular a ação hipertrófica dos andrógenos no epitélio prostático (Weihua et al., 2002; Imamov et al., 2004; Omoto et al., 2005; McPherson et al., 2008; Ellem e Risbridger, 2009).
O controle da diferenciação e da atividade prostática ocorre sob influência de um controle androgênico e estrogênico regulado e preciso, de forma que sensíveis interferências podem predispor esta glândula a desenvolver doenças como hiperplasia prostática benigna e câncer durante a vida adulta e senil.
Desreguladores endócrinos
Pesquisas recentes têm demonstrado que a exposição a diversas substâncias químicas presentes no meio ambiente pode causar alterações morfofisiológicas permanentes na próstata. Estas substâncias, denominadas desreguladores ou disruptores endócrinos (Endocrine disrupting chemicals – EDCs), representam uma ampla variedade de componentes que são encontrados em quantidades significativas na água, ar, solo, alimentos e produtos industrializados em geral. Devido à amplitude de distribuição, foi estimado que cada ser humano ingere passivamente cerca de 40 μg/kg/dia destes químicos ambientais (Toppari, 2008).
Desreguladores endócrinos são componentes naturais ou sintéticos que possuem a habilidade de alterar funções endócrinas dentro do organismo, mimetizando ou bloqueando hormônios endógenos (Schug et al., 2011). Os EDCs são geralmente associados ao câncer do sistema reprodutivo devido a sua ação nas vias dos hormônios sexuais (Rogers et al., 2013).
Os EDCs são capazes de exercer seus efeitos através de vários mecanismos de ação. Eles podem se ligar uma variedade de receptores nucleares e hormonais associados a hormônios sexuais e outros esteróides do sistema endócrino (Schug et al., 2011). Através
destas interações e agindo como agonistas ou antagonistas, os EDCs são capazes de alterar a atividade de elementos de resposta de genes, bloquear hormônios naturais de se ligarem aos seus receptores, ou até mesmo aumentar a quantidade de hormônio endógeno percebido no corpo, agindo como um mímico (Rogers et al., 2013) (Fig. 5).
Figura 5: Representação de algumas das interações dos desreguladores endócrinos (EDCs) com os
ligantes naturais (NL) e seus receptores. (A) EDCs podem competir com NLs para ligação ao receptor. (B) A ligação dos EDCs em oposição ao NLs pode alterar a sinalização do receptor. (C) Os EDCs podem se ligar aos receptores ao mesmo tempo em que os NLs também se ligam, alterando a sinalização do receptor (Adaptado de Rogers et al., 2013).
O grupo de moléculas identificadas como desreguladores endócrinos é altamente heterogêneo e inclui produtos químicos sintéticos utilizados como solventes industriais, lubrificantes e seus derivados [bifenilas policloradas (PCBs), bifenilas polibromadas (PBB), dioxinas], plásticos [Bisfenol A (BPA)], plastificantes (ftalatos), pesticidas (metoxicloro, diclorodifeniltricloretano), fungicidas (vinclozolin), e fármacos (dietilestilbestrol) e alguns metais pesados como o cádmio (Diamanti-Kandarakis et al., 2009).
Algumas destas substâncias agem como desreguladores androgênicos e outras como estrogênicos. Dentre os diversos desreguladores de ação estrogênica destacam-se o dietilestilbestrol, o etinilestradiol, o BPA e o cádmio (Cd) (Waalkes, 2000; Timms et al., 2005; Prins et al., 2008).
O BPA é um contaminante ambiental utilizado na produção de embalagens plásticas, resinas epóxi e muitos outros produtos domésticos comuns, sendo um dos produtos químicos de maior volume de produção no mundo (Prins et al., 2007). Quando aquecidos ou lavados repetidamente, os recipientes plásticos liberam grandes quantidades
de monômeros de BPA. A presença de BPA tem sido detectada no plasma sanguíneo humano, líquido amniótico, sangue de recém-nascidos, placenta e leite materno (Vandenberg et al., 2007). De acordo com a Agência americana de Proteção Ambiental (USEPA) a dose considerada segura para ingestão diária de BPA é de 50ug/kg/dia.
Em contato com o organismo de mamíferos, o BPA apresenta atividade estrogênica, podendo causar profundas alterações em tecidos e órgãos regulados por hormônios. A afinidade de ligação do BPA aos receptores de estrógeno (ERα e ERβ) é cerca de 10.000 vezes menor do que a dos estrógenos endógenos. Contudo, ele é um completo antagonista destes receptores estrogênicos (Prins et al., 2008).
Próstatas de animais expostos ao BPA apresentaram mudanças epigenéticas permanentes com alteração no padrão de metilação do DNA em múltiplos genes (Diamanti-Kandarakis et al., 2009). Pesquisas recentes com roedores têm demonstrado que a exposição a baixas concentrações de BPA aumentam significativamente a incidência e a severidade de neoplasias prostáticas (Ogura et al., 2007; Yang et al., 2010).
O Cádmio é um metal pesado tóxico de interesse ocupacional e ambiental devido à amplitude de efeitos adversos que pode causar quando em contato com o organismo. Ele apresenta uma meia-vida de 15 anos no organismo humano, acumulando-se principalmente no fígado e nos rins (Waalkes, 2000). De acordo com a Agência americana de Proteção Ambiental (USEPA) a dose considerada segura para ingestão diária de cádmio de 25 µg/kg de peso corporal.
Os humanos normalmente absorvem o cádmio por ingestão ou inalação; a absorção cutânea geralmente não é considerada significante (Lauwerys, 1988). Existem várias fontes de exposição humana ao cádmio, incluindo a manipulação de metais em indústrias, a contaminação do solo e da água por fertilizantes, e a inalação ativa e/ou passiva da fumaça do tabaco. Um cigarro contém cerca de 1-2 µg de cádmio e cerca de 10% do teor de cádmio é inalado quando o cigarro é fumado (WHO, 1992). A exposição ocupacional ao cádmio tem sido associada ao desenvolvimento de câncer de pulmão e próstata em humanos (Goyer et al., 2004).
Tem sido demonstrado que a próstata é um órgão alvo para a deposição de cádmio (Elinder, 1985; Lindegaard et al, 1990; Brys et al, 1997). Vários estudos experimentais mostraram que o cádmio pode agir na indução de tumores e lesões hiperplásicas na próstata
de ratos (Waalkes, 2003). Os mecanismos que envolvem a progressão da carcinogênese prostática provocada pelo cádmio são pouco conhecidos. No entanto, foi observado que o cádmio liga-se aos receptores estrogênicos mimetizando estrógenos (Prins, 2008).
Estudos epidemiológicos apontam dados preocupantes sobre o aumento da incidência de anormalidades no sistema reprodutor de vertebrados nos últimos 40 anos. Em humanos, tem-se observado uma diminuição na contagem de espermatozóides e aumento na incidência de criptoquirdismo, hipospadias e câncer de mama, testículo e próstata (DenHond & Schoeters, 2006). Muitos pesquisadores têm atribuído estas desordens à exposição a baixos níveis de químicos ambientais que alteram o sistema endócrino. Como a puberdade é um importante período de crescimento e maturação sexual, a exposição a estas substâncias pode aumentar a suscetibilidade dos órgãos reprodutores em desenvolver lesões na vida adulta e senil.
Metabolismo do bisfenol A e Cádmio
O BPA é metabolizado no fígado onde sofre conjugação com ácido glicurônico e forma o metabólito glicuronídeo do BPA (BPAG) (USEPA- U.S. Environmental Protection Agency, 2010). Em ratos, o bisfenol A é metabolizado a sua forma biologicamente inativa mais rapidamente quando administrado oralmente, que quando administrado por via não oral, por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa (Pottenger et al, 2000). Isto ocorre porque o bisfenol A, administrado oralmente, passa do intestino para o fígado onde sofre conjugação, principalmente com o ácido glicurônico, antes de atingir a circulação sistêmica (efeito de primeira passagem) (NTP- U.S. National Toxicology Program, 2008). Desta forma a administração subcutânea não sofre os efeitos de primeira passagem do metabolismo, o que resulta em uma maior circulação de bisfenol A livre, em comparação com a administração por via oral. Tem sido relatado que o BPA conjugado possui baixa atividade esterogênica ou não possui atividade esterogênica (Pottenger et al., 2000; Snyder et al. 2000; Matthews et al., 2001).
O metabolismo do cádmio também ocorre no fígado. Após a exposição e absorção para a circulação sistêmica, o Cd é inicialmente ligado à albumina plasmática, e o complexo Cd-albumina é então transportado para o fígado. No fígado este complexo é desfeito e a liberação do cádmio induz a produção de metalotioneína (MT), uma proteína de
baixo peso molecular (Nordberg, 2009). Essa proteína se liga ao cádmio nas células do fígado; esse novo complexo é então liberado lentamente para o plasma sanguíneo e filtrado através da membrana glomerular, realizando assim o transporte do Cd para os túbulos renais (Nordberg et al., 1971, Nordberg, 1972).
Desta, forma ocorre a eliminação da metalotioneína do plasma sanguíneo por filtração glomerular, entretanto como outras pequenas proteínas, ela é reabsorvida na urina primária nos túbulos proximais dos rins.
Proliferação e Morte Celular
Os processos de proliferação e de morte celular (apoptose) são eventos fisiológicos normais dos tecidos vivos. A proliferação celular é o mecanismo pelo qual as células crescem e se dividem. Esse processo, também chamado de ciclo celular, é mais evidente durante o desenvolvimento, mas também ocorre durante a substituição de células que são perdidas através de processos normais de desgaste ou danos teciduais. Alterações nos mecanismos de controle de proliferação celular estão envolvidas em estados patológicos, como aterosclerose, psoríase, hipertensão, doença renal policística e câncer (Berridge, 2012).
A regulação do ciclo celular é dependente de proteínas quinases (Wang et al., 2003) e outras proteínas como a p16, p27 e p53 (Fernandez et al., 2002). Assim, o ciclo celular pode ser estudado em diferentes fases através do estudo de marcadores moleculares relacionados à proliferação celular – como PCNA e Ki67 (Leite et al., 1999)
O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma proteína altamente conservada, pertencente a uma família de “sliding clamp”, que agrupa proteínas com estrutura em forma de um anel que circunda a molécula de DNA e funciona como um “grampo deslizante” para a DNA polimerase delta/épsilon ou como um esqueleto de acoplamento para outras proteínas também envolvidas nos processos de replicação e reparo do DNA e no controle do ciclo celular (Bowman et al., 2004; Sakurai et al., 2005; Naryzhny, 2008).
O PCNA foi primeiramente identificado como um fator atuante no processo de síntese de DNA durante a replicação (Bravo et al., 1987; Prelich et al., 1987; Strzalka & Ziemienowicz, 2011). No entanto, além desta função, o PCNA também está associado a
diferentes processos celulares vitais, como o remodelamento da cromatina, o reparo do DNA, a coesão de cromátides irmãs (Maga & Hubscher, 2003). Os níveis de PCNA oscilam durante o ciclo celular, e seu padrão de expressão o torna uma ferramenta muito utilizada para o estudo da proliferação celular (Tománek & Chronowska, 2006; Naryzhny, 2008). Sua maior expressão acontece durante as fases G1 e S (onde as células aumentam em tamanho e duplicam seu genoma), decaindo novamente nas fases G2 e M (onde as células checam a replicação do DNA e se dividem por mitose) (Strzalka & Ziemienowicz, 2011).
Análises de culturas de células demonstraram que células cancerígenas apresentam altos níveis de PCNA quando comparadas a células normais, de forma que esta análise pode se tornar uma ferramenta para o prognóstico de câncer em alguns casos (Czyzewska et al., 2004; Naryzhny & Lee, 2007).
A apoptose é um processo de morte celular programada que ocorre tanto sob condições fisiológicas normais, como na embriogênese ou homeostase de tecidos maduros, quanto em diversas doenças, incluindo o câncer (Kyrylkova et al., 2012). É um processo complexo e altamente regulado composto por uma série de passos coordenados que resultam na morte da célula. Alterações nas vias de apoptose são importantes na formação de tumores e na progressão de cânceres, pois permitem que células malignas sobrevivam e se proliferem (Matsushita et al., 2011).
Células em apoptose apresentam características morfológicas específicas, tais como rompimento da membrana nuclear, condensação da cromatina, contração celular e nuclear e formação de corpos apoptóticos (fragmentos celulares que se desprendem pela membrana). O acontecimento bioquímico que marca o processo de apoptose é a degradação do DNA em pequenos fragmentos, feito por endonucleases (Loo, 2011; Kyrylkova et al., 2012).
A técnica de TUNEL (TdT dUTP Nick-End Labeling) baseia-se nesta característica para localizar DNA apoptótico fragmentado in situ. A enzima Terminal deoxynucleotidyl Transferase – TdT – cataliza a adição de dUTPs identificadas a um terminal 3’-hidroxil de DNA, o qual pode ser visualizado por meio de técnicas imunohistoquímicas (Gorczyca et al., 1993; Rode et al., 2004).
Entretanto, a reação por TUNEL não se limita apenas à detecção de células apoptóticas (Watanabeet al., 2002; Huerta et al., 2007). Como a reação de ligação da TdT
às extremidades 3’ não é específica no sentido de que pode ocorrer com qualquer terminal 3’-OH livre, independentemente do mecanismo molecular que tenha levado à sua formação, a reação por TUNEL também é capaz de identificar células não apoptóticas, incluindo células necróticas degenerativas, células sob reparo de DNA, células injuriadas por forças mecânicas e até mesmo células sob transcrição ativa (Loo, 2011). Desta forma, faz-se necessária a adoção de outros métodos mais específicos para caracterização e confirmação do evento. Muitos deles incluem reações de imunohistoquímica para caspase-3, Western blots para caspases clivadas e detecção de fosfatidilserina na superfície da célula com Anexina V (Rode et al., 2004; Kyrylkova et al., 2012).
As caspases pertencem a uma família de cisteína-proteases, cuja principal função é a regulação central da morte celular (Wlodkowic et al., 2011). Das 12 caspases identificadas em humanos, 7 estão envolvidas na regulação e execução da apoptose (MacKenzie et al., 2010). Todas as caspases existem em células normais como enzimas inativas, análogas aos zimógenos inativos (pró-caspases). A proteólise é necessária para ativar a pró-enzima e transformá-la em uma caspase ativa (Park, 2012; Sanmartín et al., 2012).
As caspases podem ser classificadas como iniciadoras, tais como as caspases -2, -8, -9 e -10, e executoras, tais como as caspases -3 e -7. Caspases iniciadoras medeiam a formação de complexos de proteínas que proporcionam a plataforma molecular para ativação e inibição de caspases. Caspases iniciadoras clivam alguns substratos específicos, incluindo algumas caspases executoras. Esta clivagem ativa as caspases executoras, que por sua vez clivam substratos citoplasmáticos (como actina e citoqueratinas) e nucleares (como polimerase e lamininas), provocando a morte celular por apoptose (MacKenzie et al., 2010; Wlodkowic et al., 2011).
Falhas no mecanismo de regulação do equilíbrio entre os processos de proliferação celular e apoptose podem estar relacionadas com a hiperplasia e o carcinoma prostático (Xie et al., 2000; Carson & Rittmaster, 2003). Os desreguladores endócrinos por apresentarem atividade hormonal, podem interferir nesse equilíbrio. Assim, o uso de marcadores moleculares de proliferação celular e apoptose torna-se uma ferramenta muito importante para verificar interferências nesses processos.
PROBLEMÁTICA DO ESTUDO
A biologia prostática é assunto de interesse de vários pesquisadores no mundo, principalmente devido à propensão que esta glândula apresenta para desenvolver lesões durante a senescência (Cunha et al, 2001). O câncer de próstata é o principal tipo de câncer entre homens nos países desenvolvidos e o segundo mais comum em todo o mundo (Jemal et al, 2011). No entanto, há muito que se descobrir a respeito das causas que levam ao desenvolvimento desta doença (Patel et al., 2008).
Nas últimas décadas, os seres humanos tem se tornado cada vez mais expostos a níveis crescentes de poluentes ambientais. Estes químicos ambientais, também denominados de “desreguladores endócrinos”, estão presentes em quantidades significativas no solo, ar, água e em produtos industrializados em geral (Prins et al., 2007). Em contato com o organismo, estas substâncias apresentam atividade hormonal, geralmente mimetizando andrógenos ou estrógenos. Por mimetizar esteróides, os químicos ambientais podem interferir diretamente no balanço hormonal sistêmico, causando alterações irreversíveis nos órgãos regulados por estes hormônios.
Na década de 1990, os cientistas propuseram a "hipótese da baixa-dose," que postula que EDCs já tem efeitos em doses baixas, especialmente no desenvolvimento e na reprodução; e que os efeitos observados nos animais ocorreriam em doses semelhantes aos níveis de exposição humana (Vandenberg, 2014). Trabalhos vêm sendo desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa buscando verificar o impacto de baixas doses de BPA (50μg/kg/dia) sobre a próstata de gerbilos adultos (Fascina et al., 2015). Entretanto, de acordo com a hipótese citada os efeitos observados em baixas doses não são necessariamente aqueles previstos a partir de altas doses. Isso demonstra a necessidade de se verificar o impacto da administração de altas doses desses compostos sobre a próstata de gerbilos adultos, caracterizando o órgão sob a exposição aguda aos químicos ambientais.
Diversos estudos têm demonstrado que a exposição intra-uterina e neonatal a desreguladores estrogênicos como o bisfenol A e o cádmio altera o padrão normal da morfogênese prostática, favorecendo o desenvolvimento de lesões na vida adulta e senil (Waalkes, 2000; Goyer et al., 2004; Prins et al., 2008). Entretanto pouco se sabe a respeito
dos efeitos da exposição simultânea desses dois compostos, e pouca atenção tem sido voltada para os efeitos da exposição a estes desreguladores durante a puberdade.
A puberdade é um importante período do desenvolvimento pós-natal da próstata, pois a secreção testicular de andrógenos iniciada na adolescência induz um novo surto de crescimento e diferenciação prostática (Den Hond & Schoeters, 2006). Se roedores machos são castrados neste período, a próstata mantém-se pouco desenvolvida, devido à ablação androgênica (Vilamaior et al., 2005). Contudo, se a próstata destes animais castrados for estimulada por outras vias, como por exemplo, a ação estrogênica de desreguladores ambientais, pode-se instalar um padrão alterado de desenvolvimento, morte e proliferação celular.
OBJETIVOS Avaliar por métodos imunocitoquímicos, os efeitos a curto e longo prazos da exposição aguda ao bisfenol A e ao cádmio durante a puberdade, nos padrões de proliferação e morte celular da próstata ventral de gerbilos machos sob condições androgênicas normais e após castração.
ARTIGO
Os resultados obtidos neste estudo foram apresentados na forma de artigo.
High dosages of Bisphenol A and cadmium cause changes in
morphology of gerbil ventral prostate and promote alterations in
High dosages of Bisphenol A and cadmium cause changes in
morphology of gerbil ventral prostate and promote alterations in
proliferation and cell death on androgen dependence
Simone J. Colleta1; Marianna Zanatelli1; Fernanda C. A. Santos2, Rejane M. Goes1,3, Patricia S. L. Vilamaior3, Sebastiao R. Taboga 1,3*
1
Department of Biology Structural and Functional, State University of Campinas - UNICAMP, Campinas, São Paulo, Brasil; 2Department of Cell Biology, Histology and Embryology, Federal University of Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, BraziL; 3Department of Biology, Univ. Estadual Paulista - UNESP, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
Running Head: Bisphenol A and cadmium action on the gerbil ventral prostate
Contract Grant Sponsor: Sao Paulo State Research Foundation – FAPESP; Bazilian National Research and Development Council – CNPq.
Contract Grant Numbers: FAPESP (2011/07885-6, 2013/05115-0); CNPq (301596/2011-5)
* Correspondence to:
Prof. Dr. Sebastiao Roberto Taboga (e-mail: taboga@ibilce.unesp.br)
Department of Biology, Institute of Biosciences, Humanities and Exact Sciences (IBILCE) Univ. Estadual Paulista - UNESP
Rua Cristovao Colombo, 2265, Jardim Nazareth Sao Jose do Rio Preto, SP, Brasil, CEP: 15054-000
ABSTRACT
The bisphenol A (BPA) and cadmium (Cd) are environmental pollutants that have estrogenic activity. They enter in human body mainly through oral intake, and have been reported for development of potential reproductive effects. The prostate is an accessory gland of reproductive system sensitive to estrogenic compounds. The aim of this study was evaluate whether exposure to BPA and Cd in puberty can cause changes in morphology, proliferation and cell death in normal and castrated male gerbil's ventral prostate, considering an acute exposition of chemicals and evaluation after short (7 days) and long (75 days) periods. For this, morphological, serological and immunocitochemical (PCNA, TUNEL and caspase-3) methods were used. After 7 days for chemicals exposition and in non-castrated animals, our data showed that BPA and Cd administration increased epithelial height and in smooth muscle layer (SML) thickness. BPA and Cd individually increased proliferation and cell death by caspase-3. BPA+Cd increased apoptotic cells number by TUNEL. In castrated animals, Cd or BPA+Cd increased epithelium height, SML thickness, nuclear area and perimeter, besides a reduction in epithelial cells proliferation. BPA+Cd decreased cell death by caspase-3. After 75 days for chemicals exposition and in non-castrated animals, BPA and Cd increased epithelial height and SMC thickness. PIN lesions were observed in these groups of animals, but not caused by the chemicals administration, since no significant differences were observed in incidence and multiplicity among them. BPA declined stromal cell proliferation. Cd or BPA+Cd increased epithelium proliferation. Furthermore, Cd increased apoptotic cells number by TUNEL and decreased their number by caspase-3. In castrated animals, BPA and Cd increased epithelial cell death by TUNEL. We can conclude that bisphenol A and cadmium are important agents in changing patterns of morphology, proliferation and cell death of epithelial and stromal prostatic cells.
INTRODUCTION
Artificial compounds that mimic endogenous steroid hormones may be capable of altering natural processes in both humans and wildlife (Colborn, et al., 1993; Vos et al., 2000). Among them, Bisphenol A (BPA) and Cadmium (Cd) are chemicals established to have estrogenic properties (Waalkes, 2000; Prins et al., 2007).
BPA is a high-production chemical found in thousands of consumer products including polycarbonate bottles, epoxy resins, and dental sealants (Wetherill et al, 2007; Biedermann et al., 2010). Polycarbonate bottles is used in food and drink packaging; resins are used as lacquers to coat metal products such as food cans, bottle tops, and water supply pipes (Chapin et al., 2008). Studies have shown that BPA can leach from polycarbonate plastics and from epoxy resins and other products in contact with food and drink, and as a result, routine ingestion of BPA is presumed (Vandenberg, 2007).
Cd is generally present in the environment at low levels; however, human activity has greatly increased those levels. Contained in soil and water can be taken up by certain crops and aquatic organisms and accumulate in the food-chain. Exposure to Cd occurs primarily through ingestion of contaminated water, food and to a significant extent through inhalation and cigarette smoking (Sarkar et al., 2013). Exposure levels of 30-50 mg per day have been estimated for adults (Satarug, et al., 2003). The prostate is one of the target organs for bioaccumulation of Cd (Elinder, 1985; Lindegaard et al., 1990).
The prostate is an accessory gland of the reproductive system, which has the normal growth and functional activities, mainly controlled by androgens (Cunha et al. 1986; Banerjee et al. 2000; Taplin & Ho 2001). In addition, the oestrogens also play an important role in prostate homeostasis and appear to be involved in the control of cell proliferation and carcinogenesis (Harkonen & Makela 2004). The hormone imbalance that occurs due to exposure of compounds that have hormonal activity can cause severe changes in the gland.
Our research group adopted the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) as an experimental model for prostate. The model has presented significant responses to hormonal treatments (Perez et al., 2011, 2012; Zanatelli et al., 2013; da Silva et al., 2013;
de Jesus et al., 2015). This characteristic makes the gerbil useful for investigating whether BPA and Cd promote or accelerates the development of prostate diseases.
The particular consequences of estrogenic exposure and the mechanisms involved undoubtedly differ depending on the time of exposure (Rubin et al., 2001). Effects on prostate differentiation of high doses of natural and man-made estrogens are thus opposite to effects of low doses (vom Saal et al., 1997). Puberty is an important period of postnatal development of the prostate, because the androgen testicular secretion initiated in this period induces an outbreak of prostatic growth and differentiation (DenHond & Schoeters, 2006). Therefore, it is essential to evaluate the effects that exposure to high doses of BPA and Cd during puberty have in the ventral prostate of gerbils.
In this study we evaluated the effects of exposition to BPA and Cd in puberty, alone and in combination, in morphology, proliferation and cell death for normal and castrated male gerbil's ventral prostate.
MATERIAL AND METHODS Experimental Design
Eighty male gerbils (Meriones unguiculatus) were used in this experiment. They were obtained from biotherium of the Biology Department of the Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences, campus of São José do Rio Preto – SP. The gerbils were housed in polyethylene cages maintained at 25°C and 40–70% relative humidity on a 12 h light– dark cycle; water and chow were provided ad libitum. The experiment was approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA/UNESP, protocol 034/2010). We used glass water bottles in these studies to ensure that related compounds did not leach from plastic water bottles and potentially confound the results of our studies.
Initially, the gerbils were arbitrarily divided into two groups: non-castrated and castrated. At 44 days of age, 40 animals were submitted to bilateral orchiectomy after anesthetized by ketamine (100 mL)/xylazine (30 μL) (1 ml/kg).
In next day (45 days of age), the male castrated and non-castrated animals were divided into experimental groups described below:
2. Bisphenol A (BPA): non-castrated animals that received subcutaneous injection of
bisphenol A (50 mg/Kg - Sigma) diluted in 0,1 mL mineral oil Nujol® (adapted from Stoker et al., 1999).
3. Cadmium (Cd): non-castrated animals that received subcutaneous injection of
Cadmium chloride (5 μmol/kg) diluted in 0,1 mL saline (adapted from Waalkes et al., 1988).
4. Bisphenol A + Cadmium (BPA + Cd): non-castrated animals that received
subcutaneous injection of bisphenol A (50 mg/Kg - Sigma) and Cadmium chloride (5 μmol/kg), diluted as described above.
5. Castrated (Ca): submitted to bilateral orchiectomy animals.
6. Castrated + Bisphenol A (Ca + BPA): castrated animals that received subcutaneous
injection of bisphenol A (50 mg/Kg - Sigma) diluted in 0,1 mL mineral oil Nujol® (adapted from Stoker et al., 1999).
7. Castrado + Cadmium (Ca + Cd): castrated animals that received subcutaneous
injection of Cadmium chloride (5 μmol/kg) diluted in 0,1 mL saline (adapted from Waalkes et al., 1988).
8. Castrated + Bisphenol A + Cadmium (Ca + BPA + Cd): castrated animals that
received subcutaneous injection of bisphenol A (50 mg/Kg - Sigma) and Cadmium chloride (5 μmol/kg), diluted as described above.
Studies report that the daily dose considered safe for ingestion by humans BPA is 50μg/kg/day (vom Saal & Hughes, 2005; Alonso-Magdalena et al., 2011; Castro et al., 2013). The concentration of BPA used in this experiment aimed to to verify the impact of high doses of this compound administered during puberty. The doses of cadmium used in this experiment were based on previous studies with rats that suggests induction of prostate tumors occurred only at doses of cadmium below the threshold for induction of testicular degeneration and dysfunction (~5 μmol/kg) (Waalkes et al., 1988).
Each experimental group was divided into two subgroups, one containing animals were sacrificed 7 days after drugs administration of (52 days age) and other containing animals were sacrificed 75 days after drugs application (120 days age). Thus, we observed the immediate and long term effects of these drugs in morphology, proliferation and cell
death in ventral prostate of castrated and not castrated animals. The experimental design was summarized in Figure 1.
Figure 1. Representation of experimental design.
At the end of each treatment, the gerbils were weighed and killed by decapitation following CO2 inhalation. The prostatic complex were weighed and fixed in buffered
paraformaldehyde 4% (pH 7,2- 0,1M) for 24 hours. After fixation, the tissues were dehydrated in an ethanol series, cleared in xylene, embedded in paraffin (Histosec; Merck, Darmstadt, Germany). Sections of 4μm were made in microtome and collected on silanized glass slides. For the present study only changes in ventral lobe of prostate complex were analyzed.
Testosterone serum levels
Blood samples were collected immediately after decapitation, centrifuged (3000 rpm for 20 min), and the serum samples were frozen at −80°C for subsequent analyses of testosterone levels. Analyses were performed by ELISA, using specific commercial kits (Testosterone EIA Kit, catalog number 582701, Cayman Chemical Company, MI, USA) according to the manufacturer’s recommended procedure. The detection limits for
Co 52d
0 44 45 52 120
Days
No intervention BPA, Cd or BPA+Cd s.c. injection
Androgen deprivation
Castration Death Post chemicals administration
BPA/ Cd/ BPA+Cd 52d Ca 52d Ca+BPA/ Ca+Cd/ Ca+BPA+Cd 52d Co 120d BPA/ Cd/ BPA+Cd 120d Ca 120d Ca+BPA/ Ca+Cd/ Ca+BPA+Cd 120d
testosterone was 6pg/mL. Readings were taken using a Spectra Max Plus 384 reader (Molecular Devices, CA, USA).
Cytochemistry
Tissue ventral prostate sections were stained by hematoxylin–eosin (H&E) for general histology, Gömöri’s reticulin to assess reticular fibers and periodic acid-Schiff (PAS) to analyze glycoprotein secretion. Analyses were carried out using BX-60 light microscope (Zeiss, Jena, Germany) coupled to an image acquisition system (Image ProPlus; ©Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).
Morphometric, stereologic and karyometric analysis
Stereological analysis of H&E-stained histological ventral prostate sections was carried out to determine the relative frequency (%) of the various tissue compartments (epithelium, lumen, muscular stroma and non-muscular stroma). To this end, 30 random microscopic fields were captured per animal at 200×magnification, per experimental
group, through a System Images Analyzer with Image-Pro Plus 6.0 software (©Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). Relative frequency (%) was estimated using the M130 multipoint test system (Weibel, 1963), applied to the prostate according to the procedure detailed by Huttunen et al., 1981.
For the morphometric study, measurements of epithelial cell height (µm) and stromal smooth muscle layer thickness (μm) were made in 180 random prostatic fields. For karyometric analysis, nuclear area (μm2) and perimeter (μm), were measured in 180 epithelial cells from each experimental group.
Incidence and multiplicityanalysis
To obtain these indices, tissue ventral prostatic sections stained with H&E were used. Whole three tissue sections were examined in order to quantify the number of prostatic lesions (PIN), the sections were digitalized at 400× magnification using a
BX61VS camera (Olympus Corporation,Tokyo, Japan) coupled to an Olympus VS120®Virtual Microscopy Slide Scanning System (VS120-S5) from the same
manufacturer. The diagnosis of Prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) was given second Shappell and collaborators (2004). Incidence of each histopathological feature was expressed as a percentage of animals exhibiting PIN of all animals from the experimental group. The multiplicity of lesions was estimated by averaging PIN foci per histologic section.
Immunocytochemistry
Paraffin ventral prostatic sections were subjected to immunocytochemistry for the detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA; PC10 sc-56, Santa Cruz Biotechonology, EUA) and activated caspase-3 (NB100-56113, Novus Biologicals, USA). Deparaffinized and rehydrated histological sections were subjected to antigen retrieval in in citrate buffer pH 6,0 at high temperature (98°C) for 30 min. Endogenous peroxidase blocking was performed with 3% H2O2 in methanol for 30 min and the blockade of
non-specific protein interactions was achieved by incubating sections with skim milk 3% in Tris-buffered saline for 30 min. For detection of PCNA, slides was incubated with the primary antibody 1:100 in BSA 1% for 60 minutes at 37 ° C, detection of the primary antibody was performed with EnVision TM + Dual Link System-HRP (Dako, Carpinteria, CA, USA) polymer for 45 min. For detection of activate caspase-3 slides was incubated with the primary antibody 1:200 in BSA 1% overnight at 4ºC, detection of the primary antibody was performed biotinylated secondary antibody (Rabbit ABC Staining System SC-2018 – Santa Cruz Biotechnology). The reactions were revealed with diaminobenzidine (DAB), and the sections were counterstained with Harris’s haematoxylin. The slides were dehydrated and mounted in Canada balsam.
Detection of DNA fragmentation in situ (TUNEL)
For detection of apoptotic cells was used TUNEL reaction (Rabbit polyclonal IgG, Abcam, UK), paraffin sections were immersed in TBS (20 mM, 140 mM NaCl, pH 7.6 ) and treated with proteinase K (1: 1000 in 10 mM Tris, pH 8.0) for 20 min at room temperature. Endogenous peroxidases were blocked with H2O2 (30%) in methanol (1:10)
for 5 min. Subsequently, the sections were incubated with biotinylated-TdT and the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) for 1 h at 37°C. Upon completion of the
reaction, biotinylated nucleotides were detected using streptovidina perdoxidase conjugate, and immunostaining was detected by diaminobenzidine (DAB). Subsequently, the sections were washed in water, counter-stained with hematoxylin and mounted in Canada balsam.
Quantification of immunostained cells
For quantification of proliferation and cell death levels 30 images were taken at 400x magnification, of each experimental group, by System Images Analyzer with Image-Pro Plus 6.0 software. The reactive and non-reactive epithelial and stromal cells were counted in its entirety, and the values obtained were transformed into percentage.
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using GraphPad Prism5.0 software (GraphPad Software, Inc., CA, USA). Parametric data were analyzed initially by analysis of variance (One-way ANOVA) and subsequently by Tukey test for multiple comparisons. For analysis of non-parametric data were used the Kruskal-Wallis test for multiple comparisons. The level of significance was 5% (p ≤ 0.05).
RESULTS
Biometric analysis
In relation to the body weight of animals, no significant variations were found among all the experimental groups (Table 1).
There was, however, a significant prostatic complex weight increase in BPA group compared with Co and BPA+Cd 52 days groups, and increase in prostatic relative weight compared with Co 52 days. Among the young castrated animals (52 days), there was no significant difference in prostatic complex weight and in the relative weight among the experimental groups.
In adult (120 days) non-castrated animals, no significant differences in prostatic complex weight and relative weight were found among the experimental groups. Among the castrated animals the Ca+BPA+Cd group showed an increase in prostatic complex
weight of in relation Ca group, no significant differences were observed in prostatic relative weight.
At 52 days age, the treatment with bisphenol A and cadmium cause a decrease in prostatic complex weight and relative weight in castrated animals (Ca+BPA and Ca+Cd groups) in relation to non-castrated animals submitted to same treatment(BPA and Cd). In all treatment, adults castrated animals exhibit a significant reduction in prostatic complex weight and relative weight in relation to non-castrated animals.
Testosterone serum levels
The testosterone serum levels are shown in Table II. There was no significant difference in testosterone serum levels among the experimental groups, both young (52 days) and adult animals (120 days). At 52 days age, no significant variations were found between castrated and non-castrated animals. Already in adult (120 days), the testosterone levels declined significantly in castrated animals in relation to non-castrated animals.
Morphometric, stereologic and karyometric analysis
Animals Killed at 52 days of age.
The values of Morphometric, stereologic and karyometric analysis are represented in Table III. Among the non-castrated animals, prostatic epithelial cell height and smooth muscle layer thickness (SMC) was higher in the BPA, Cd and BPA+Cd than in Co. The karyometric analysis revealed an increase in the nuclear area of BPA group in relation to Co group, and the nuclear perimeter of epithelial secretory cell was higher in BPA, Cd and BPA+Cd groups than in Co group. The stereological data revealed that treatment with Cd caused an increase in prostatic epithelial compartment and reduction in non-muscular stroma. The luminal compartment and SML showed no significantly difference among the groups.
Among the castrated animals, Ca+Cd and Ca+BPA+Cd groups showed a reduction in epithelial cell height and in SCM thickness in relation to Ca and Ca+BPA groups. The nuclear area and perimeter of epithelial secretory cell were significantly lower in Ca+BPA, Ca+Cd and Ca+BPA+Cd groups than in Co groups. There was a reduction in prostatic
epithelial compartment in Ca+BPA+Cd group in relation to Co group. The other prostatic compartments (lumen, SML and non-muscle stroma) showed no significant differences among the experimental groups.
The epithelial height of castrated animals was lower than non-castrated animals, subjected to the same experimental treatment. Already the SMC thickness, the nuclear area and perimeter of epithelial secretory cell decrease in castrated animals of Ca+BPA, Ca+Cd and Ca+BPA+Cd groups in relation to their respective non-castrated groups.
Animals Killed at 120 days of age.
The values of Morphometric, stereologic and karyometric analysis are represented in Table III. The morphometric analysis of non-castrated animals, demonstrated that the treatment with bisphenol-A and cadmium, alone or in combination (BPA, Cd and BPA+Cd) cause an increased in epithelial height. The smooth muscle layer thickness (SMC) was higher in BPA and Cd than in Co and BPA+Cd groups. The Cd group showed an increase in nuclear area and perimeter of secretory epithelial cell in relation to the Co group, and the BPA+Cd group showed a decrease of these values in relation to Co group. The administration of bisphenol-A and cadmium in association caused an increase in the epithelial compartment and reduction of luminal compartment compared with Co group. The stromal compartments (muscular and non-muscular) did not change among the experimental groups.
Among the castrated animals, the Ca+BPA+Cd group showed a reduction in epithelial height in relation to others groups. The SML became thinner in the Ca+Cd group. The nuclear area of epithelial secretory cells was greater in Ca+Cd group, already the nuclear perimeter was higher in Ca+BPA, Ca+Cd and Ca+BPA+Cd groups that in Ca group. The stereology revealed that the Ca+BPA group had an increase in luminal compartment in relation other groups. The other compartments (epithelium, SML and non-muscular stroma) showed no significant differences among the treatments.
The morphometric analysis showed a decrease in epithelial height in Ca+BPA, Ca+Cd and Ca+Cd+BPA groups in relation to their respective non-castrated BPA, BPA + Cd and Cd groups. The SML become thinner in Ca+Cd and Ca+BPA groups than the BPA and Cd groups, respectively. The castrated animals (Ca, Ca+BPA, Ca+Cd and Ca
+BPA+Cd) showed a reduction in nuclear area of the secretory epithelial cells compared with non-castrated animals (Co, BPA, BPA + Cd and Cd). The nuclear perimeter was also lower in castrated animals than the non-castrated animals, except in group Ca+BPA+Cd that showed no difference as compared with your non-castrated group (BPA+Cd). The epithelial compartment was higher in Ca group than the Co. All castrated groups (Ca, Ca+BPA, Ca+Cd and Ca+BPA+Cd) showed a reduction in luminal compartment and increased SML in relation to castrated groups (Co, BPA, Cd and BPA+Cd). The muscular stroma increased in castrated animals in relation to their receptive groups non-castrated, except in group Ca+BPA+Cd, which showed no difference compared with BPA+Cd group.
Morphological analysis
Animals Killed at 52 days of age.
The morphological aspect of the ventral prostate of gerbilos of different experimental groups is shown in Figure 2. The ventral gerbil's prostate of the Co group presents acinar simple epithelium, with small creases in its extension and secretion slightly acidophil. The epithelium is composed of two main cell lines, secretory and basal cells; and the stroma that involves the acini is composed of smooth muscle cells, collagen, elastic fibers and blood vessels (Figure 2A).
Eight days after castration the acini are morphologically regressed with regions of epithelial pleating (Figure 2E); the lumen become less wide and observed a decrease in prostate secretory activity compared with Co group, showed by PAS method (Figure 3A, E).
There were no drastic morphological alterations in non-castrated animals treated with bisphenol-A, and cádimo (BPA, Cd or BPA+Cd; Figure 2B, C and D). However, these animals showed a reduction in prostatic secretory activity, as evidenced by PAS staining (Figures 3B, C and D). Among the castrated animals no marked differences were observed in prostatic morphology among the experimental groups (Ca, Ca+BPA, Ca+Cd and Ca+BPA+Cd) (Figure 2E, F, G and H).
