POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA

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POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA

AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES

DA MATRIZ (MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS

ATIVADOS POR DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS PERÍODOS DE

TEMPO

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AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS ATIVADOS POR DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS PERÍODOS DE TEMPO

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Microbiologia / Imunologia.

Orientador: Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge Co-orientador: Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira

São José dos Campos 2009

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Apresentação gráfica e normalização de acordo com:

Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2008.

V618a Vilela, Polyana das Graças Figueiredo.

Avaliação da liberação de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e MMP-8) por macrófagos ativados por diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) em variados períodos de tempo / Polyana das Graças Figueiredo Vilela. __ São José dos Campos : [s.n.], 2009.

74.f. : il.

Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,Universidade Estadual Paulista, 2009.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge

1. Metaloproteinases da Matriz. 2. Endotoxinas. 3. Macrófagos. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. III. Título

tD24

Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP

AUTORIZAÇÃO

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte. São José dos Campos, 20 de Agosto de 2009 .

Assinatura :

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BANCA EXAMINADORA

Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador)

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista – UNESP

Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista – UNESP

Profa. Dra. Mariella Vieira Pereira Leão

Instituto Básico de Biociências Universidade de Taubaté - UNITAU

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DEDICATÓRIA

A meu pai e minha mãe do céu, por abençoarem cada dia de minha vida.

Aos meus amados pais, Dércio Afonso Maria Vilela e Celma Figueiredo Vilela. Vocês são meus maiores exemplos de dignidade, bom caráter, perseverança, responsabilidade, sabedoria, força e humildade. Obrigada por tudo que fazem por mim. Minha família é o maior presente que Deus me deu.

À minha amada irmã Luciana Figueiredo Vilela, por ser minha eterna e grande amiga. Por estar sempre ao meu lado, me dando um pouco de sua força e sabedoria.

Aos meus queridos sobrinhos Álvaro, João Pedro e Luís Henrique e ao meu afilhado Luan, por nos darem o prazer e a alegria da convivência.

Ao Eder, por seu amor, seu companheirismo, sua paciência e por todos os momentos simples e felizes que tivemos. Sua presença neste momento foi muito importante.

A todos de minha grande e maravilhosa família, que mesmo longe estão presentes em minha vida.

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À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Prof. Adj. José Roberto Rodrigues e do vice-diretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli.

Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, na coordenação da Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito e Profa. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha.

Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal.

Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria Aparecida Consíglio de Souza, pelos auxílios prestados.

À Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de mestrado (Processo 2007/57552-4) e do Auxílio à Pesquisa (Processo 2008/55780-2) que possibilitaram a realização deste trabalho.

Ao Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge, pelo conhecimento compartilhado, pelo apoio, pela confiança e por suas sábias considerações. Seu senso de justiça, equilíbrio, sabedoria e ponderação são marcantes e admiráveis.

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À Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira. Agradeço especialmente e muito carinhosamente por sua amizade, compreensão, paciência, preocupação, dedicação, por suas orações, seu carinho, seus ensinamentos científicos e pessoais e pelo apoio de sempre.

À Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito. Muito obrigada por sua amizade, seu apoio, ensinamento, carinho, preocupação e disposição em todos os momentos, principalmente nos mais difíceis.

À Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira, pelo convívio fraterno e pelos ensinamentos compartilhados.

À minha querida amiga Emanuele Gonçalves Brito, que muito me ajudou e ensinou neste ano. Muito brigada por tudo que fez por mim.

Aos amigos da Pós-graduação, Rogério de Lima Romeiro, Pietro Mainenti, Joyce da Silva Martins, Bruno Mello de Matos, Alessandra Sverberi Carvalho, Marta Majewski, Rosilene Batista de Aguiar Almeida, Flávio Pires Molina, Ana Carolina Salvia, Daniel Freitas Alves Pereira, Ana Paula de Lima, Karina Bortolin Lodi e Mary Anne Moreira Bárbara pelo convívio fraterno e pelas parcerias, em especial agradeço Cristiane Aparecida Pereira, Fernanda Lourenção Brighenti, Graziella Nuremberg Back Brito, Simone Vilela e Guilherme Rodrigues Teodoro, que me deram apoio em todos os momentos. Muito obrigada pelo carinho, pela amizade e preocupação nos momentos difíceis.

Ao Sérgio Giovanny Alves, Domingos Gonçalves Pontes e Ana Paula Simão Correa Matos, pela convivência e por tudo que fazem por nós da Pós-graduação.

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Marta Rampani, pelo apoio e pela convivência enriquecedora e agradável.

Aos amigos José Márcio Nacur de Almeida e Aldo Ivan Pereira Paiva e às amigas Patrícia Almeida Grunewald, Aneíse Gomes de Moura, Liliam Gazolla, Ana Carolina Nogueira, Patrícia Reis, Luciana Caetano, Michele Cardoso, Ana Paula Ferreira, Isabela Oliveira, Gleyce Oliveira Silva, que mesmo longe ou perto sempre me deram apoio. À Lívia Maria Serpa Gregorio, Lo Ruana Pereira de Freitas e Lígia Tiaki Yamamoto, pela convivência fraterna.

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“Tão misericordioso é Deus, que nos dá oportunidade de corrigir erros, começar de novo, fazer o dia de hoje melhor que o dia de ontem.”

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RESUMO... 10

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... 11

1 INTRODUÇÃO... 12

2 REVISÃO DA LITERATURA... 17

2.1 Endotoxina (LPS): participação nas alterações pulpares e periapicais... 17

2.2 Envolvimento das metaloproteinases da matriz (MMP) nas alterações pulpares e periapicais... 20

3 PROPOSIÇÃO... 31

4 MATERIAL E MÉTODO... 32

4.1 Cultura celular... 32

4.2 Diferenciação celular... 33

4.3 Viabilidade da cultura de células... 35

4.4 Endotoxinas (LPS)... 36

4.5 Ativação celular pela endotoxina (LPS)... 37

4.6 Análise da liberação de metaloproteinases da matriz extracelular (MMP-3 e MMP-8) pelos monócitos/macrófagos (U937)... 38 5 RESULTADOS... 41 5.1 Produção de MMP-3... 41 5.2 Produção de MMP-8... 46 6 DISCUSSÃO... 52 6.1 Da metodologia... 52 6.2 Dos resultados... 55 7 CONCLUSÃO... 62 8 REFERÊNCIAS... 63

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ANEXO ... 73 ABSTRACT... 74

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RESUMO

A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP-3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p<0,05) e redução da produção de MMP-8 após ativação com diferentes concentrações de LPS em relação ao controle, nos períodos de 24, 48 e 72 h. Em praticamente todos os grupos (incluindo os controles), pode-se verificar que a produção de MMP-3 ou MMP-8 aumentou significativamente em relação ao aumento do tempo. Pode-se concluir que: a) diferentes concentrações de endotoxinas apresentaram capacidade de induzir aumento significativo da produção de MMP-3 nos períodos de 24, 48 e 72 h, independente da concentração utilizada, sugerindo que esta ativação é dependente da presença de endotoxina e não da dose; b) a presença de diferentes concentrações de endotoxinas induziu significativa redução da produção de MMP-8 em relação ao controle, em todos os períodos de tempo avaliados.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMPc = Adenosina Monofosfato Cíclico

CMT = Tetraciclina Quimicamente Modificada

COX = Cicloxigenase

cPLA2 = Fosfolipase A2 citosólica

DO = Densidade Óptica

ELISA = Ensaio Imunossorbente Ligado à Enzima

EU = Unidade de Endotoxina

FGF = Fator de Crescimento para Fibroblatos

IL = Interleucina

ICAM 1 = Molécula de Adesão Intercelular-1

LPS = Lipopolissacarídeo

MEC = Matriz Extracelular

MMP = Metaloproteinase da Matriz

MT-MMP = Metaloproteinase ligada à Membrana Plasmática

NO = Óxido Nítrico

(O2-) = Superóxido

PDGF = Fator de Crescimento Plaquetário

PGE2 = Prostaglandina E2

PMA = Phorbol-12-myristate-13-acetate

PMN = Polimorfonuclear Neutrófilo

RNAm = Ácido Ribonucléico mensageiro

TIMP = Inibidor de Metaloproteinase Tecidual

TNF = Fator de Necrose Tumoral

TGF = Fator de Crescimento e Transformação

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Microrganismos e seus produtos são os principais responsáveis pela indução e manutenção das alterações pulpares e periapicais, promovendo reação inflamatória e reabsorção óssea periapical (Hong et al., 2004). A inflamação pulpar geralmente é causada por uma extensão da cárie dentária, permitindo que as células da polpa entrem em contato com bactérias ou seus produtos, o que pode resultar em pulpite (Hahn; Liewehr, 2007; Lee et al., 2008). Em dentes com necrose pulpar e periodontite apical, a infecção é causada por combinações específicas de bactérias anaeróbias facultativas e estritas, principalmente Gram-negativas (Sundqvist et al., 1989).

O principal fator de virulência das bactérias Gram-negativas é representado pela liberação de endotoxinas, que são complexos lipopolissacarídicos presentes na membrana externa da parede celular bacteriana (Petsch; Anspach, 2000). O acúmulo destes componentes bacterianos na polpa dentária ou na região periapical pode estimular macrófagos presentes na área a produzirem citocinas. A secreção de citocinas pode estimular as células da polpa a produzirem enzimas que degradam a matriz extracelular (Panagakos et al., 1996). Desta forma, as bactérias Gram-negativas têm papel central na inflamação pulpar e periapical (Lee et al., 2008).

Durante a inflamação periapical, as células residentes do tecido periapical liberam vários mediadores inflamatórios, citocinas pró-inflamatórias e fatores de crescimento por meio de resposta imune inata e adaptativa (Lin et al., 2007; Carneiro et al., 2009). Citocinas como IL-1 e TNF- são potentes estimuladores da reabsorção óssea. Um dos mecanismos pelos quais estas citocinas induzem reabsorção é por meio

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da estimulação da produção e secreção de metaloproteinases da matriz (MMP) pelas células presentes no local da inflamação (O’Boskey; Panagakos, 1998).

Em 1997, Wang et al. demonstraram em modelo

experimental de reabsorção óssea em ratos, que IL-1 e TNF- são importantes mediadores da reabsorção óssea na patogênese da lesão. Entretanto, existe pouca informação sobre o efeito das citocinas e do LPS na produção de MMP por células da polpa in vitro (Panagakos et al., 1996) e o mecanismo patológico preciso, envolvido na lesão periapical, ainda não está totalmente esclarecido (Takahashi, 1998).

Estudos relataram que a inoculação de LPS no interior dos canais radiculares de cães produziu reação inflamatória e reabsorção óssea periapical (Nelson-Filho et al., 2002; Silva et al., 2002), demonstrando a correlação positiva entre endotoxinas e presença de lesões periapicais (Sundqvist, 1992).

Hong et al. (2004) sugeriram que a presença de endotoxinas em canais radiculares infectados estimula macrófagos a liberar IL-1 e TNF-, as quais induzem a síntese de metaloproteinase da matriz (MMP-1) e, conseqüentemente, reabsorção óssea periapical. De acordo com os autores, IL-1 e TNF- apresentam papel significante na patogênese das alterações pulpares e periapicais. Os autores verificaram ainda, em modelo experimental de lesão periapical em ratos, que a administração de polimixina B (antibiótico catiônico com potente atividade sobre LPS) reduziu a extensão das lesões em 76% a 80% e, simultaneamente, reduziu o número de macrófagos produtores de MMP-1.

As metaloproteinases da matriz são uma família de enzimas estruturalmente relacionadas, mas geneticamente distintas, que degradam componentes da matriz extracelular (Sorsa et al., 2004) e estão envolvidas com a remodelação fisiológica e patológica do tecido (Krane, 1994; Lin et al., 2001). Este grupo de 23 enzimas humanas é classificado em colagenases (MMP-1, 8 e 13), gelatinases (MMP-2 e 9),

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estromelisinas (MMP-3, 7, 10, 11 e 12) , enamelisina (MMP-20) e MMPs ligadas à membrana plasmática (MT-MMP), entre outras (Llano et al., 1997; Tjäderhane et al., 2001). O conhecimento detalhado das MMP é importante para o entendimento da patogênese da inflamação pulpar e periapical (Tsai et al., 2005).

As MMP são produzidas por diversos tipos de células incluindo neutrófilos, fibroblastos e macrófagos (Kumar et al., 2005) e sua atividade é controlada por alterações no delicado balanço entre a expressão e síntese das MMP e seus principais inibidores endógenos (Sorsa et al., 2004). A produção das MMP e dos inibidores de metaloproteinases teciduais (TIMP) pelas células é regulado por muitas citocinas, fatores de crescimento e hormônios. O desequilíbrio entre MMP e TIMP pode influenciar o processo de destruição tecidual (Takahashi, 1998).

Assim como em outros tecidos com inflamação, as MMP estão presentes no tecido pulpar inflamado e em lesões periapicais (Wahlgren et al., 2002). Entretanto, os dados sobre a presença e função das MMP nos tecidos dentários são limitados (Tjäderhane et al., 2001). De acordo com Takahashi (1998), são necessários mais estudos para determinar o mecanismo regulatório de MMP e TIMP nas lesões periapicais. Em 2001, Lin et al. sugeriram que a expressão gênica de MMP-1 e TIMP-1, estimulada por citocinas em fibroblastos da polpa, é mediada, em parte, por uma via dependente de prostaglandina. Outros autores têm demonstrado que a prostaglandina E2 (PGE2) tem sido relatada como sinérgica ou antagônica com IL-1 ou TNF- na modulação da expressão de MMP-1 e TIMP-1, dependendo do tipo de célula (Takahashi et al., 1997; Zhang et al., 1998).

Lin et al.(2002) relataram que macrófagos e osteoblastos estão envolvidos no desenvolvimento de lesões periapicais e que promovem reabsorção óssea pela produção de MMP-1, IL-6 e cicloxigenase-2 (COX-2). Em 2003, Lin et al. relataram que a participação

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de diferentes citocinas em estimular a secreção de MMP envolvidas nas alterações da polpa e periápice ainda não está bem esclarecida.

Shin et al. (2002) detectaram MMP-1, MMP-2 e MMP-3 em tecido pulpar inflamado e em lesões periapicais, sugerindo que as MMP têm importante papel na inflamação pulpar e periapical, especialmente em pulpites sintomáticas, o que poderia estar relacionado com o aumento do nível de prostaglandina E2 (PGE2) nestas situações. No entanto, esta interação entre MMP e prostaglandina em macrófagos deve ser melhor estudada.

As células do infiltrado inflamatório são as principais produtoras de MMP, e o efeito parácrino e autócrino do repertório de citocinas destas células inflamatórias é, provavelmente, o que causa o desequilíbrio na proporção entre MMP e TIMP, levando, por fim, à alteração da arquitetura da matriz extracelular (Kim et al., 2006).

Em 2007, Bodet et al. avaliaram a produção de MMP e de seus inibidores (TIMP) por fibroblastos gengivais estimulados por LPS de

Actinobacillus actinomycetemcomitans e verificaram que LPS pode

estimular a produção de MMP-2, MMP-3 e TIMP-1 e a atividade das MMP. É provável também que o aumento da expressão de TIMP não compense o aumento da expressão de MMP, causando um desequilíbrio na relação MMP/TIMP, o que pode contribuir para destruição do tecido conjuntivo periodontal.

LPS é um potente ativador de monócitos/macrófagos e pode, portanto, induzir a produção de diversos mediadores e citocinas (Tanabe; Grenier, 2008) como TNF-, IL-1β, PGE2 (Bodet et al., 2006; Lee et al., 2007) e IL-1α (Hong et al., 2004), além de possuir importante papel na maturação de células progenitoras de osteoclastos e na perda óssea (Islam et al., 2007). No entanto, o real papel do LPS na indução e manutenção da reabsorção óssea periapical ainda não está totalmente esclarecido, de modo que sua participação na liberação de citocinas e, conseqüentemente, de diferentes metaloproteinases da matriz

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extracelular poderia esclarecer melhor os efeitos do LPS na patogênese das alterações pulpares e periapicais e os principais fatores envolvidos neste processo.

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2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Endotoxina (LPS): participação nas alterações pulpares e periapicais

A partir da década de 80, os avanços tecnológicos na cultura e identificação microbiológica demonstraram que, em canais radiculares de dentes com necrose pulpar e lesão periapical crônica, predominavam microrganismos anaeróbios, principalmente Gram-negativos (Leonardo et al., 2004). Quando a polpa dentária é exposta à cavidade bucal, ocorre contaminação inicial, predominantemente, de microrganismos aeróbios e facultativos. À medida que o processo infeccioso progride, o decréscimo de oxigênio e o desenvolvimento de um baixo potencial de óxido-redução favorecem a mudança desta microbiota que passa a ser, predominantemente, de microrganismos anaeróbios (Sundqvist; Sweden, 1994). Tani-Ishii et al., em 1994, verificaram que na fase ativa de destruição óssea periapical e expansão das lesões em ratos, havia predomínio de bactérias anaeróbias estritas Gram-negativas.

Os microrganismos Gram-negativos, além de possuírem diferentes fatores de virulência e gerarem produtos e subprodutos tóxicos aos tecidos apicais e periapicais, contêm lipopolissacarídeo (LPS) na membrana externa de sua parede celular. O LPS, que tem atividade de endotoxina, é liberado quando há multiplicação ou morte bacteriana, desencadeando uma série de efeitos biológicos, que levam a uma reação inflamatória e à reabsorção dos tecidos mineralizados (Nelson-Filho et al., 2002; Leonardo et al., 2004), desempenhando importante papel na indução e manutenção das lesões periapicais (Jiang et al., 2006).

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Segundo Takahashi (1998), os possíveis mecanismos patológicos da lesão periapical precisam ser discutidos, uma vez que, o mecanismo preciso envolvido nesta lesão ainda não está totalmente esclarecido. Existem poucos estudos que avaliaram, isoladamente, o efeito do LPS no tecido apical e periapical (Silva et al., 2002) e a relação entre LPS e o desenvolvimento de lesão periapical com concomitante reabsorção óssea, permanece controversa (Hong et al., 2004).

Lee et al. (2008) examinaram o papel do LPS de E. coli na reação inflamatória em células da polpa dentária humana, para tanto, avaliaram a capacidade do mesmo induzir a expressão da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1). Estas moléculas são expressas no tecido pulpar em resposta ao estímulo inflamatório e contribui para o recrutamento e migração das células inflamatórias. A expressão destas moléculas pelas células aumentaram, significativamente, de acordo com a dose e o tempo de tratamento com LPS. Com base neste resultado, os autores propuseram que LPS purificado de E. coli é um potente indutor da inflamação pulpar.

Estudos, realizando inoculação de LPS nos canais radiculares de cães, mostraram que, após 30 dias, a endotoxina presente nos canais induziu área de lesão periapical com extensa reabsorção óssea visível radiograficamente (Nelson-Filho et al., 2002) e um intenso infiltrado inflamatório, com predomínio de neutrófilos e macrófagos (Silva et al., 2002).

Durante o desenvolvimento da lesão periapical, que resulta da interação entre a resposta imune e a infecção microbiana (Lee et al., 2007), os macrófagos são as principais células responsáveis pela destruição tecidual e pela produção de vários mediadores pró-inflamatórios, como IL-1β e TNF-α, que são citocinas importantes na regulação da reabsorção óssea na região periapical (Stashenko et al., 1998; Lee et al., 2007). Wang et al. (1997) demonstraram, em modelos experimentais em ratos, o envolvimento de IL-1α e TNF-α no

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desenvolvimento de lesão periapical com concomitante reabsorção óssea. Pita et al. (2009), demonstraram que a aplicação de LPS de E. coli na polpa dentária de ratos, induziu reação inflamatória, com produção de PGE2 e MMP-3 associadas com a alta atividade de óxido nítrico e sugeriram que NO induz a expressão de COX-2 e que a PGE2 produzida pela COX-2, induz a produção de MMP-3.

As endotoxinas, quando presentes, ligam-se ao receptor CD14 na superfície de monócitos e macrófagos, e estas células ativadas secretam interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8), fator de necrose tumoral- (TNF-), superóxido (O2-), óxido nítrico, interferons ,  e , e moléculas lipídicas como o fator ativador de plaquetas e as prostaglandinas, entre outros (Janeway et al., 2002). Assim, diversos estudos têm sugerido que as endotoxinas representam um dos principais fatores etiológicos envolvidos na patogênese da inflamação pulpar e periapical (Barthel et al., 1997; Nelson-Filho et al., 2002; Silva et al., 2002; Tanomaru et al., 2003; Hong et al., 2004; Silva et al., 2004).

O acúmulo de LPS na área infectada pode estimular a liberação de citocinas pró-inflamatórias de neutrófilos ou monócitos/macrófagos (Wilson et al., 1996; Lin et al., 2001). Citocinas como IL-1 e TNF- podem iniciar e, conseqüentemente, aumentar a resposta inflamatória levando à destruição tecidual (Unemori et al., 1994; Lin et al., 2001) desempenhando importante papel na degradação da matriz extracelular durante a inflamação pulpar e periapical (Wisithphrom; Windsor, 2006). Segundo Lin et al. (2001), as reações que levam à destruição tecidual da polpa e periápice após a indução de IL-1 e TNF- ainda não estão totalmente esclarecidas, mas acredita-se, que a possível degradação da matriz extracelular, que ocorre durante a pulpite, resulte da excessiva produção de MMP, determinada pelas citocinas pró-inflamatórias. Desta forma, a secreção de MMP pode ter uma correlação com o nível de citocinas e endotoxinas presentes na lesão pulpar e periapical (Salo et al., 1991; Shin et al., 2002). Assim, o conhecimento

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detalhado das MMP pode ser importante para o entendimento da patogênese da inflamação pulpar, uma vez que o mecanismo preciso desta patogênese ainda precisa ser elucidado (Tsai et al., 2005).

2.2 Envolvimento das metaloproteinases da matriz (MMP) nas alterações pulpares e periapicais

A lesão periapical geralmente é uma resposta à chegada de microrganismos pelo canal radicular (Itoh et al., 2009), consistindo em inflamação periapical com destruição do ligamento periodontal e reabsorção do osso alveolar e da raiz (de Paz, 2007; Morimoto et al., 2008).

O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo denso, localizado entre o cemento e o osso alveolar, suportando o dente. A destruição do ligamento periapical é inicializada pela degradação da matriz extracelular (MEC), que é composta principalmente por fibras colágenas e elásticas, incluindo fibras oxitalânicas e fibras contendo elastina (Kielty et al., 2005;Morimoto et al., 2008).

A matriz extracelular (MEC) do tecido pulpar é composta primariamente por colágeno tipo I e II (van Amerongen et al., 1983; Lin et al., 2001), sendo o tipo I mais abundante na matriz orgânica da dentina (Tjäderhane et al., 2001; Sulkala et al., 2007). A degradação do colágeno apresenta importante papel na destruição pulpar durante a pulpite (Takahashi, 1998; Lin et al., 2001). No processo de periodontite apical, o colágeno é a principal proteína destruída, resultando na destruição das fibras colágenas e na reabsorção óssea (Takahashi, 1998). Uma vez gerados, os fragmentos de colágeno ativam os osteoclastos para a reabsorção óssea; desta forma, acredita-se que as MMP sejam essenciais para o início da reabsorção óssea (Holliday et al., 1997), o que poderia

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explicar o fato da reabsorção óssea ser altamente sensível a citocinas como IL-1 e TNF- (Birkedal-Hansen, 1993). Como as MMP são as principais enzimas responsáveis pela degradação da MEC (Takahashi, 1998; Massova et al.,1998), sugere-se que as mesmas apresentam importância em condições inflamatórias, como nas alterações pulpares e periapicais (Wahlgren et al., 2002; Shin et al., 2002), mas o mecanismo molecular envolvendo as MMP nestes processos ainda não é completamente conhecido (Carneiro et al., 2009).

As metaloproteinases da matriz são uma família de endopeptidases que inclui mais de 20 membros classificados de acordo com a especificidade ao substrato e estrutura molecular, em: a) colagenases (MMP-1, 8 e 13), que atuam em colágeno fibrilar dos tipo I, II e III; b) gelatinases (MMP-2 e 9), que degradam o colágeno amorfo, bem como a fibronectina; c) estromelisinas (MMP-3, 7, 10, 11 e 12), que atuam numa variedade de componentes da matriz extracelular, incluindo proteoglicanas, laminina, fibronectina e colágenos amorfos; d) enamelisina (MMP-20), que degrada enamelina; f) MMPs ligadas à membrana plasmática (MT-MMP) (MMP-14, 15, 16 e 17), entre outras (Llano et al., 1997; Tjäderhane et al., 2001).

Diversos tipos de células (fibroblastos, macrófagos, neutrófilos, células sinoviais e algumas células epiteliais) produzem as MMP (Birkedal-Hansen, 1993; Kumar et al., 2005) e sua liberação é induzida por estímulos, incluindo fatores de crescimento (PDGF, FGF), citocinas (IL-1, TNF) e estresse físico. São inibidas por TGF-, esteróides e inibidores de proteases, como os inibidores de metaloproteinases teciduais (TIMP) (Kumar et al., 2005). O desequilíbrio entre MMP e seus inibidores (TIMP) pode influenciar o processo de destruição tecidual, de modo que o mecanismo regulatório entre MMP e TIMP nas lesões periapicais precisa ser mais estudado (Takahashi, 1998; Lin et al., 2002; Wahlgren et al., 2002).

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As MMP estão envolvidas em processos fisiológicos, incluindo remodelamento, reparação e desenvolvimento tecidual (Massova et al., 1998; Uitto et al., 2003; Sorsa et al., 2004). Em tecidos adultos, a expressão e a atividade das MMP são normalmente baixas, mas aumentam significativamente em várias condições patológicas que podem levar à destruição tecidual, como doenças inflamatórias e neoplasias, assim como em doenças bucais como câncer e cárie (Sorsa et al., 2004). Podem atuar também na aterogênese, onde as MMP produzidas pelos macrófagos podem ser responsáveis pela ruptura da placa aterosclerótica (Hua et al., 2009). Como o papel das MMP na degradação tecidual tem se tornado evidente em muitas doenças, tentativas de controlar suas atividades por meios farmacológicos têm ganhado muita atenção (Sorsa et al., 2004). Em 2009, Hua et al. demonstraram que a aspirina pode inibir a expressão de MMP-2 e MMP-9 assim como pode potencializar a sua inibição pela indução da expressão de TIMP-1 e TIMP-2, resultado este que sugere um novo efeito farmacológico protetor da aspirina quanto à ruptura da placa aterosclerótica. No entanto, o exato papel das MMP nestas várias doenças ainda não está totalmente esclarecido (Uitto et al., 2003; Sorsa et al., 2004).

Em 1996, Panagakos et al. utilizando células da polpa dentária humana e células de ratos, avaliaram, in vitro, o papel do LPS e de citocinas inflamatórias na síntese e secreção de MMP. Os autores observaram que, em uma cultura de curto período (24 a 48h), não houve alteração no padrão e na quantidade de MMP determinada pelas células humanas e que as células de ratos secretaram maior quantidade de MMP após tratamento com IL-1 β e TNF-α. Em 1998, O’Boskey e Panagakos avaliaram o efeito de citocinas na produção e secreção de MMP por células da polpa dental humana, mas em culturas de longo-período (2 a 16 dias). Os autores observaram que houve aumento da produção de MMP-2 e MMP-9 a partir do nono dia, sugerindo que as citocinas

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desempenham um papel crítico na patogênese da inflamação pulpar e que, durante a fase crônica desta inflamação, o aumento dos níveis das citocinas potencializam as células pulpares quanto à secreção de MMP.

Existem indícios da ação das MMP na organização da matriz dentinária e na regulação da mineralização, mas os dados da presença e das funções das MMP nos tecidos dentários são limitados (Tjäderhane et al., 2001). A presença das formas pró e ativa da MMP-8, MMP-2 e MMP-9 foi demonstrada em lesões de cárie dentária humana. A presença da forma ativa serve como indicativo da atividade das MMP durante a degradação da matriz na dentina (Tjäderhane et al., 1998). Segundo Itoh et al. (2009), a lesão periapical, que é uma resposta à chegada de microrganismos do canal radicular e que está relacionada à destruição da MEC, pode estar associada à ativação de metaloproteinases da matriz como MMP-1, MMP-2 e MMP-9. Estes autores demonstraram que Prevotella nigrescens, que têm sido isoladas de canal radicular e associadas com lesão periradicular, são capazes de ativar as formas proMMP-2 e proMMP-9 in vivo e esta ativação pode estar relacionada à destruição do tecido periapical. Neste mesmo ano, Santos et al. (2009) investigaram a presença de MMP na dentina radicular por meio de zimografia e Western blotting. Os autores puderam confirmar a presença de MMP-2, MMP-8 e MMP-9 na dentina coronária, assim como demonstrar a sua existência também região radicular do dente.

Wahlgren et al. (2002) detectaram presença significativa de MMP-8 em tecidos pulpares inflamados e demonstraram que os macrófagos presentes no local da inflamação podiam expressar MMP-8. Além disso, o nível de MMP-8 presente no exsudato periapical diminuiu nos pacientes com sucesso do tratamento endodôntico e manteve-se alto naqueles em que o processo inflamatório persistiu, indicando que a sua análise poderia servir para monitorar a atividade inflamatória e como indicador do sucesso do tratamento. No entanto, são necessários mais estudos clínicos para que a mensuração de MMP dos canais radiculares,

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durante o tratamento, seja usada como instrumento para avaliação da inflamação periapical (Wahlgren et al., 2002), assim como estudos sobre o mecanismo regulatório entre MMP e TIMP nas lesões periapicais (Takahashi, 1998). Acredita-se que inibidores de MMP em canais radiculares e em tecidos periapicais possam oferecer, no futuro, uma nova perspectiva para o tratamento endodôntico (Wahlgren et al., 2002).

Segundo Ramamurthy et al. (2002), nas últimas décadas, intensificou-se o interesse no desenvolvimento de inibidores de MMP para uso terapêutico em diversas doenças. Os autores demonstraram que o uso de inibidores de MMP reduziu a atividade de MMP e adicionalmente reduziu a margem de reabsorção óssea em periodontites induzidas em ratos pela injeção local de LPS.

As metaloproteinases da matriz são tradicionalmente vistas como enzimas destrutivas em doenças inflamatórias, no entanto, com base nos resultados do seu estudo, Tjäderhane et al. (2007) propõem uma nova visão do papel da MMP. Os autores avaliaram o efeito de inibidores de MMP (tetraciclina quimicamente modificada/CMT-3) na formação da lesão periapical em modelo experimental de ratos e, surpreendentemente, encontraram maior área de necrose pulpar e lesão periapical no grupo de ratos que receberam (CMT-3) do que no grupo controle (submetido somente à exposição pulpar). De acordo com os autores, estes resultados podem indicar que as MMP possuem propriedades anti-infecciosas e/ou anti-inflamatória na patologia pulpar e periapical. Desta forma, são necessários mais estudos para avaliar se o efeito anti-infeccioso e/ou anti-inflamatório das MMP é local, específico a um determinado tecido ou é geral e também verificar se este efeito está relacionado a uma MMP ou a vários membros da família de MMP.

Utilizando-se ensaio imunoenzimático (ELISA), Shin et al. (2002) avaliaram o nível e a distribuição de MMP em tecidos pulpares inflamados e em lesões periapicais. Os autores verificaram que as concentrações de MMP-1, MMP-2 e MMP-3 foram significativamente

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maiores nos grupos com pulpite aguda do que no grupo controle (pacientes com polpa no seu estado normal), sugerindo o importante papel das MMP na progressão do processo inflamatório pulpar e na destruição tecidual periapical. Além disso, por análise imunohistoquímica, MMP-1 e MMP-3 foram localizadas na matriz extracelular ao redor das células inflamatórias, resultado este sugestivo de que MMP-1 e MMP-3 podem ser secretadas por células inflamatórias como neutrófilos, macrófagos e linfócitos (Shin et al., 2002) e que há uma fonte multicelular de MMP nas infecções endodônticas (Tjäderhane et al., 2007). Entretanto, a regulação da produção de MMP-3 durante a inflamação pulpar ainda é pouco entendida. Acredita-se que durante o processo inflamatório da polpa dentária há indução e ativação da síntese de óxido nítrico pelas células endoteliais, fibroblastos, macrófagos que então catalisam a síntese de NO. Este, por sua vez, induz a expressão de COX2 causando a liberação de PGE2. O acúmulo de PGE2 determina a secreção de MMP-3 (Pita et al., 2009).

A técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) adotada no estudo de Shin et al. (2002) também foi utilizada por Figueredo et al. (2003) para quantificar MMP-9 do fluido gengival de pacientes com gengivite e de pacientes com periodontite crônica. Segundo os autores, esta técnica consegue quantificar a MMP-9 ativa somada a proMMP-9, ou seja, ela não é capaz de analisar a atividade gelatinolítica total, nem as frações ativas e latentes separadamente, no entanto, ela é extremamente sensível. Os resultados deste estudo demostraram que a quantidade de MMP-9 nos sítios com perda de inserção foi maior do que nos sítios com inflamação mas sem destruição periodontal, sugerindo que esta enzima pode estar envolvida na destruição tecidual que ocorre na periodontite.

Além de MMP-8 (Wahlgren et al., 2002), MMP-1 e MMP-3 (Shin et al., 2002), outra metaloproteinase da matriz encontrada em níveis aumentados em dentes com inflamação pulpar é a MMP-9, indicando que esta MMP pode estar relacionada com a destruição do tecido pulpar

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(Gusman et al., 2002). Em 2005, Tsai et al. demonstraram que o tecido pulpar humano pode expressar MMP-9, uma vez a mesma foi detectada em odontoblastos, fibroblastos, infiltrados inflamatórios e células endoteliais. Adicionalmente, o nível de MMP-9 nas polpas com inflamação foi, significativamente, maior do que nas polpas com aspectos clínicos saudáveis. Assim, estes autores relataram existir boa evidência para suspeitar que MMP-9 pode ter um papel importante na patogênese da inflamação pulpar.

Carneiro et al. (2009) demonstraram que a expressão de MMP-9 também foi significativamente maior em dentes com periodontite apical do que naqueles com ligamento periodontal normal, sugerindo que a MMP-9 pode estar diretamente envolvida na destruição da MEC nestas lesões e, portanto, pode estar associada ao desenvolvimento e progressão da lesão periapical. Os resultados deste estudo sugeriram a participação de várias células inflamatórias na expressão de MMP-9 em particular macrófagos, sugerindo que estas células são fonte de MMP-9 durante periodontite apical. A presença de macrófagos na periodontite periapical crônica é crucial devido ao seu papel na reposta protetora, assim como no desenvolvimento da lesão e na perpetuação da resposta inflamatória (Márton; Kiss, 2000; Carneiro et al., 2009).

Os macrófagos desempenham importante papel na regulação do turnover da MEC por meio da secreção de proteases, incluindo MMP, inibidores de proteases e citocinas, tanto em condições normais como patológicas (Hong et al. 2000; Shin et al. 2002). Os macrófagos podem expressar várias MMP, incluindo colagenase I (1), gelatinases (2, 9), estromelisinas (3, 7, MMP-12), colagenase-3 (MMP-13) (Goetzl et al., 1996; Imai et al., 1998) e outra colagenase (MMP-8) (Wahlgren et al., 2002).

Alguns estudos sugerem que a expressão de MMP por macrófagos ativados com LPS pode ocorrer por meio de uma via dependente de PGE2 e AMPc (Wahl; Corcoran, 1993). Em 1998, Zhang et

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al. foram os primeiros a demonstrar que a produção de MMP-1 por monócitos pode ser induzida por citocinas e que MMP-1, MMP-9 e TIMP-1 são diferentemente regulados por combinações de citocinas, por de mecanismos dependentes (MMP-1) e independentes (MMP-9 e TIMP-1) de prostaglandina (PG). O primeiro mecanismo foi demonstrado pela inibição da produção de MMP-1 dos monócitos pela indometacina e a reversão desta inibição com o uso de agentes exógenos, como PGE2, que eleva o nível intracelular de AMPc. A produção de MMP-9 e TIMP, por sua vez, não apresentou alteração na presença de indometacina, sugerindo um mecanismo de regulação de MMP por via independente de PG. Estes autores (Zhang et al.,1998) relataram ainda que os mecanismos sinalizados por citocinas e que promovem a produção de MMP parecem ser, em parte, diferentes para diversos tipos de células.

De acordo com Takahashi et al. (1997), os efeitos de inibidores de cicloxigenase e de PGE2 na produção de TIMP-1 e MMP-1 também parecem variar de acordo com o tipo de célula estudada. Utilizando fibroblastos da sinóvia de pacientes com artrite reumatóide, os autores observaram que IL-1 estimulou a produção de TIMP e pro-MMP, efeito este que foi aumentado com a utilização de inibidores da cicloxigenase, entretanto, por outro lado, foi suprimido na presença de PGE2 exógena, indicando que esta tem efeito negativo na produção de TIMP-1 e pro-MMP-1 (Takahashi et al.,1997). Lin et al. (2001) relataram que a expressão gênica de MMP-1 e TIMP-1 induzida por mediadores como IL-1 α, TNF-α e PGE2 em fibroblastos da polpa dental é, em parte, mediada por uma via dependente de PGE2. Na presença de IL-1α e TNF-α houve elevada expressão pelas células de MMP-1 e baixa expressão de TIMP-1, enquanto PGE2 induziu alta expressão de TIMP-1, mas não teve o mesmo efeito na MMP-1. Por sua vez, o uso concomitante de PGE2 e IL-1 α ou TNF-α suprimiu a indução de MMP-1 em comparação ao efeito destas citocinas utilizadas isoladamente. Por outro lado, o uso de PGE2 aumentou o efeito na expressão de TIMP induzida por estas citocinas, o

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que sugere um possível efeito protetor da PGE2 à excessiva destruição tecidual durante a pulpite.

Em modelos experimentais de lesão periapical em ratos, Lin et al. (2002) detectaram a expressão gênica de MMP-1, TIMP-1, IL-6 e COX-2, indicando, portanto, o envolvimento destes mediadores no desenvolvimento da lesão periapical associada à reabsorção óssea. Os macrófagos foram as principais fontes de MMP-1, IL-6 e COX-2, principalmente na fase inicial. Estas células se agregaram ao redor da área de reabsorção óssea e o número de células expressando MMP-1 aumentou consideravelmente à medida que a lesão progredia, implicando o envolvimento dos macrófagos no desenvolvimento da lesão periapical. Os autores observaram também uma redução característica da área de reabsorção óssea e na expressão de MMP-1 e IL-6 após uso de inibidores da COX-2, sugerindo a importância da COX-2 na patogênese da lesão periapical pela modulação indireta à expressão de MMP-1 e IL-6. Shin et al. (2002) relataram, entretanto, que são necessários novos estudos sobre a relação entre MMP e prostaglandinas em macrófagos.

A hipótese do envolvimento de citocinas como IL-1α, IL-1β e TNF-α na produção de MMP-1 foi verificada na estudo de Hojo et al. (2000), no qual anticorpos contra estes mediadores foram colocados em co-cultura de células endoteliais e monócitos o que resultou numa significativa inibição da produção de MMP-1 por estas células, quando na presença de anti-IL-1β e anti-TNF-α.

Para avaliar o papel do LPS em lesões periapicais, Hong et al. (2004) investigaram in vitro o efeito do LPS na produção de IL-1 α, TNF-α e MMP-1 por macrófagos de camundongos (J774) e demonstraram que o LPS induziu a produção destas citocinas e a expressão gênica de MMP-1, efeito este que foi reduzido, significativamente, com o uso de anticorpos anti-IL-α e anti-TNF-α. Além disso, o uso de polimixina B, antibiótico com importante ação sobre endotoxina, reduziu a produção de MMP-1 e a extensão da lesão associada com a perda óssea na análise, in

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vivo, dos modelos experimentais de ratos. Desta forma, os autores

sugeriram que o LPS desempenha um importante papel nas lesões periapicais, onde a reabsorção óssea é induzida pela liberação de citocinas pró-inflamatórias, que por sua vez modulam a produção de MMP-1 pelos macrófagos.

Durante o desenvolvimento da lesão periapical, induzida por exposição pulpar (7, 14, 21, 28 e 42 dias) em modelos experimentais de ratos, foi avaliada a presença de elastase (macrófago elastase), que é um membro da família de MMP produzida especificamente por macrófagos e de neutrófilo elastase, secretada por neutrófilos. A macrófago elastase, detectada após 7 dias, foi significativamente maior do que neutrófilo elastase entre 7º e 21º dias, enquanto neutrófilo elastase, detectada a partir do 14º dia, aumentou gradualmente entre 14º e 28º dias. Ambas elastases aumentaram durante o desenvolvimento da lesão, com destruição do osso alveolar. Estes resultados indicam que a atividade de macrófago elastase aumentou no início destruição do tecido periradicular e que a atividade de neutrófilo elastase pode estar relacionada com a expansão da destruição. Uma vez que os macrófagos foram mais ativos durante o estágio inicial da lesão periradicular, acredita-se que macrófago elastaacredita-se possa contribuir para o início da destruição da MEC do tecido periapical (Morimoto et al., 2008).

Monócitos/macrófagos humanos da linhagem U937, considerados úteis para estudar o comportamento dos macrófagos (Jiang et al., 2003; Lee et al., 2007), têm sido utilizados para quantificação, por ensaio imunoenzimático (ELISA), após ativação por LPS, da produção de citocinas (Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007;

Tanabe; Grenier, 2008), PGE2 (Tanabe; Grenier, 2008) e de

metaloproteinases da matriz (Maldonado et al., 2004; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Tanabe; Grenier, 2008). Em 2006, Grenier e Grignon, utilizando monócitos/macrófagos humanos (U937), demonstraram que o LPS de Fusobacterium nucleatum induziu

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significativo aumento da secreção de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, PGE2 e MMP-9 por estas células. Em 2008, Tanabe e Grenier também demonstraram significativa indução destes mediadores pelos macrófagos (U937), após 24 horas de ativação por LPS de A.

actinomycetemcomitans. No entanto, são poucos os estudos na literatura

que avaliaram a relação específica das MMP produzidas por macrófagos com outros fatores liberados numa infecção endodôntica, como endotoxinas, citocinas e prostaglandinas.

Assim, torna-se interessante avaliar a relação entre LPS e a produção de MMP por macrófagos, a fim de verificar o envolvimento do LPS na produção de MMP, uma vez que as vias de ativação das MMP nas alterações pulpares e periapicais ainda não estão totalmente esclarecidas.

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3 PROPOSIÇÃO

O objetivo desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzirem a secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, nos períodos de 24, 48 e 72 h.

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Esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos (102/2007-PH/CEP – Anexo).

4.1 Cultura celular

Foi utilizada linhagem de monócitos humanos (U937) obtida do banco de células da Associação Técnico Científica Paul Ehrlich (APABCAM, Rio de Janeiro, RJ). As células foram mantidas em meio RPMI-1640 (LGC Biotecnologia, Cotia, SP), enriquecido com 10% de soro fetal bovino (GIBCO, Invitrogen, NY, USA), em incubadora a 37ºC com 5% de CO2 (Figura 4). O meio de cultura foi trocado (Figura 1) a cada dois dias, mantendo uma concentração celular entre 1x105 e 2x106 monócitos/mL para garantir ótimo crescimento (Grenier; Grignon, 2006).

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4.2 Diferenciação celular

Os monócitos humanos da linhagem (U937) foram diferenciados em macrófagos aderentes por meio de tratamento com

phorbol-12-myristate 13-acetato (PMA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,

USA) (Figura 2). Para isto 1 x 106 monócitos/mL foram mantidos por 48 h em meio RPMI-1640, enriquecido com 10% de soro fetal bovino, na presença de 1 g/mL de PMA (Figura 2). Este tratamento foi realizado para induzir características de macrófagos maduros (Rovera et al., 1979; Vogel et al., 2005; Bodet et al., 2006; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). Em seguida, o meio foi removido por aspiração e as células foram incubadas novamente em meio RPMI-1640, enriquecido com 10% de soro fetal bovino, livre de PMA, pelo período de 24 h.

A B

Figura 2 – a) frasco contendo phorbol-12-myristate 13-acetato (PMA; SIGMA- Aldrich); b) adição de 1g/mL de PMA à cultura celular.

Os macrófagos aderidos foram retirados com uso de cell

scrap (SPL Ciencor Scientific, São Paulo, SP) (Figura 3) e a solução foi

centrifugada (1200 Xg/ 10 min/ 250C) (Figura 4 e Figura 5) e

ressuspendida com meio RPMI-1640 enriquecido com 1% de soro fetal bovino. Em seguida, foi feita a análise da viabilidade celular.

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Figura 3 – Uso de cell scrap (SPL Ciencor) para retirada de macrófagos aderidos.

A B

Figura 4 - a) incubadora de CO2 (Ultrasafe/Biosystems Ltda); b) centrífuga microprocessada (MPW/Biosystems Ltda).

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35

4.3 Viabilidade da cultura de células

A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de exclusão utilizando azul de tripan (0,5%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e contagem das células viáveis em câmara de Neubauer. Para tanto, em uma alíquota de 50 L da suspensão celular foi adicionado 5 L de azul de tripan 0,5% (Figura 6). Uma alíquota de 10 L desta mistura foi colocada na câmara de Neubauer (Figura 6) e visualizada em microscópio óptico, para realizar a contagem das células viáveis (não coradas).

A B

Figura 6 – a) adição de 5 L do azul de tripan 0,5% à suspensão celular; b) câmara de Neubauer sendo preenchida com uma alíquota da cultura celular acrescentada de azul de tripan.

Para realização dos testes, foram colocados 1 x 106 células viáveis em cada poço da placa de polistireno (apirogênica) de 24 poços (COSTAR, Corning Incorporated, NY, USA) acrescentado de meio RPMI-1640 enriquecido com 1% de soro fetal bovino até obter volume final de 1000 L (Figura 7).

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Figura 7 – Distribuição de 1 x 106 células viáveis em cada poço da placa de polistireno (apirogênica) de 24 poços.

4.4 Endotoxinas (LPS)

Foi utilizada neste estudo endotoxina padrão de

Escherichia coli (Cambrex), em diferentes concentrações (0, 5, 10 e 20

EU/mL) (Figura 8).

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37

4.5 Ativação celular pela endotoxina (LPS)

Após distribuição das células nos poços, estas foram ativadas com diferentes concentrações de LPS (0, 5, 10 e 20 EU/mL) (Figura 9). Foram realizadas 30 repetições para cada concentração de LPS, totalizando 120 amostras. A produção de metaloproteinases da matriz foi avaliada em três diferentes períodos de tempo após ativação celular: 24, 48 e 72 h, sendo utilizadas 10 repetições para cada tempo de avaliação.

Figura 9 – Placa de cultura de 24 poços contendo macrófagos. As células foram ativadas pela adição de diferentes concentrações de endotoxinas.

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4.6 Análise da liberação de metaloproteinases da matriz extracelular (MMP-3 e MMP-8) pelos monócitos/macrófagos (U937)

A produção de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e MMP-8) foi avaliada por ensaios imunoenzimáticos (ELISA) utilizando os Kits DuoSet® ELISA Development System (R&D Systems, Minneapolis, USA) (Figura 10). Assim, microplacas de 96 poços (Nunc) foram previamente sensibilizadas com anticorpos de captura anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 (R&D Systems). As placas foram mantidas overnight, em temperatura ambiente e depois foi feita lavagem abundante com PBS contendo Tween 20. (Figura 11). Após a lavagem, foi feito bloqueio (Figura 11) com a adição de Reagente Diluente (PBS contendo 1% de Soro Bovino Albumina–BSA) e a placa foi mantida em temperatura ambiente por 1 h. Após uma nova lavagem, amostras dos sobrenadantes de cada poço da cultura de células e os controles da reação (curva-padrão) foram adicionados e as placas mantidas por 2 h em temperatura ambiente (Figura 12). Os testes foram realizados em duplicata para cada amostra. Após lavagem abundante com PBS contendo Tween 20 foi acrescentado anticorpo de detecção anti-MMP-3 ou anti-MMP-8 marcado com biotina (Figura 12). Após 2 h de incubação, as placas foram novamente lavadas e foi adicionada estreptoavidina conjugada com peroxidase (R&D Systems) e foram mantidas por 20 minutos ao abrigo da luz. Repetiu-se a lavagem abundante com PBS contendo Tween 20 e a reação foi revelada (Figura 13) com solução de substrato cromogênico que contem Reagente A (peróxido de hidrogênio) e Reagente B (tetrametilbenzidina) (R&D Systems) (Figura 10). A reação foi bloqueada após os 20 minutos com ácido sulfúrico 2 N (Figura 14). As densidades ópticas (DO) foram lidas no leitor de microplacas (Biotek) (Figura 15) com comprimento de onda de 450 nm e os níveis de MMP-3 e MMP-8 presentes nos sobrenadantes das culturas foram determinados. Os

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39

resultados foram analisados estatisticamente, pela análise de variância ANOVA, com nível de significância de 5%, e pelo teste de Tukey.

A B

Figura 10 - Kit e Reagentes utilizados para quantificação de MMP. a) Kit DuoSet® ELISA Development System (R&D Systems, Minneapolis, USA; b) Reagente A e Reagente B (R&D Systems, Minneapolis, USA).

A B

Figura 11 - Procedimentos realizados no ensaio imunoenzimático a) lavagem da placa com PBS contendo Tween 20; b) adição de Reagente Diluente (Bloqueio).

A B

Figura 12 - Procedimentos realizados no ensaio imunoenzimático. a) adição das amostras e dos controles; b) adição de anticorpo de detecção anti-MMP-3.

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A B

Figura 13 – Revelação da reação: a) adição da solução de substrato cromogênico que reage com a peroxidase; b) resultado da reação após 20 minutos.

Figura 14 - Procedimento realizado no ensaio imunoenzimático: bloqueio da reação anterior com ácido sulfúrico 2 N.

Figura15 - Leitor de microplacas (Biotek) utilizado para realizar as leituras das densidades ópticas (DO).

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5. RESULTADOS

5.1 Produção de MMP-3

Os valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxinas de E. coli nas concentrações 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL, em diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72 h), estão apresentados nas Tabelas 1 a 4, respectivamente.

Tabela 1 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação por endotoxina de E. coli (controle), nos diferentes períodos de tempo Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 63,28 391,92 712,83 2 113,12 239,90 814,36 3 58,36 245,05 711,34 4 77,48 192,09 622,25 5 155,72 189,00 385,58 6 106,36 124,27 895,61 7 328,50 677,14 617,28 8 369,67 797,30 2105,77 9 158,58 291,93 327,18 10 118,75 273,87 339,11

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Tabela 2 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 5 EU/mL, nos diferentes períodos de tempo

Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 913,33 1623,23 2629,09 2 879,72 2312,72 2589,09 3 1050,20 1157,65 2008,72 4 759,70 1503,54 2105,00 5 892,18 2521,21 1991,66 6 869,59 1988,33 2045,01 7 1095,62 2532,12 2268,33 8 1322,45 2185,46 2100,03 9 1191,53 2238,77 2126,39 10 1286,06 2119,75 2125,59

* grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxina.

Tabela 3 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 10 EU/mL nos diferentes períodos de tempo

Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 2111,71 2151,88 2240,23 2 2160,29 2407,64 2343,36 3 2208,83 2127,78 2248,26 4 2036,61 2309,19 2657,44 5 2200,07 2144,57 2303,76 6 2095,19 2323,09 2503,51 7 2154,07 2126,32 2205,18 8 2452,40 2510,98 2588,54 9 2147,27 2327,90 2406,83 10 2100,89 2363,71 2576,07

(46)

43

Tabela 4 – Valores médios da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 20 EU/mL nos diferentes períodos de tempo

Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 2092,73 2119,75 2174,51 2 2422,19 2514,55 2542,49 3 2515,32 2577,41 2589,83 4 2392,70 2474,19 2402,79 5 2396,58 2447,03 2561,11 6 1491,69 1527,82 1528,86 7 1621,40 1538,76 1624,82 8 1505,68 1555,76 1564,79 9 1449,82 1484,56 1482,80 10 1607,69 1516,43 1617,01

Após análise estatística, em relação ao tempo, pode-se verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-3 (24, 48 e 72 h), exceto no grupo ativado com endotoxina na concentração 20 EU/mL. Assim, no grupo controle houve aumento significativo da produção de MMP-3 do tempo 24 ou 48 h para 72 h (p<0,05). No grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxinas, houve aumento significativo na produção de MMP-3 do tempo de 24 h para os tempos de 48 ou 72 h. No grupo ativado com 10 EU/mL de endotoxinas, no período de 24 h a produção de MMP-3 foi significativamente inferior ao período de 72 h (p<0,05). Já no grupo ativado com 20 EU/mL, os valores da produção de MMP-3 foram similares em todos os períodos avaliados (p>0,05). As tabelas 5 a 8 demonstram os valores médios ± desvios-padrão da produção de MMP-3 em cada grupo, em função do tempo, e a formação de grupos homogêneos.

(47)

Tabela 5 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação (controle)

Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos

24 154,98 108,21 A

48 342,25 221,70 A

72 753,13 514,30 B

Tabela 6 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 5 EU/mL

24 1026,00 193,14 A

48 2018,30 453,77 B

72 2198,90 229,53 B

24 2166,70 112,78 A

48 2279,30 134,66 A B

72 2407,30 163,99 B

24 1949,60 452,30 A

48 1975,60 490,33 A

(48)

45

Com relação à concentração de endotoxina utilizada na ativação celular, pode-se verificar que, em relação ao controle, houve significativo aumento na produção de MMP-3 (p<0,05) após ativação com diferentes concentrações de endotoxina (5, 10 e 20 EU/mL). Comparando-se as concentrações de endotoxinas, somente no tempo de 24 h houve diferença significante entre a concentração 5 EU/mL em relação às concentrações 10 ou 20 EU/mL (p>0,05). Nos períodos de 48 e 72 h, não houve diferença significante entre as concentrações de endotoxinas utilizadas (p>0,05) na ativação celular. Os valores médios e desvios-padrão de cada grupo e a formação de grupos homogêneos, nos tempos 24, 48 e 72 h, estão demonstrados nas tabelas 9 a 11.

Tabela 9 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-3 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação com 0, 5, 10 e 20 EU/mL nos período de 24 h

Concentrações de

endotoxina (EU/mL) média desvio-padrão Grupos homogêneos

0 (controle) 154,98 108,21 A

5 1026,00 193,14 B

10 2166,70 112,78 C

20 1949,60 452,30 C

0 (controle) 342,25 221,70 A

5 2018,30 453,77 B

10 2279,30 134,66 B

(49)

0 (controle) 753,13 514,30 A

5 2198,90 229,53 B

10 2407,30 163,99 B

20 2008,90 484,80 B

5.2 Produção de MMP-8

Os valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxinas de E. coli nas concentrações 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL, em diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72 h), estão apresentados nas Tabelas 12 a 15, respectivamente.

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47

Tabela 12 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação por endotoxina de E. coli (controle), nos diferentes períodos de tempo Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 1893,36 2295,33 2056,14 2 1490,35 1837,69 1999,26 3 1202,75 1568,78 3503,92 4 908,56 1801,75 3680,98 5 1625,70 1826,04 2617,54 6 1088,51 1847,46 2212,66 7 1325,37 2356,83 4029,48 8 1800,76 2735,03 3926,28 9 1436,96 2494,08 3421,77 10 1264,68 1990,22 3202,14

* grupo controle: sem ativação por endotoxina.

Tabela 13 – Valores médios da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares após ativação por endotoxina de E. coli na concentração 5 EU/mL nos diferentes períodos de tempo

Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 554,88 797,98 1202,75 2 520,74 981,38 1084,02 3 418,99 1007,29 1068,09 4 754,30 1158,99 984,41 5 710,26 1010,36 1477,66 6 804,86 1313,26 1242,35 7 825,76 921,74 1084,02 8 1334,91 1371,17 1688,79 9 1282,31 1081,07 1693,72 10 1366,14 1445,86 1841,67

(51)

Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 622,91 1490,58 1047,05 2 369,17 1112,95 1171,23 3 907,36 1009,64 1069,04 4 792,59 1148,52 1297,52 5 416,68 1078,48 1048,38 6 691,65 1496,34 1376,12 7 496,07 676,15 582,46 8 867,17 1263,04 1378,82 9 485,77 464,04 513,58 10 953,97 1301,70 548,35

Amostras* 24 h 48 h 72 h 1 445,01 568,91 605,20 2 393,78 543,01 543,50 3 380,74 670,54 608,82 4 326,77 594,32 681,01 5 237,82 521,04 704,31 6 177,11 435,92 942,13 7 269,19 294,60 618,68 8 192,80 356,85 593,80 9 208,01 554,41 590,70 10 210,23 844,24 684,32

(52)

49

Após análise estatística, em relação ao tempo, pode-se verificar que houve aumento significativo da produção de MMP-8 (24, 48 e 72 h), independente da concentração de endotoxina utilizada na ativação celular. Assim, em todas as amostras, incluindo o grupo controle, houve aumento significativo da produção de MMP-8 do tempo de 24 até 72 h. No grupo ativado com 5 EU/mL de endotoxinas, houve significativo aumento da produção de MMP-8 do tempo 24 h para 72 h (p<0,05). Nos grupos ativados com 10 ou 20 EU/mL, houve aumento significativo da produção de MMP-8 do tempo 24 h para 48 h (p<0,05) e do tempo 24 para 72 h (p<0,05), sendo que os períodos de 48 h e 72 h apresentaram valores semelhantes (p>0,05). As tabelas 16 a 19 demonstram os valores médios ± desvios-padrão da produção de MMP-8 em cada grupo, em função do tempo, e a formação de grupos homogêneos.

Tabela 16 – Valores médios ± desvio-padrão da quantidade de MMP-8 (pg/mL) obtidos nos sobrenadantes das culturas celulares sem ativação (controle)

Tempo média desvio-padrão Grupos homogêneos

24 1403,70 310,14 A

48 2075,30 372,29 B

72 3065,00 779,64 C

24 857,31 349,68 A

48 1108,90 209,59 A B

(53)

24 660,33 213,83 A

48 1104,10 328,63 B

72 1003,30 337,80 B

24 284,15 95,72 A

48 538,38 155,83 B

72 657,25 111,86 B

Com relação à concentração de endotoxina utilizada na ativação celular, pode-se verificar que, em relação ao controle, houve significativa redução da produção de MMP-8 após ativação com endotoxinas nas diferentes concentrações. A produção de MMP-8 nos grupos ativados com 5 e 10 EU/mL foram semelhantes entre si (p>0,05) e significativamente inferior ao grupo controle (p<0,05). A produção de MMP-8 no grupo ativado com 20 EU/mL foi significativamente inferior a de praticamente todos os grupos avaliados (p<0,05). Os valores médios e desvios-padrão de cada grupo e a formação de grupos homogêneos, nos tempos 24, 48 e 72 h, estão demonstrados nas tabelas 20 a 22.

(54)

51

0 (controle) 1403,7 310,14 A

5 857,3 349,68 B

10 660,3 313,83 B

20 284,1 95,72 C

0 (controle) 2075,3 372,29 A

5 1108,9 209,59 B

10 1104,1 328,63 B

20 538,4 155,83 C

0 (controle) 3065,0 779,64 A

5 1336,7 312,18 B

10 1003,3 337,80 B C

(55)

6.1 Da metodologia

Na presente pesquisa, para verificar os efeitos da endotoxina sobre a produção de metaloproteinases da matriz, foi selecionada a linhagem celular humana U937 (monócitos/macrófagos), pois os macrófagos têm importante papel no início e manutenção do processo inflamatório periapical, incluindo reabsorção óssea (Grenier; Grignon, 2006). Estudos têm demonstrado que endotoxinas (LPS) têm a capacidade de se ligar ao receptor CD14 na superfície de monócitos e macrófagos e induzir a liberação de citocinas envolvidas no processo inflamatório, incluindo metaloproteinases da matriz (MMP) (Hong et al., 2004; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). A linhagem U937 foi selecionada, pois é muito utilizada em diversos estudos recentes que avaliam os efeitos de LPS em macrófagos, como a produção de diversas citocinas e também de MMP (Maldonado et al., 2004; Grenier; Grignon, 2006; Nareika et al., 2007; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008).

Como as células da linhagem U937 (monócitos) não são aderentes, foi preciso realizar a diferenciação celular para macrófagos maduros (Hojo et al., 2000; Jiang et al., 2003; Vogel et al., 2005; Grenier; Grignon, 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008). Para obter esta diferenciação, foram realizados primeiramente dois pilotos: a) as células foram mantidas em phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) na concentração 5 µg/mL por 48 h para promover aderência celular (Vogel et al., 2005); b) as células foram mantidas em PMA na concentração 10

(56)

53

ng/mL por 48 h para promover aderência celular (Tanabe; Grenier, 2008). Após a realização destes pilotos, um maior número de células aderidas viáveis foram obtidas com a metodologia proposta por Tanabe e Grenier (2008), entretanto, foi também realizado um terceiro piloto, utilizando concentração intermediária de PMA (1 g/mL) por 48 h, a qual promoveu um maior número de células viáveis aderidas, sendo este protocolo selecionado para a presente pesquisa.

Foi utilizado o teste de exclusão com azul de tripan (0,5%) para verificar a viabilidade celular, pois este é um método confiável, utilizado por vários autores (Chang et al., 2002; Vogel et al., 2005; Bodet et al., 2006; Bodet et al., 2007; Oliveira et al., 2007). A quantidade de células viáveis distribuídas em cada poço da placa foi padronizada em 1x106 células/mL, quantidade previamente relatada na literatura (Bodet et al., 2006; Lee et al., 2007; Tanabe; Grenier, 2008).

Para promover ativação celular foi utilizada endotoxina purificada de E. coli. Embora esta bactéria não seja comumente encontrada no interior dos canais radiculares com polpa necrosada, sua endotoxina apresenta a estrutura básica do componente lipídico, que representa o centro ativo responsável pelas propriedades tóxicas do LPS (Yin et al., 2003). Além disso, endotoxina de E. coli é considerada padrão e é utilizada na maioria dos trabalhos relatados na literatura (Jiang et al., 2004; Maldonado et al., 2004; Oliveira et al., 2005; Oliveira et al., 2007; Jiang et al., 2006; Lee et al., 2007; Nareika et al., 2007).

As metaloproteinases da matriz (MMP) representam uma família de endopeptidases zinco-dependentes com atividades proteolíticas sobre vários componentes da matriz extracelular (Krane, 1994; Lin et al., 2001). Os macrófagos expressam várias MMP, incluindo colagenases (MMP-1, MMP-8), gelatinases (MMP-2, MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-7, MMP-12) e colagenase-3 (MMP-13) (Goetzl et al., 1996; Imai et al., 1998; Wahlgren et al., 2002).