AVALIAÇÃO DA FERMENTAÇÃO DE GLICEROL POR Enterobacter sp. PARA A PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO E ETANOL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DA FERMENTAÇÃO DE GLICEROL POR Enterobacter sp. PARA A PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO E ETANOL
AUTOR: José Augusto Zorel
ORIENTADORA: Prof. Dra. Silvana de Queiroz Silva
Ouro Preto – MG, Fevereiro de 2019
Trabalho de doutorado submetido ao programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia, área de concentração: Biotecnologia Industrial.
Zorel, J. A. Desenvolvimento
iii DESENVOLVIMENTO
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-Organismos (LBTM) – ICEB/NUPEB/DECBI/UFOP e no Laboratório de Química Tecnológica e Ambiental (LQTA) – DEQUI/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científio e Tecnológico (CNPq), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Zorel, J. A. Epígrafe
iv
"Educação é uma descoberta progressiva de nossa própria ignorância." Voltaire
v Agradecimentos
À minha esposa, Cyntia, a quem eu devo muito do que sou hoje, por estar comigo e ter me ajudado a crescer. Aos meus filhos, João Renato e Henrique, meus grilos falantes, aos quais agradeço por minha vida, esperança, felicidade e consciência.
Aos meus pais, meu irmão e à toda a minha família, por tudo que fizeram por mim.
À minha orientadora, professora Silvana, uma das melhores pessoas que já conheci. Agradeço por ter me aceitado como aluno, pela orientação e pela compreensão durante os últimos sete anos.
Ao professor Leandro Moreira, pelas conversas, pela ajuda e pelo exemplo. Aos outros professores dos quais tenho o prazer de ter sido aluno, professor William de Castro-Borges, professor José Maurício e “seu” Cézar.
Aos demais professores do nosso grupo e a todos os integrantes do LBTM, em especial, Ana Cláudia, Érica e Letícia, por toda a ajuda nos momentos mais complicados. Agradeço àqueles que muitas vezes foram minhas mãos durante esse tempo, Thanmilly, Isabela, Marília e Heitor.
Agradeço aos dois colombianos sem os quais esse trabalho não seria o mesmo, Ivon e Oscar Herrera, dois grandes amigos, aos quais sou grato por toda a ajuda técnica e pessoal.
Aos professores do Laboratório de Química Tecnológica e Ambiental e aos colegas do Galpão. Agradeço não só pelo uso da estrutura física do laboratório, mas principalmente por toda a ajuda que recebi dos integrantes do laboratório.
Ao casal Bruno e Ananda, por tudo que me ensinaram e por todo o apoio que me deram.
Ao meu grande amigo e duas vezes doutor Diego Roberto, a quem nem sei como agradecer pelo companheirismo e não consigo listar quantas vezes me ajudou.
A todos que participaram desse período, mesmo que não mencionados aqui, agradeço pela presença e pelos ensinamentos.
Zorel, J. A. Índice vi ÍNDICE RESUMO ... ix ABSTRACT ... x LISTA DE ABREVIATURAS ... xi LISTA DE FIGURAS ... x
LISTA DE TABELAS ... xiii
CAPÍTULO 1 ... 2
1. Revisão de Literatura ... 2
1.1. Aumento da demanda energética e produção de biocombustíveis ... 2
1.2. Ascensão do biodiesel e a questão da co-produção de glicerol residual ... 3
1.3. Transformação de indústrias de produção de biodiesel em biorrefinarias ... 7
1.4. Produção e vantagens do hidrogênio ... 11
1.5. Fermentação do glicerol a hidrogênio , etanol e outros metabólitos ... 14
1.6. Alternativas para melhoria da bioconversão do glicerol ... 19
1.6.1. Engenharia metabólica e análise do fluxo metabólico ... 20
1.6.2. Escolha do tipo de cultura microbiana e otimização das condições de fermentação ... 24 CAPÍTULO 2 ... 27 2.1. Justificativa ... 27 2.2. Objetivos ... 29 Objetivo geral ... 29 Objetivos específicos ... 29 CAPÍTULO 3 ... 30 3. Metodologia ... 30
3.1. Isolamento das bactérias ... 31
3.2. Caracterização morfológica e bioquímica dos isolados ... 31
3.3. Sequenciamento do gene rRNA 16S ... 31
3.4. Ensaios de crescimento bacteriano, consumo de glicerol e produção de H2 e outros metabólitos em reatores em batelada sob diferentes condições ... 32
3.4.1. Determinação da massa seca de células ... 33
3.4.2. Verificação da influência da concentração inicial de glicerol sobre o metabolismo dos isolados ... 34
3.4.3. Avaliação dos impactos de contaminantes do glicerol bruto sobre o metabolismo do isolado Enterobacter sp. 9R ... 35
3.4.5. Avaliação dos efeitos da quantidade inicial de células sobre o metabolismo do isolado Enterobacter sp. 9R ... 35
vii
3.4.6. Avaliação dos efeitos da aerobiose e do pH sobre o metabolismo do isolado
Enterobacter sp. 9R... 36
3.5. Técnicas analíticas ... 36
3.5.1. Coleta da fase líquida e quantificação dos compostos por cromatografia líquida ... 36
3.5.2. Coleta da fase gasosa e determinação do H2 produzido ... 37
3.6. Cálculos, planejamento experimental e modelagem ... 37
3.6.1. Análise da cinética de produção de H2 ... 37
3.6.2. Análise da cinética de consumo de substrato e crescimento microbiano ... 38
3.6.3. Equação estequiométrica da conversão de glicerol em produtos ... 39
3.6.4. Planejamento experimental e determinação dos parâmetros de desejabilidade para a obtenção de diferentes produtos de interesse ... 39
CAPÍTULO 4 ... 42
Resultados e Discussão ... 42
4.1. Isolamento, caracterização e análises metabólicas iniciais ... 42
4.1.1. Obtenção e caracterização morfológica, bioquímica e molecular dos isolados obtidos no meio EMB ... 42
4.2. Influência da concentração inicial de glicerol na produção de H2, no crescimento microbiano e no consumo de substrato ... 44
4.2.1. Influência da concentração inicial de glicerol sobre os produtos da fermentação e a relação desses com a produção de H2 ... 51
4.2.1.1. Ácido fórmico ... 56
4.2.1.2. Ácido lático e 1,3-propanodiol ... 57
4.2.1.3. Etanol ... 58
4.2.1.4. Ácido acético ... 59
4.2.1.5. Ácido succínico e 2,3-butanodiol ... 61
4.2.1.6. Consumo de glicerol ... 62
4.2.1.7. Alterações do direcionamento de carbono e indicativos de inibição para o isolado 9R ... 63
4.3. Avaliação dos efeitos de alterações nos parâmetros ambientais sobre o metabolismo de glicerol pelo isolado Enterobacter sp. 9R ... 71
4.3.1. Avaliação da possibilidade de pré-adaptação do metabolismo do isolado 9R induzida pela concentração de substrato no pré-inóculo ... 72
4.3.2. Influência do pH inicial e da oxigenação durante a conversão do glicerol pelo isolado 9R ... 75
4.3.3. Influência de impurezas do glicerol bruto sobre a conversão do glicerol a H2 e subprodutos ... 79
Zorel, J. A. Índice
viii
4.4. Melhorias na conversão de glicerol a hidrogênio e etanol pelo isolado Enterobacter sp.
9R ... 87
4.4.1. Avaliação de alterações na produção de hidrogênio e etanol e consumo de glicerol com auxílio do planejamento experimental ... 88
4.4.1.1. Produção de etanol ... 92
4.4.1.2. Produção de hidrogênio ... 95
4.4.1.3. Consumo de glicerol ... 100
4.4.2. Aumento do consumo de glicerol e da produção de hidrogênio e etanol pelo isolado 9R com uso da função de desejabilidade ... 105
CAPÍTULO 5 ... 119
5.1. Conclusões ... 119
5.2. Sugestões para Pesquisas Futuras ... 120
ix RESUMO
A despeito da imagem de sustentabilidade que acompanha o biodiesel, o balanço de massa de seu ciclo de vida ainda está longe de ser fechado, de modo que, com a expansão do biodiesel e em dependência de fatores do mercado, o glicerol pode ser considerado como coproduto ou resíduo. Portanto, a expansão sustentável das indústrias de biodiesel depende do tratamento do glicerol. Nesse sentido, a fermentação escura pode aliar o tratamento do glicerol à produção de monômeros, energia e biocombustíveis (como H2 e etanol), aumentando a gama de produtos das indústrias de biodiesel. No entanto, esse processo ainda é dificultado pela presença de impurezas e pelas altas concentrações necessárias para conferir aplicabilidade ao processo. Desse modo, esse trabalho avaliou as alterações no metabolismo fermentativo de dois isolados de Enterobacter sp., 3R e 9R, em resposta a variadas concentrações iniciais de glicerol (5, 10 e 40 gL-1; G5, G10 e G40, respectivamente). Apresentando-se como mais promissor, o isolado 9R foi avaliado quanto aos efeitos de impurezas, pH, oxigenação e quantidade de células sobre a bioconversão do glicerol. Os resultados desses testes serviram como base para definir os fatores pH, quantidade de células e concentração de glicerol como os mais influentes sobre o desempenho do isolado. Em seguida, foi realizada a busca dos melhores valores para esses parâmetros com uso da matriz de Doehlert e da função de desejabilidade. Desse modo, foram definidas três configurações visando diferentes objetivos: HEPG (maior consumo de glicerol e produção simultânea de H2, etanol e 1,3-PDO; sendo os valores ótimos: pH 7,85; 27,5 GI; 0,009 Inóc.); PG (maior consumo de glicerol e produção de 1,3-PDO; sendo os valores ótimos: pH 7,70; 41,0 GI; 0,009 Inóc.); e HEG (maior consumo de glicerol e produção simultânea de H2 e etanol; sendo os valores ótimos: pH 8,00; 23,0 GI; 0,009 Inóc.). Os resultados dos ensaios determinados pela função de desejabilidade ficaram de acordo com o estipulado, sendo obtidos os valores máximos de 59,4 mmol L-1 para a produção de H
2 e 7,6 gL-1 (164,28 mmolL-1) para a produção de etanol pela configuração HEG. O consumo de glicerol também foi otimizado, alcançando na condição HEG o valor de 22,5 gL-1 (98,0 % do glicerol adicionado) em menos 24 horas. Essa condição possibilitou a obtenção de 0,42 L de etanol e 59,04 L H2 por kg de glicerol consumido. Espera-se que os resultados obtidos nesse trabalho sirvam como base para os próximos estudos desenvolvidos por nosso grupo no campo de bioconversão do glicerol.
Zorel, J. A. Abstract
x ABSTRACT
In spite of the sustainability image that accompanies biodiesel, the mass balance of its life cycle is still far from being closed, so that with the expansion of biodiesel and depending on market factors, glycerol can be considered as co-product or waste. Therefore, the sustainable expansion of the biodiesel industries depends on the treatment of glycerol. In this context, dark fermentation can combine the treatment of glycerol with the production of building-blocks, energy and biofuels (such as H2 and ethanol), increasing the range of products of biodiesel industries. However, this process is still hampered by the presence of impurities and by the high concentrations required to confer applicability to the process. Thus, this work evaluated the alterations in the fermentative metabolism of two isolates of Enterobacter sp., 3R and 9R, in response to different initial concentrations of glycerol (5, 10 e 40 gL-1; G5, G10 e G40, respectively). Enterobacter sp. 9R, the most promising isolate, was evaluated for the effects of impurities, pH, oxygenation and number of cells on glycerol bioconversion. These tests served as a basis to define the factors pH, number of cells and concentration of glycerol as the most influential on the performance of the isolate. Then, these parameters were optimized using the Doehlert matrix and the desirability function. Next, three configurations were defined aiming at different objectives: HEPG (optimization of glycerol consumption and simultaneous production of H2, ethanol and 1,3-PDO); being the optimal values pH 7.85; 27.5 GI; 0.009 Inoc); PG (optimization of glycerol consumption and 1,3-PDO production; being the optimal values pH 7.70; 41.0 GI; 0.009 Inoc); and HEG (optimization of glycerol consumption and simultaneous production of H2 and ethanol; being the optimal values pH 8.00; 23.0 GI; 0.009 Inoc.). The results of the tests determined by the desirability function were in agreement with the stipulated, obtaining the maximum values of 59.4 mmol H2 and 7.6 gL-1 ethanol (164.3 mmolL-1) at the HEG configuration. Glycerol consumption has also been optimized, reaching the value of 22.5 gL-1 (98.0% of glycerol added) in less 24 hours at the HEG condition. In this condition, isolate 9R produced 0.42 L of ethanol and 59.04 L H2 per kg of glycerol consumed. It is hoped that the results obtained in this work will serve as a basis for the next studies developed by our group in the field of glycerol bioconversion.
xi LISTA DE ABREVIATURAS 1,2-PDO – 1,2-propanodiol 1,3-PDO – 1,3-propanodiol 2,3-BDO – 2,3-butanodiol 3-HPA – 3-hidroxipropionaldeído ABF – Análise do Balanço de Fluxo ACM – Análise de Controle Metabólico AFM – Análise do Fluxo Metabólico AGL – Ácidos Graxos Livres
CNTP – Condições Normais de Temperatura e Pressão DHA – Dihidroxiacetona
DHAP – Dihidroxiacetona-fosfato EMB – Eosin methylene blue
GC-TCD – Gas Chromatography-Thermal Conductivity Detector HPLC – High Performance Liquid Chromatography
NFOR – NADH:Ferredoxina oxido-redutase PCR – Polymerase Chain Reaction
PEP – fosfoenolpiruvato, do inglês phosphoenolpyruvate PFL – Piruvato-formiato liase
qRT-PCR – quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction PFOR – Piruvato:ferredoxina oxido-redutase
TSI – Triple Sugar and Iron
UASB – Upflow Anaerobic Sludge Blanket VP – Voges-Proskauer
Zorel, J. A. Lista de Figuras
x LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Processo de transesterificação para a produção de biodiesel. Na presença de um
catalisador alcalino, o metanol reage com a porção de ácidos graxos que compõe o triglicéride, formando moléculas de ésteres metílicos (biodiesel) e glicerol. Adaptado de Silva e colaboradores, 2009...5
Figura 2. Conceito simplificado da integração de processos em uma biorrefinaria.
Adaptado de Azapagic, 2014...8
Figura 3. Esquema simplificado dos processos de produção biológica de hidrogênio por
fotofermentação (esquerda) e fermentação escura (direita). Adaptado de Hallenbeck e Ghosh (2009)...13
Figura 4. Esquema simplificado da fermentação do glicerol em compostos de interesse
comercial e vias de produção de hidrogênio por anaeróbios facultativos (via PFL) e anaeróbios estritos (via PFOR). DHA, dihidroxiacetona; DHAP, dihidroxiacetona-fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato. Setas pontilhadas indicam a existência de várias reações. Adaptado de Silva e colaboradores (2009), Clomburg e Gonzalez (2013) e Goyal e colaboradores (2013)...15
Figura 5. Fluxograma dos experimentos realizados nesse trabalho...30 Figura 6. Curvas de crescimento a 5 (triângulos), 10 e 14 (quadrados) e 40 gL-1 (círculos) de glicerol para os isolados 3R (A) e 9R (B)...45
Figura 7. Produção cumulativa de H2 (mmol) da fermentação de 5 (triângulos), 10 e 14 (quadrados) e 40 gL-1 (círculos) de glicerol para os isolados 3R (A) e 9R (B)...46
Figura 8. Ajuste do modelo modificado de Gompertz aos dados experimentais do ensaio
G10 para o isolado 9R, apresentado aqui como exemplo dos ajustes obtidos para os demais experimentos...47
Figura 9. Monitoramento dos produtos da fermentação do glicerol em diferentes
concentrações iniciais pelo isolado 3R. ▲ = G5 (glicerol inicial a 5 gL-1) e ■ = G10...54
Figura 10. Monitoramento dos produtos da fermentação do glicerol em diferentes
concentrações iniciais pelo isolado 9R. ▲ = G5 (glicerol inicial a 5,00 gL-1), ■ = G10 (glicerol inicial a 14,00 gL-1) e ● = G40 (glicerol inicial a 40,00 gL-1)...55
Figura 11. Modelagem dos dados de crescimento microbiano e consumo de glicerol nas
condições (A) G5, (B) G10 e (C) G40. ○ – Dados experimentais do crescimento da biomassa; + – dados experimentais do consumo de glicerol; linha contínua – modelagem do crescimento da biomassa; linha tracejada – modelagem do consumo de glicerol. (A) e
xi
(B) dados modelados pelo modelo de Monod e (C) dados modelados pelo modelo de Luong...67
Figura 12. Distribuição do fluxo de carbono pelo isolado 9R nas condições G5, G10 e
G40. Esquerda: Rendimento (mol/mol glicerol) de biomassa e produtos produzidos previamente a acetil-CoA. Símbolos abertos: círculo – 1,3-PDO, quadrado – ácido sucínico, triângulo – ácido lático, triângulo invertido - biomassa. Direita: Rendimento (mol/mol glicerol) de produtos derivados de acetil-CoA. Símbolos fechados: círculo – etanol, quadrado – H2, triângulo – ácido fórmico, triângulo invertido – ácido acético. Abaixo: Razão dos rendimentos dos produtos pós acetil-CoA/pré acetil-CoA nas três condições...69
Figura 13. Crescimento (esquerda) e produção de hidrogênio (direita) pelo isolado
Enterobacter sp. 9R sob condições variadas de concentrações iniciais de glicerol para inóculos e ensaios de fermentação...73
Figura 14. Curvas de concentração dos metabólitos solúveis pelo isolado Enterobacter
sp. 9R sob condições variadas de concentrações iniciais de glicerol para inóculos e ensaios de fermentação...74
Figura 15. Crescimento (esquerda) e produção de hidrogênio (direita) pelo isolado
Enterobacter sp. 9R sob condições variadas de pH, oxigenação e concentrações iniciais de glicerol...76
Figura 16. Curvas de concentração dos metabólitos presentes no meio de fermentação do
isolado Enterobacter sp. 9R sob condições variadas de pH, oxigenação e concentrações iniciais de glicerol...78
Figura 17. Crescimento da biomassa (esquerda) e produção de H2 (direita) pelo isolado 9R na presença de impurezas em diferentes concentrações...80
Figura 18. Concentração final dos produtos da fermentação do glicerol a 10 gL-1 pelo isolado 9R na presença de impurezas em diferentes concentrações...82
Figura 19. Consumo de glicerol e metabólitos produzidos após 24 horas de fermentação
de glicerol a 40,00 gL-1 pelo isolado Enterobacter sp. 9R com diferentes concentrações iniciais de inóculo...84
Figura 20. Produção de H2 por uma amostra em uso (esquerda) ou descongelada (direita) do isolado 9R em ensaios durante 4 meses sem contato do isolado com glicerol...86
Figura 21. Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados para a variável resposta YP/S de etanol...94
Zorel, J. A. Lista de Figuras
xii
Figura 22. Superfície de resposta para a variável resposta YP/S de etanol. A variável Inóculo foi fixada em 0,02 gL-1...94
Figura 23. Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados para a variável resposta YP/S de hidrogênio...98
Figura 24. Superfície de resposta para a variável resposta YP/S de hidrogênio. A variável Inóculo foi fixada em 0,02 gL-1...98
Figura 25. Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados para a variável resposta
consumo de glicerol...103
Figura 26. Superfícies de resposta para a variável resposta consumo de glicerol. (Acima)
A variável Inóculo foi fixada em 0,02 gL-1. (Ao centro) A variável Glicerol foi fixada em 27,50 gL-1. (Abaixo) A variável pH foi fixada em 8,0...104
Figura 27. Análise de desejabilidade para a configuração HEPG (maior consumo de
glicerol e produção equilibrada de etanol, H2 e 1,3-PDO)...106
Figura 28. Análise de desejabilidade para a configuração PG (maior consumo de glicerol
e produção de 1,3-PDO)...106
Figura 29. Análise de desejabilidade para a configuração HEG (maior consumo de
glicerol e produção de etanol e H2)...107
Figura 30. Curvas de concentração dos metabólitos solúveis nas configurações HEPG
(●), PG (■) e HEG (▲) durante as 48 horas de fermentação...111
Figura 31. Crescimento e produção de hidrogênio pelo isolado Enterobacter sp. 9R nas
xiii LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição média do glicerol bruto originário de diferentes biomassas e
usinas de produção...6
Tabela 2. Comparação entre diferentes combustíveis em relação à capacidade calorífica
e emissão específica de carbono. Adaptado de Das e colaboradores, 2014...12
Tabela 3. Vantagens da produção de biohidrogênio. Adaptado de Das e colaboradores,
2014...12
Tabela 4. Valores das variáveis pH, concentração inicial de glicerol e inóculo
determinados pelo planejamento experimental de Doehlert...41
Tabela 5. Características morfológicas dos isolados do lodo de um reator anaeróbio
tratando glicerol residual (NUNES, 2014)...42
Tabela 6. Identidade entre a sequência do gene 16S rRNA dos isolados e de espécies de
referência e produção volumétrica de biogás em 24 horas (NUNES, 2014)...43
Tabela 7. Caracterização bioquímica dos isolados 3R e 9R...44 Tabela 8. Dados experimentais e modelados da produção de hidrogênio e dados
experimentais do consumo de glicerol e rendimento de hidrogênio...48
Tabela 9. Concentrações e rendimentos finais (YP/S) dos produtos da fermentação do glicerol pelos isolados 3R e 9R nas condições G5, G10 e G40. Os rendimentos YP/S são dados em mol produto/mol glicerol consumido...52
Tabela 10. Coeficientes estequiométricos de substratos e produtos para as condições G5,
G14 e G40 para o isolado 9R...65
Tabela 11. Parâmetros cinéticos encontrados para os ensaios pelo modelo de Monod
(para G5 e G10) e pelo Modelo de Luong (para G40)...66
Tabela 12. Condições experimentais fornecidas pelo planejamento experimental de
Doehlert e variáveis resposta obtidas para cada ensaio (24h)...90
Tabela 13. Resultados da análise de variância (ANOVA) para a variável resposta YP/S de etanol...93
Tabela 14. Resultados da análise de variância (ANOVA) para a variável resposta YP/S de hidrogênio...97
Tabela 15. Dados obtidos com o modelo modificado de Gompertz e produção máxima
de hidrogênio pelo isolado Enterobacter sp. 9R para os diferentes ensaios determinados pelo planejamento experimental...99
Zorel, J. A. Lista de Tabelas
xiv
Tabela 16. Resultados da análise de variância (ANOVA) para a variável resposta
consumo de glicerol...103
Tabela 17. Condições determinadas pela ferramenta de desejabilidade e quantidades
médias dos produtos obtidos e glicerol consumido para cada configuração com 24 horas de fermentação. HEPG: maior consumo de glicerol e produção equilibrada de H2, etanol e 1,3-PDO; PG: maior consumo de glicerol e favorecimento da produção de 1,3-PDO; e
HEG: maior consumo de glicerol e favorecimento da produção de H2 e etanol...109
Tabela 18. Dados obtidos com o modelo modificado de Gompertz e produção máxima
de hidrogênio pelo isolado Enterobacter sp. 9R para as diferentes configurações determinadas pela função de desejabilidade...113
Tabela 19. Rendimentos de etanol e hidrogênio e taxa volumétrica de produção de
hidrogênio após 24 horas de fermentação do glicerol por Enterobacter sp. 9R...115
Tabela 20. Resultados obtidos para a produção de hidrogênio e/ou etanol por diferentes
2 CAPÍTULO 1
1. Revisão de Literatura
1.1. Aumento da demanda energética e produção de biocombustíveis
A estrutura da sociedade moderna é fundamentada no uso de combustíveis fósseis, principalmente carvão mineral e petróleo, para a geração da energia necessária às atividades cotidianas. Entretanto, além da incerteza sobre a disponibilidade das reservas desses combustíveis, diversos problemas ambientais estão associados à sua produção e consumo (LI et al., 2013). Como exemplo, entre 1970 e 2004, o crescimento da demanda energética para as atividades industriais e de transporte, e do consequente consumo de combustíveis fósseis, aumentou em aproximadamente 70% as emissões mundiais de dióxido de carbono (PHILP et al., 2013). A liberação de grandes quantidades de CO2 na atmosfera é alvo de grandes discussões e, há muitas décadas, é correlacionada a situações como o efeito estufa, o aquecimento global e o aumento do nível do mar (MERCER, 1978; NORDHAUS, 1991).
Levando em consideração os problemas citados, nos últimos anos é crescente a busca por formas alternativas de energia que sejam menos poluentes e que possuam ciclos de renovação mais rápidos, chamadas de energias limpas e renováveis, respectivamente. Entre os principais recursos energéticos renováveis em uso atualmente estão a energia eólica, solar, hidroelétrica e de biomassa – a qual inclui produtos e resíduos agroindustriais e os biocombustíveis (bioetanol e biodiesel). No Brasil, fontes renováveis são de grande importância para a matriz energética, sendo que enquanto a média mundial de geração de energia a partir de tais fontes é de 13%, 46% da energia em nosso país é oriunda de recursos renováveis. Com grande participação nesse percentual, devem ser ressaltados a energia hidrelétrica, os produtos da cana-de-açúcar (principalmente o etanol) e o biodiesel, o qual apresenta aumentos anuais crescentes em sua produção (EPE, 2018).
O uso de biocombustíveis no Brasil teve seu primeiro pico na década de 70, quando, frente à iminência de escassez do petróleo e à instabilidade política dos países produtores, o país iniciou o plano Pró-Álcool, uma medida governamental que, por meio da PETROBRAS, subsidiou a produção e a venda de etanol combustível produzido a partir da cana-de-açúcar. Atualmente, o etanol é consumido em sua forma anidra, a qual é misturada à gasolina no percentual de 27% para aumentar sua octanagem, ou hidratada, podendo ser usado diretamente como combustível (GOLDEMBERG, 2008; MME,
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
3
2018). Em 2009, a produção de etanol alcançou 24 bilhões de litros, alimentando 12,5 milhões de veículos no país e em 2017 foram produzidos mais de 27 bilhões de litros desse biocombustível (EPE, 2018; MORAES, 2011).
Outra alternativa ao uso de derivados de petróleo é o biodiesel, combustível composto de ésteres alquílicos obtidos da transesterificação de ácidos graxos (óleos vegetais e gorduras animais). A possibilidade de mistura do biodiesel ao diesel convencional tem aumentado progressivamente a produção e o consumo desse biocombustível. Em 2012, a produção dos países integrantes da União Europeia alcançou os 3 bilhões de galões, enquanto os Estados Unidos foram responsáveis por 1 bilhão de galões, soma equivalente a aproximadamente 15,2 bilhões de litros (SARMA et al., 2013a).
No Brasil, como efeito do lançamento do Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB) em 2004, entre 2006 e 2012 a produção aumentou de 69 milhões para 2,7 bilhões de litros, sendo que a capacidade de plantas de produção instaladas no país em 2012 chegou a 6,2 bilhões de litros por ano (LEONETI et al., 2012). Segundo o último balanço energético nacional, a produção de biodiesel no país ultrapassou os 4,2 bilhões de litros em 2017 e estima-se que o consumo em 2018 tenha chegado aos 5,3 bilhões de litros (EPE, 2018; MME, 2018). Esse crescimento da produção de biodiesel, apesar de trazer vários benefícios ambientais, acarreta também na geração de maiores quantidades de subprodutos residuais (constituídos principalmente pelo glicerol), os quais necessitam de atenção especial à sua destinação.
1.2. Ascensão do biodiesel e a questão da co-produção de glicerol residual
Em nosso país, desde 2005 o biodiesel vem sendo misturado ao diesel convencional vendido em postos varejistas, sendo que a partir de 2008 a adição de 2 % de biodiesel ao diesel (o chamado B2) tornou-se obrigatória, em 2010 foi elevada para 5 % e atualmente está a 10 %, com aumentos progressivos previstos para os próximos anos, tendo como máximo os 15 % até 2023. Em casos especiais, como uso industrial e agrícola, a legislação regulamenta a adição de 20 a 30 % de biodiesel ao diesel de petróleo. Em países da União Europeia e nos Estados Unidos (outros dois maiores produtores mundiais de biodiesel) o panorama atual e as previsões futuras são similares. Essa condição de obrigatoriedade legal acarretou no aumento da demanda nacional de biodiesel, tornando o Brasil o segundo maior produtor mundial e beneficiando pequenos produtores de grãos com inclusão social e desenvolvimento regional (YAZDANI e GONZALEZ, 2007;
4
LEONETI et al., 2012; NAYLOR e HIGGINS, 2017; MME, 2018; PADULA et al., 2012).
Fundamentado nas promessas de benefícios ambientais e sociais, a afirmação do biodiesel como integrante eminente da matriz energética mundial foi conseguida por meio da confirmação de sua viabilidade econômica. Essa, por envolver questões como o uso de terras que poderiam ser empregadas para a produção de alimentos e estar relacionada diretamente aos preços do petróleo, foi estabelecida e é mantida com o auxílio de diretivas e subsídios políticos e econômicos, principalmente em épocas de baixa no valor de mercado do petróleo (NAYLOR e HIGGINS, 2017) . Além disso, a grande geração de subprodutos, principalmente o glicerol, é um fator ao qual se deve atenção permanente durante a era de produção do biodiesel, a fim de garantir sua sustentabilidade ambiental, sendo o manejo do glicerol considerado ainda como principal gargalo da indústria desse biocombustível (MONTEIRO et al., 2018).
A co-produção de glicerol residual é um fato inerente à maioria dos processos de produção de biodiesel realizados atualmente, visto que esse biocombustível é obtido pela reação de transesterificação (Figura 1) de ácidos graxos, na qual um álcool (metanol ou etanol) e um catalisador alcalino (hidróxido de sódio ou de potássio) são adicionados a uma mistura de triglicérides (óleos vegetais ou gorduras animais). Durante a reação, após interação do catalisador com o álcool, ocorre um processo de substituição acílica nucleofílica, no qual as moléculas de triglicérides são convertidas em glicerol e ésteres alquílicos de ácidos graxos, o biodiesel. Em alguns processos, ao invés do uso de um catalisador básico e um álcool, é empregado diretamente o íon alcóxido do metanol ou outro álcool de cadeia curta. Com aquecimento a 55°C, a reação é completada em aproximadamente 3 horas, sendo necessárias de 24 a 48 horas adicionais para a separação, por sedimentação, dos ésteres e do glicerol (MONTEIRO et al., 2018; SILVA et al., 2009).
Como produto inevitável da reação, o glicerol é gerado na razão de 10 kg para cada 100 kg de biodiesel produzidos. Além da reação de transesterificação, a presença de água e ácidos graxos livres (AGL) em óleos vegetais acarreta na ocorrência da saponificação dos AGL, decorrente de sua reação com o catalisador alcalino (LEUNG et al., 2010). Desse modo, ao final do processo, o principal resíduo da produção de biodiesel é o glicerol bruto, uma mistura de glicerol, sabão, ácidos orgânicos livres, sais inorgânicos, água, ésteres metílicos e metanol, além de mono-, di- e triglicérides que não reagiram. Tanto a composição quanto a proporção dos componentes podem variar
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
5
dependendo da matéria-prima, método de transesterificação e condições de separação do glicerol residual (CHATZIFRAGKOU e PAPANIKOLAOU, 2012). A tabela 1 mostra os principais componentes do glicerol bruto bem como a faixa de variação de sua porcentagem em dependência do tipo de óleo vegetal empregado para a produção de biodiesel.
Figura 1. Processo de transesterificação para a produção de biodiesel. Na presença de um
catalisador alcalino o metanol reage com a porção de ácidos graxos que compõe o triglicéride, formando moléculas de ésteres metílicos (biodiesel) e glicerol. Adaptado de Silva e colaboradores, 2009.
Inicialmente considerado um co-produto, o glicerol bruto, após purificação, era vendido a indústrias de cosméticos, de bebidas, farmacêuticas e alimentícias (YAZDANI et al., 2010). No entanto, o crescimento da oferta do glicerol bruto, que acompanhou a expansão do setor do biodiesel, fez com que seu preço no mercado internacional caísse em aproximadamente dez vezes apenas entre 2004 e 2006 (YAZDANI e GONZALEZ, 2007). No Brasil, em 2005, o preço médio do glicerol era de R$ 3,00/kg, sendo que em 2012 (ano em que foram produzidos 270 milhões de litros de glicerol residual de biodiesel) esse valor chegou a R$ 0,60/kg. A despeito de variações positivas e negativas no valor de mercado do glicerol em decorrência da falência de indústrias que produziam esse composto antes do crescimento das usinas de biodiesel, dados do ano de 2017 mostram que o resultado líquido dessas alternâncias foi a queda do preço do glicerol para R$ 0,25/kg (Biomercado, 2017).
6
Tabela 1. Composição média do glicerol bruto originário de diferentes biomassas e
usinas de produção. Composto Porcentagem (m/m) Glicerol 22,90 – 96,50 Metanol 0,00 – 22,70 Sais 0,01 – 6,60 Água 1,0 – 28,7 Sabão 0,0 – 31,4
Ésteres alquílicos de ácidos graxos 0,5 –28,8
Glicerídeos 0,4 –7,0
Ácidos graxos livres 0,0 – 34,8
Cinzas 0,0 – 29,4
Fonte: Adaptado de Chen e Walker, 2011; Hansen et al., 2009; Hu et al., 2012; Kerr et al., 2009; Liang et al., 2010; Mothes et al., 2007; Rywinska et al., 2016; Venkataramanan et al., 2012.
A queda no preço, aliada aos altos custos de purificação do glicerol bruto, aumentou drasticamente a razão oferta/demanda desse subproduto, transformando o que era antes um co-produto em um resíduo da produção de biodiesel para o qual o descarte sem tratamento pode acarretar em problemas ambientais. Tendo em vista o crescimento previsto para a indústria de biodiesel e os valores do glicerol bruto até o ano de 2017, era consenso que a expansão dessas usinas dependeria fortemente do desenvolvimento de métodos para a conversão do glicerol bruto residual em outros produtos com maior valor agregado (HUANG et al., 2017; LEONETI et al., 2012).
Tal conjuntura impulsionou o desenvolvimento de vários estudos na área de conversão do glicerol. No entanto, variações inesperadas e abruptas nos preços tanto para o glicerol quanto para os produtos oriundos de sua transformação devem ser considerados devido às flutuações do mercado, de modo que a busca por métodos de conversão do glicerol deve ser justificada não só por agregar valor a este substrato mas também por aumentar a gama de commodities que pode ser oferecida por uma indústria de biodiesel, convertendo-a, de fato, em uma biorrefinaria.
Além disso, apesar de ocorrer em menores proporções, o glicerol também é um resíduo da produção de etanol, o mais importante biocombustível nacional. Durante a conversão de açúcares em etanol, as leveduras responsáveis pelo processo produzem
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
7
glicerol, o qual é encontrado na concentração de 2% (m/v) no caldo ao final da fermentação e, caso seja de interesse da usina, também pode ser direcionado para um processo de transformação (YAZDANI et al., 2010).
Portanto, a despeito das oscilações de mercado, a conversão do glicerol em outros produtos químicos apresenta-se como uma solução tanto para o problema de destinação de resíduos quanto para a consolidação de indústrias de biodiesel como biorrefinarias, nas quais todos os compostos gerados possam ser considerados produtos de interesse econômico, seja de maneira imediata ou a médio e longo prazo.
1.3. Transformação de indústrias de produção de biodiesel em biorrefinarias
A possibilidade de conversão do glicerol residual de biodiesel em produtos com maior potencial de mercado ou que sirvam como recurso energético propicia a transformação de indústrias de biodiesel em biorrefinarias. O conceito de biorrefinaria pode ser definido como uma unidade fabril na qual a biomassa é convertida em um produto final e os resíduos do processo podem ser transformados – por meio de vias termoquímicas ou bioquímicas – em produtos químicos, energia (eletricidade ou calor) e biocombustíveis, de modo que tudo que resulte do processo produtivo apresente algum ganho para a usina (AZAPAGIC, 2014). Uma explicação simplificada do conceito de biorrefinaria aplicado às indústrias de biodiesel pode ser visto na figura 2.
Processos de transformação do glicerol residual em outros bens de capital ou consumo podem ser realizados através de aplicação direta, transformação química ou conversão microbiana. Um exemplo de aplicação direta do glicerol é seu emprego na alimentação de gado. No entanto, a presença de metanol e outros compostos no glicerol bruto exige o pré-tratamento do resíduo para a diminuição de efeitos danosos desses contaminantes sobre os animais (YANG et al., 2012).
Devido às suas características químicas peculiares, o glicerol pode ser convertido em compostos químicos variados, tanto por meios termoquímicos quanto por processos biológicos. Entre as conversões termoquímicas, podem ser citados os processos de polimerização, reforma a vapor, eterização, oligomerização e pirólise. Apesar de úteis na obtenção de produtos como polímeros cíclicos, acroleína, acetaldeído, alcanos e hidrogênio, essas reações ocorrem em temperaturas entre 90 e 650°C, sendo que algumas são dependentes de catalisadores químicos e de alterações na pressão do sistema, fatores que elevam os gastos com o processo (ALSAMAD et al., 2018; MEDEIROS et al., 2011). Wu e colaboradores (2013) demonstraram a produção simultânea de hidrogênio e
8
nanotubos de carbono a partir da reforma do glicerol, processo que exige o uso de catalisadores químicos complexos e temperaturas de 700 °C. Como visto, a despeito dos produtos obtidos, os processos termoquímicos requerem, além de catalisadores, alto gasto energético para a operação dos reatores.
Figura 2. Conceito simplificado da integração de processos em uma biorrefinaria.
Adaptado de Azapagic, 2014.
Por outro lado, tais exigências não são encontradas em processos biológicos de conversão do glicerol residual. Na literatura são descritas várias linhagens bacterianas com a capacidade de metabolizar o glicerol na presença ou ausência de aceptores finais de elétrons (em processos de respiração ou fermentação, respectivamente) sendo que os processos fermentativos são mais interessantes pois, além de produzirem diferentes metabólitos e não necessitarem de gastos com a aeração dos reatores, também apresentam a possibilidade de co-produção sequencial de biogás contendo hidrogênio e/ou metano (ALMEIDA et al., 2012 DAMS et al., 2018; DIKSHIT et al., 2018; LENG et al., 2019; SARMA et al., 2013; SPEECE, 1983). Entre as bactérias com a capacidade de fermentação do glicerol encontram-se espécies dos gêneros Klebsiella, Citrobacter,
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
9
Anaerobiospirillum e Gluconobacter, entre outras (DIKSHIT et al., 2018; MURARKA et al., 2008)
Além dessas bactérias, Dharmadi e colaboradores (2006) demonstraram a capacidade da bactéria Escherichia coli de utilizar o glicerol na ausência de aceptores finais de elétrons, ao contrário do que já tinha sido apresentado em outros trabalhos. Como discutido por Dharmadi e colaboradores (2006), a fermentação de glicerol por E. coli ainda não havia sido verificada devido à faixa de pH empregada para os meios de cultura. Segundo os autores, a alteração do pH de valores básicos para valores ácidos possibilitou a degradação anaeróbia do glicerol devido ao aumento da atividade do complexo FHL em condições ácidas, acarretando na maior disponibilidade de CO2, um composto importante para várias vias anabólicas em E. coli.
No entanto, trabalhos posteriores de outro grupo mostraram que a degradação do glicerol por E. coli pode ocorrer em faixas iniciais de pH básico, auxiliando na atividade das enzimas glicerol desidrogenase e dihidroxiacetona quinase (primeiras a atuarem na degradação do substrato) e que a consequente acidificação intracelular causada pela formação de ácidos orgânicos possibilitaria a atuação do complexo FHL (TRAN et al., 2015). Levando em consideração o conhecimento sobre o genoma e a similaridades entre o metabolismo de E. coli e de outros micro-organismos (principalmente da família Enterobacteriacea), tal descoberta apresenta grande importância para estudos sobre as vias metabólicas de conversão do glicerol, mesmo que as taxas de metabolização do glicerol por essa bactéria ainda sejam muito menores que as encontradas para outras espécies (ITO et al., 2005; TRAN et al., 2014).
Quando comparado a açúcares como glicose, xilose, arabinose e sacarose (substratos comuns utilizados em biorrefinarias lignocelulósicas), o uso de glicerol em processos de fermentação apresenta a vantagem de este ser um co-produto inerente a um biocombustível em expansão contínua no mercado além de não ser usado como recurso para alimentação humana. Outro ponto a favor do uso de glicerol para a produção biológica de compostos químicos é o maior grau de redução (κ) de seus átomos de carbono (κ = 4,67) em relação aos açúcares supracitados – todos com κ = 4,00 – e também em relação à massa celular bacteriana (κ = 4,30) (CLOMBURG e GONZALEZ, 2013; NIELSEN et al., 2003).
O grau de redução por carbono (κ) de uma molécula pode ser interpretado como o número de elétrons disponíveis por unidade de carbono ou, em outras palavras, a “quantidade de energia” disponível por carbono do substrato orgânico. Visto o maior κ
10
do glicerol em relação à massa celular, seu consumo pelos micro-organismos acarreta no excesso de equivalentes redutores durante a produção de biomassa bacteriana. Para garantir a manutenção do estado redox intracelular, os micro-organismos redirecionam tais equivalentes redutores para vias que possam consumi-los, possibilitando uma maior obtenção de compostos mais reduzidos (tais como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol e propanol) quando comparado à fermentação da glicose (CLOMBURG e GONZALEZ, 2013; HUANG et al., 2017).
Por meio de fenômenos de regulação enzimática, esse maior grau de redução do glicerol facilita a produção simultânea de etanol e hidrogênio por anaeróbios facultativos, o que é mais difícil de se obter quando a glicose é usada como substrato, além de também ser possível a produção de demais produtos comuns da fermentação (como lactato, succinato, formiato, propanol e butanol) (CLOMBURG e GONZALEZ, 2013; LI et al., 2013; NIELSEN et al., 2003). Detalhes da fermentação do glicerol e da regulação enzimática serão apresentados a frente, no item 1.5.
Além dos biocombustíveis e outros compostos orgânicos, alguns trabalhos mostram a possibilidade de produção direta de eletricidade durante a degradação do glicerol com o uso de sistemas bioeletroquímicos, como as células de combustível microbianas. Esses sistemas aliam o tratamento de resíduos à produção de energia elétrica por meio da oxidação bacteriana da matéria orgânica em câmaras similares às baterias elétricas. O processo consiste da respiração anaeróbia do substrato – e consequente liberação de prótons e elétrons – por micro-organismos aderidos a um anodo, o qual serve como receptor final de elétrons. A migração dos prótons (através da solução) e dos elétrons (através de um circuito externo) até o cátodo dá origem a uma corrente elétrica (NIMJE et al., 2011). Nimje e colaboradores (2011), reportaram a capacidade de geração de 60 mW/m2 de potência por meio da degradação do glicerol bruto pela bactéria Bacillus subtilis. Nesse âmbito, Chookaew e colaboradores (2014) demonstraram a possibilidade de produção sequencial de H2 e eletricidade em um sistema de dois estágios para a conversão de glicerol residual em bioenergia por uma comunidade mista. No sistema reportado pelos autores, o resíduo foi primeiramente fermentado a hidrogênio (com rendimento de 0,55 mol de H2/mol de glicerol) e ácidos orgânicos. Na segunda etapa, os ácidos foram empregados como substrato em uma célula de combustível microbiana, gerando uma potência de 92 mW/m2.
Como demonstrado nos trabalhos discutidos acima, a bioconversão do glicerol residual é uma alternativa interessante para a geração de diferentes bens de interesse
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
11
econômico por indústrias de biodiesel, por meio da produção de energia, biocombustíveis e de outros compostos com potencial de mercado. Em nosso trabalho, o foco foi voltado principalmente para a produção de hidrogênio, etanol e 1,3-propanodiol, compostos que podem ser produzidos simultaneamente e apresentam características físico-químicas que facilitam sua separação.
1.4. Produção e vantagens do hidrogênio
Entre os biocombustíveis que podem ser obtidos por meio da fermentação do glicerol residual, o hidrogênio é um produto ao qual é dedicada atenção crescente nos últimos anos. Frente a outros biocombustíveis, o biohidrogênio mostra três principais vantagens que o tornam um promissor carreador de energia limpo e renovável. Em primeiro lugar, o H2 é o único combustível livre de carbono, de modo que durante sua conversão no interior de células de combustão o principal resíduo gerado é a água, sem que haja liberação de gases causadores do efeito estufa. Em segundo lugar, o dióxido de carbono emitido na produção biológica de hidrogênio pode ser facilmente capturado, visto que é liberado durante a produção – e não durante o consumo – desse biocombustível. Outra vantagem do hidrogênio é sua maior capacidade calorífica (em termos mássicos) em comparação a combustíveis fósseis convencionais ou mesmo os demais biocombustíveis (BIELEN et al., 2013; VALLE et al., 2017). As principais diferenças entre o H2 e outros combustíveis podem ser vistas na Tabela 2.
Tabela 2. Comparação entre diferentes combustíveis em relação à capacidade calorífica
e emissão específica de carbono. Adaptado de Das e colaboradores, 2014.
Combustível Estrutura química Conteúdo de
carbono (% m/m) Capacidade calorífica (MJ/kg) Emissão específica de carbono (kg C/kg combustível) Hidrogênio H2 0,0 141,90 0,00 Etanol C2H5OH 52,0 29,90 0,50 Biodiesel Ésteres alquílicos de ácidos graxos (C12 a C22) 77,0 37,00 0,50 Metanol CH3OH 37,5 22,30 0,50 Metano CH4 75,0 50,00 0,46 Gasolina C4 a C12 74,0 47,40 0,86
12
Como ocorre para outros produtos químicos, o hidrogênio também pode ser obtido por processos termoquímicos de conversão do glicerol ou outros substratos. Para a obtenção de H2 são utilizados praticamente apenas insumos fósseis e, até os dias de hoje, os principais métodos de produção desse gás são: reforma a vapor de gás natural (48%), reforma de óleos e nafta (30%), gaseificação de carvão mineral (18%) e eletrólise da água (3,9%) (DAS e VEZIROGLU, 2008; ŁUKAJTIS et al., 2018; MOHAN e PANDEY, 2013). Contudo, além de muitos desses métodos serem baseados em recursos não renováveis, eles também apresentam as mesmas desvantagens citadas anteriormente para as conversões termoquímicas do glicerol, como a exigência de altas temperaturas e o alto gasto energético. Mesmo o processo de eletrólise da água, que pode usar energia elétrica obtida de geradores eólicos ou fotovoltaicos, apresenta grandes perdas energéticas e emprega na geração de hidrogênio uma forma já refinada de energia (eletricidade), a qual poderia ser usada diretamente para consumo (HALLENBECK, 2009). Por outro lado, a produção biológica de hidrogênio ocorre em condições mais brandas de temperatura e pressão, além de aliar o tratamento de resíduos à produção de H2. Outras vantagens da produção de biohidrogênio são listadas na tabela 3.
Tabela 3. Vantagens da produção de biohidrogênio. Adaptado de Das e colaboradores,
2014.
Vantagens do biohidrogênio Comentário
Naturalidade Produzido por micro-organismos sob condições
ambientais de temperatura e pressão.
Neutralidade Produção não acarreta na emissão de gases causadores do
efeito estufa, desde que o dióxido de carbono seja retido.
Versatilidade Pode ser produzido de uma grande variedade de
substratos, incluindo glicerol residual.
Garantia de substratos Certeza da produção contínua de resíduos em grandes quantidades.
Sustentabilidade Produção e consumo atual não interferem negativamente
em processos futuros.
Segurança energética Redução da dependência energética de países
politicamente instáveis.
Acessibilidade Mais rentável quando comparado aos combustíveis
fósseis.
Eficiência A combustão do H2 é 50% mais eficiente do que da
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
13
Os processos biológicos de produção de H2 podem ser separados em dois principais grupos: os que necessitam de luz (fotofermentação e biofotólise direta ou indireta) ou os que ocorrem na ausência de luz (fermentação escura), sendo que os processos de fotofermentação e fermentação escura recebem maior atenção, devido aos resultados mais promissores (HALLENBECK e GHOSH, 2009; KHETKORN et al., 2017; YANG e WANG, 2018). O esquema simplificado dos dois processos pode ser visto na figura 3.
Figura 3. Esquema simplificado dos processos de produção biológica de hidrogênio por
fotofermentação (esquerda) e fermentação escura (direita). Adaptado de Hallenbeck e Ghosh (2009).
No processo de fotofermentação, bactérias fotossintéticas usam a luz e substratos orgânicos (preferencialmente ácidos carboxílicos) para a obtenção de ATP e elétrons, por meio de um processo chamado fluxo reverso de elétrons. Esses elétrons são usados para reduzir a proteína ferredoxina, a qual, juntamente com as moléculas de ATP geradas, direciona a redução de prótons (H+) a hidrogênio (H2) realizada, com auxílio da enzima nitrogenase na ausência de nitrogênio. Apesar da conversão praticamente completa de alguns substratos a H2 e CO2, a operação contínua do processo de fotofermentação depende da exposição constante dos reatores à luz, necessidade que acarreta em gastos adicionais com energia para iluminação. Além disso, os fotobiorreatores têm que ser construídos com materiais acrílicos transparentes e impermeáveis ao hidrogênio, o que
14
também torna o processo mais oneroso (HALLENBECK e GHOSH, 2009; KHETKORN et al., 2017).
Tais desvantagens não são encontradas nos processos de fermentação escura, os quais ocorrem na ausência de luz e podem ser realizados em reatores convencionais, mas também impermeáveis ao hidrogênio. Além disso, devido à variada capacidade de degradação de micro-organismos fermentativos, diferentes tipos de resíduos, inclusive o glicerol bruto, podem ser empregados para a produção de biohidrogênio. Outros resíduos orgânicos (como restos de alimentos, resíduos de suinocultura e bagaço de cana-de-açúcar) também podem ser empregados para a produção biológica de hidrogênio. No entanto, materiais lignocelulósicos (como o bagaço de cana-de-açúcar) requerem métodos de pré-tratamento severos para que seus açúcares se tornem disponíveis para os micro-organismos produtores de hidrogênio, enquanto que resíduos sólidos (como os de suinocultura ou alimentícios) necessitam de moagem e/ou mistura para que possam ser submetidos à fermentação. Por outro lado, o glicerol residual produzido pela indústria de biodiesel pode ser diretamente consumido por micro-organismos fermentativos após a diluição do resíduo e tratamentos menos severos, mostrando-se como um substrato ideal para futura a produção em larga escala de hidrogênio, como já demonstrado para diferentes bactérias (SARMA et al., 2012; YANG e WANG, 2018)
1.5. Fermentação do glicerol a hidrogênio , etanol e outros metabólitos
Como citado anteriormente, o glicerol apresenta características químicas que propiciam a produção biológica não só de hidrogênio, mas de vários bens econômicos, principalmente o etanol, quando a bioconversão é realizada por alguns tipos de enterobactérias. A produção de ácidos e outros compostos orgânicos durante a fermentação escura também pode ser considerada como uma vantagem desse método biológico, visto que esses podem ser purificados e empregados em variados processos químicos ou usados como substrato em uma segunda etapa de produção de hidrogênio, dessa vez por fotofermentação. Alguns trabalhos mostram também a possibilidade de uso do efluente ou das células geradas durante a fermentação escura de diferentes fontes de carbono como substrato para a produção de metano por digestão anaeróbia (BAÊTA et al., 2016; JUNG et al., 2012; LUO et al., 2011; NWACHUKWU et al., 2012; SARMA et al., 2013a). A conversão biológica do glicerol a variados produtos pode ser vista, de maneira simplificada, na figura 4.
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
15
Figura 4. Esquema simplificado da fermentação do glicerol em compostos de interesse
comercial e vias de produção de hidrogênio por anaeróbios facultativos (via PFL) e anaeróbios estritos (via PFOR). DHA, dihidroxiacetona; DHAP, dihidroxiacetona-fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato. Setas pontilhadas indicam a existência de várias reações. Adaptado de Silva e colaboradores (2009), Clomburg e Gonzalez (2013) e Goyal e colaboradores (2013).
As vias de bioconversão de açúcares ou glicerol a hidrogênio apresentam módulos em comum para todas as bactérias, no entanto, algumas diferenças importantes podem ser notadas entre bactérias anaeróbias estritas e anaeróbias facultativas ou mesmo entre membros desses grupos e serão ressaltadas no texto quando necessário (Figura 4) (CLOMBURG e GONZALEZ, 2013; GOYAL et al., 2013).
Após sua internalização, o glicerol pode ser direcionado a três vias principais: produção de massa celular; redução a 1,3-propanodiol pela enzima glicerol desidratase (codificada pelo gene dhaB); ou oxidação a dihidroxiacetona pela enzima glicerol desidrogenase (dhaD). Como durante a produção de massa celular existe a liberação de
16
equivalentes redutores, a via de produção de 1,3-propanodiol serve como um sistema de manutenção do estado redox intracelular, consumindo o excesso desses equivalentes na redução do glicerol (TRINH e SRIENC, 2009). Micro-organismos com a capacidade de fermentar glicerol e que não possuem essa via direcionam o excesso de elétrons para a produção de 1,2-propanodiol, a partir da redução de dihidroxiacetona-fosfato (METSOVITI et al., 2012). A produção de 1,3-PDO é de grande interesse da indústria, visto o seu uso na produção de diferentes poliésteres e fibras têxteis especiais baseadas em um de seus derivados, o politrimetileno tereftalato (PTT), o qual vêm apresentando crescimento contínuo de mercado nos últimos anos (HUANG et al., 2017; WISCHRAL et al., 2016).
A via oxidativa, terceira via de metabolização do glicerol, é empregada pelos micro-organismos para a geração de energia e produção de compostos para o suprimento das demais rotas metabólicas microbianas. Do ponto de vista da produção de ácidos orgânicos, monômeros, hidrogênio e outros combustíveis (como etanol), a via oxidativa é a que apresenta o maior número de estudos e tentativas de manipulação, visto o grande número de etapas (e, consequentemente, de genes e enzimas) envolvidas nos processos de transformação. Além disso, tal processo apresenta grande similaridade com as vias de oxidação de açúcares, sendo, portanto, alvo de vários estudos (ALMEIDA et al., 2012; CLOMBURG e GONZALEZ, 2013; WESTBROOK et al., 2018).
Visto a complexidade da via oxidativa e sua relação com demais vias metabólicas, o rendimento teórico da produção de H2 a partir do glicerol pode variar em dependência dos micro-organismos empregados, das condições do processo e dos co-produtos gerados durante a fermentação. Por exemplo, quando o acetato é o subproduto majoritário da fermentação pela bactéria termofílica Thermotoga maritima podem ser gerados teóricos 4 mol de H2 (e 1 mol de ácido acético) por mol de glicerol, ao passo que a co-produção exclusiva de etanol por E. coli ou Enterobacter sp. resulta na liberação teórica máxima de 1 mol de H2 (junto a 1 mol de etanol) por mol de glicerol consumido (CLOMBURG e GONZALEZ, 2013; DOUNAVIS et al., 2015; MARU et al., 2013). É importante ressaltar que tais valores são baseados no balanço estequiométrico entre produtos e reagentes da conversão de modo que, para sistemas biológicos, esse valor serve como base para comparações, mas pode variar em decorrência do consumo de outras fontes de carbono e da atividade das demais vias metabólicas dos micro-organismos.
A oxidação do glicerol se inicia após sua internalização através de uma proteína facilitadora de difusão (codificada pelo gene glpF) e pela ação da enzima glicerol
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
17
desidrogenase (DhaD) sendo convertido em dihidroxiacetona (DHA). Em seguida a DHA é fosforilada e convertida em um intermediário da glicólise, a dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) a qual alimenta a via glicolítica. Nessa etapa ocorre a principal diferença entre o metabolismo do glicerol e de outras fontes de carbono, pois a enzima dihidroxiacetona quinase (DhaK, codificada pelos genes dhaKLM) usa o fosfoenolpiruvato (PEP) como doador do grupo fosfato para a fosforilação da DHA. Desse modo, uma característica única da metabolização do glicerol por E.coli é que a conversão de PEP a piruvato é acoplada à fosforilação de DHA e realizada por uma única enzima, a DhaK. Para outras fontes de carbono o piruvato é obtido a partir do fosfoenolpiruvato pela ação da enzima piruvato quinase. A obtenção de piruvato é de grande importância para a geração de etanol e H2, visto que serve de composto chave para a produção desse gás tanto por bactérias anaeróbias estritas quanto por anaeróbias facultativas (ABO-HASHESH e HALLENBECK, 2012; CINTOLESI et al., 2012).
Em organismos anaeróbios facultativos sob condições favoráveis, o piruvato é convertido a acetil-CoA e formiato, o qual é transformado em CO2 e H2. Para anaeróbios estritos, durante a conversão de piruvato a acetil-CoA, ocorre a redução simultânea da ferredoxina, a qual é empregada na redução de uma hidrogenase para a produção de hidrogênio (DAS e VEZIROGLU, 2008). As vias de produção de hidrogênio a partir do piruvato em cada grupo bacteriano recebem o nome da primeira enzima responsável pelo processo, desse modo, em anaeróbios facultativos a via é denominada PFL formiato liase), enquanto que para anaeróbios estritos a principal via é a PFOR (piruvato-ferredoxina oxido-redutase).
Neste ponto do metabolismo, para anaeróbios facultativos, o uso de glicerol como substrato também favorece a produção de H2 comparado a outras fontes de carbono, pois o piruvato também poderia ser convertido a acetil-CoA e CO2 pela enzima piruvato-desidrogenase. Apesar dessa enzima ser ativa principalmente em condições aeróbias, ainda apresenta alguma atividade na ausência de oxigênio. No entanto, sua atividade é reprimida por altas razões NADH/NAD+, como ocorre durante a fermentação do glicerol (DURNIN et al., 2009), como exposto no item 1.3. Em determinados tipos de enterobactérias, a molécula de acetil-CoA oriunda dessa etapa pode ser convertida em etanol por meio da ação da enzima acetaldeído/álcool-desidrogenase, fato que, do ponto de vista de obtenção de energia é uma grande vantagem, devido aos benefícios ambientais em relação aos combustíveis fósseis apresentados por esse biocombustível.
18
Além das vias convencionais citadas acima, existe também a possibilidade de produção de H2 por meio de enzimas capazes de aproveitar os prótons e elétrons adicionados às moléculas de NAD+ durante o catabolismo de substratos orgânicos, as chamadas NADH:ferredoxina oxido-redutases (NFOR) para anaeróbios estritos e uma suposta hidrogenase membranar estudada em Enterobacter aerogenes (HALLENBECK et al., 2012; NAKASHIMADA et al., 2002).
No entanto, a operação das NFOR no sentido da redução da molécula de ferredoxina é extremamente desfavorável termodinamicamente e ocorre apenas em condições de pressões parciais de hidrogênio muito baixas (KHANAL, 2008). Desta forma pode-se considerar que a diminuição da pressão parcial de hidrogênio do meio favoreceria a ação das NFOR e portanto poderia levar a uma maior produção de hidrogênio pelas bactérias anaeróbias estritas (ABO-HASHESH e HALLENBECK, 2012). Entretanto, níveis de baixa pressão parcial de hidrogênio (abaixo de 10-3 atm) são reportados apenas para ambientes em que encontram-se comunidades compostas por bactérias fermentativas e por micro-organismos consumidores de hidrogênio, tais como comunidades anaeróbias mistas contendo metanogênicos hidrogenotróficos. Porém o consumo do H2 liberado por bactérias fermentativas resulta na produção quase nula do gás. Outra alternativa para direcionar o funcionamento das enzimas NFOR para a redução da ferredoxina seria a remoção do H2 dissolvido por meio do stripping de gases do meio, entretanto, os fluxos necessários são considerados impraticáveis e a mistura com outros gases dificultaria o processo de purificação do hidrogênio (HALLENBECK, 2005).
Quanto à provável hidrogenase NADH-dependente citada para Enterobacter aerogenes, existem estudos realizados com glicose como substrato que levantam suposições sobre sua ocorrência baseadas (i) em suposições termodinâmicas que explicariam sua existência; (ii) na diferença encontrada por alguns autores entre a produção molar de hidrogênio e a soma da produção molar de acetato e etanol ou outros produtos oriundos da conversão da molécula de acetil-CoA; (iii) na evolução de H2 a partir de NADH mediada apenas pela fração membranar de células de E. aerogenes e (iv) no rendimento encontrado estar acima do teórico máximo para a conversão da fonte de carbono (KUMAR; GHOSH; DAS, 2001; NAKASHIMADA et al., 2002; TANISHO et al., 1989; ZHAO et al., 2009).
Porém, essa diferença quantitativa poderia estar relacionada (i) ao consumo de acetato decorrente de alterações no metabolismo bacteriano ocasionadas pela diminuição da disponibilidade de fontes de carbono e redução do pH no decorrer da fermentação; (ii)
Zorel, J. A. Capítulo 1: Revisão de Literatura
19
diferenças na quantidade excretada (ou re-internalizada) dos produtos da metabolização de acetil-CoA; (iii) pelo consumo de outros fatores nutricionais presentes encontrados no meio de cultura para a produção de formiato; (iv) pela conversão de acetil-CoA a componentes da biomassa e (v) pela interconversão de formiato a acetato (CHONG et al., 2009; COZZONE, 1998; GONG et al., 2016; LEONHARTSBERGER et al., 2002; NGUYEN et al., 2008; SAWERS, 2005; WOLFE, 2005; ZELCBUCH et al., 2016).
Somado a isso, apesar da crescente atenção destinada a essa via, não existe a confirmação experimental da existência de nenhuma enzima que participe diretamente da conversão de NADH a H2, além do que essas também estariam sujeita às limitações termodinâmicas ressaltadas anteriormente para as NFOR (LIU et al., 2017; ZHANG et al., 2011). Tais discrepâncias demonstram que, a despeito do conhecimento parcial sobre a produção biológica de H2, ainda existem muitas informações sobre o metabolismo microbiano a serem obtidas e confirmadas para que esse processo possa ser aplicado com sucesso em escala real.
A exemplo do que ocorre para outros substratos, apesar do enorme potencial biotecnológico da fermentação do glicerol residual a hidrogênio, algumas questões ainda inviabilizam a aplicação em grande escala desse processo. Entre as principais questões a serem resolvidas estão a sensibilidade dos micro-organismos aos outros componentes do glicerol bruto e a produção de H2 apenas em concentrações muito baixas de glicerol, fatores que tornam o processo mais oneroso devido principalmente à necessidade de diluição do glicerol residual (CHATZIFRAGKOU e PAPANIKOLAOU, 2012; ŁUKAJTIS et al., 2018; SARMA et al., 2013a,c).
Desta forma, a fim de garantir a aplicabilidade do processo, torna-se imprescindível tanto a busca por linhagens bacterianas que produzam hidrogênio com uma menor diluição do glicerol quanto a compreensão dos efeitos de altas concentrações desse substrato sobre o metabolismo microbiano, uma vez que essas inibem não só a produção de H2, mas o desempenho das culturas de forma geral.
1.6. Alternativas para melhoria da bioconversão do glicerol
Atualmente, as abordagens de otimização da bioconversão de substratos orgânicos a hidrogênio podem ser divididas em três vertentes principais: busca por novas linhagens, adequação das condições de fermentação e modificação das vias metabólicas microbianas. Tais abordagens serão discutidas nos itens a seguir.
