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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” – UNESP
INSTITUTO DE QUÉMICA DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NOS
MECANISMOS DE HOMEOSTASE DE COBRE EM
Xanthomonas citri
subsp.
citri
ELIANE CRISTINA DE FREITAS
2013
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ELIANE CRISTINA DE FREITAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NOS
MECANISMOS DE HOMEOSTASE DE COBRE EM
Xanthomonas citri
subsp.
citri
Tese apresentada ao Instituto de Química,
Universidade Estadual Paulista, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Maria Célia Bertolini
ARARAQUARA
2013
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DADOS CURRICULARES
1. DADOS PESSOAIS
Nome: Eliane Cristina de Freitas
Nascimento: 10 de abril de 1964
Nacionalidade: brasileira
Naturalidade: Araraquara - SP
Estado civil: solteira
Filiação: Waldecir de Freitas e Aide Dotti de Freitas
Profissão: Química
Documento de Identidade: 11.648.078-6
Cadastro de Pessoa Física: 081.331.868-89
Endereço Residencial: Rua Caetano Nigro, n° 694, Jardim Eldorado
CEP: 14802-450 – Araraquara, SP
Endereço profissional: Instituto de Química de Araraquara – UNESP
Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química
Rua Prof. Francisco Degni, n°55. CEP: 14800-900 – Araraquara, SP
2. FORMAÇÃO ACADÊMICA
Doutorado em Biotecnologia, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, área de
concentração Biotecnologia, Instituto de Química de Araraquara, UNESP, concluído em
setembro de 2013.
Mestrado em Biotecnologia, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, área de
concentração Biotecnologia, Instituto de Química de Araraquara, UNESP, concluído em
2002.
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Licenciada em Química, pelo Instituto de Química de Araraquara, UNESP, concluído
em 1987.
Bacharel em Química, pelo Instituto de Química de Araraquara, UNESP, concluído em
1986.
3. ATIVIDADES PROFISSIONAIS E DE PESQUISA
Química da Agroindústria Citrícola durante 21 anos, com trabalhos
técnico-administrativos em processos industriais, agrícolas, de pesquisas e gerenciamento.
FREITAS, E. C.; UCCI, A. P.; TEIXEIRA, E. C.; PEDROSO, G. A.; HILARIO, E.;
FERREIRA, H.; BERTOLINI, M. C. The short upstream ORF XAC3629 mediates
regulation of the copper inducible
copAB
operon in
Xanthomonas citri
subsp.
citri.Journal of Bacteriology
(submetido à publicação).
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Dedico este trabalho,
Aos meus queridos pais Waldecir e Aide, a minha
querida irmã Maristela, ao Raphael e ao Francisco, por
fazerem parte da minha vida, por estarem sempre por
perto, me apoiando, incentivando, sempre me ouvindo e
pelo imenso amor.
A Deus.
7
AGRADECIMENTOS
- Ao Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química e ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia do Instituto de Química da UNESP, pela oportunidade da
realização do curso de doutorado.
- A Profa. Dra. Maria Célia Bertolini, pela valiosa orientação, acolhimento, dedicação e
disponibilidade que permitiram a realização deste trabalho.
- A Dra. Fernanda Zanolli e a Dra. Ana Paula Felício pela amizade, sugestões,
discussões e ensinamentos durante o andamento desse projeto.
- Ao Dr. Franklin Belhau e ao Prof. Dr. Henrique Ferreira pelas discussões e
importantes sugestões durante o processo de qualificação.
- Ao Dr. José Belasque Júnior (Fundecitrus) pelo fornecimento das linhagens
bacterianas.
- Ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio-Campinas), particularmente a Dra.
Adriana Paes Leme, pelas análises de espectrometria de massa.
- Aos meus queridos amigos de Laboratório do IQ, Rodrigo, Thiago, Erick, Messias,
Fernanda Cupertino, Amanda, Monica, Flávia, Carol, Susi, Stela, Vivia e Heloisy, pela
alegria, força, união e grande oportunidade de convivência.
- Ao Tarcísio, pela imensa ajuda e amizade durante todos esses anos.
- A FAPESP, CNPq e CAPES pelo suporte financeiro.
- A todos os professores do Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química, pelo
respeito e confiança demonstrados quanto tivemos a oportunidade de trabalhar juntos.
8 RESUMO
Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é uma bactéria fitopatogênica causadora do cancro cítrico. Genes que codificam proteínas relacionadas à tolerância a cobre foram identificados no genoma de Xac (copA e copB) e estudos de caracterização molecular e bioquímica vem sendo realizados pelo nosso grupo. Compostos a base cobre são usados no controle de doenças bacterianas em plantas e a eficácia desse processo tem sido reduzida pelo aparecimento de linhagens resistentes a cobre. Inicialmente, linhagens de Xac isoladas em diferentes estados foram avaliadas em relação ao crescimento na presença de cobre e os resultados mostraram que as linhagens isoladas no sul do país possuem uma maior tolerância ao metal. Entretanto, análises de Southern Blot mostraram que algumas destas linhagens apresentaram um perfil de organização genômica das ORFs envolvidas na homeostase de cobre semelhante ao da linhagem controle. Os genes cromossomais copA e copB em Xac estão organizados em um operon cuja transcrição foi previamente mostrada ser induzida e específica ao cobre. A ORF XAC3629, objeto de estudo no presente trabalho, está localizada upstream ao operon copAB e codifica uma proteína homóloga a CopL de X. axonopodis pv. vesicatoria. Análises de expressão gênica mostraram que o transcrito da ORF também foi induzido por cobre e que a inativação da ORF pela inserção de um transposon levou a não expressão do operon copAB, sugerindo que a ORF controla a expressão do operon. Além disso, a linhagem mutante XAC3629::Tn foi incapaz de crescer na presença de cobre, mesmo em baixas concentrações. Uma linhagem de Xac, a qual expressa o produto da ORF fusionado à proteína TAP foi construída e tal linhagem mostrou que a proteína pode não ser sintetizada in vivo em Xac, sugerindo que a sequência nucleotídica que contém a ORF muito provavelmente atua como uma sequência regulatória. Visando compreender os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da tolerância ao cobre, fragmentos da região de 5'-flanqueadora do operon copAB
foram analisados por EMSA utilizando extratos proteicos enriquecidos para proteínas responsivas a cobre. Os resultados mostraram que a região contêm elementos de DNA regulatórios que são reconhecidos por proteínas ativadas por cobre e algumas dessas proteínas foram identificadas por espectrometria de massa. As proteínas identificadas fazem parte de diferentes sistemas que podem contribuir para a homeostase do cobre. As proteínas diferencialmente expressas na presença de cobre foram identificadas através de análises proteômicas acopladas à espectrometria de massas utilizando duas linhagens de Xac com graus de tolerância a cobre diferenciais. Os resultados mostraram que proteínas responsivas ao estresse oxidativo foram altamente induzidas na presença de cobre. Entretanto, proteínas relacionadas à patogenicidade e adaptação, assim como proteínas ligadas aos sistemas de dois componentes e outras proteínas foram também identificadas. Este trabalho permitiu o aprofundamento dos conhecimentos sobre homeostase e resistência a cobre em Xac. O conhecimento das proteínas sensoras, responsivas ao metal, seus genes-alvo e dos fatores que influenciam suas especificidades podem ajudar na compreensão dos mecanismos de resposta ao cobre nos organismos procariotos, entre os quais se encontram as bactérias fitopatogênicas.
Palavras-Chave: Xanthomonas citri subsp. citri, cobre, tolerância, resistência, expressão gênica, proteínas.
9 ABSTRACT
Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a plant pathogen that causes citrus canker. Genes encoding proteins related to tolerance to copper have been identified in the genome of Xac
(copA and copB) and studies of molecular and biochemical characterization has been performed by our group. Copper-based compounds are used in the control of bacterial diseases in plants and the effectiveness of this process has been limited by the appearance of strains resistant to copper. Initially, Xac strains isolated in different States of the country were evaluated for growth in the presence of copper. The results showed that the strains isolated in the South have the higher tolerance to the metal. However, Southern blot analysis showed that some strains exhibited an identical profile in the genomic organization of ORFs involved in copper homeostasis when compared to the control strain (Xac, strain 306). The chromosomal genes
copA and copB in Xac are organized in an operon whose transcription was previously shown to be induced and specific to copper. The ORF XAC3629, object of study in this work, is located upstream to copAB operon and encodes a protein homologous to CopL of X. axonopodis pv. vesicatoria. Gene expression analysis showed that the transcript of the ORF was also induced by copper and inactivation of the ORF by insertion of a transposon led to no expression of the operon copAB, suggesting that the ORF controls the expression of the operon. Furthermore, the XAC3629::Tn mutant was unable to grow in the presence of copper, even at low concentrations. A Xac strain, which expresses the ORF product fused to the protein TAP was constructed and the results showed that the XAC3629 protein may not be synthesized in vivo in Xac, suggesting that the nucleotide sequence containing the ORF is likely a regulatory sequence. To understand the molecular mechanisms involved in the regulation of tolerance to copper, fragments of the 5'-flanking region of the operon copAB were analyzed by EMSA using protein extracts enriched for proteins responsive to copper. The results showed that the region contains regulatory DNA elements, which are recognized by proteins activated by copper and some of these proteins were identified by mass spectrometry. The proteins identified are part of different systems, which can contribute to copper homeostasis. Proteins differentially expressed in the presence of copper were identified by proteomics analyses coupled to mass spectrometry using two strains of Xac with different degrees of tolerance to copper. The results showed that oxidative stress responsive proteins were highly induced in the presence of copper. However, proteins related to pathogenicity and adaptation, as well as proteins belonging to two-component systems and other proteins were also identified. This work led to a better knowledge about copper homeostasis and resistance in Xac. The knowledge of sensor proteins, responsive to the metal, its target genes and the factors that influence their specificities may help in the understanding the mechanisms of response to copper in prokaryotic organisms, including the phytopathogenic bacteria.
Key-words: Xanthomonas citri subsp. citri, copper, tolerance, resistance, gene expression, proteins.
10 ABREVIATURAS
°C graus Celsius
µFa micro Faraday
µg microgramas
µL microlitros
µM micromolar
ƿM picoMol
2D duas dimensões
2D-PAGE eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida contendo SDS
ACN acetonitrila
ATP adenosina trifosfato
BSA soroalbumina bovina
cpm cintilações por minuto
C-terminal região carboxi-terminal da proteína
DO densidade ótica
dATP desoxiadenosina trifosfato
ddNTP didesoxinucleosídeos trifosfatados
DEPC dietil pirocarbonato
DNA ácido desoxirobonucléico
dNTP desoxiribonucleosídeos 5’-trifosfatados (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)
dpi dots per inch
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
ESI electrospray ionization
HEPES ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N´-2-etanossulfônico
IAA iodoacetamida
IEF isoeletric focalization
kb quilobase – 1 kb equivale a 1000 pares de bases
kDa kilodalton
LC cromatografia liquida
M molar
mA miliAmpéres
mg miligramas
mL mililitros
mM milimolar
11
MM massa molecular
MOPS ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico
MS espectrometria de massas
MS/MS espectrometria de massas em sequência
ng nanogramas
nm nanômetros
N-terminal região amino terminal da proteína
ORF Open Reading Frame
pb pares de bases
PBS salina tamponada com fosfato
PCR Polimerase Chain Reaction
pI ponto Isoelétrico de proteínas
PM peso molecular
PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonil
pv. patovar
Q quadrupole
rDNA DNA que codifica o RNA ribossômico
RNA ácido ribonucléico
RNAse ribonuclease pancreática A
rpm rotações por minuto
rRNA RNA ribossômico
SDS dodecilsulfato de sódio
SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
spp. espécie específica
SSPE saline sodium phosphate - EDTA
subsp. subespécie
TAE tampão Tris-acetato-EDTA
TBE tampão Tris-borato-EDTA
TCA ácido tricloroacético
TE tampão Tris-EDTA
TEMED tetrametiletilenodiamina
TOF time of flight
Tris hidroximetilaminometano
U unidade enzimática
UV ultravioleta região
V volts
12 SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 15
1. Aspectos gerais da citricultura 17
2. Cancro cítrico 18
3. Mecanismos de homeostase e resistência a cobre nos diferentes organismos 21
3.1. Os reguladores transcricionais responsivos a cobre 28
3.1.1. CueR, ativador de transcrição de um componente em proteobacterias 29
3.1.2. CusRS como um sistema de dois componentes 29
3.1.3. ComR, regulador semelhante a TetR, controla a aquisição de cobre em E. coli 31
3.1.4. CopY como repressor em bactérias Gram-positivas 31
3.1.5. Repressores semelhantes a CsoR são comuns em procariotos 32
3.1.6. Regulação pós-transcricional responsiva a cobre em 33
Rhodobacter capsulatus 4. Mecanismos de homeostase e resistência a cobre em fitopatógenos 33
OBJETIVOS 39
MATERIAIS E MÉTODOS 41
1. Linhagens de Xac e condições de estocagem 42
2. Avaliação de tolerância a cobre de diferentes linhagens de Xac 42
2.1. Avaliação do crescimento de células mutantes na presença de cobre 44
3. Confirmação dos isolados por PCR 44
4. Análise do DNA genômico de linhagens de Xac por Southern Blot 45
4.1. Análise por Southern blot 45
4.1.1. Pré-hibridização, hibridização e a lavagem da membrana 46
4.1.2. Preparo e purificação das sondas radioativas 46
4.1.3. Amplificação por PCR da XAC3629 47
5. Análise da expressão gênica na presença de cobre 47
5.1. Extração e análise de RNA total 48
5.2. Ensaio de Northern blot 48
13
6. Análise da região upstream ao operon copAB por EMSA 49
6.1. Preparo e fracionamento do extrato celular bruto de Xac 49
6.2. Sondas de DNA e competidores específicos para EMSA 50
6.3. Ensaio de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) 51
7. Análise de frações protéicas de Heparina-Sepharose por eletroforese bidimensional 51
7.1. Análise de imagens de 2-DE das frações cromatográficas 52
7.2. Digestão protéica, análises de espectrometria de massa e busca 52
em banco de dados 8. Análise de proteínas diferencialmente expressas por eletroforese bidimensional 53
8.1. Extração e preparação das proteínas totais 54
8.2. Ensaio de 2D-PAGE 54
8.3. Análise de imagens de 2-DE e comparação entre géis com proteínas 55
diferencialmente expressas em cobre 8.4. Digestão protéica, análises de espectrometria de massa e busca em 55
banco de dados 9. Análise da expressão proteica de CopA e CopB por Western blot 55
9.1. Ensaio de Western blot 56
10. Avaliação da produção da proteína XAC3629 recombinante em E. coli 56
10.1. Ensaio de Western blot 58
10.2. Análise por sequenciamento de DNA 58
11. Avaliação da produção da proteína XAC3629 fusionada a TAP em Xac 306 58
11.1. Eletroporação em células de Xac 306 58
11.2. Avaliação da produção da proteína XAC3629 fusionada a TAP in vivo 59
12. Preparo e transformação de células competentes de E. coli 59
13. Extração e análise de DNA plasmidial 60
14. Análises de restrição enzimática 61
14
RESULTADOS E DISCUSSÃO 62
1. Avaliação de tolerância a cobre em linhagens de Xac 63
2. Avaliação de tolerância a cobre de linhagens mutantes na ORF XAC3629 69
3 Confirmação dos isolados por PCR 70
4. Análise do DNA genômico de linhagens selecionadas por Southern Blot 71
5. Análise da expressão gênica na presença de cobre 74
6. Análise da região upstream ao operon copAB por EMSA 75
6.1. Ensaio de ligação do extrato proteico bruto de Xac aos fragmentos de 76
DNA da região upstream ao operon copAB 6.2. Ensaio de ligação de frações proteicas de Xac 306 aos fragmentos de 76
DNA da região 5’-flanqueadora do operon copAB 7. Análise de frações proteicas de Xac 306 por eletroforese bidimensional 78
8. Análise de proteínas diferencialmente expressas em cobre por eletroforese 89
bidimensional 9. Análise da expressão proteica de CopA e CopB por Western blot 102
10. Análise da expressão do produto da ORF XAC3629 105
CONSIDERAÇÕES FINAIS 108
REFERÊNCIAS 111
ANEXO 1 122
ANEXO 2 133
15
Introdução
16
O Brasil é o maior produtor de laranja doce e maior exportador de suco de laranja concentrado do mundo. É o segundo maior produtor mundial de frutas cítricas, sendo a China o maior produtor mundial. Apesar do destaque de produção e da importância econômica que a citricultura representa, o país tem um histórico assinalado por uma sucessão de doenças causadas por vírus, bactérias e fungos (MACHADO; CRISTOFANI-YALY; BASTIANEL, 2011). Atualmente, as doenças bacterianas são as que causam maiores prejuízos para os cultivos de laranja doce no Brasil e os cultivares comerciais não apresentam resistência às três principais doenças bacterianas, ou seja, à clorose variegada dos citros (CVC) causada por Xylella fastidiosa, ao cancro cítrico causado por Xanthomonas citri subsp. citri e ao huanglongbing (HLB) associado a três espécies de Candidatus Liberibacter. As medidas de controle para estas doenças têm sido associadas ao uso de mudas sadias obtidas de viveiros certificados, a eliminação de plantas doentes e a eliminação dos insetos vetores, no caso de HLB e CVC (BOTEON e NEVES, 2005; KOIZUMI et al., 1993).
Uma alternativa para controle do fitopatógeno bacteriano Xanthomonas citri subsp. citri
(Xac) é a utilização de defensivos a base de cobre com o objetivo de diminuir a fonte de inóculo no campo. Compostos a base de cobre têm sido amplamente utilizados para o controle de doenças bacterianas devido às suas propriedades citotóxicas e o uso frequente pode levar ao desenvolvimento de mecanismos de resistência ao metal, o que prejudica o controle da doença. Em linhagens patogênicas às plantas, mecanismos de resistência a cobre foram bem caracterizados em nível molecular em Pseudomonas syringae pv. tomato (COOKSEY, 1987; MELANO e COOKSEY, 1988) e em diferentes espécies de Xanthomonas, como por exemplo
X. campestris pv. juglandis (LEE et al., 1994) e X. euvesicatoria, anteriormente X. campestris
pv. vesicatória (BASIM et al., 2005).
Em Xac (linhagem 306, SILVA et al., 2002), o operon de origem cromossomica copAB
foi descrito ser responsivo a cobre, ambas as proteínas CopA e CopB foram induzidas especificamente na presença de cobre e a inativação do gene copA conduziu a uma estirpe mutante incapaz de crescer na presença de cobre (TEIXEIRA et al., 2008). O papel exato de ambas as proteínas, quer de resistência ou tolerância a cobre permanece a ser determinado. Mais recentemente, BEHLAU et al. (2011) descreveu em uma linhagem de Xac, um isolado resistente ao cobre (linhagem A44), a existência de sete genes sequencialmente localizados em um plasmídeo, que codificam as proteínas CopA, CopB, CopM, CopG, CopC, CopD e CopF, homólogas a outras proteínas envolvidas em resistência ao cobre. Adicionalmente aos genes plasmidias, dois genes cromossomais (copA e copB), mostrando homologia com os mesmos genes de origem plasmidial foram também identificados na mesma linhagem.
17
COOKSEY, 2005) e codifica uma proteína rica em resíduos de cisteína e histidina, possivelmente envolvida na interação com cobre. Este gene também está localizado upstream
ao operon cromossomico do fitopatógeno Xyllela fastidiosa (SIMPSON et al., 2000) e de outras espécies de Xanthomonas. Enquanto copL foi descrito como um gene regulador em X.
axonopodis pv. vesicatoria (VOLOUDAKIS; REIGNIER; COOKSEY, 2005), controlando a
expressão de copA, seu papel funcional exato permanece indeterminado. Este trabalho tem como objetivos estudar a região cromossomal upstream ao operon copAB, identificar os elementos regulatórios presentes nesta região e avaliar os mecanismos de homeostase e resistência a cobre em linhagens de Xac com diferenças na tolerância ao metal.
1. Aspectos gerais da citricultura
As espécies de citros pertencem à família Rutaceae, tribo Citreae e subtribo Citrinae
(SWINGLE, 1967). Além do gênero Citrus, que apresenta maior importância econômica, também apresentam interesse comercial os gêneros Poncirus e Fortunella. Ao gênero Citrus
relacionam-se as laranjas doces (C. sinensis (L.) Osbeck), tangerina comum (C. reticulata
Blanco), limas ácidas (C. aurantifolia Swing.), limas doces (C. limettioides Tan.), limões (C. limon Burm F.), cidras (C. medica L.), tangerina Sunki (C. sunki hort. ex Tanaka), tangerina Cléopatra (C. reshini hort. ex Tanaka), laranjas azedas (C. aurantium L.), pomelos (C. paradisi
Macf.), toranjas (C. grandis Osbeck), e outras espécies, incluindo híbridos naturais.
Entre as frutas comercializadas, as cítricas apresentam a maior expressão econômica mundial, tendo sido produzidas, no mundo, em 2010, mais de 123 milhões de toneladas de frutas cítricas (FAO, 2012). O Brasil é o maior produtor e exportador de suco de laranja desde 1980 e atualmente, é o segundo maior produtor mundial de frutas cítricas, tendo em 2010 contribuído com 27,5% da produção total de laranjas. Em 2010, o país produziu 21.327.480 toneladas de frutas cítricas e exporta cerca de 60% do suco de laranja consumido no mundo (IBGE, 2012). O Brasil, a China e os Estados Unidos são responsáveis por 45,5% da produção mundial de laranja e 44,6% da produção mundial de frutas cítricas (FAO, 2012). O setor citrícola promove grande fonte de emprego e renda no Brasil. A citricultura brasileira gera mais de 400 mil empregos diretos e indiretos, e o sistema agroindustrial citrícola movimenta aproximadamente US$ 9 bilhões anualmente, de suco de laranja (BELASQUE JÚNIOR et al., 2009). Aproximadamente 98% do suco produzido é exportado, principalmente, para os Estados Unidos e União Europeia, além do Japão e outros 45 países.
18
quanto à ocorrência de doenças, causando redução da produtividade. A média nacional de 50 kg planta-1ano-1 é considerada baixa, e atualmente, com o aumento no custo de produção
devido aos gastos para controle e erradicação de plantas com sintomas do HLB, têm-se reduzido a margem de lucro ao produtor. Em 2010, a produtividade de laranja doce no Brasil foi de 22,6 t.ha-1, enquanto que nos Estados Unidos, o segundo maior produtor de laranja do
mundo foi de 28,7 t.ha-1 (FAO, 2012).
Ao longo da história da citricultura brasileira, várias doenças foram identificadas afetando a cultura, como a tristeza dos citros (CTV- Citrus tristeza virus), a pinta preta (Guignardia citricarpa Kiely), a verrugose (Elsione spp.), a rubelose (Corticium salmonicolor), a melanose (Diaporthe citri), a podridão floral (Colletotrichum acutatum), a podridão de
Phytophthora spp. Entre as doenças causadas por bactérias citam-se o cancro cítrico (X. citri
subsp. citri), a clorose variegada dos citros (CVC - Xyllela fastidiosa) e o Huanglongbing (HLB), doença associada a três bactérias de Candidatus Liberibacter (BOTEON e NEVES, 2005; FEICHTENBERGER et al., 2005). Entre as doenças bacterianas de maior importância para a citricultura, destacam-se o cancro cítrico e o HLB, responsáveis por grandes danos e prejuízos ao setor.
2. Cancro cítrico
O cancro cítrico é causado pela bactéria Gram-negativa X. citri subsp. citri. Esta espécie foi identificada e classificada pela primeira vez como Pseudomonas citri por HASSE (1915). Posteriormente, foi renomeada como Bacillus citri (HOLLAND, 1920) e depois, como
Phytomonas citri (BERGEY et al., 1923). Em 1939, com a criação do gênero Xanthomonas
(DOWSON, 1939) foi reclassificada como X. citri, e mais tarde como X. campestris pv. citri (DYE et al.,1980). Em 1995, foi novamente reclassificada como X. axonopodis pv. citri (VAUTERIN et al., 1995) e em 2006, teve a nomenclatura modificada, para X. citri subsp. citri
que é a utilizada atualmente (SCHAAD et al., 2006).
As bactérias deste gênero estão sempre associadas a plantas. Foram relatadas a ocorrência de Xanthomonas spp. em mais de 124 espécies de monocotiledônias e 268 de dicotiledôneas, o que confirma a grande importância deste gênero, não só na cultura dos citros, mas também em várias outras. Existem centenas de subclassificações das espécies de
Xanthomonas e estas estão relacionadas à espécie hospedeira (LEYNS et al., 1984). Entre as
doenças causadas pelas espécies de Xanthomonas, o cancro cítrico, também conhecido como cancrose A e cancro asiático, é a de maior ocorrência e gravidade. Causado pela estirpe A da
19
Além da estirpe A de X. citri subsp. citri, outras duas variantes foram identificadas, denominadas de A* (VERNIÈRE et al.,1998) e Aw (SUN et al.,2004). Ambas possuem limitada
gama de hospedeiros e são consideradas menos severas para a citricultura quando comparadas com o tipo A. Produzem sintomas típicos do cancro cítrico. Apesar de possuírem patogenicidade restrita, semelhante a X. fuscans subsp. aurantifolii, causadora das cancroses B e C, são geneticamente similares a X. citri subsp. citri (VERNIÈRE et al., 1998). A bacteriose dos citros, detectada no México em 1981, em plantas de Citrus aurantifolia foi considerada como cancrose D, pela semelhança dos sintomas com os do cancro cítrico, e acreditava-se que esta doença estaria relacionada à ocorrência de uma estirpe D de X. citri, porém, posteriormente foi constatado que o agente etiológico é o fungo Alternaria limicola e a doença deixou de ser classificada como cancrose (PALM e CIVEROLO, 1994).
X. citri subsp. citri (Xac) pertencente à ordem Xanthomonadales, gênero Xanthomonas, é uma bactéria Gram-negativa, baciliforme, aeróbia e se movimenta por um único flagelo polar (monotríquia). A bactéria se desenvolve sob temperaturas entre 28 e 39 ºC, e não é capaz de sobreviver por longos períodos em solo, plantas invasoras ou em restos de cultura, necessitando de tecido de citros para garantir sua sobrevivência. O cancro cítrico tem como provável fonte de origem o continente Asiático, do Sudeste da China, Indonésia ou Éndia (KOIZUMI, 1985). No Brasil, foi detectado pela primeira vez, em 1957, na região de Presidente Prudente pela entrada de material contaminado (BITANCOURT, 1957; CIVEROLO, 1985).
No estado de São Paulo, desde a detecção do cancro cítrico, era realizada a erradicação das plantas sintomáticas. A partir de 1997, adotou-se a eliminação de plantas num raio de 30 metros da planta identificada com a doença. Após a introdução da larva minadora dos citros no Estado de São Paulo, houve um importante aumento na incidência do cancro cítrico o que levou a modificação da lei a partir de 1999. Nesta modificação ficou determinada a eliminação de todas as plantas dos talhões infestados que tivessem mais de 0,5% de incidência. Para incidências iguais ou menores que 0,5% as plantas doentes e as demais contidas num raio de trinta metros eram eliminadas. O cancro cítrico representa um alto dispêndio anual com inspeções e erradicações de plantas doentes. No Brasil, entre 1999 a 2008, foram gastos cerca de 476 milhões de dólares (BASSANEZI; BELASQUE JÚNIOR; MASSARI, 2009). GOTTWALD e GRAHAM (2000) estimaram nos Estados Unidos, entre 1995 e 2005, o impacto econômico do cancro cítrico em um bilhão de dólares com inspeções, erradicação e indenizações.
20
2011 (BELASQUE JÚNIOR e BEHLAU, 2011). Este aumento vem ameaçando a citricultura nacional.
Nos estados do Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso e Minas Gerais, a erradicação não tem sido realizada a muitos anos, o que contribuiu para o estabelecimento definitivo da bactéria nestas áreas (FEICHTENBERGER; MÜLLER; GUIRADO, 1997; MACIEL; DUARTE; AYUB, 1998). A bactéria causadora do cancro cítrico, X. citri subsp. citri, é classificada como Praga Quarentenária A2 (AMARAL, 2003), o que torna o cancro cítrico uma doença regulamentada por leis internacionais que visam, principalmente, impedir a entrada do patógeno em áreas livres da doença (CIVEROLO, 1985; GOTTWALD et al., 2001). Desta forma, países com ocorrência de cancro cítrico estão sujeitos à imposição de barreiras fitossanitárias que muitas vezes podem comprometer a comercialização da produção (FUNDECITRUS, 2006; GOTTWALD et al., 2001; STALL e CIVEROLO, 1991).
Em citros, a infecção por Xanthomonas ocorre pela entrada em tecidos jovens por meio de aberturas naturais, como estômatos e hidatódios, ou por ferimentos em tecidos maduros (BROWN, 2001). A larva minadora dos citros (Phyllocnistis citrella) também contribui para a disseminação, pois, apesar de não ser vetor da doença, colabora com a disseminação por causar ferimentos nas folhas, tornando-as suscetíveis à infecção pela bactéria causadora da doença (BELASQUE JÚNIOR et al., 2005). Durante a alimentação, as larvas rompem a cutícula e a epiderme expondo o mesófilo foliar, tornando o hospedeiro mais suscetível à infecção (CHAGAS et al., 2001; JESUS JUNIOR et al., 2006). A disseminação a curtas distâncias ocorre principalmente pela ação de respingos de chuvas que associadas com ventos, promovem uma maior disseminação e a longa distância dá-se pelo transporte de material vegetal infectado. No Brasil, o cancro cítrico é mais severo no início do verão, quando altas temperaturas, chuvas intensas e ventos ocorrem ao mesmo tempo e em um período no qual as plantas hospedeiras apresentam grande quantidade de tecidos imaturos (ramos, folhas e frutos) (CIVEROLO, 1985).
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com a bactéria apresentam inicialmente manchas oleosas circulares na superfície abaxial das folhas e depois também na superfície adaxial. Essas lesões tornam-se corticosas e circunscritas por um halo amarelo.
Sintomas da doença também ocorrem no caule e frutos. Quando atingem uma grande área da planta, podem ocasionar desfolha e queda de frutos. O sintoma de cancro, ocorre pela hiperplasia celular, que é resultante da atividade do gene pthA da bactéria, que codifica uma proteína de sinalização de divisão celular, secretada pelo sistema de secreção tipo III (SSTT) da bactéria e causa divisões celulares excessivas no hospedeiro (BRUNINGS e GABRIEL, 2003). Os sintomas do cancro cítrico em si não constituem o maior problema ocasionado pela doença, pois, raramente, levam a planta à morte. Todavia, devido ao estresse biótico, a planta responde produzindo diversas substâncias, levando a um desequilíbrio hormonal (CROZIER et al., 2001). Após a entrada do patógeno na planta, esta inicia a produção de etileno como resposta de defesa ao patógeno, o que desencadeia a queda prematura de frutos imaturos. Os frutos que caem são inadequados tanto para o mercado de frutas frescas quanto para o processamento de sucos (GOTO; YAGUCHI; HYODO, 1980).
As espécies e cultivares de citros apresentam grande variação quanto à resistência a esta doença, porém nenhuma é totalmente imune. São classificadas como moderadamente resistentes as cultivares Valência e Pêra premunizada, moderadamente suscetível a cultivar Natal e como suscetíveis as cultivares Hamlin, Bahia, Baianinha e Seleta (FEICHTENBERGER et al., 2005).
Para a prevenção e controle do cancro cítrico, além do uso de mudas sadias e eliminação de plantas doentes, é recomendado o uso de quebra-ventos para reduzir riscos de introdução e disseminação do patógeno, fazer aplicações de cobre em fluxos vegetativos novos em pomares próximos a áreas contaminadas e realizar a descontaminação de materiais e equipamentos utilizados nas colheitas (BASSANEZI; BELASQUE JÚNIOR; MASSARI, 2009). É previsto o aumento desta doença, devido a não obrigatoriedade da eliminação de plantas doentes (BELASQUE JÚNIOR e BEHLAU, 2011).
3. Mecanismos de homeostase e resistência a cobre nos diferentes organismos
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danos ao DNA, membranas lipídicas e causam estresse oxidativo. Devido a este efeito tóxico do metal, tanto os organismos eucariotos como os procariotos têm desenvolvido sistemas de detoxificação para manter a homeostase de cobre e, assim, se protegerem das altas concentrações deste metal e assegurar os níveis nutricionais de cobre necessários a sua sobrevivência.
A importância do cobre como elemento essencial aos seres vivos pode ser avaliada pelo grande número de proteínas e enzimas dependentes desse metal, participando de inúmeros processos biológicos, onde desempenham funções variadas. A maioria das espécies, de bactérias aos seres humanos, sintetizam várias enzimas cúpricas incluindo amina oxidases, citocromo c oxidases, lacases, lisil oxidases, metano monoxigenases, multicobre oxidases (MCOs), nitrito oxidases, plastocianins, superóxido dismutase (SOD) e tirosinases, que desempenham funções em processos celulares como transdução de energia, mobilização de ferro e resposta ao estresse oxidativo (ARREDONDO e NÚNEZ, 2005; GRASS; RENSING; SOLIOZ, 2011). Na enzima SOD de Cu+2 e Zn+2, por exemplo, o cobre tem papel antioxidante,
catalisando a dismutação de radicais superóxido, enquanto nas oxidases, como tirosinase, catecol oxidase, amina oxidase ou galactose oxidase, catalisa a oxidação de vários substratos pelo oxigênio molecular, levando à formação de produtos carbonílicos (aldeídos, quinonas, etc.) e peróxido de hidrogênio. Em todas estas enzimas, participa de ciclos catalíticos envolvendo os estados de oxidação Cu+ e Cu+2. Em sistemas-modelos apresenta alta
reatividade frente a espécies paramagnéticas (radicalares) como íons superóxido de O2•, NO•,
radical fenoxil, o-semiquinona, etc (KAIM, 2003).
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não está bem estabelecida, mas parece estar envolvida na saída do cobre da mitocôndria, controlando então a concentração do cobre intramitocondrial (LAMB et al., 2001; GLERUM; SHTANKO; TZAGOLOFF, 1996).
A proteína Ctr1, na levedura Saccharomyces cerevisiae, possui 406 aminoácidos, é altamente glicosilada e carrega oito seqüências repetidas, características de regiões de ligação a metal (MX2MXM) no domínio N-terminal extracelular (DANCIS et al., 1994). Essas regiões são repetidas duas vezes nas prováveis proteínas transportadoras de cobre em humanos (hCtr1) e camundongos (mCtr1) e cinco vezes na proteína Ctr4 de Schizosaccharomyces pombe (LABBE e THIELE, 1999). A proteína Ctr3 de S. cerevisiae não possui esta região, mas tem vários resíduos de cisteína ao longo da proteína (11 Cys de um total de 241 aminoácidos) em seus prováveis domínios transmembranas. Desde que os resíduos de metionina e cisteína são potenciais sítios de ligação a cobre (KOCH; PENA; THIELE, 1997), esses resíduos são importantes para a captura deste metal. O cobre está distribuído então em eucariotos em todas as organelas celulares incluindo o núcleo, as mitocôndrias, os lisossomas, o retículo endoplasmático e o citosol (CULOTTA et al., 1997). As proteínas de cobre estão assim localizadas em todo o compartimento celular: superóxido dismutase no citosol e possivelmente nos peroxissomas (LINDER, 1991), lisil oxidase no complexo de Golgi e em organelas secretórias (CRAPO et al., 1992) e metalotioneína no citosol, núcleo e lisossomas (KUIVANIEMI; ALA-KOKKO; KIVIRIKKO, 1986). Deste modo, o tráfego intracelular de cobre desempenha um papel vital na distribuição de cobre para as proteínas de cobre.
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Para manter o metabolismo celular, perante às diferentes concentrações de cobre do ambiente, as bactérias têm desenvolvido sistemas homeostase de cobre específicos que atuam principalmente como mecanismo de defesa. Um sistema de defesa contra o cobre é essencial para a virulência de bactérias patogênicas. A maioria das bactérias sintetiza ATPases do tipo P para exportação de cobre como os principais determinantes de defesa quando as concentrações de cobre excedem os níveis favoráveis. Além disso, muitas bactérias utilizam sistemas de multicomponentes de efluxo de cobre pertencentes à família RND (resistance nodulation cell division) e multicobre oxidases (MCOs) para lidar com o excesso de cobre (RADEMACHER e MASEPOHL, 2012). Os membros representativos destas proteínas de homeostase de cobre são a ATPase de cobre CopA, o sistema CusCFBA do tipo RND e a multicobre oxidase CueO, todos exemplos presentes na bactéria Gram-negativa Escherichia coli (RENSING e GRASS, 2003).
Os reguladores transcricionais responsivos a cobre dos sistemas de um único componente, amplamente distribuídos em bactérias, são representados pelos reguladores transcricionais CueR, CopY e CsoR, os quais foram inicialmente identificados em E. coli, Enterococcus hirae e Mycobacterium tuberculosis, respectivamente. CueR ativa a expressão de genes de homeostase de cobre em concentrações elevadas, enquanto CopY e CsoR reprimim seus genes alvo sob baixas concentrações de cobre. Além destes sistemas de um único componente, que detectam o cobre citoplasmático, muitas bactérias Gram-negativas utilizam sistemas de dois componentes, os quais detectam concentrações de cobre periplásmicas, como as proteínas CusRS de E. coli. Além destes reguladores transcricionais bem estudados, existem mecanismos de controle de cobre que atuam nos níveis pós-transcricional e pós-traducional (RADEMACHER e MASEPOHL, 2012).
Em E. coli (Figura 1), o sistema cue (para Cu efllux) consiste de uma proteína metaloregulatória, CueR, que diretamente detecta e responde ao cobre citoplasmático, regulando a expressão de dois genes, copA e cueO (OUTTEN et al., 2000). A proteína CopA é uma ATPase tipo P de efluxo de cobre com significante homologia aos transportadores de cobre eucarióticos em leveduras e humanos (RENSING et al., 2000) e a proteína CueO é uma oxidase que apresenta similaridade a grande família de multicobre oxidases, incluindo ascorbato oxidase, ferroxidases Fet3 de levedura e ceruloplasmina de mamíferos (OUTTEN et al., 2000). GRASS e RENSING (2001) demonstraram que a proteína CueO é uma multicobre oxidase periplasmática, a qual protege enzimas periplasmáticas, como fosfatase alcalina, da ação tóxica do cobre, ligando 4 átomos de cobre por molécula. A ATPase tipo P de translocação de Cu+ em E. coli (CopA) tem 834 resíduos de aminoácidos e mostra indução por
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O sistema cus (para Cu-sensing) em E. coli foi descrito por MUNSON et al. (2000). Este sistema (Figura 1) é formado pelo operon cusCFBA e é regulado por um sistema de transdução de sinal de dois componentes formado pelos genes cusS e cusR. A proteína CusS é uma histidina quinase localizada na membrana citoplasmática, age como um sensor da presença de íons cobre no periplasma e CusR age como um regulador da resposta ativando a transcrição dos genes cusCFBA. Assim, CusRS ativa a expressão do operon cusCFBA em resposta a concentrações elevadas de cobre. A proteína CusC possui 457 resíduos de aminoácidos e é uma proteína de membrana externa formadora de canais com homologia a TolC, uma proteína de resposta a estresse (KORONAKIS, ESWARAN, HUGHES, 2004). A proteína CusB possui 407 resíduos de aminoácidos e pertence à família das proteínas de fusão à membrana, as quais são tipicamente ancoradas na membrana interna com um longo domínio periplasmático (ZGURSKAYA e NIKAIDO, 1999) e a proteína CusA, de 1047 resíduos de aminoácidos, é a proteína central do sistema cus, responsável pelo transporte de cobre. A proteína CusA faz parte da família RND, as quais são transportadores secundários, exportando numerosos substratos variando de metais pesados até proteínas (SAIER et al., 1999). Juntas estas três proteínas formam um complexo de transporte que atravessa ambas as membranas e o espaço periplasmático. CusF é uma metalochaperona periplasmática que transporta cobre para o complexo de efluxo CusCBA, facilitando a detoxificação de cobre no periplasma.
Resumindo, em E. coli (Figura 1) CopA exporta excesso de Cu+ do citoplasma para o
periplasma, enquanto que CusCFBA exporta Cu+ a partir do periplasma (FRANKE et al., 2003;
LONG et al., 2010; OUTTEN et al., 2001; RENSING et al., 2000). Tem sido relatado também que o sistema CusCBA excreta cobre a partir do citoplasma. A proteína CueO exibe atividade oxidase de cobre in vitro, sugerindo que converte Cu+ periplasmático para o menos tóxico Cu2+
in vivo (SINGH et al., 2004). Além disso, CueO oxida sideróforos de enterobactina, que está envolvida em primeiro lugar na aquisição de ferro (GRASS et al., 2004). A oxidação do sideróforo impede a redução mediada em enterobactina de Cu2+ para Cu+. Os sistemas CopA,
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Além desses sistemas, algumas linhagens de E. coli possuem o cluster gênico plasmidial pcoABCDRSE (plasmid-borne copper resistance), permitindo a essas linhagens sobreviver em concentrações muito elevadas de cobre que seriam letais (BROWN et al., 1995). O componente central deste sistema é a multicobre oxidase PcoA (605 aminoácidos) (Figura 2). Similar a multicobre oxidase CueO, PcoA também possui um motif formado por dois resíduos de arginina consecutivos no peptídeo do sinal e é, provavelmente, translocada pela via TAT (twin-arginine translocation) (BERKS; SARGENT; PALMER, 2000) com cobre ligado em seus sítios ativos. A proteína PcoB é uma proteína de 296 resíduos de aminoácidos e, provavelmente, localizada na membrana externa, PcoC contém 126 resíduos de aminoácidos e foi demonstrada ligar um átomo de cobre por molécula, podendo atuar como um dímero (LEE et al., 2002) e PcoD, uma proteína integral de membrana, possui 309 resíduos de aminoácidos. No modelo proposto (Figura 2), PcoC transfere cobre periplasmático para o citoplasma via PcoD, o qual liga-se a PcoA. O outro gene, pcoE é requerido, também, para uma resistência máxima. A expressão desse operon plasmidial é regulada por seu próprio promotor, o qual é induzível por cobre e está sob o controle do sistema de dois componentes PcoRS.
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Mecanismos de tolerância a cobre também são encontrados em outras bactérias patogênicas, como Bacillus subtilis, Enterococcus hirae, Helicobacter pilori, E. faecium e
Lactococcus lactis. Em B. subtilis a homeostase de cobre é mediada por uma ATPase tipo P, CopA e uma chaperona de cobre, CopZ (GABALLA; CAO ; HELMANN, 2003). A proteína CopZ transfere Cu+ para CopA (BANCI et al., 2003). A região regulatória do operon copAZ contém
um promotor que é reconhecido por reguladores transcricionais do tipo MerR, os quais são responsáveis por regular a transcrição de operons de resistência a mercúrio, tanto em bactérias Gram-positivas como em Gram-negativas (HELMANN et al., 1989). A proteína CsoR é um repressor responsivo a cobre nesse sistema (Figura 3). A bactéria intestinal Gram-positiva E. hirae (anteriormente Streptococcus faecalis) abriga o operon copYZAB que codifica o repressor responsivo a cobre CopY, a chaperona CopZ e duas ATPases de cobre, CopA e CopB (ODERMAT e SOLIOZ, 1995) (Figura 3). Como CopA de E. coli, CopB de E. hirae exporta de forma eficaz o excesso de íons Cu+ do citoplasma. Originalmente CopA de E. hirae foi discutida
como para a importação de íons Cu+ em condições de cobre limitantes porque
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mutantes CopA cresciam pouco sob a ausência de cobre (SOLIOZ e STOYANOV, 2003). Entretanto recentemente, foi mostrado que CopA pertence à subclasse FixI das ATPases de cobre e, portanto, atua mais provavelmente como um exportador de baixa atividade providenciando cobre para as enzimas extracitoplasmáticas (ARGUELLO; GONZALEZ-GUERRERO; RAIMUNDA, 2011; GONZALEZ-GUERRERO et al, 2010; LUBBEN et al., 2009). Como a maioria das ATPases, CopA possui um sítio de ligação ao metal na extremidade N-terminal, CXXC, o qual não é encontrado em CopB. A ATPase CopB, diferentemente de CopA, possui uma região N-terminal rica em histidina, a qual também pode constituir um sítio de ligação a metal. A chaperona de cobre CopZ entrega Cu+ ao repressor CopY por interação
direta (COBINE et al., 1999). Além disso, CopZ interage especificamente com CopA (MULTHAUP et al., 2001), embora a transferência de cobre de CopZ para CopA não tenha sido ainda demonstrada.
3.1. Os reguladores transcricionais responsivos a cobre
Segundo RADEMACHER e MASEPOHL (2012) a maioria dos reguladores transcricionais responsivos a cobre descritos, até o momento, pertencem às classes CueR,
Figura 3- Principais mecanismos de tráfico e homeostase de cobre em B. subtilis e E. hirae.
(A) Em B. subtilis, o sensor de cobre citosólico CsoR induz a exportação de cobre através da ATPase CopA. A chaperona de cobre copZ canaliza cobre à CopA. (B) Em E. hirae o cobre é encaminhado para o sensor de cobre citosólico CopY e ao exportador de cobre a ATPase CopB pela chaperona de cobre CopZ. Em altas concentrações de cobre, CopY é liberado do promotor e a transcrição do operon acontece (OSMAN e CAVET, 2008).
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CusRS, CopY e CsoR. Estes reguladores de transcrição podem ser divididos em nove classes representadas pelos seus membros fundadores: E. coli (classes 1-3: CueR, CusRS, ComR), outras proteobacterias (classes 4 e 5: CopL, CorE), as cianobactérias (classe 6: BxmR) e as bactérias Gram-positivas (classes 7-9: CopY, CsoR, YcnK). Na sequência descrevemos alguns detalhes desses principais reguladores transcricionais.
3.1.1. CueR, ativador de transcrição de um componente em proteobacterias
CueR pertence à família dos ativadores de transcrição MerR (BROWN et al., 2003). Reguladores MerR exibem uma estrutura com três domínios: um domínio de ligação ao DNA N-terminal, compreendendo um padrão hélice-volta-hélice (HTH), um domínio de dimerização central, e um domínio de ligação a metal C-terminal. Vários membros da família MerR respondem a ions metálicos, tais como Hg+2 (MerR), Zn+2 (ZntR), Pb+2 (PbrR) e Cu+ (CueR).
Além de E. coli, ativadores semelhantes a CueR são encontrados também nas gamma-proteobacterias P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens e Salmonella enterica, e nas alpha-proteobacterias Agrobacterium tumefaciens e Rhodobacter sphaeroides (RADEMACHER e MASEPOHL, 2012).
CueR em E. coli, coordena um ion Cu+ por monômero em um centro linear de S-Cu+-S
que abrange dois resíduos de cisteína (Cys112 e Cys120) localizados na interface do dímero
(CHANGELA et al., 2003; CHEN et al., 2003). Tanto o holo-regulador CueR (levando Cu+)
como o aporegulator (sem cobre) se ligam aos promotores alvo, mas exclusivamente o holo-regulador ativa a transcrição (ANDOY et al., 2009). Dímeros de CueR se ligam às sequências da díade-simétrica (CCTTCC-N7-GGAAGG) nos seus promotores alvo (STOYANOV; HOBMAN; BROWN, 2001; YAMAMOTO e ISHIHAMA, 2005). Tipicamente, os locais de ligação dos ativadores da transcrição estão localizados upstream aos sitios de ligação da RNA polimerase, enquanto que sitios de ligação de CueR se sobrepõem às regiões -35/-10 dos seus promotores alvo. Os promotores dependentes de CueR são caracterizados por um espaçamento maior (19-20 pares de bases) entre os motifs -35 e -10.
3.1.2. CusRS como um sistema de dois componentes
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E. coli, sistemas de dois componentes responsivos a cobre foram caracterizados nas proteobacterias P. fluorescens, P. putida, P. syringae e Helicobacter pylori, na cianobactéria
Synechocystis spp. PCC 6803 e na bactéria Gram-positiva Corynebacterium glutamicum. Como informado anteriormente, E. coli abriga os operons cusCFBA e cusRS os quais são transcritos de forma divergente e codificam um sistema do tipo RND de efluxo cobre e um sistema de dois componentes cobre-responsivo, respectivamente. O sistema CusCFBA é especialmente importante para a viabilidade celular em concentrações elevadas de cobre, sob condições anaeróbicas, mas a tolerância a cobre completa requer também o sistema CopA-CueO descrito anteriormente (OUTTEN et al., 2001; RENSING e GRASS, 2003). CusS ligada à membrana detecta o cobre periplasmico. Após a ligação de Cu+, CusS deverá se autofosforilar
e doar o grupo fosforil para CusR, o qual ativa a transcrição dos operons cusCFBA e cusRS
(FRANKE et al., 2003; GUDIPATY et al., 2012; OUTTEN et al., 2001; RENSING e GRASS, 2003). Os dois operons partilham um único sitio de ligação palindrômico para CusR (AAAATGACAA-N2-TTGTCATTTT) flanqueado pelos motifs -35/-10 dos promotores de cusC e
cusR (YAMAMOTO e ISHIHAMA, 2005). Enquanto o genoma de E. coli contém 197 sítios de ligação putativos para CueR, não foram detectados outros sítios de ligação para CusR.
Além do sistema CusRS, dois outros sistemas reguladores de dois componentes, CpxRA e YedWV, estão relacionados com a homeostase de cobre (YAMAMOTO e ISHIHAMA, 2005, 2006) em E. coli. Em contraste com CusS, no entanto, o sensor quinase CpxA não detecta diretamente o cobre periplasmático mas responde ao cobre induzida por enrolamento protéico diferenciado. O seu regulador de resposta CpxR controla a expressão de genes envolvidos na motilidade, na quimiotaxia e na resposta ao estresse, bem como dois genes de proteases que codificam a protease periplasmática DegP e a protease de membrana HtpX. O papel do sistema YedWV na homeostase de cobre não é claro, mas o sensor quinase YedV serve como doador do grupo fosforil não só para o seu regulador resposta YedW, mas também para CusR (YAMAMOTO et al., 2005).
Algumas linhagens de E. coli abrigam também o cluster gênico plasmidial
pcoABCDRSE, discutido anteriormente, que é semelhante ao cluster copABCDRS de P. syringae, um fitopatógeno analisado adiante, permitindo a essas estirpes sobreviver em concentrações letais de cobre (BROWN et al., 1995; MILLS; JASALAVICH; COOKSEY, 1993). O componente central deste sistema, a multicobre oxidase PcoA, pode substituir funcionalmente CueO e a ativação do operon pco responsivo a cobre é mediada pelo sistema dois componente PcoRS.
Helicobacter pylori, uma bactéria que desempenha um papel importante na produção de
úlceras estomacais humanas, induz a expressão de uma ATPase CopA em resposta ao cobre assim como do sistema CrdA-CrdB-CzcB-CzcA, o qual exibe similaridade com o sistema Cus
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CrdRS é essencial para a ativação do promotor de crdA responsivo a cobre. Mutantes em CrdR ou CrdS são sensíveis a cobre. Embora CrdR exiba clara similaridade a CusR de E. coli, CrdR aparentemente liga-se a uma sequência espelho (AACACC-N4-CCACAA), enquanto que CusR se liga uma sequência palindrômica (YAMAMOTO e ISHIHAMA, 2005).
3.1.3. ComR, regulador semelhante a TetR, controla a aquisição de cobre em E. coli
Ions cobre (Cu+ e Cu+2) atravessam a membrana externa de E. coli e entram no
periplasma provavelmente através porinas, enquanto apenas Cu+ é capaz de atravessar a
membrana interna e atingir o citoplasma por um mecanismo atualmente desconhecido (OUTTEN et al., 2001.; RENSING e GRASS, 2003) (Figura 4). A proteína de membrana externa ComC reduz a permeabilidade da membrana externa ao cobre (MERMOD et al., 2012). Não se sabe se ComC limita a aquisição de cobre afetando a atividade da porina ou se isso acontece por um outro mecanismo. Sob baixas concentrações de cobre, a transcrição de comC
é reprimida pelo regulador ComR semelhante a TetR (regulador transcricional de tetraciclina). Após a ligação ao cobre, ComR é liberado do promotor de comC e a transcrição é realizada. É desconhecido se ComR regula outros genes alvo além de comC. Embora proteínas como as ComC sejam comuns em bactérias Gram-negativas, não se sabe se a expressão de ortólogos de comC é regulada por cobre e se tal regulação envolve repressores semelhantes a TetR.
3.1.4. CopY como repressor em bactérias Gram-positivas
CopY de E. hirae é o membro fundador de uma família repressora responsiva a cobre pertencente à superfamília dos reguladores HTH (ODERMATT e SOLIOZ, 1995; SOLIOZ et al., 2010). Reguladores do tipo CopY são difundidos em bactérias Gram-positivas, mas aparentemente ausentes em espécies Gram-negativas (LIU et al., 2007). Além de em E. hirae, um papel repressor de CopY na homeostase de cobre tem sido demonstrado para E.faecalis,
L. lactis, Streptococcus mutans e S. pneumoniae. CopY possue um domínio de ligação a DNA N-terminal e um domínio de ligação a metais C-terminal com um motif Cys-X-Cys-X4-Cys-X-Cys (SOLIOZ e STOYANOV, 2003; STRAUSAK e SOLIOZ, 1997). CopY coordena um íon Zn+2
por monômero em baixas concentrações de cobre, o qual é substituído por dois íons Cu+ em
32 3.1.5. Repressores semelhantes a CsoR são comuns em procariotos
CsoR de Mycobacterium tuberculose é o membro fundador de uma família repressora responsiva a cobre muito comum (LIU et al., 2007). Além da regulação em M. tuberculose, reguladores do tipo CsoR têm sido mostrados reprimir genes de homeostase de cobre nas bactérias Gram-positivas de B. subtilis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e
Streptomyces lividans. Reguladores do tipo CsoR tem sido previsto em muitas proteobacterias, e cianobactérias (LIU et al., 2007). Foi demonstrado que CsoR controla a homeostase de cobre em Thermus thermophilus pertencentes ao filo Deinococcus-Thermus, que é distantemente relacionado às proteobactérias e espécies Gram-positivas (SAKAMOTO et al., 2010). Aparentemente, homólogos a CsoR são os principais reguladores responsivos a cobre de um único componente em procariotos na ausência do regulador CueR (LIU et al., 2007).
As estruturas cristalinas do regulador CsoR foram resolvidas para M. tuberculose (Mt),
S. lividans (Sl) e T. thermophilus (Tt) (DWARAKANATH et al., 2012; LIU et al., 2007; SAKAMOTO et al., 2010). Mt-CsoR forma homodímeros, enquanto Sl-CsoR e Tt-CsoR formam
Figura 4. Homeostase de cobre em E. coli. Ions Cu+ e Cu+2 entram no periplasma,
provavelmente através de porinas localizadas na membrana externa. ComC reduz a permeabilidade da membrana externa aos ions cobre. Desconhece-se se ComC interage com as porinas. Em baixas concentrações de cobre externas, a transcrição de comC é reprimida pelo ComR (não mostrado). Ions Cu+ atravessam do periplasma para o citoplasma por um
mecanismo desconhecido, enquanto que os ions Cu+2 não atravessam a membrana
citoplasmática. O efluxo de cobre envolve a ATPase CopA e o sistema multicomponente CusCFBA. A multicobre oxidase CueO oxida Cu+ periplasmático para o Cu+2. Os ativadores
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tetrâmeros. As estruturas fundamentais dos três reguladores são muito semelhantes. Estes reguladores não contêm qualquer motif de ligação a DNA conhecidos, mas feixes antiparalelos de quatro hélices têm sido sugeridos por atuar como uma região de ligação ao DNA. Todos os três reguladores ligam dois íons Cu+ por dímero. Cada ion cobre é coordenado por um resíduo
do primeiro monômero e dois resíduos do segundo monômero. O motif C-H-C coordenada Cu+
em Mt-CsoR (Cys36-His61’-Cys65’) e Sl-CsoR (Cys75-His100’-Cys104’), enquanto que a ligação de
íons cobre envolve o motif C-H-H em Tt-CsoR (Cys41, His 70’ e His66’).
3.1.6. Regulação pós-transcricional responsiva a cobre em Rhodobacter capsulatus
Todos os mecanismos regulatórios responsivos a cobre descritos anteriormente, controlam a homeostase de cobre no nível transcricional inicial. Um mecanismo de controle de cobre pós-transcricional foi recentemente descrito para a alfa proteobacteria fototrófica R.
capsulatus (RADEMACHER et al., 2012) (Figura 5). Após a exposição ao cobre, R. capsulatus
induz a expressão da multicobre oxidase CutO, que confere tolerância ao cobre (WIETHAUS; WILDNER; MASEPOHL, 2006). O gene cutO faz parte do operon orf635-cutO-cutR. A transcrição deste operon é estritamente dependente de um promotor independente de cobre (constitutivo) localizado upstream a orf635 (RADEMACHER et al., 2012). Enquanto a expressão da orf635 não é afetada pelo cobre celular, cutO e cutR são expressos apenas em concentrações elevadas de cobre. A expressão diferencial é baseada no RNAm intergênico entre a região orf635-cutO, que forma uma estrutura em stem-loop. Mutações sitios específicas desestabilizando esta estrutura impedem a regulação cúprica, provavelmente devido a não deformação do RNAm em baixas concentrações de cobre. Interessantemente, mutações compensatórias restaurando a estrutura em stem-loop também restauram a regulação responsiva a cobre, o que sugere que a estabilidade do RNAm depende mais da formação da estrutura característica do que apenas da conservação da sequência. Esse tipo de regulação por cobre não é transferível para E. coli, como mostrado por uma fusão repórter na região intergênica entre a orf635-cutO, sugerindo que pelo menos um fator específico de R.
capsulatus está ausente no hospedeiro heterólogo (RADEMACHER et al., 2012).
4. Mecanismos de homeostase e resistência a cobre em fitopatógenos
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aparecimento de linhagens de bactérias resistentes a cobre (CHA e COOKSEY,1991; BEHLAU et al., 2011). A aquisição de resistência a cobre por bactérias fitopatogênicas é atualmente um problema sério, visto que a aplicação em larga escala de bactericidas contendo cobre é ainda a base do controle de doenças bacterianas em muitas culturas economicamente importantes; a existência de tais patógenos resistentes ao metal pode explicar porque a incidência da doença é alta apesar das aplicações frequentes desses compostos.
Linhagens resistentes a cobre foram identificadas em várias espécies bacterianas fitopatogênicas, incluindo as espécies de Pseudomonas (ANDERSEN; MENKISSOGLOU; LINDOW,1991; BENDER e COOKSEY,1986; CAZORLA et al., 2002; SCHECK e PSCHEIDT, 1998; SUNDIN; JONES; FULBRIGHT, 1989), Pantoea (NISCHWITZ et al., 2007), Erwinia (AL-DAOUDE; ARABI; AMMOUNEH, 2009), e várias espécies de Xanthomonas, tais como X. euvesicatoria, anteriormente X. campestris pv. vesicatoria e X. axonopodis pv. vesicatoria
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(MARCO e STALL,1983; STALL; LOSCHKE; JONES, 1986), X. campestris pv. juglandis (LEE et al., 1994), X. alfalfae subsp. citrumelonis e X. citri subsp. citri (BEHLAU et al., 2011).
O primeiro sistema mais bem estudado de resistência a cobre nestas bactérias foi o plasmídeo pPT23D, encontrado em uma linhagem de P. syringae pv. tomato, um fitopatógeno que ataca culturas de tomate (COOKSEY, 1987). Este plasmídeo apresenta o sistema cop, no qual os genes estão organizados em um operon consistindo de quatro genes, copABCD, sob o controle de um promotor induzível por cobre e regulado por dois genes, copR e copS, cujos produtos são homólogos aos produtos PcoR e PcoS do determinante de resistência plasmidial a cobre de E. coli, descrito por SILVER et al., 1993. Os genes copA e copC em P. syringae
codificam proteínas periplasmáticas capazes de se ligar a íons cobre (Figura 6), o gene copB
codifica uma proteína de membrana externa e o gene copD codifica uma proteína de membrana interna (CHA e COOKSEY, 1991). A proteína periplasmática CopA é rica em resíduos de metionina e é capaz de ligar até 11 átomos de cobre, sendo homóloga a muticobre oxidases, como a ceruloplasmina, encontrada no soro humano (DWULET e PUTNAM, 1981), e a ferroxidase Fet3, envolvida na captura de ferro em leveduras.
Figura 6- Homeostase de cobre em P. syringae. Cobre extracelular alcança o espaço periplasmático através de poros na membrana externa (OM). CopA, homóloga a multicobre oxidases, poderia atuar na resistência a cobre devido a sua alta capacidade de ligar cobre. CopB e CopC também contribuem para a proteção contra o efeito tóxico do cobre. CopC pode transferir cobre de CopA para o transportador de membrana interna (IM) CopD, onde o cobre é importado para o citoplasma. A proteína de membrana interna CopS percebe o excesso de cobre no periplasma, talvez via interações com CopA ou CopC. O sinal de cobre pode ser transmitido a CopR, a qual, por sua vez, induz a expressão do operon copABCD. Os genes
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OUZOUNIS e SANDER (1991) mostraram que as multicobre oxidases, grandes complexos de proteínas que se caracterizam por ligarem muitos átomos de cobre por molécula de proteína, contém, pelo menos, um provável sítio de ligação a cobre tipo-1 na extremidade C-terminal, com a seguinte estrutura geral: His-X48-Cys-X4-His-X4-Met. Na proteína CopA de P. syringae, este sítio se encontra nas posições His-542, Cys-591, His-596 e Met-601 e na proteína codificada pela ORF 1 de X. campestris pv. juglandis, outro fitopatógeno resistente a cobre descrito a seguir, nas posições His-568, Cys-617, His-622 e Met-627. Os domínios de ligação a cobre constituem, provavelmente, o sítio catalítico nas multicobre oxidases. A proteína CopB, também rica em resíduos de metionina, é uma proteína de membrana externa, para a qual não existem evidências de ligação a cobre. A proteína CopC, pertencente a classe das chaperonas de cobre, é uma pequena proteína solúvel encontrada no espaço periplasmático que mostrou ligar 1 átomo de cobre por molécula (COOKSEY, 1993).
As chaperonas de cobre, pertencentes à classe das metalochaperonas, atuam no tráfego intracelular de íons metálicos, essenciais para a célula, guiando e protegendo o metal, enquanto facilitam sua doação para enzimas específicas dependentes de cobre (HARRISON et al., 2000). A proteína CopC, teve sua estrutura tridimensional resolvida (ARNESANO et al., 2002). O espectro de EPR (ressonância paramagnética electrônica) de CopC-Cu+2 prediz que o
átomo de Cu+2 é ligado a átomos de nitrogênio e oxigênio numa geometria tetragonal. Quatro
resíduos altamente conservados na família CopC, His1, His91, Glu27 e Asp89, formam o sítio de ligação ao Cu+2 (HUFFMAN et al., 2002). CopC é formada por 9 folhas β que se arranjam
em uma estrutura β barril similar as cobredoxinas, pequenas proteínas capazes de ligar cobre.
A proteína CopC periplasmática e a proteína CopD de membrana interna formam um sistema de captação de cobre, uma vez que as estirpes de P. syringae que superexpressam os genes copCD têm hipersensibilidade ao cobre e acumulam maiores quantidades de cobre do que as estirpes parentais (CHA e COOKSEY, 1993). Segundo RADEMACHER e MASEPOHL (2012) a cotranscrição de genes de exportação de cobre, copAB e genes absorção de cobre,
copCD, indica uma regulação adicional a nível pós-transcricional ou pós-traducional nesse patógeno. Estudos recentes têm mostrado também que P. syringae pode abrigar outros determinantes de resistência a cobre, como o sistema cusCBA de efluxo (GUTIÈRREZ-BARRANQUERO et al., 2013).
