2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

(1)

© 2 0 1 5 Dr . W a lte r F . d e A z e v e d o Jr . 1 000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000000 000000000000111111111110001100000000000 000000000001111111111111111111000000001 000000000111111111111111111111111000000 000000000111111111111111111111111000000 000000000011111111111111111111100000000 000000001111111111111111111111111000000 000011111111111111111111111111111000000 001111111111111111111111111111110000000 111111111111111111111111111110000000000 111111111111111111111111111110000000000 000011111111111111111111111111111110000 001111111111111111111111111111111111000 011111111111111111111111111111111111000 001111111111111111111111111111111111100 000000011111111111111111111111111111110 000000001111111111111111111111111111110 000000000001111111111111111111111111110 000000000000011111111111111111111111110 000000000000000111111111111111111111000 000000000000000000000000001111000000000 000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000000

(2)

1. Cristalização. Para

cristalizar uma

macromolécula temos que leva-la a um estado de supersaturação, que favorece a formação de cristais, como os mostrados acima. Os cristais de moléculas biológicas normalmente apresentam dimensões inferiores a 1 mm de comprimento em cada aresta.

2. Coleta de dados de difração de raios X. Os cristais apresentam um arranjo ordenado de moléculas, como uma pilha de tijolos ordenados. Na analogia, cada tijolo representa uma molécula. As distâncias entre os átomos são da ordem de 1 Å (0,1 nm ou 10-10 _{m), usando-se}

raios X (com comprimento de onda da odem de Å ) teremos difração.

3. Interpretação do padrão de difração de raios X. A figura abaixo é o registro da difração de raios X de um cristal. Os raios X interagem com o cristal, o que produz um padrão de difração. A análise desta informação possibilita a resolução de estrutura 3D.

4. Resolução da estrutura. A partir da análise do padrão de difração é possível gerar mapas de densidade eletrônica (à direita). A interpretação de tais mapas gera a estrutura 3D de molécula.

5. Análise. A partir da estrutura resolvida procedemos a análise, onde relaciona-se a estrutura 3D à sua função biológica.

Etapas para resolução da

estrutura 3D de

macromoléculas biológicas por cristalografia

2 Cristalografia

(3)

Para cristalizarmos uma macromolécula biológica é necessário trazê-la a um

estado de supersaturação.

Consideremos uma proteína dissolvida em um tampão. Nesta situação, para que a proteína seja levada a formar cristais, é necessário que as moléculas da proteína sejam trazidas a uma situação onde as moléculas fiquem relativamente próximas umas das outras. Para levar a proteína a à supersaturação, podemos aumentar sua concentração (eixo vertical), ou aumentar

a concentração do sal presente na

solução da proteína. O diagrama ao lado

ilustra as diferentes regiões de

solubilidade da proteína.

3 Supersaturação

(4)

O processo de cristalização da proteína normalmente deve ser lento, ou seja, considerando-se a proteína inicialmente

numa região abaixo da curva de

solubilidade, devemos aumentar a

concentração salina, ou da proteína, de

modo a trazê-la na região de

supersaturação, de forma a propiciar um arranjo ordenado das moléculas. De uma forma geral, espera-se que o processo de cristalização demore horas, dias ou até meses. A partir o gráfico ao lado, vemos que na região de supersaturação teremos as moléculas da proteína próximas umas das outras, o que, em casos favoráveis, promoverá o aparecimento dos primeiros núcleos cristalinos. Esses microcristais servirão de base para o crescimento de

cristais maiores, adequados para

experimentos de difração de raios X. 4

(5)

Para cristalizarmos proteínas,

normalmente usamos o método de

difusão de vapor. Uma gota de proteína

é colocada sobre uma lamínula. Na gota adicionamos uma solução contendo sal,

ou outro agente precipitante, como

polietileno glicol (PEG). Colocamos a lamínula sobre um poço, onde temos a solução do precipitante. Ao fecharmos

esse sistema, ocorrerá difusão de

moléculas de água da gota para o poço, levando a proteína, em casos favoráveis, a um estado de supersaturação, que pode levar à formação dos primeiros núcleos cristalinos.

5 Supersaturação

(6)

Fenômeno de salting-in. a) Macromolécula biológica sem a presença de íons dissolvidos na solução. A atração eletrostática entre os grupos carregados em duas os mais macromoléculas causa a aglomeração e precipitação. b) Íons blindam a interação eletrostática entre as macromoléculas, aumentando a solubilidade.

Diversos fatores interferem com a solubilidade da proteína, entre eles a concentração salina. O aumento da solubilidade de uma macromolécula a baixa concentração salina (<0,5M) é chamada salting-in. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar o fenômeno é considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons no solvente, a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução, esses blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade.

+

-

₊

-+

-

₊

-+ +

-a) b) 6 Supersaturação

(7)

Sequência de eventos para a montagem de uma gota de cristalização: a)

Coloca-se 1-2l da solução da macromolécula biológica sobre a lamínula de vidro. b) Adiciona-se 1-2l da solução do reservatório à gota com a solução da macromolécula biológica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a solução de macromolécula biológica mais a solução do reservatório.

Solução do poço

7 Método da Gota Suspensa (Hanging-drop)

(8)

Com o aumento do número de macromoléculas biológicas cristalizadas com

sucesso, tornou-se óbvio que muitas das condições de cristalização se

assemelhavam, ou seja, havia uma concentração de resultados positivos de

cristalização de macromoléculas biológicas usando-se número limitado de

precipitantes, tampões e aditivos. Isto levou à proposição de diversos métodos de cristalização (Carter & Carter, 1979), onde um número limitado de condições de cristalização eram testados, usando-se pequenas quantidades da macromolécula biológica, geralmente por volta de poucos miligramas.

8

0,5mm 0,5mm 0,5mm

Jancarik, J. & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24, 409-411.

(9)

A partir da observação dos resultados preliminares desses experimentos era possível determinar que tampão, aditivo e agente precipitante seriam os mais favoráveis e a partir daí proceder-se a sucessivos melhoramentos até se conseguir cristais adequados, ou ainda, em casos favoráveis, obter-se cristais adequados já na primeira tentativa com as condições padrões. Dentro deste raciocínio a Dra. Jaru Jancarick da University of California, Berkeley propôs o método da matriz esparsa ( Jancarick & Kim, 1991) onde diversas condições diferentes são tentadas para se cristalizar a macromolécula biológica.

Jancarik, J. & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24, 409-411. 9 0,5mm

0,5mm 0,5mm

(10)

Parâmetros da matriz de cristalização (Jancarik & Kim, 1991)

Agentes precipitantes

Não-Voláteis Sais Voláteis Mistura

MPD Tartarato de Na,K 2-Propanol Sulfato de NH₄ + PEG

PEG 400 Fosfato de NH₄ 2-Propanol + PEG

PEG 4000 Sulfato de NH₄ PEG 8000 Acetato de Na Sulfato de Li Formiato de Na Fosfato de Na,K Citrato de Na Formiato de Mg Faixa de pH: 4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5

Aditivos: Cloreto de Ca, Citrato de Na, Cloreto de Mg, Acetato de NH₄, Sulfato de NH₄, Acetato de Mg, Acetato de Zn e Acetato de Ca.

10 Matriz Esparsa

(11)

Por tentativa e erro a matriz

multimensional foi simplificada

eliminando-se as condições que podem

ser parcialmente representadas por

resultados de outras condições, a

proposta original apresenta 58 condições.

Comercialmente a empresa Hampton

Research, (USA) simplificou o método original, e disponibiliza um kit com 50

condições de cristalização.

Comercialmente há outros kits usando-se como princípio a variação de pH, força iônica e agentes precipitantes.

Imagem disponível em: <

http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?ci

d=1&sid=17&pid=1>.

Acesso em: 8 de Abril de 2015.

(12)

Um dos sistema usados para cristalização de proteínas é a placa linbro, mostrada acima. Essa placa apresenta 24 poços, que permite testarmos diversas condições de cristalização. As lamínulas são colocadas sobre cada um dos poços, e vedadas com graxa de vácuo.

Fonte: http://www.hamptonresearch.com

(13)

Cristais de proteínas são frágeis, assim diversos cuidados são tomados na manipulação. Na coleta de dados de difração de raios X, uma forma possível de manipularmos os cristais é deixando-os saturados de solvente e inseri-los num capilar, como mostrado na figura acima. Os cristais, assim dispostos, podem ser

levados para coleta de dados de difração de raios X. 13

(14)

Uma forma alternativa de coletarmos dados é transferir o cristal para uma solução com protetor criogênico (Polietileno glicol, glicerol entre outros). O cristal é então exposto a um fluxo de nitrogênio líquido e transferido para uma base metálica (cabeça goniométrica). O cristal fica pronto para a coleta de dados. As temperaturas

criogênicas minimizam os dados causados pela radiação. 14

(15)

Fonte: http://www.hamptonresearch.com

Na figura da esquerda vemos uma base de cobre usada como suporte para o cristal. À direita temos o cristal inserido num laço. A exposição ao nitrogênio líquido leva à formação de um filme rígido e transparente que mantém o cristal no laço.

15 Coleta de Dados de Difração de Raios X

(16)

Experimentos de cristalização no espaço normalmente geram cristais de melhor qualidade para estudos

de difração de raios X. As

condições de microgravidade do

espaço, propiciam um

empacotamento cristalino mais

ordenado, gerando cristais que

difratam à mais alta resolução. A proteína uropesina (Canduri et al., 2001) foi cristalizada em condições de microgravidade na missão STS-95 do ônibus espacial Discovery (

Disponível em: <

http://www.youtube.com/watch?v=N 9IFiQNY8mE >).

Fonte: http://www.aviationspectator.com/more-aviation-photos?page=405. Crédito: NASA

Cristal de uropepsina . 16

(17)

Uma etapa inicial importante na elucidação da estrutura tridimensional de proteínas, por meio de cristalografia por difração de raios X, é determinação do conteúdo da cela unitária. Uma vez tenhamos determinado os parâmetros da cela unitária: a, b, c, alfa, beta e gama, temos que determinar quantas moléculas temos na unidade assimétrica. Para isto precisamos, além dos parâmetros da cela unitária, o massa molecular da proteína cristalizada. O método proposto por Matthews (1968) permite calcular o número de moléculas por unidade assimétrica. Matthews determinou que para cristais de proteínas a relação entre volume da cela unitária (V_cell) e a massa molecular da proteína cristalizada fica na faixa de 1,7 a 3,5 Å3_{/Da, com a maioria dos valores em} torno de 2,15 Å3_{/Da. Tal volume é chamado de volume de Matthews (V}

M), e definido pela equação abaixo:

onde Z é o número de moléculas na cela unitária, MW a massa molecular da proteína cristalizada e V_cell o volume cela unitária, que para uma cela unitária qualquer é dada por:

V_cell = a.b.c [1 + 2 cos  cos  cos  - cos2 _{- cos}2 _{- cos}2_]1/2

17 Caracterização de Cristais de Proteína

MW

Z

V

_M cell

.



(18)

A fração de volume ocupada por proteína (V_protein) é dada por:

A fração de volume de solvente no cristal é dada por:

O V_protein pode também ser determinado por:

18 Caracterização de Cristais de Proteína

M protein

V



1 ,

23

M solvent

V



1 

1 ,

23

M protein

V

Volume

Específico

da

Proteína(g

/cm

)

3

(19)

Principais seções de um artigo de cristalização de proteínas:

1) Clonagem, expressão e purificação da proteína 2) Cristalização

3) Coleta de dados de difração de raios X

4) Outros (teste de atividade, sequenciamento, solução da estrutura e refinamento cristalográfico parcial.

19 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

(20)

(21)

The purifed MtCS was concentrated and dialyzed against 50 mM Tris±HCl buffer pH 7.8 (Hampton Research, USA). The final protein concentration was about 10 mg.ml-1_.

Crystallization was performed by the hanging-drop vapour-diffusion and sparse-matrix methods (Jancarik & Kim, 1991) using tissue-culture multiwell plates with covers (Linbro, ICN Biomedicals, Inc, USA) at a temperature of 293 K. Each hanging drop was prepared by mixing 1 ml each of protein solution and reservoir solution and was placed over 700 l reservoir solution. Initial conditions were screened using Crystal Screen I and II kits (Hampton Research,

USA). Hexagonal crystals of MtCS. Approximate dimensions

are 0.30 0.25 0.25 mm.

Fonte: Dias MV, Ely F, Canduri F, Pereira JH, Frazzon J, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of chorismate synthase from Mycobacterium tuberculosis. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60(Pt 11):2003-5.

(22)

A data set was collected at a wavelength of 1.427 Å using a synchrotron-radiation source (Station PCr, LNLS, Campinas- Brazil). The data set was collected from a single MtCS crystal using a MAR CCD image-plate system. The crystal was looped out from the drop and flash-cooled. The PEG 400 present in the crystallization conditions served as a cryoprotectant, X-ray diffraction data were collected at a temperature of 100 K under a cold nitrogen stream generated and maintained with an Oxford Cryosystem. The crystal was rotated through a total of 160o_{, with a 1}o

oscillation range per frame, a crystal-to-detector distance of 130 mm and an exposure time of 60 s. Data were processed on a Silicon Graphics Octane2 computer using the programs MOSFLM (Leslie, 1990) and SCALA (CCP4, 1994).

A typical diffraction pattern of the MtCS crystal with 1oscillation range. The crystal diffracts to 2.8 Å resolution.

(23)

Summary of data-collection statistics.

X-ray wavelength (A ° ) 1.427

Space group P6₄22 or P6₂22

Unit-cell parameters (Å ) a = 129.74, b = 129.74, c = 156.77

Highest resolution shell (Å) 2.94–2.8

Asymmetric unit content 2 molecules

Total reflections measured 92610

Number of independent reflection 19341

Completeness (%) 97.9 (97.9)

Rmerge (%) 5.6 (16.5)

Values in parentheses are for the highest resolution shell (2.94–2.8 Å).

(24)

Aplicações

1) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da corismato sintase de

Mycobacterium tuberculosis (Dias et al., 2004). A partir dos dados de difração de

raios X foi determinado os parâmetros da cela unitária. a = 129,74 Å

b = 129,74 Å c = 156,77 Å

Grupo espacial: P6₄22 ou P6₂22 MW = 41,800 kDa

Para cela hexagonal: V_cell= a.b.c.sen ()

V_cell = 129,74. 129,74 . 156,77. sen(120o_{) = 2.285.290,31 Å}3

(25)

Para determinarmos o conteúdo da unidade assimétrica, calcularemos o volume de Matthews para diferentes possibilidades de unidade assimétrica e verificaremos qual valor fica mais próximo da faixa de 1,7 a 3,5 Å3_{/Da, como segue:}

Z V_M(Å3_/Da) 1 54,67 6 9,11 12 4,56 18 3,04 24 2,28 30 1,82 25 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

MW

Z

V

_M cell

.



(26)

Os valores dentro da caixa estão na faixa prevista por Matthews, contudo sabemos que o grupo espacial é hexagonal primitivo, o que significa que temos 6 unidades assimétricas, assim esperamos um número de moléculas múltiplo de 6, ou seja, 12, 18, 24, 30.., sendo o valor mais provável 24. Assim temos:

V_protein = 1,23/V_M = 0,5395 e V_solvent = 0,4605 Z V_M(Å3_/Da) 1 54,67 6 9,11 12 4,56 18 3,04 24 2,28 30 1,82 26 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

(27)

(28)

C. roseum seeds were ground to a fine powder in a coffee mill. The powder was stirred with 0.15 M NaCl [1:10(w:v)] at room temperature for 4 h and then centrifuged at 10 000g for 20 min at 278 K. The resultant supernatant was applied onto a Sepharose-4B-mannose column (0.5 10 cm) equilibrated with 0.15 M NaCl containing 5 mMCaCl2 and 5 mMMnCl2. After removing unbound material, the lectin was eluted with 0.1 M glycine, 0.15 M NaCl pH 2.6. Purified CRL was monitored by SDS–PAGE as described by Laemmli (1970) and was used to perform further characterization. N-terminal sequence analysis was performed using an Applied Biosystems pulsed-liquid phase 477A protein sequencer with a 120A PTH aminoacid analyzer, following the method described by the manufacturer.

Fonte: Cavada BS, Marinho ES, Souza EP, Benevides RG, Delatorre P, Souza LA, Nascimento KS, Sampaio AH, Moreno FB, Rustiguel JK, Canduri F, de Azevedo WF Jr, Debray H. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006; 1(62): 235-7.

(29)

(30)

The lyophilized purified CRL was dissolved to a concentration of 12 mg ml-1

in 20 mM Tris–HCl pH 8.0 containing 0.5 mM CaCl₂ and MnCl₂ and used for crystallization trials. Crystallization screening by the hanging-drop vapour-diffusion method was performed in Linbro plates at 293 K using Hampton Research Crystal Screens I and II, SaltRx, Index and PEG/Ion Screens (Hampton Research, Aliso Viejo, CA, USA). The drops were composed of equal volumes (2 ml) of protein solution and reservoir solution and were equilibrated against 500 ml reservoir solution. An example of a crystal of CRL is shown in Fig. 1(a).

(31)

A crystal was transferred to a cryoprotectant solution consisting of 30% glycerol in the crystallization reservoir solution. Data were collected at 1.42 A ° wavelength at a synchrotron-radiation source (beamline MX1, CPr station, Laboratório Nacional de LuzSíncrotron– LNLS, Campinas, Brazil) using a MAR Research CCD imaging plate at a crystal-to-detector distance of 70 mm. A set of 100 1 oscillation images was recorded (an image is shown in Fig. 1b). Diffraction data were indexed, integrated and scaled using MOSFLM and SCALA (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994).

(32)

Summary of data-collection statistics for CRL.

Space group P2₁2₁2₁

Unit-cell parameters (A° ) a = 67.82, b = 103.14, c = 122.09

Resolution limits (A ° ) 34.92–1.77

Asymmetric unit content 4 molecules

Total reflections measured 286361 Unique reflections measured 80568

Completeness (%) 97.00 (97.0)

Rmerge (%) 5.4 (32.5)

Values in parentheses are for the highest resolution shell (1.87–1.77 A ° ).

(33)

Aplicações

1) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da Lectina de Cymbosema

roseum seeds (Cavada et al., 2006). A partir dos dados de difração de raios X

foram determinados os parâmetros da cela unitária. a = 67,82 Å b = 103,14 Å c = 122,09 Å Grupo espacial: P2₁2₁2₁ MW = 25kDa V_cell = 67,82 . 103,14 . 122,09 = 854.014,03 Å3 33 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

(34)

Para determinarmos o conteúdo da unidade assimétrica calcularemos o volume de Matthews para diferentes possibilidades de unidade assimétrica e verificaremos qual valor fica mais próximo da faixa de 1,7 a 3,5 Å3_{/Da, como segue:}

Z V_M(Å3_/Da) 1 34,14 2 17,07 3 11,38 4 8,53 5 6,83 6 5,69 7 4,88 8 4,27 Z V_M(Å3_/Da) 9 3,79 10 3,41 11 3,10 12 2,85 13 2,63 14 2,44 15 2,28 16 2,14 Z V_M(Å3_/Da) 17 2,01 18 1,90 19 1,80 20 1,71 21 1,63 22 1,55 23 1,49 24 1,42 34 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

MW

Z

V

_M cell

.



(35)

Os valores dentro das caixas estão na faixa prevista por Matthews, contudo sabemos que o grupo espacial é ortorrômbico primitivo, o que significa que temos 4 unidades assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplo de 4, ou seja, 12, 16 ou 20, sendo o valor mais provável 16. Assim temos:

V_protein = 1,23/V_M = 0,575 e V_solvent = 0,425 Z V_M(Å3_/Da) 1 34,14 2 17,07 3 11,38 4 8,53 5 6,83 6 5,69 7 4,88 8 4,27 Z V_M(Å3_/Da) 9 3,79 10 3,41 11 3,10 12 2,85 13 2,63 14 2,44 15 2,28 16 2,14 Z V_M(Å3_/Da) 17 2,01 18 1,90 19 1,80 20 1,71 21 1,63 22 1,55 23 1,49 24 1,42 35 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

(36)

(37)

The pheA gene (Rv3838c) encoding prephenate dehydratase from M. tuberculosis was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) from genomic DNA. The forward

(5’-TGCATATGGTGCGTATCGCTTACCTCGGTCC- 3’) and reverse

(5’-ACAAGCTTTCATGCTTGCGCCCCCTGGTCG- 3’) synthetic oligonucleotide primers were based on the amino-terminal coding and carboxyterminal non-coding strands of the pheA gene (Cole et al., 1998) containing 50 NdeI and 30 HindIII restriction sites, respectively. The PCR product was cloned into pET-23a(+) expression vector (Novagen) and the recombinant plasmid was sequenced to confirm the identity of the cloned DNA fragment and to ensure that no mutations had been introduced by the PCR amplification step. ...

Fonte: Vivan AL, Dias MVB, Schneider CZ, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006; F62: 357-60.

(38)

The supernatant was loaded onto a Q-Sepharose Fast Flow (2.6 8.2 cm) anion-exchange column (GE Healthcare) and fractionated using a 0.0–0.5 M NaCl linear gradient. The fractions were pooled and ammonium sulfate was added to a final concentration of 0.6 M; the mixture was then loaded onto a HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HP hydrophobic interaction column (GE Healthcare). The active fractions were loaded onto a Mono Q HR 16/10 anion-exchange column (GE Healthcare) and eluted using a 0.0–0.5 M NaCl linear gradient.

(39)

Crystallization trials were initially performed by the hanging-drop vapour-diffusion method at 292 K. Hampton Crystal Screen and Crystal Screen 2 kits (Hampton Research) were used to determine the initial crystallization conditions. Hanging drops were prepared by mixing 1 ml of a solution containing 10 mg ml1 recombinant protein in 50 mM Tris–HCl pH 7.8 and 1 ml reservoir solution. Crystals were obtained with a reservoir solution containing 0.1 M HEPES pH 7.5, 28%(v/v) PEG 400, 0.2 M calcium chloride.

(40)

The data set for recombinant M. tuberculosis prephenate dehydratase was collected at a wavelength of 1.438 Å using a synchrotronradiation source (Station MX1, LNLS, Campinas) and a MAR CCD detector. The crystal was flash-frozen at 100 K in liquid nitrogen. The oscillation range used was 0.8, the crystal-to-detector distance was 150 mm and the exposure time was 90 s. The crystal diffracted to 3.2 Å resolution. All data were processed and scaled using the programs MOSFLM and SCALA from the CCP4 program suite (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994).

(41)

Summary of data-collection statistics for M. tuberculosis prephenate dehydratase

Temperature (K) 100

Resolution range (A° ) 65.94–3.20 (3.37–3.20)

Total/unique reflections 71611/23215

Space group I222 or I212121

Matthews coefficient (Å3 _Da-1₎ _2.7 Unit-cell parameters a (Å) 98.26 b (Å ) 133.22 c (Å ) 225.01 Mosaicity () 0.43 Data completeness (%) 94.4 (97.2) Average I/(I) 5.7 (1.5) Multiplicity 3.1 (3.0) Rmerge(%) 0.120 (0.434) 41 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

(42)

Fonte: Vivan AL, Dias MVB, Schneider CZ, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. F62, 357-360, 2006

Aplicações

1) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da MtPD. A partir dos dados de difração de raios X foi determinado que os parâmetros da cela unitária.

a = 98,26 Å b = 133,22 Å c = 225,01 Å

Grupo espacial: I222 ou I212121 MW = 33,6 kDa

(43)

Para determinarmos o conteúdo da unidade assimétrica calcularemos o volume de Matthews para diferentes possibilidades de unidade assimétrica e verificaremos qual valor fica mais próximo da faixa de 1,7 a 3,5 Å3_{/Da, como segue:}

Z V_M(Å3_/Da) 1 87,66 8 10,96 16 5,48 24 3,65 32 2,74 40 2,19 48 1,83 43 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

MW

Z

V

_M cell

.



(44)

Os valores dentro das caixas estão na faixa prevista por Matthews, contudo sabemos que o grupo espacial é ortorrômbico com centragem I, o que significa que temos 16 unidades assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplo de 16, ou seja, 16, 32,…, sendo o valor mais provável 32. Assim temos:

V_protein = 1,23/V_M = 0,4489 e V_solvent = 0,5511 Z V_M(Å3_/Da) 1 87,66 8 10,96 16 5,48 24 3,65 32 2,74 40 2,19 48 1,83 44 Artigos Científicos Sobre Cristalização de Proteínas

(45)

Artigo indicado

Segue um artigo de revisão sobre cristalografia de proteínas:

Canduri F, de Azevedo WF. Protein crystallography in drug discovery. Curr Drug Targets. 2008; 9(12):1048-53.

45 Material Adicional (Artigo Indicado)

(46)

Canduri F, de Azevedo WF. Protein crystallography in drug discovery. Curr Drug Targets. 2008; 9(12):1048-53.

Cavada BS, Marinho ES, Souza EP, Benevides RG, Delatorre P, Souza LA, Nascimento KS, Sampaio AH, Moreno FB, Rustiguel JK, Canduri F, de Azevedo WF Jr, Debray H. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006; 1(62): 235-7.

Dias MV, Ely F, Canduri F, Pereira JH, Frazzon J, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of chorismate synthase from Mycobacterium tuberculosis. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60(Pt 11):2003-5.

Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer-Verlag.

Moreno FBMB, Delatorre P, Freitas BT, Rocha BAM, Souza EP, Facó F, Canduri F, Cardoso ALH, Freire VN, Lima Filho JL, Sampaio AH, Calvete JJ, De Azevedo Jr. WF, Cavada BS. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the lectin from Canavalia gladiata seed. Acta Cryst. 2004; D60: 1493-5.

Moreno FBMB, Martil DE, Cavada BS, de Azevedo Jr. WF. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of an anti-H(O) lectin from Lotus tetragonolobus seeds. Acta Cryst. 2006; F62: 680-3.

Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2nd _{ed.San Diego: Academic Press.}

Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons. Vivan AL, Dias MVB, Schneider CZ, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2006; F62: 357-60.

Última atualização em: 12 de abril de 2015.

46 Referências

(47)

Calcule o volume de Matthews (V_M), a fração de volume ocupada por proteína (V_protein), a fração de volume de solvente no cristal (V_solvent) e o número de moléculas de

proteína na cela unitária para os cristais descritos nos seguintes artigos:

1) Moreno FBMB, Martil DE, Cavada BS, de Azevedo Jr. WF. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of an anti-H(O) lectin from Lotus tetragonolobus seeds. Acta Cryst. 2006; F62: 680-3.

2) Moreno FBMB, Delatorre P, Freitas BT, Rocha BAM, Souza EP, Facó F, Canduri F, Cardoso ALH, Freire VN, Lima Filho JL, Sampaio AH, Calvete JJ, De Azevedo Jr. WF, Cavada BS. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the lectin from Canavalia gladiata seed. Acta Cryst. 2004; D60: 1493-5.

Indique o desenvolvimento do cálculo, como mostrado na aula de hoje, onde é calculado o V_M para diversos valores de Z e selecionado aquele que se encontra dentro da faixa esperada de V_M de 1,7 a 3,5 Å3_/Da.

Data da entrega: 23 de abril de 2015. 47