Metalotioneínas em Bílis de Peixe
Aluno: Bernardo Cerqueira Paranhos Tuton Pereira Orientadora: Tatiana D. Saint’Pierre
Co-orientadora: Rachel Ann Hauser-Davis
1 – Introdução
A relação direta entre os níveis de metais no ambiente e concentrações de metalotioneínas (MTs) em tecidos de animais permite que estas proteínas sejam utilizadas em estudos para verificar exposição a metais pesados. MTs em peixes são geralmente analisadas no fígado, porém a bílis oferece uma forma alternativa de analisar diversos contaminantes, pois o fígado e bílis estão intrinsecamente ligados: o fígado desintoxica o organismo de compostos exógenos e a bílis excreta estes do corpo.
2 - Objetivos
Verificar se MTs estão presentes na bílis em diferentes espécies de peixes e investigar se os seus níveis podem ser, como no fígado, usados para determinar exposição a metais, tanto no campo ou em laboratório, através de dois métodos independentes: espectrofotometria e SDS-PAGE 1D e 2D.
3 - Metodologia
Tilápias (Oreochromis niloticus) foram obtidas de dois locais contaminados: a Lagoa de Jacarepaguá (n = 7) e a Lagoa Rodrigo de Freitas (n = 4), pertencentes à Baía de Guanabara. Ambos são zonas de pesca de importância econômica e social, mas recebem do ambiente impactos diários, como esgotos domésticos não-tratados e efluentes industriais.
Devido a esses impactos, a baía é uma área impactada mostrando os efeitos da matéria orgânica em excesso, tais como óleos e vários outros compostos, entre eles os metais. A Lagoa Rodrigo de Freitas Lagoa possui uma contaminação por metal maior do que a de Jacarepaguá, uma vez que que recebe descargas mais urbanas, apresentando valores de cobre de até a 2 mg mL-1 [1]. Tilápias também foram coletadas em um terceiro local (n = 10), Silva Jardim, uma área referência de aquicultura comercial, em que os peixes são criados especificamente para o consumo humano em tanques sob condições controladas. Bílis a partir de duas outras espécies foram também analisadas, mullet (n = 4) (Geophagus brasiliensis) (Mugil liza) e acará(n = 3).
Os peixes foram sacrificados por ruptura da medula espinhal e as bílis coletadas por punção direta da vesícula biliar e imediatamente armazenadas a -80 oC em frascos eppendorf estéreis até as análises.
Para o experimento de exposição em laboratório, os peixes foram mantidos em tanques contendo 500 L de água a pH 7,0 Sulfato de cobre (CuSO4 · 5H2O) foi dissolvido na água a uma concentração final de 2 mg mL-1 de Cu. Esta concentração foi escolhido uma vez que é o valor máximo observado na contaminada Lagoa Rodrigo de Freitas [1] e porque é o limite máximo permitido para este elemento pela lei governamental brasileira CONAMA [2].
(phenylmethylsulphonylfluoride) 0,5 mM como um agente antiproteolítico e ercaptoetanol-%
0,01 como um agente redutor. Eles foram, então, centrifugado a 20.000 × g durante 1 h à 4 oC.
O sobrenadante foi então cuidadosamente separado do sedimento e transferido para novos frascos eppendorf estéreis e, então, aquecido a 70 oC por 10 min. Outro passo de centrifugação foi conduzida a 20.000× g durante 30 min à 4 oC e os sobrenadantes finalmente contendo somente o MTS foram separadas e congeladas a -80 oC até à análise.
As amostras foram então analisadas por dois métodos independentes:
a) Ensaio espectofotométrico (Reação de Ellman): O sobrenadante contendo as MT foi tratado com HCl 1 mol L-1 contendo EDTA 4 mmol L-1 e NaCl 2 mol L-1 contendo 0,43 mmol L-1 de DTNB (5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico) tamponado com 0,2 mol L-1 de tampão fosfato de sódio, pH 8,0 [2] (confuso, tava tudo na mesma solução?), e incubadas durante 30 min. As amostras foram então centrifugadas a 3000 × g durante 5 min e a absorvância medida em 412 nm. As concentrações de MT foram estimadas utilizando glutationa reduzida (GSH) como padrão analítico para a curva. O teor de MT foi então estimado assumindo que a relação 1 mol MT = 20 mol de GSH, como descrito por Kagi para peixes [4]. Este método é amplamente usado pois possui baixo custo, alta reprodutibilidade e alta sensibilidade.
b) Eletroforese em gel SDS-PAGE 1D e 2D: A proteína total presente nas amostras foi quantificada pelo método de Lowry, modificado por Peterson [5] utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão. Dois tipos de separações 1D foram conduzidos, em sódio a 15%
géis de dodecil sulfato de poliacrilamida SDS-PAGE), seguindo o protocolo de Laemmli, e em 16,5% de baixo peso molecular SDS-PAGE géis, seguindo o protocolo de Schagger e Vonjagow, que utiliza tricina em vez de glicina para uma maior eficiência na separação de pequenas proteínas (<10 kDa). Três replicatas de cada amostra (12 µg em cada poço do gel) foram realizadas, para assegurar a reprodutibilidade do método. Os géis foram corados tanto por coloração com prata, descrito por Heukeshoven e Dernick [6], como por Coomassie Blue G-250. Separações 2D também foram conduzidas. A focalização isoelétrica foi realizada em uma unidade de focalização isoelétrica Ettan IPGPhor 3 (GE Healthcare®). Os pesos moleculares das bandas e dos pontos protéicos foram determinados usando padrões de peso molecular Precision Plus da Biorad. Os géis foram escaneados usando um scanner ImageScanner II (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). O software Image Master 2D Platinum-6 (GeneBio, Genebra, Suíça) foi utilizado para as análises de imagem dos géis.
4 – Resultados e discussão
A determinação MT por espectrofotometria mostrou que as MT estão de fato presentes em bílis da tilápia. As amostras do local de referência apresentaram valores muito baixos, enquanto as amostras da Lagoa de Jacarepaguá apresentaram valores mais elevados.
Espécimes expostos no laboratório apresentaram os maiores valores de MT. As concentrações observadas utilizando a reação Ellman foram concordantes com as obtidas por eletroforese 1D em gel SDS-PAGE, descrita a seguir.
Figura 1: Valores de MT na bílis de tilápias de três locais diferentes (Lagoa de Jacarépagua, local de referência e amostras expostas em laboratório).
1D e 2D SDS-PAGE Géis
Ficou muito claro a presença de bandas no que se concluiu ser o nível de moléculas de tamanho molecular de 14Kda confirmando sua identidade como bandas de MT, já que seu peso molecular é conhecido e relatado na literatura.
Ao comparar as amostras dos diferentes locais – Lagoa de Jacarepaguá e do local de referência - a mesma tendência vista no ensaio espectrofotométrico MT foi observada nos géis: amostras a partir do local de referência mostrou bandas extremamente leves, às vezes não visíveis, enquanto as amostras de Jacarepaguá Lagoa apresentaram bandas mais visíveis.
As amostras a partir da experiência de exposição ao cobre 2 apresentaram as bandas mais visíveis e expressas, como indicado na fig. 2.
Fig. 2. Gel que mostra os diferentes intensides nas bandas de metalotioneína para amostras
pontos mais intensos. Estes spots protéicos estão todos na faixa de 14 kDa, confirmando novamente a sua identidade como MT.
Fig. 3 Separação 2D de MT da área de referência (A) e da Lagoa de Jacarepaguá (B).
4 – Conclusões
A presença de MT em bílis de peixe foi verificada por cada um dos métodos independentes. Isto, juntamente com a mesma tendência anteriormente observada no fígado dessa espécie, provou que os níveis de MT são mais elevados em organismos expostos a metais. Este trabalho indica que a bílis de peixe é um ótimo candidato a biomarcador em casos de exposição a metais, pois a excreção biliar uma matriz de acesso mais fácil que o fígado e que não demanda o sacrifício do animal devido à possibilidade de canulação hepática para extração da bílis.
Produções científicas obtidas longo deste trabalho
Pôster entitulado “Bile and liver metallothionein comparisons in fish sublethally exposed to copper: is bile analysis more adequate regarding metal exposure?” que será exposto no - SETAC North America 33rd Annual Meeting, em Novembro de 2012.
Em paralelo também foram conduzidos experimentos bioanalíticos similares ao descrito neste resumo, em parceria com o Departamento de Psicologia da PUC-Rio, com modelos animais de ansiedade. Estes trabalhos culminaram no pôster entitulado “Preliminary assessment of diferential protein expression in rats displaying high and low conditioned freezing”, apresentado na II Reunião Anual do IBNeC, 2011.
Referências
1 - INEA, 2011. State Institute of the Environment Rio de Janeiro - Water Quality of Coastal Lagoons in the Rio de Janeiro Area. . INEA.
2 - CONAMA, 2003. CONAMA.
3 - Erk, M., Ivankovi, D., Raspor, B., Pavicic, J., Evaluation of different purification procedures for the electrochemical quantification of mussel metallothioneins. Talanta 57, 1211–1218, 2002.
4 - Kagi, J.H.R., Overview of metallothionein. In: Rierdan, J.F., Vallee, B.L. (Eds.), Methods of Enzymology: Metallobiochemistry: Metallothionein and Related Molecules. Academic Press, San Diego, pp. 613–626, 1991.
5 - Peterson, G.L., Review of the foline phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall. Analytical Biochemistry 100, 201–220, 1979.
6 - Heukeshoven, J., Dernick, R., 1985. Simplified Method for Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels and the Mechanism of Silver Staining. Electrophoresis 6, 103-112.
