Controle de Xanthomonas citri subsp. citri com cobre orgânico

Dr. Galdino Andrade – UEL

E-mail: andradeg@uel.br

Controle de Xanthomonas citri

subsp. citri com cobre orgânico

Laboratório de Ecologia Microbiana

LEM

www2.uel.br/laboratorios/ecologiamicrobiana E-mail: andradeg@uel.br

Problemas

• Queda de rentabilidade

• Custo em alta (insumos)

• Adubo 120% de alta

• Mão de obra

• Dólar em baixa

• Doença: greening

Boas práticas de produção

• Fairtrade: Alemanha

• Garante que a laranja foi produzida e

comercializada com os critérios que

preservam critérios trabalhistas, sociais e

ambientais

• Agrega valor ao produto

Cancro cítrico

• Xanthomonas citri pv. citri

• Gram(-), aeróbio, flagelo polar, viscosidade, 20 a 39ºC

• Registro: 1827-1831: Índia ; 1957: Brasil

• Reservatório natural: Órgãos infectados, plantas

não-hospedeiras e solo

• Disseminação:

• Distâncias curtas: chuvas e ventos

• Distâncias longas: órgãos infectados e material contaminado

• Larva minadora dos citros (Phyllocnistis citrella)

• Tecidos jovens  aberturas naturais ou ferimentos

• Folhas: até 40 dias

Cancro cítrico

• Programa de manejo integrado prevenção e controle

do cancro cítrico década de 80 (Leite Júnior, 2000).

• Produção mudas sadias

• Cultivares mais resistentes

• Quebra ventos arbóreos (Casuarina sp)

• Controle larva mineradora

• Aplicações regulares com bactericidas cúpricos

• Inspeção

Bactericidas a base de cobre

• oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, hidróxido de cobre e

óxido cuproso.

• Protege o tecido vegetal

• Dimunuí população de bactérias na folha

• Várias aplicações

• A época e o número de aplicações vários fatores:

• susceptibilidade cultivar, idade da planta, condições

ambientais e adoção de outras medidas de controle

• Uso prolongado seleção de bactérias resistentes

X. citri pv. citri

X. citri pv. citri

X. citri pv. citri => Cancro cítrico

X. citri pv. citri => Cancro cítrico

X. citri pv. citri + EPS

CONTROLE QUÍMICO X CONTROLE BIOLÓGICO

Contaminação por metal pesado O cobre reduz a população

bacteriana na superfície das folhas

O controle químico leva níveis de contaminação na cadeia trófica nem sempre aceitáveis

Exigências dos consumidores por produtos agrícolas livres de resíduos tóxicos.

A procura de microrganismos com potencial de uso como agente de

biocontrole, ou a obtenção de compostos produzidos por estes microrganismos, é uma das alternativas atualmente muito estudadas pela comunidade científica para o controle de patógenos.

- Avaliação da sensibilidade da Xcc 306 a diferentes concentrações de cloreto de cobre

- Avaliação da concentração de cobre remanescentes nos compostos antibióticos

- Avaliação da atividade antibiótica in vitro Disco difusão

Concentração inibitória mínima

- Avaliação dos compostos antibióticos no controle da

formação de lesão de cancro cítrico em casa de vegetação - Avaliação ultraestrutural (in vitro)

Microscopia eletrônica de varredura Microscopia eletrônica de transmissão

Resultados

Resultados

Resultados

Conclusão

A fração F3 demonstrou alta atividade antibiótica contra a bactéria

Xcc 306 in vitro.

Degradação ou inibição de produção de EPS em cultura de Xcc 306 tratados com a fração F3.

Alto potencial de controle da formação de lesão de cancro cítrico em folhas de laranja.

No entanto, mais estudos são necessários para determinar as moléculas envolvidas na atividade antibiótica, a ultraestrutura da infecção por Xcc 306 tratadas com frações mais purificadas ou substâncias puras.

Avaliação do numero de lesões de cancro cítrico em folhas de

laranja.

preventivo e curativo

Três concentrações [1, 10 e 100 µg mL-1_]

Dois regimes de tratamentos (preventivo e curativo)

Seis diferentes tempos (0, 6, 12, 24, 48 e 120 h)

Avaliação ultraestrutural da infecção

por Xcc 306 em folhas de laranja.

Resultados

Avaliação da atividade antibiótica de frações semi-purificadas

Disco difusão

Table 1: Antibiotic activity against Xcc 306 by diffusion agar method of nine fractions obtained from

purification of F3 fraction (Oliveira et al., 2011). The fractions obtained from F3 were purified by vacuum liquid chromatography using nine mobile phases with crescent polarity (F3a hexane [100%], F3b hexane/dichloromethane [50:50], F3c dichloromethane [100%], F3d dichloromethane/ethyl acetate [50:50], F3e ethyl acetate [100%], F3f ethyl acetate/methanol [50:50], F3g methanol [100], F3h methanol/water [50:50], and F3i water [100%].

Fractions Concentration (μg) 100 1000 F3 10.5 ± 0.5 26.5 ± 0.5 F3a _- -F3b _- -F3c _- -F3d _{35 ± 0.5 42.5 ± 0.5} F3e _- -F3f _- -F3g _- -F3h _- -F3i _- -NC _-

-F3 was considered as positive control and dichloromethane or chloroform solvent was considered as negative one (NC). The data represent the mean of four replicates and its respective standard

Controle do meio e ação antibiótica da F3d Crescimento bacteriano [1] = 400 μg mL-1 [2] = 200 μg mL-1 [3] = 100 μg mL-1 [4] = 50 μg mL-1 [5] = 25 μg mL-1 [6] = 12.5 μg mL-1 [7] = 6.25 μg mL-1 [8] = 3.12 μg mL-1 [9] = 1.56 μg mL-1 [10] = 0.78 μg mL-1

Resultados

Avaliação do número de lesões de cancro cítrico em folhas de

laranja.

Resultados

Resultados M.E varredura

Controles

Resultados 24 h

Preventivo Curativo

Controle positivo

Figura 3

Resultados 48 h

Preventivo Curativo

Controle positivo

Figura 3

Resultados 120 h

Preventivo Curativo

Controle positivo

Figura 3

Resultados M.E transmissão

Controles

Resultados

Preventivo

Figura 5

Figura 6

Resultados

Curativo

Diferente dos resultados obtidos por Oliveira et al. (2011) onde a F3 apresentou alto controle da formação de lesão de cancro cítrico. Neste

estudo, a F3d purificada demonstrou aumento na atividade antibiótica, além de não causar fitotoxicidade nas folhas de laranja testadas.

Com relação ao melhor controle observado no tratamento preventivo, sugere que além da ação imediata do composto antibiótico, outros compostos podem estar envolvidos no mecanismo de resistência na planta.

Em varredura foi observado uma grande redução e alteração no EPS.

Considerando que o EPS esta diretamente relacionado com a dispersão e sobrevivência da Xcc, a redução do número de lesão de cancro cítrico também deve estar relacionada a ausência e/ou alteração do EPS.

Em transmissão, foi confirmado a redução do inóculo da Xcc 306 além da redução do EPS no mesofilo da folha de laranja. No entanto, quando

comparado as plantas controle positivo com as tratadas (preventivo e

curativo) foi observado que as células do mesofilo das folhas de laranja não apresentaram nenhuma alteração morfologia ou desarranjo da parede celular, confirmando a baixa ou a ausência de fitotoxicidade da F3d.

O fato de ter sido encontrados a Xcc 306 lisadas ou morfologicamente

alteradas dentro do mesofilo foliar de laranja, sugere que a F3d apresentou um certa capacidade de penetração no interior da folha e atividade antibiótica.

FD = 1000 µg F3 = 500 µg F3d = 100 µg

F3d.3 = 100 µg F3d.3.4 = 30 µg F3d.3.4.5 = 30 µg

21,5 23,5

42 39 67

• A doença Huanglongbing (HLB), é considerada a mais importante e destrutiva doença da citricultura mundial .

• O agente causal da doença HLB, são bactérias Gram-negativas classificadas como α-Proteobacteria, da ordem Rhizobiales e família Rhizobiaceae, denominadas de Candidatus Liberibacter spp.

FONTE: Tanaka et al. (2007)

• Nos países asiáticos o HLB está associado à presença da bactéria Ca. Liberibacter asiaticus.

• No continente Africano, o HLB está associado a Ca. Liberibacter africanus. • Nas Américas ocorrem Ca. Liberibacter americanus e Ca. Liberibacter

asiaticus.

Diaphorina citri Trioza erytreae

• Morte econômica em curto espaço de tempo. • Queda acentuada de folhas e frutos.

• Morte de ponteiros.

• Diminuição do tamanho dos frutos, assimetria, aumento da acidez • Sementes abortadas com coloração marrom.

• Menor desenvolvimento geral em relação às sadias

Fonte: (FUNDECITRUS, 2013)

• Moléculas elicitoras (biótica ou abiótica) podem ativar a resistência sistêmica, protegendo os tecidos da planta.

• Aumento de atividade de proteínas relacionadas à patogênese (PR), sendo mediada por um processo dependente do ácido salicílico.

• β-1,3 glucanases (PR-2), enzimas hidrolíticas capazes de inibir o crescimento de patógenos.

Bioactive Organocopper Compound

from Pseudomonas aeruginosa Inhibits the Growth

of Xanthomonas citri subsp. Citri

Front. Microbiol., 09 February 2016

Objetivo

• O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da fração F4A análoga à fração F3D produzida através do metabolismo secundário de Pseudomonas

aeruginosa (cepa LV) no controle de Ca. Liberibacter asiaticus em plantas

Quantificação por PCR em tempo real da

população de Candidatus Liberibacter

asiaticus em plantas de laranja Valência

inoculadas com a bacteria e submetidas a

Ensaio em casa de vegetação

• Pulverização direta nas plantas, concentrações: 10 µg mL-1_{; 100 µg mL}-1 _{e 1000}

µg mL-1

• Sete replicatas biológicas/ Valência/ Limão cravo • blocos casualizados.

• Tratamento preventivo: aplicação sete dias antes da inoculação.

• Tratamento curativo: aplicação 30 dias após a inoculação.

I

NOCULAÇÃO

• Enxertia

• Dois segmentos de borbulhas infectadas • Plantas com sintomas/PCR positivas

Amostras de DNA

• O DNA total foi extraído após quatro meses e oito meses após a inoculação de acordo com o protocolo descrito por Murray e Thompson (1980).

• Confirmação de presença ou ausência de plantas infectadas com Ca. Liberibacter asiaticus (PCR convencinal)

RESULTADOS

R

- PCR

• Quatro meses após a inoculação, a aplicação de 100 µg mL-1 _{da fração F4A} apresentou um percentual de 14,2% de plantas positivas no tratamento preventivo e 0% no tratamento curativo

A

C

L

(Q-PCR)

• Primers e sonda específicos para Ca. Liberibacter asiaticus baseado no rDNA 16S (Li et al., 2006).

• Termociclador StepOne Plus (Applied Biosystems)/ FUNDECITRUS utilizando o sistema Taqman de detecção.

• Curva padrão construída a partir de plasmideos contendo o gene Ca. Liberibacter asiaticus.

• Análises estatísticas: Log/ teste de Dunnett

Avaliação da Resistência Sistêmica Adquirida

através da expressão do gene PR-2 (β-1,3

glucanase) em plantas de laranja tratadas com

a fração F4A

Ensaio em casa de vegetação

• Plantas de laranja Valência / três repetições biológicas

• Tratamentos : aplicação foliar da fração F4A nas concentrações de 10 µg mL-1_{, 100 µg mL}-1_{, 1000 µg mL}-1 _{e aplicação via solo de} acibenzolar-S-methyl (BION) na concentração de 200 mg por planta e água destilada como controle.

• Duas folhas por planta foram coletadas, 24h, 7 dias e 15 dias após a aplicação dos produtos.

Conclusão

• A fração utilizada no presente estudo já foi relatada por outros autores como um importante agente antimicrobiano frente a fitopatógenos (Oliveira et al, 2011; Lopes et al, 2012; Vasconcelos, 2009).

• Estes estudos já sugeriam que esta fração poderia atuar também como um indutor de resistência em plantas devido a sua composição.

• Plantas tratadas com 100 µg mL-1 _{da fração F4A expressaram nove vezes} mais o gene de resistência após 24h da aplicação, e ao sétimo dia as mesmas plantas apresentaram uma expressão 12,9 vezes maior.

• A população de Ca. Liberibacter asiaticus revelada por Q-PCR em plantas tratadas com 100 mg mL-1 _{após quatro meses de inoculação foi} significativamente reduzida quando comparada as plantas não tratadas (testemunhas).

• Estes resultados sugerem que o tratamento com esta dosagem pode atuar na redução bacteriana tanto por seu potencial indutor de resistência quanto por seu efeito antibacteriano

Universidade Estadual de Londrina – UEL

Laboratório de Ecologia Microbiana

– LEM