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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
BRUNO SILVA FIORILLO
“CARACTERIZAÇÃO DO TRATO REPRODUTOR
MASCULINO E DOS ESPERMATOZÓIDES EM VESPAS DO
GÊNERO Pegoscapus (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA).”
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do Título de Mestre em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.
Orientadora: Profa. Dra. Sônia Nair Báo
iii Campinas, 15 de fevereiro de 2008
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Sônia Nair Báo (Orientadora)
Assinatura
Profa. Dra. Irani Quagio-Grassiotto
Assinatura
Prof. Dr. Rodrigo Augusto Santinelo Pereira
Assinatura
Profa. Dra. Carminda da Cruz-Landim
Assinatura
Prof. Dr. Odair Aguiar Junior
iv
Àqueles que dedicam a mim grande parte de suas vidas, meus pais.
v
Agradecimentos
Agradecimentos
Agradecimentos
Agradecimentos
À Profa. Sônia Báo pela orientação dedicada. Agradeço pela confiança, atenção e
agilidade nos assuntos relacionados ao meu projeto e pelo grande exemplo de profissional
que é.
Ao Prof. Odair Aguiar Júnior, Prof. Sebastião Taboga e Profa. Irani
Quagio-Grassioto pela disponibilidade e pelas contribuições dadas ao trabalho no decorrer da
banca prévia.
Ao Prof. Rodrigo Santinelo Pereira pelas inúmeras contribuições ao trabalho, com
o envio das espécies e dicas bastante valiosas. Agradeço por sua disponibilidade, atenção e
agilidade nas respostas às minhas dúvidas.
Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de
Biologia da Unicamp, em especial às coordenadoras do programa durante o período do
meu mestrado, Profa. Maria Júlia e Profa. Laurecir.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural.
Agradeço especialmente aos professores Edson, Heidi, Karina, Shirlei, Maria Luiza e Ana
Maria Guaraldo, que colaboraram bastante na minha formação durante o mestrado.
À Liliam Panagio, que merece muitos agradecimentos por sua prestatividade,
competência, grande paciência e pelo carinho que tem com todos os alunos do programa.
Às agências de fomento CAPES, CNPq, FINATEC e FINEP pelo apoio
financeiro destinado a este trabalho.
Ao prof. José Lino-Neto, meu segundo orientador durante toda a minha vida
acadêmica. Agradeço por seus ensinamentos, sua prestatividade e seu exemplo de
dedicação no trabalho com os Hymenoptera. Um agradecimento também muito especial à
Profa. Uyrá pelas inúmeras ajudas e ensinamentos e também à Jane e Vinícius pela
colaboração nos trabalhos e fora deles.
vi
Ao Instituto de Biologia da Universidade de Brasília, pela disponibilização das
instalações físicas e equipamentos do Laboratório de Microscopia Eletrônica, onde o
projeto foi executado.
A todos os amigos da Microscopia Eletrônica da UnB, que certamente tiveram um
papel fundamental em toda minha formação: Leonora, Gustavo, Suzi, Júlio, Saulo, Carol
Luque, Bruno Arrivabene, Victor, Shélida, Phúblio, Larissa, Ingrid, Elaine, João Victor,
Khesler, Juliana. Também aos que não são do grupo, mas fazem parte dessa galera:
Cláudio, Vivi, Isabel, Marcelo, Tiago, Hugo.
Aos colegas de mestrado que participaram comigo das disciplinas do curso. Em
especial àqueles que também partilharam momentos extracurriculares: Davi, Luis
Gustavo, André, Suzi e Tiago. Também aos colegas de moradia em Campinas: Eduardo,
Rodrigo, José Arroyo, Azize, Barbara, Eliana e Maruska.
Aos meus pais e à minha irmã pelo amor e por todo apoio que me dedicaram
durante toda a minha vida.
À Bruna, pelo amor, carinho, compreensão e por ser sempre minha maior
incentivadora, minha certeza de alegria nos momentos difíceis e minha grande
companheira nos bons momentos.
vii
" Que a inspiração chegue não depende de mim.
A única coisa que posso fazer é garantir
que ela me encontre trabalhando."
viii SUMÁRIO
RESUMO... ix
ABSTRACT... xi
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1 A ordem Hymenoptera e a superfamília Chalcidoidea... 1
1.2 A família Agaonidae e sua interação com plantas do gênero Ficus... 4
1.3 Morfologia do aparelho reprodutor masculino de Hymenoptera... 6
1.4 Estrutura e ultra-estrutura dos espermatozóides de Hymenoptera... 8
1.5 OBJETIVOS... 12
2. ARTIGO Structural and ultrastructural characterization of male reproductive tracts and spermatozoa in fig wasps of the genus Pegoscapus (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA)... 13
3. CONCLUSÕES... 52
ix
Resumo
As vespas da família Agaonidae, são as únicas entre as vespas de figo que polinizam as figueiras possuindo uma identidade espécie-específica em relação à planta. A relação de polinização das vespas do figo com as figueiras é de um mutualismo obrigatório: a planta necessita das vespas para a dispersão do pólen e para a polinização e, por sua vez, as vespas são completamente dependentes dos figos para que seu ciclo de vida se complete. Essa interação representa talvez o melhor exemplo de mutualismo integrado à polinização que se tem conhecimento. Trabalhos de sistemática com estas vespas são de fundamental importância para estudos de ecologia e evolução. Inúmeros estudos têm demonstrado que a estrutura e a ultra-estrutura do trato reprodutor masculino e dos espermatozóides em Hymenoptera apresentam variações suficientes para gerar caracteres adicionais para as análises cladísticas. Sendo assim, análises estruturais e ultra-estruturais foram realizadas a fim de descrever a morfologia do trato reprodutor masculino e dos espermatozóides em três espécies do gênero Pegoscapus. Para tanto, utilizamos as seguintes metodologias: microscopia de luz utilizando campo claro, contraste de fase e fluorescência para DAPI; microscopia eletrônica de transmissão convencional e citoquímica com E-PTA e microscopia eletrônica de varredura. As espécies de Pegoscapus apresentaram o trato reprodutivo interno e a estrutura básica dos espermatozóides similares a outros Chalcidoidea. Os espermatozóides de duas espécies demonstraram as mesmas características enquanto a terceira apresentou diferenças em relação ao comprimento e à espessura da camada extracelular. Além dessas diferenças, todas as espécies analisadas compartilharam de algumas características: vesícula seminal sem divisões de câmaras;
x ausência de estruturas acrossomais no espermatozóide; comprimento da camada extracelular e os microtúbulos centrais sendo os primeiros a terminar na seqüência de desmontagem do axonema em sua porção final. Essas características permitem o estabelecimento de um padrão para o gênero Pegoscapus que será útil para futuros estudos filogenéticos do grupo Chalcidoidea.
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Abstract
The wasps of the family Agaonidae, are the only among fig wasps which pollinate figs, they are also species-specific to their host. The relationship of the pollinating fig wasps with their host fig tree is an obligate mutualism: the tree relies on the wasps for pollen dispersal and pollination, and in turn the wasps are completely dependent on the fig for the completion of their life cycle. This interaction represents perhaps the most tightly integrated pollination mutualism that is known. Systematic works on these wasps are of fundamental importance to ecological and evolutionary studies. Numerous investigations have demonstrated that structure and ultrastructure of the male reproductive tract and spermatozoa in Hymenoptera furnish sufficient variations to provide additional characters for cladistic analysis. Thus, structural and ultrastructural studies were carried out to describe the morphology of the male reproductive tract and the spermatozoa in three species of the genus Pegoscapus. For this study, we employed the methods: light microscopy using bright-field, phase-contrast and DAPI fluorescence; transmission electron microscopy with conventional preparations and cytochemistry (E-PTA) and scanning electron microscopy. Pegoscapus species presented the internal reproductive tract features and the basic sperm structure similar to that of other Chalcidoidea. The spermatozoa of two
Pegoscapus species showed the same features while the other presented differences in
length and in extracellular sheath thickness. Besides these differences, all species analyzed share some characteristics: the seminal vesicle not divided in chambers; the absence of acrosomal structures in the spermatozoa; the length of the extracellular sheath and the central microtubules being the firsts to terminate in the sequence of microtubular cutoff at
xii the final axonemal portion. These characteristics permit the establishment of a pattern for the genus Pegoscapus that will be useful for phylogenetic studies in Chalcidoidea.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 A ordem Hymenoptera e a superfamília Chalcidoidea
Hymenoptera é uma das maiores ordens de insetos apresentando mais de 100.000 espécies já descritas, estimando-se que existam pelo menos 250.000 espécies no mundo (Hanson & Gauld, 1995). A ordem é dividida em duas subordens, Symphyta e Apocrita. Os Symphyta, com pouco mais de 5% das espécies descritas, são considerados um grupo basal, e os Apocrita, contendo a maioria das espécies conhecidas, dividem-se em Aculeata e Parasítica. Os Aculeata compreendem as abelhas, formigas e vespas e são considerados os mais derivados dentre os Hymenoptera, por apresentarem fêmeas com ferrão originado de modificações do ovipositor e os Parasítica são constituídos por todos os Apocrita que não tiverem o ovipositor modificado em ferrão (Hanson & Gauld, 1995).
Segundo Hanson (1995), os Hymenoptera contêm mais espécies de interesse às atividades humanas do que qualquer outra ordem de insetos. Os membros fitófagos da ordem constituem um importante grupo, principalmente pelo aspecto da polinização, sendo absolutamente essenciais à manutenção da diversidade das angiospermas (Hanson, 1995). Qualquer redução na diversidade deste grupo de insetos causará seguramente um impacto ambiental pelo desaparecimento de várias espécies vegetais. Entretanto, impacto mais direto será sobre a alimentação humana, pois aproximadamente 30% desta provém de espécies vegetais polinizadas por membros da ordem Hymenoptera (O´Toole, 1992). Porém, a grande maioria dos Hymenoptera é parasitóide, ou seja, são vespas cujas larvas se desenvolvem no corpo de outro artrópodo, usualmente um inseto ou uma massa única ou
2 gregária de hospedeiros, como ootecas ou massas de larvas galhadoras, acarretando a morte do hospedeiro ao final do desenvolvendo do parasitóide (Godfray, 1994). Muitas dessas espécies desempenham papel importante no equilíbrio natural das populações de seus hospedeiros. Por esta mesma razão os Hymenoptera são de longe os insetos mais usados em programas de controle biológico, tanto de pragas agrícolas como florestais (Hanson, 1995).
Dentro do grupo dos Hymenoptera parasitóides, a superfamília Chalcidoidea é uma das que apresenta maior diversidade de hábitos biológicos, sendo que indivíduos de um mesmo gênero podem apresentar biologia distinta. Algumas famílias são compostas por representantes fitófagos, enquanto outras apresentam larvas predadoras. O fato de grande parte dos Chalcidoidea serem parasitóides passíveis de utilização para controle biológico e de algumas famílias apresentarem espécies consideradas pragas agrícolas ou indesejáveis por atacarem predadores ou parasitóides de pragas (Noyes, 1990), constituem razões que motivam grande parte dos estudos realizados sobre essa superfamília.
Os Chalcidoidea incluem cerca de 22.000 espécies descritas e catalogadas (Noyes, 2001). Considerando-se que esta superfamília é relativamente pouco estudada, há estimativas da existência de 60.000 a 100.000 espécies (Noyes, 1990), extrapolando-se até 500.000 ou 10% das espécies de insetos (Noyes, 2001). É um grupo encontrado no mundo todo, seja pela distribuição natural, seja pela introdução de representantes como agentes de controle biológico. Noyes (2001) lista 3.654 táxons reconhecidos para a região Neotropical, sendo 1.091 para o Brasil.
Apesar da inquestionável importância econômica e ecológica dos Hymenoptera, ainda existem muitas dúvidas ou controvérsias sobre as relações evolutivas dessa ordem de insetos (Dowton & Austin, 1994; Dowton et al., 1997; Ronquist et al., 1999). A primeira e mais completa hipótese filogenética a respeito dos Hymenoptera foi proposta por Rasnitsyn
3 (1988) baseada em uma série de caracteres de morfologia somática. A maioria dos estudos feitos posteriormente tem abrangido apenas grupos específicos dentro da ordem, praticamente não alterando as relações filogenéticas propostas inicialmente por este autor. Ainda, vários estudos utilizando dados moleculares em geral não têm chegado às mesmas hipóteses filogenéticas propostas a partir da morfologia somática (Cameron, 1993; Dowton & Austin, 1994; Dowton et al., 1997; Whitfield,1998).
Não somente a Ordem Hymenoptera, mas também as superfamílias que a compõe são alvos de discussões relativas à sua filogenia. A superfamília Chalcidoidea é um exemplo de grupo onde as relações entre seus membros não são bem resolvidas. A inconstância da sistemática em Chalcidoidea é atribuída, pelo menos em parte, à sua plasticidade morfológica (Gibson et al., 1999), à ausência de um consenso sobre caracteres que permitam decidir a respeito das relações entre os morfotáxons (Gibson, 1990) e às dificuldades encontradas nas definições de gênero e mesmo de espécies, dadas as restrições impostas pelo tamanho diminuto dos indivíduos e confusões decorrentes da existência tanto de espécies crípticas (populações morfologicamente indistintas, mas reprodutivamente isoladas) quanto de espécies que apresentam mais de um aspecto morfológico, dependendo de aspectos como local de oviposição ou hospedeiro. Portanto, acredita-se que um grande número das famílias atuais sejam meramente "grupos de conveniência" (Grissell & Schauff, 1997).
Apesar das discussões sobre os táxons dentro da superfamília, Chalcidoidea é definido como um grupo monofilético (Gibson, 1986), sendo que o número de famílias incluídas neste grupo apresentou variação decorrente de diferentes classificações. A partir do trabalho de Bouček (1988), 21 famílias eram reconhecidas. Porém, Noyes & Valentine (1989) e Gibson (1993) passaram a reconhecer Mymarommatidae como uma nova
4 superfamília (Mymarommatoidea). Sendo assim, atualmente o consenso estabelecido entre os especialistas é de 20 famílias (Hanson & LaSalle, 1995).
1.2 A família Agaonidae e sua interação com plantas do gênero Ficus
Um grupo particular de Chalcidoidea evoluiu em uma associação bastante próxima com as plantas do gênero Ficus. As plantas desse gênero constituem um recurso-chave para o funcionamento de florestas tropicais provendo alimento para animais frugívoros em períodos de escassez de outros frutos (Shanahan et al., 2001). Particularmente, o elevado nível de cálcio dos figos confere uma importância adicional aos vertebrados, sendo ainda, uma fonte potencial de proteína animal fornecida pelas larvas dos insetos associados (Shanahan et al., 2001). Além disso, as figueiras apresentam um papel importante na regeneração e recomposição de comunidades vegetais, atraindo animais frugívoros dispersores de outras espécies vegetais (Kinnaird et al., 1996) e servindo também de hospedeiras de uma comunidade diversa de plantas epífitas (Gonçalves & Waechter, 2003).
A família Agaonidae é definida como um grupo de vespas polinizadoras de Ficus. Existem aproximadamente 750 espécies conhecidas do gênero Ficus Linnaeus, 1753 (Moraceae) em todo o mundo e cada uma está intimamente associada a uma espécie de vespa polinizadora da família Agaonidae (Bouček, 1988). Apesar de existirem espécies de outros hymenópteros como Pteromalidae, Torymidae e Eurytomidae (Chalcidoidea) associadas à sicônios de Ficus, os Agaonidae são os únicos especializados na polinização ativa desta planta (Bouček, 1993). A família Agaonidae apresenta um acentuado dimorfismo sexual, onde as fêmeas apresentam o ovipositor externalizado e os machos são ápteros e geralmente possuem mandíbulas bem desenvolvidas.
5
Os figos são inflorescências (sicônios) que possuem ostíolos através dos quais a fêmea
de Agaonidae, com o pólen sendo transportado, penetra para alcançar as flores. Nesta fase, apenas as flores pistiladas (femininas) encontram-se abertas, sendo então polinizadas. As fêmeas ovipõem nos ovários dessas flores, morrendo após a ovipostura (Gibernau et al., 1996), sendo que as larvas eclodem dos ovos nesses ovários florais. As larvas se mantêm nos ovários alimentando-se do saco embrionário e do endosperma. Quando as vespas adultas emergem, o figo está com as flores estaminas (masculinas) abertas. Os machos emergem primeiro e ficam permanentemente dentro do sicônio, fecundando as fêmeas antes mesmo de elas saírem das galhas (Goulet & Huber, 1993). As fêmeas então emergem e ao deixarem o sicônio, através das aberturas feitas pelos machos, passam pelas flores estaminas e se enchem de pólen (Patel, 1998). Desse modo, a fêmea leva o pólen para outra inflorescência reiniciando o ciclo (Weiblen, 2002). A interação Ficus – vespas é considerada um dos exemplos mais extremos de mutualismo entre planta e inseto (Weiblen, 2002).
As vespas não-polinizadoras, em sua maioria, também são fitófagas e alimentam-se do endosperma no ovário das plantas, seja como galhadoras, seja como cleptoparasitas. Estas espécies não penetram no sicônio pelo ostíolo e sim ovipositam através da sua parede. Nestas subfamílias, o grau de especificidade com a planta hospedeira é variável (Hanson & Gaud, 1995).
Agaonidae é registrada principalmente nas áreas tropicais e subtropicais do mundo: nas ilhas do Oceano Pacífico e do Índico, nas Américas, do sul dos EUA até a Argentina; no Velho Mundo, nos países Mediterrâneos, África e sul da Ásia (Noyes, 2001). Existem aproximadamente 140 espécies de figos nas Américas, classificados em dois subgêneros:
6 Wiebes (1995) aponta dois gêneros: Tetrapus, com 6 espécies, e Pegoscapus, com 35 espécies (em 6 complexos). Tetrapus é associado à Pharmacosycea e Pegoscapus à
Urostigma.
A classificação de Agaonidae é considerada um tanto quanto confusa (Grissell & Schauff, 1997). As vespas polinizadoras de Ficus, como também grande parte do grupo de vespas não-polinizadoras são classificadas como integrantes da família Agaonidae de acordo com Bouček (1988, 1993). Segundo este autor, Agaonidae inclui 6 subfamílias que totalizam 757 espécies: Agaoninae, Epichrysomallinae, Otitesellinae, Sycoecinae, Sycophaginae e Sycorictinae. Porém, estudos moleculares mais recentes têm demonstrado que Agaonidae, como definido por Bouček (1988, 1993), trata-se de um grupo não monofilético (Machado 1998; Rasplus et al., 1998) sendo que, com exceção de Agaoninae, os demais grupos têm posições variáveis. A exemplo, Sycoecinae, Otitesellinae & Sycoryctinae são considerados por estudos moleculares como pertencentes à família Pteromalidae (Rasplus et al., 1998; Campbell et al., 2000).
1.3 Morfologia do aparelho reprodutor masculino de Hymenoptera
Em geral, o aparelho reprodutor masculino dos Hymenoptera é constituído por dois testículos, dois reservatórios seminais e por duas glândulas acessórias, todos conectados entre si por meio de ductos. Os testículos podem variar na sua forma, de esférica a fusiforme e são bastante desenvolvidos na fase de pupa e nos adultos jovens, sofrendo, freqüentemente, uma degeneração gradativa até a completa regressão ao final de sua maturidade sexual. São constituídos por folículos, que podem variar em número, forma e tamanho de acordo com os diferentes grupos taxonômicos. Por exemplo, todas as espécies
7 de vespas parasíticas até hoje observadas, possuem apenas um folículo (Lino-Neto, informação pessoal). Já em outros grupos taxonômicos como em Vespidae e na maioria dos Apoidea são observados três folículos com exceção de Apidae onde são observados quatro folículos por testículo (Ferreira et al., 2004). Esse número é bastante constante dentro de um mesmo grupo, porém, podem ser observadas espécies com valores discrepantes, como é o caso de Apis mellifera (Apidae) que possui cerca de 250 folículos e Hypanthidium
rubriventris (Megachilidae) que possui cerca de 54 folículos (Lino-Neto, informação
pessoal). Sendo assim, o número de folículos testiculares constitui um dado passível de uso na separação de alguns táxons dentro da ordem Hymenoptera (Ferreira et al., 2004).
Nos insetos, os espermatozóides são transferidos dos testículos para as vesículas seminais onde ficam armazenados e sofrem pequenas modificações até a cópula. As vesículas seminais são regiões especializadas do ducto deferente, que nos Hymenoptera pode compreender apenas uma porção dilatada deste ou todo o ducto deferente. Na maioria dos Chalcidoidea já observados, a vesícula seminal é dividida em duas câmaras (Gerling & Legner, 1968; Damiens & Boivin, 2005). Essas câmaras separadas têm funções distintas, enquanto a porção anterior tem função de reservatório de espermatozóides, a posterior atua no controle da ejaculação (Gerling & Legner, 1968; Baer & Boomsma, 2004). Assim, os espermatozóides são liberados aos poucos permitindo a cópula de um único macho com várias fêmeas em uma rápida sucessão (King, 1987). As glândulas acessórias, assim como os demais órgãos do sistema reprodutivo, apresentam grande diversidade morfológica, podendo até mesmo estarem ausentes, como nas abelhas da tribo Meliponini (Ferreira et al., 2004).
8 1.4 Estrutura e ultra-estrutura dos espermatozóides de Hymenoptera.
De modo geral, os espermatozóides dos Hymenoptera são semelhantes àqueles considerados típicos para os Pterygota (Baccetti, 1972). A representação esquemática do espermatozóide típico de Hymenoptera é mostrada na Figura 1. Eles são finos e geralmente muito longos, apresentando regiões de cabeça e cauda com aproximadamente o mesmo diâmetro. A região da cabeça é formada anteriormente por um acrossoma seguido pelo núcleo (Quicke et al., 1992). O acrossoma, em geral, é formado pela vesícula acrossomal e, pelo perforatorium, o qual tem a base inserida em uma cavidade na porção anterior do núcleo. O núcleo também é geralmente bastante longo e com a cromatina muito elétron densa e bastante compacta. Na maioria dos Hymenoptera, o flagelo é formado por um axonema, dois derivados mitocondriais e dois corpos acessórios. O axonema apresenta 9 + 9 + 2 microtúbulos: sendo nove túbulos acessórios simples, nove duplas periféricas e dois microtúbulos centrais simples. Os dois derivados mitocondriais geralmente apresentam cristas, podendo conter material paracristalino. Eles também podem ou não ser iguais em diâmetro e comprimento (Wheeler et al., 1990; Quicke et al., 1992; Newman & Quicke, 1998). Os dois corpos acessórios (Baccetti, 1972) são estruturas longas, situadas entre os derivados mitocondriais e o axonema e, geralmente, possuem formato aproximadamente triangular, em corte transversal.
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Fig 1. Representação esquemática do espermatozóide de Apis mellifera segundo Cruz-Hofling et al., (1970), apresentando os padrões típicos de Hymenoptera. Lateralmente micrografias de secções transversais de diferentes porções. acr: acrossoma; ac: adjunto do centríolo; af: filamento acrossomico (perforatório); c: centríolo; cd: corpos deltóides (corpos acessórios); dm: derivado mitocondrial; fa: flagelo; ma: matriz paracristalina; n: núcleo.
Nos espermatozóides dos Chalcidoidea já estudados, diferente da maioria dos Hymenoptera, o núcleo, os derivados mitocondriais e o axonema apresentam um curso em espiral conforme demonstrado na figura 2 (Wilkes & Lee, 1965; Hogge & King, 1975; Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto & Dolder 2001a). Estes apresentam também uma camada extracelular cobrindo o acrossoma (quando presente) e a parte anterior do núcleo (Lino-neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto & Dolder, 2001a). A
10 interface cabeça-flagelo apresenta o padrão simétrico, onde o adjunto do centríolo antecede o axonema e os dois derivados mitocondriais. Estes derivados mitocondriais apresentam também o diâmetro bastante semelhante (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto & Dolder, 2001a).
Fig 2. Representação esquemática do espermatozóide típico de Chalcidoidea. Modificado de Wilkes & Lee (1965).
11 Os aspectos morfológicos do espermatozóide são característicos da espécie que o produz, constituindo um caráter único de identidade para a espécie (Carcupino et al., 1995; Jamieson et al., 1999). Sendo assim, a ultra-estrutura desta célula vem sendo largamente utilizada em estudos taxonômicos e filogenéticos de vários grupos de animais incluindo os insetos (Dallai, 1979; Dallai & Afzelius, 1995; Carcupino et al., 1995; Jamieson et al., 1999). Em Hymenoptera, cada vez mais se tem demonstrado que a diversidade morfológica dos espermatozóides é suficiente para compor um sistema de caracteres (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a,b; Lino-Neto & Dolder 2001a,b, 2002; Báo et al., 2004; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b, 2007; Fiorillo et al., 2005). Associado a outros, esse sistema poderá ser usado em estudos filogenéticos para resolver vários pontos controversos das relações evolutivas dos Hymenoptera.
Em Chalcidoidea, são relativamente poucos os trabalhos relacionados à ultra-estrutura de seus espermatozóides, podendo ser citados os trabalhos de Hogge & King (1975) com representante da família Pteromalidae, Lino-Neto et. al. (1999) com representante da família Eurytomidae, Lino-Neto et al., (2000a) e Lino-Neto & Dolder (2001a) com representantes de Trichogrammatidae, e alguns trabalhos com poucos detalhes ultra-estruturais como os de Wilkes & Lee (1965) com Eulophidae e de Lingmei & Dunsu (1987) com Trichogrammatidae. Porém, apesar de poucos, estes trabalhos já apontam que o espermatozóide também apresenta uma diversidade ultra-estrutural suficiente para fornecer um sistema de caracteres (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto & Dolder, 2001a).
12 1.5 OBJETIVOS
O presente trabalho tem por objetivo geral ampliar as informações que possam contribuir para um melhor conhecimento da biologia e taxonomia do gênero Pegoscapus, representante da família Agaonidae. Assim, buscar também novos caracteres que possam ser utilizados para estudos filogenéticos da superfamília Chalcidoidea e também da ordem Hymenoptera.
Para tanto, o trabalho teve como objetivos específicos:
• Descrever a anatomia e a histologia do sistema reprodutor masculino de três espécies representantes do gênero Pegoscapus;
• Caracterizar a estrutura e ultra-estrutura dos espermatozóides dessas espécies; • Comparar os dados morfológicos obtidos com os existentes para outros Chalcidoidea, analisando caracteres que possam contribuir para futuras análises filogenéticas.
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2. ARTIGO
Submetido para publicação no periódico Micron.
Structural and ultrastructural characterization of male reproductive tracts and spermatozoa in fig wasps of the genus Pegoscapus (HYMENOPTERA,
CHALCIDOIDEA).
14 Structural and ultrastructural characterization of male reproductive tracts and spermatozoa in fig wasps of the genus Pegoscapus (HYMENOPTERA, CHALCIDOIDEA).
B. S. Fiorillo1,2; J. Lino-Neto3; S. N. Báo2
1 Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Estrutural, Institute of
Biology, CP 6109, State University of Campinas - UNICAMP, São Paulo, CEP: 13083-970, Brazil. brunofiorillo@yahoo.com.br
2 Department of Cellular Biology, Institute of Biological Sciences, University of
Brasília, Distrito Federal, CEP: 70919-970, Brazil. snbao@unb.br
3 Department of General Biology, Federal University of Viçosa, Minas Gerais,
CEP:365570-000, Brazil. linoneto@ufv.br
Running head: Reproductive tract and spermatozoa of Pegoscapus.
Keywords: Ultrastructure; Spermatozoa; Reproductive tract; Pegoscapus; Chalcidoidea; Ficus pertusa; Ficus obtusifolia; Ficus citrifolia.
Correspondence to: Profª. Sônia Nair Báo
Laboratório de Microscopia Eletrônica Departamento de Biologia Celular - Instituto de Ciências Biológicas
Universidade de Brasília, Brasília, Distrito Federal - Brazil. CEP: 70919-970
15 Abstract
The three Pegoscapus species present the same internal reproductive tract features comprising testes with a single testicular tubule, seminal vesicles, vasa
deferentia, accessory glands and an ejaculatory duct. The seminal vesicle presents two morphologically distinct portions although they do not resemble the separate chambers found in other Chalcidoidea. The anterior portion of the seminal vesicle presents a prominent epithelium and stores the mature spermatozoa, while the posterior region is formed by a thicker muscular sheath that acts on the ejaculation. The sexual maturation in Pegoscapus is achieved at the emergence, when the testicular degeneration occurs. The spermatozoa of Pegoscapus present a basic structure similar to that of other Chalcidoidea. In Pegoscapus sp1. and
Pegoscapus sp2. they present the same features, whereas P. tonduzi comprises some different characteristics. It measures approximately 160 µm in Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2, while in P. tonduzi the spermatozoa measure about 360 µm. The extracellular sheath thickness is another difference among the species. While Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2. present a thick extracellular sheath, in P. tonduzi this sheath is very thin resulting in a large space intervening between the extracellular sheath and the nucleus. Despite these differences, the three species analyzed share some characteristics which allows the establishment of an identity to the spermatozoon of the genus Pegoscapus: the seminal vesicle not divided in chambers; the absence of acrosomal structures in the spermatozoa; the length of the extracellular sheath; the central microtubules being the firsts to terminate in the sequence of microtubular cutoff at the final axonemal portion.
16 Introduction
Fig wasp is a term applied to chalcid wasps that exclusively breed in figs, which are the enclosed inflorescence of fig trees. The members of the family Agaonidae are the only among fig wasps which pollinate figs (Bouček, 1993). The interaction between figs (Ficus: Moraceae) and fig pollinating wasps (Agaonidae, Chalcidoidea) represents perhaps the most tightly integrated pollination mutualism that is known (Ramirez, 1970; Wiebes, 1979; Weiblen, 2002; Cook and Rasplus, 2003). Ficus is one of the most diverse genera of flowering plants (Berg and Wiebes, 1992; Harrison, 2005). The nearly 750 described species of Ficus (Berg, 1989) occur worldwide in tropical and subtropical regions, and are considered “keystone” species in tropical forests due to their continual production of fruit, which is essential to a large number of frugivores (Korine et al., 2000). Figs depend on female wasps to pollinate the flowers and thereby initiate seed production (Herre and West, 1997; Herre, 1999). The mated female wasps, in turn, rely on the developing fig inflorescence to breed their offspring, since each wasp larva consumes the contents of one would-be seed.
The observation that related species of wasps generally pollinate related species of figs has led to the proposal of strict-sense coevolution between the two groups (Ramirez, 1974; Wiebes, 1979, 1982; Berg and Wiebes, 1992). However, the existing classifications of figs and their pollinators are based on characters that are often intimately involved in their mutualistic interactions. Therefore, the apparent congruence observed in their current classifications might simply reflect reciprocal adaptations leading to convergent evolution (Van Noort and Compton,
17 1996). Fortunately, other data can provide independent characters for reconstructing phylogenies and rigorously testing evolutionary hypotheses concerning figs and their pollinators.
Systematic work on both Ficus and its associated insects is of fundamental importance to ecological and evolutionary studies. In this sense, the Ficus taxa of the Asian-Australian and African regions have been revised albeit the identity of the taxa is still problematical (Berg, 1989). Even in relation to fig wasps, systematics of Neotropical species is controversial. The classification of some fig wasp species is uncertain and the determination of host plants is unclear (Wiebes, 1995).
The superfamily Chalcidoidea is one of the most speciose and biologically diverse group of insects (Grissell and Schauff, 1997). It accounts for roughly one-third of the world’s parasitic species of Hymenoptera (LaSalle and Gauld, 1991). In spite of its considerable importance to applied entomology, the knowledge of evolutionary relationships among chalcidoids is still in its infancy (Grissell and Schauff, 1997); as a consequence, the pattern of relationships is vague and the placement of several subfamilies and genera is a subject of disagreement. According to Heraty et al. (1997) new character systems are needed to resolve the relationships among families and subfamilies of Chalcidoidea. However, very little has so far been done and the pattern of relationships is still vague for most groups (Grissell and Schauff, 1997), perhaps because their morphological plasticity and extreme reduction in size.
Several of these uncertainties about the evolutionary relationships within the fig wasps and within Chalcidoidea probably will be resolved with the inclusion of
18 new morphological characters, and the analyses of sperm ultrastructure may reveal helpful data (Carcupino et al., 1995; Jamieson et al., 1999). Indeed, some recent studies have demonstrated that the structure and ultrastructure of spermatozoa of Chalcidoidea furnish sufficient variations to provide additional characters for cladistic analysis (Hogge and King, 1975; Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Lino-Neto and Dolder, 2001b), in accordance with other works addressing the sperm ultrastructure of varied Hymenoptera (Dallai and Afzelius, 1995; Jamieson et al., 1999; Lino-Neto et al., 2000b; Lino-Neto and Dolder, 2001a, 2002; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b, 2007; Báo et al., 2004; Araújo et al., 2005b; Fiorillo et al., 2005).
In the present study, we describe the structure and ultrastructure of the male reproductive tract and the spermatozoa in genus Pegoscapus, providing some additional data about the reproduction of the group besides revealing some data that may be useful for future studies in taxonomy and phylogeny of Agaonidae, especially within Chalcidoidea.
Materials and Methods
Pupae and adult virgin males of Pegoscapus sp1., pollinator of Ficus
obtusifolia; Pegoscapus sp2., pollinator of Ficus pertusa and Pegoscapus tonduzi which pollinates Ficus citrifolia (Pereira et al., 2000, referred to as F. eximia) were obtained from strangler figs (subgenus Urostigma, section Americana) collected in the vicinity of the Campinas State University campus, Campinas, SP and São
19 Paulo University campus, Ribeirão Preto, SP, Brazil, between February 1997 and February 2005. Ripe figs were collected from the trees, cut in half, and placed in Petri dishes to allow the wasps to emerge.
Transmission electron microscopy
The seminal vesicles were dissected and fixed for 4h in a solution containing 2.5% glutaraldehyde, 3% sucrose, 0.2% picric acid and 5 mM CaCl2 in 0.1 M
sodium cacodylate buffer at pH 7.2. After rising in buffer, they were post-fixed with 1% osmium tetroxide in the same buffer for 1 h. Dehydration was carried out in acetone, followed by embedding in Epon 812 resin. Ultrathin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and observed using a Jeol 1011 transmission electron microscope, operating at 80 kV.
For detection of basic proteins, the ethanolic phosphotungstic acid method (E-PTA) was applied. Seminal vesicles were fixed in 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer at pH 7.2, for 24 h at 4°C. After washing in the same buffer and dehydrating in alcohol, the material was treated en bloc with a solution of 2% PTA in absolute ethanol for 2 h at room temperature and embedded in Epon 812 resin. Ultrathin sections were observed unstained and partly stained with uranyl acetate and lead citrate.
20
Scanning electron microscopy
Spermatozoa collected from the seminal vesicle were spread on a coverglass slip, fixed in 2.5% glutaraldehyde, dehydrated in acetone, dried to the critical point and sputter-coated with gold. They were observed using LEO VP1430 and Jeol 840A scanning electron microscopes.
Light microscopy
The reproductive tract of the specimens was dissected and photographed. The material processed for transmission electron microscopy was also sectioned for light microscopy. Semi-thin sections were stained with toluidine blue and photographed with an Axiophot Zeiss Microscope equipped with a Zeiss Axiocam MRc digital camera and the Axiovision 4.5 software.
Dissected seminal vesicles were smeared on clean glass microscope slides, to release the sperm within it, and fixed in solution of 4% (wt/vol) paraformaldehyde in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.2. After drying at room temperature, the preparations were observed in a photomicroscope (Olympus, BX60), equipped with phase contrast.
To access nucleus measurements, some of these preparations were stained during 15 min with 0.2 µg/ml 4, 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) in PBS, washed, and mounted with Vectashield. They were then examined in an epifluorescence microscope (Olympus, BX60) equipped with a BP 360-370 nm excitation filter.
21 Results
Reproductive tract
The three analyzed species do not present any difference in their reproductive tracts. The anatomy of the internal reproductive tract of the
Pegoscapus adult male comprises: paired degenerated testes with reduced volume, seminal vesicles, vasa deferentia, accessory glands and an ejaculatory duct (Figs. 1A and B). Each testis contains a single testicular tubule (seminiferous tubule) that forms a projection into the seminal vesicle (Figs. 1A, B and D). The anterior portion of the seminal vesicle stores the mature spermatozoa until copulation and then the posterior region empties into the vas deferens (Figs. 1B-D). Accessory glands join the vasa deferentia near their ends and, posteriorly, the paired vasa deferentia join to form the ejaculatory duct (Figs. 1A and B).
The sexual maturation of Pegoscapus, which occurs close to the emergence, involves the cessation of spermiogenesis, the migration of spermatozoa to the seminal vesicles and the testicular degeneration. Before emergence, the wasp males present the testes full of spermatozoa, being more voluminous than the seminal vesicles, which are empty (Figs. 1A and B). In contrast, in newly emerged males the seminal vesicle lumen is filled with spermatozoa immersed in an amorphous material and the testes present a degenerated appearance (Figs. 1C and D). Thus, migration of the spermatozoa and degeneration of testes result in seminal vesicles larger than the testes after the emergence (Figs. 1C and D).
22 The seminal vesicle is a specialized region consisting of a globular enlargement of the anterior region of the vas deferens (Figs. 1A and B). It presents two distinct portions (Fig. 1B) comprising a double layered wall: an inner epithelium and an outer muscular sheath (Figs. 2A-C). The anterior portion bears a thin muscular layer (Figs. 2A and B), while the posterior region consists of a narrow epithelium and a thicker muscular sheath (Fig. 2C). The epithelium comprises a single layer of polarized columnar cells covered with microvilli-like projections at their luminal surface (Fig. 2B). These cells present some septate junctions in the contacts between the neighboring cells (Fig. 2A). The nucleus is irregularly shaped and it is located at the cell basal region (Figs. 2A and B). In the luminal region, the spermatozoa are stored individually and dispersed in an amorphous material of median electron density and no sperm bundles can be observed (Figs. 2A-C).
Spermatozoa
The spermatozoon of Pegoscapus is represented diagrammatically in the Figure 3. The spermatozoa are long and slender cells. In P. tonduzi they measure approximately 360 µm (Fig. 4A), while in Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2. spermatozoa measure about 160 µm (Fig. 4B). The spermatozoon is helicoidally twisted (Figs. 4G, 5D-F) and comprises a head region consisting of an extracellular sheath and the nucleus (Figs. 4H-S) and a flagellar region that includes axoneme, centriolar adjunct and paired mitochondrial derivatives (Figs. 5A-L).
The anterior region of the spermatozoon is made up of an extracellular sheath with 10 µm in length that covers the anterior portion of the nucleus (Figs.
23 4E-P). Due to the presence of this sheath, the anterior portion of the spermatozoon is larger than the others portions, as better revealed by scanning electron microscopy images (Figs. 4E and F). The extracellular sheath, from which innumerable filaments irradiate (Figs. 4H and L), varies in thickness among
Pegoscapus species, being thicker in Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2. (Figs. 4M-P) than in P. tonduzi (Figs. 4H-L). In transverse sections, this difference results in a larger space intervening between the extracellular sheath and the nucleus in P. tonduzi (Figs. 4H-L). The classical acrosomal structures (acrosomic vesicle and perforatorium) are absent in Pegoscapus species analyzed herein.
The nucleus possesses an elongated and electron-dense appearance (Figs. 4Q-S) measuring about 30 µm when stained with DAPI in light microscopy observations (Figs. 4C and D). It is helicoidally twisted and this twisting is more prominent in Pegoscapus tonduzi (Fig. 4C). The nucleus is circular in transverse sections (Fig. 4R); however it is irregularly shaped due to its twist in some sections (Fig. 4S). Cross sections also show that the nucleus narrows along its length in direction of its anterior tip (Figs. 4J, K, N-P). In E-PTA treatment,, the spermatozoan nucleus appeared completely negatively stained whereas the extracellular sheath was positively (Figs. 6A-E), which can be clearly revealed by the increased electron-density at the thicker extracellular sheath of Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2 (Figs. 6A andC).
The nuclear posterior truncated extremity is attached to the flagellum by a small, uniformly compact and electrondense centriolar adjunct measuring about 200 nm in length (Figs. 5A and B). The centriolar adjunct presents a posterior
24 projection that can be observed in transverse sections together with the beginning of the mitochondrial derivatives (Fig. 5C). This structure is E-PTA positively stained (Fig. 6D). The centriole is probably localized immediately above the nuclear tip, covered by the centriolar adjunct until the beginning of the axoneme (data not shown).
The axoneme follows the typical 9+9+2 pattern of microtubule arrangement (Figs. 5H-J). The microtubules are twisted and the spiraling is clearly evident in transverse sections, since not all of the doublets can be simultaneously sectioned at perfect right angles (Figs. 5H-L). The microtubules are E-PTA positive, while the intertubular material is negative (Fig. 6F). In the final posterior region of the sperm, the axoneme becomes gradually disorganized, with the central microtubules terminating first and the nine doublets last (Figs. 5J-L).
The mitocondrial derivatives of Pegoscapus coil around the twisted axoneme (Figs. 5D-F). In longitudinal sections as well as in scanning electron micrographs, they can be seen coiling regularly around the axoneme with a periodicity about 2 µm long (Figs. 5D and E). They are alike in diameter and placed very close to the axoneme (Fig. 5H). Anteriorly, the mitochondrial derivatives begin together in contact with the posterior extremity of the centriolar adjunct (Figs. 5B and C). Although their anterior extremities are coincident, the posterior extension of the mitochondrial derivatives varies slightly between each other, and the longest one terminates about 3 µm above the axoneme tip (Figs. 5G, I and J).
25 Discussion
The process of sexual maturation in Pegoscapus agreed with those observed for some Hymenoptera (Araujo et al., 2005a; Boomsma et al., 2005). The spermatogenesis occurs only during the pupation and ceases at the sexual maturity, which for some Chalcidoidea is reached at the male emergence. The process of spermatic maturation occurs at the testicular tubule and after the emergence, the mature spermatozoa are located at the seminal vesicle and the testes have a degenerated appearance.
The morphology of the male reproductive apparatus in Pegoscapus is similar to that of other Chalcidoidea (Damiens and Boivin, 2005). In fact, the general morphology of the apparatus has been maintained through the order Hymenoptera, but the number of testicular tubules per testis varies considerably among hymenopterans groups. The occurrence of three tubules was reported for some bee families (Ferreira et al., 2004; Araujo et al., 2005a) whereas other bees present four tubules per testis, such as Mellitidae, some Megachilidae and Apidae s. stricto (Roig-Alsina and Michener, 1993; Ferreira et al., 2004), with the exception of Apis mellifera with about 250 tubules (Chapman, 1998). On the other hand, this number varies from one to twenty-five in Formicidae (Wheeler and Krutzsch, 1992). Interestingly, in Pegoscapus only one tubule is observed per testis, such as in all Chalcidoidea species observed to date (Lino-Neto, personal communication).
26 In almost all Chalcidoidea the seminal vesicle comprises two separate chambers, which can also be observed in Spalangia cameroni (Gerling and Legner, 1968) and Trichogramma evanescens (Damiens and Boivin, 2005). Baer and Boomsma (2004) nominated these chambers as: sperm reservoir (the upper part) and ejaculatory section (the lower part). However, in Pegoscapus, the seminal vesicle is not divided in separate chambers, but it presents two morphologically distinct portions sharing similarities with the previously described chambers. The anterior portion stores the mature spermatozoa and participates in the reabsorption and digestion of defective cells (spermiophagy) and sperm fluid, as reported for other species (Viscuso et al., 1999; Dallacqua and Cruz-Landim, 2003; Araujo et al., 2005a). On the other hand, the posterior seminal vesicle portion acts on the ejaculation (Gerling and Legner, 1968; Baer and Boomsma, 2004). The presence of this second portion, probably guarantees that only a little amount of the stored spermatozoa is ejaculated per sexual copulation. This restraint than would be essential to provide each male with the potential to mate with many females in rapid succession (King, 1987).
The basic structure of the spermatozoa of Pegoscapus is similar to that of other Chalcidoidea (Wilkes and Lee, 1965; Hogge and King, 1975; Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b) whose nucleus is twisted into a helix and the mitochondrial derivatives coil around the twisted axoneme.
The spermatozoa of Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2. present the same features and there are no sperm characters that could distinguish these
27 species. On the other hand, in Pegoscapus tonduzi the spermatozoa comprise some characteristics that diverge from the sperm of other Pegoscapus species analyzed. The morphometric data show the first discordant character. The total length of Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2. spermatozoa is about a half of the Pegoscapus tonduzi sperm length. However, the head region presents the same length for the three species. This aspect is also observed in Trichogrammatidae (Lino-neto et al., 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b) where differences in sperm length are concentrated in the flagellar region.
The extracellular sheath thickness also differs among these Pegoscapus species. As occurs in Eurytomidae (Lino-neto et al., 1999) and Trichogrammatidae (Lino-neto et al., 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b), Pegoscapus sp1. and
Pegoscapus sp2. present a thick extracellular sheath that is juxtaposed to the nucleus. Conversely, in P. tonduzi this sheath is very thin resulting in a larger space intervening between the extracellular sheath and the nucleus, a characteristic that has not yet been observed for other Chalcidoidea.
The head region comprising the anterior portion of the E-PTA negative nucleus surrounded by an E-PTA positive extracellular sheath bearing some filaments is a common characteristic for chalcidoids (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b). The acrosomal structures were not observed in Pegoscapus, as they were also not distinguished in Trichogramma
pretiosum (Lino-Neto et al., 2000a). For the other Chalcidoidea already observed, the acrosomal structures are very small, measuring less than 2 µm (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b).
28 In relation to the flagellar structures, Pegoscapus spermatozoon follows the pattern observed in the other Chalcidoidea already described, where the centriolar adjunct precedes both mitochondrial derivatives and the axoneme (symmetric pattern), attaching these structures to the posterior end of the nucleus (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b). In contrast, most Hymenoptera possess an elongated centriolar adjunct located laterally to the axoneme and interposed between the nuclear base and the tip of one of the mitochondrial derivatives in an asymmetric pattern (Newman and Quicke, 1998, 1999a,b; Lino-Neto et al., 2000b; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b; Báo et al., 2004; Fiorillo et al., 2005). Still, in these hymenopterans, the anterior extremities of the axonemal microtubules are parallel to the adjunct and not inserted into it, as in chalcidoids (Lino-Neto et al., 1999; 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b). Moreover, the centriole is probably inserted into the centriolar adjunct in all Chalcidoidea, which is clearly observed in some species such as in Eulophidae representants Palmisticus elaeisis and Trichospilus diatraeae (Lino-Neto, personal communication). Unfortunately, for most chalcidoids including Pegoscapus, the high electron density of the centriolar adjunct difficults the centriole observation.
The 9+9+2 microtubular pattern is conserved throughout Hymenoptera, but the sequence of their cutoff in the final axonemal portion differentiates the major groups. In all Aculeata, the central microtubules and the nine doublets terminate first, followed by the accessory microtubules (Lino-Neto et al., 2000b; Zama et al., 2001, 2004, 2005a,b; 2007 Báo et al., 2004, Araújo et al., 2005b; Fiorillo et al., 2005, Mancini et al., 2006) although they all terminate approximately together in ants (Wheeler et al., 1990; Lino-Neto and Dolder, 2002). In the Parasitica the nine
29 doublets are the last microtubules to be lost at the flagellum tip (Newman and Quicke, 1998; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b). The other Chalcidoidea previously analyzed showed a similar pattern of microtubules cutoff, with the accessory microtubules terminating first (Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b). Nevertheless, in Pegoscapus the central microtubules disappear prior to the others.
The mitochondrial derivatives in Pegoscapus are also very similar to those of the remaining chalcidoids. They are oval and alike in diameter, lying very close to the axoneme and coiling regularly around the axoneme (Quicke et al., 1992; Lino-Neto et al., 1999, 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b). The coiling periodicity is the same as observed in the Eurytomidae Bephratelloides pomorum (Lino-Neto et al., 1999). However in Trichogrammatidae (Lino-Neto et al., 2000a; Lino-Neto and Dolder, 2001b) this periodicity is a little different, with about 1.5 µm. The mitochondrial derivatives begin together, in a small distance from the nucleus and in contact with the posterior base of the centriolar adjunct.
Finally, there are two significant differences among these species: the sperm length and the extracellular sheath thickness. The sperm length presents large variations for Chalcidoidea and the thicker extracellular sheath, which is observed for Pegoscapus sp1. and Pegoscapus sp2., is a plesiomorphic character. For these reasons, these differences may not indicate the phylogenetic relationship among these Pegoscapus species. Under these circumstances, additional works describing spermatozoal structure and ultrastructure of species of Pegoscapus genera are necessary to determine the real degree of variability in sperm ultrastructure between Pegoscapus, shedding light on the phylogenetic
30 relationships of fig wasps. On the other hand, the three species analyzed in this study share various structural and ultrastructural characteristics of the male reproductive tracts and spermatozoa which allows the establishment of an identity to the genus Pegoscapus: the seminal vesicle not divided chambers; the length of the extracellular sheath; the absence of acrosomal structures; the central microtubules being the firsts to terminate in the sequence of microtubular cutoff at the final axonemal portion. The establishment of such pattern for the genus
Pegoscapus will be useful for future phylogenetic studies in Chalcidoidea.
Acknowledgements
We would like to thank Prof. Dr. Rodrigo Augusto Santinelo Pereira (USP - Ribeirão Preto) for supplying the insects. This research was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Empreendimentos Científico e Tecnológico (FINATEC), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP)
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40 Figure Legends
FIGURE 1. Internal reproductive tract of pupae (A,B) and adult (C,D) males of
Pegoscapus. (A) The complete reproductive tract presenting voluminous testes full of sperm cysts. (B) Single unit of the tract showing the localization of anterior (line) and posterior (dotted line) portions of the seminal vesicle. (C) Section of the reproductive tract showing the testes presenting a degenerated appearance. (D) Section of the testis/seminal vesicle interface. Arrow indicates the testis projection into the seminal vesicle. Ed: ejaculatory duct; G: accessory gland; Sv: seminal vesicle; T: testis; Vd: vas deferens. Scale bars: A-B: 50 µm; C-D: 20 µm.
