CONIC-SEMESP

CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:

ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:

SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:

INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP INSTITUIÇÃO(ÕES):

AUTOR(ES): BRUNA CAROLINE FERREIRA SANTANA, ANA BEATRIZ CAROLLO ROCHA LIMA AUTOR(ES):

ORIENTADOR(ES): ANA BEATRIZ CAROLLO ROCHA LIMA ORIENTADOR(ES):

COLABORADOR(ES): DRA CLAUDIA DE MOURA, DRA LUCIANA BIZETO ZALORENZI COLABORADOR(ES):

UNIVERSIDADE PAULISTA

VICE-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

RELATÓRIO FINAL DE PESQUISA

Pesquisa Financiada pela Vice-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

da UNIP, no Programa “Iniciação Científica”.

É proibida a reprodução total ou parcial.

COMPARAÇÃO DA TAXA DE MUTAGÊNESE

EM HORTALIÇAS CULTIVADAS COM

AGROTÓXICOS E HORTALIÇAS ORGÂNICAS

ATRAVÉS DA METODOLOGIA TRAD-MCN.

Autor: Bruna Caroline Ferreira Santana

Prof. Orientador: Ana Beatriz Carollo Rocha Lima

2018

8º semestre

Jundiaí - SP

COMPARAÇÃO DA TAXA DE MUTAGÊNESE EM HORTALIÇAS

CULTIVADAS COM AGROTÓXICOS E HORTALIÇAS ORGÂNICAS

ATRAVÉS DA METODOLOGIA TRAD-MCN.

Autor: Bruna Caroline Ferreira Santana

UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP

Resumo: O Brasil é um dos maiores consumidores de agrotóxicos do

mundo, e 1/3 dos alimentos consumidos pelos brasileiros está

contaminado por agrotóxicos. O uso excessivo de agrotóxicos pode

causar diversos problemas ambientais, e os agrotóxicos podem estar

relacionados a problemas de saúde nos produtores e consumidores

destes produtos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a

genotoxicidade e mutagenicidade em hortaliças cultivadas com

agrotóxicos e orgânicas através da técnica Trad-MCN, que consiste na

utilização da planta Tradescantia pallida purpurea para quantificação de

micronúcleos a fim de obter a taxa de mutagênese. Foram coletadas

hastes contendo inflorescências de T. pallida purpurea, que foram

levadas ao Laboratório de Análises Clínicas da UNIP Campus

Jundiaí-SP, onde passaram pelas etapas de adaptação, intoxicação e

recuperação. Foram avaliados quatro grupos experimentais, utilizando

chicória originária de cultivo orgânico e de cultivo tradicional batida com

água ou picada levemente em água, além dos controles positivo,

negativo e branco. Foi realizada a leitura microscópica de 300 tétrades

para cada amostra em lâminas preparadas com botões das

inflorescências macerados com corante. Não foram identificadas

diferenças estatisticamente significativas entre as amostras de hortaliças

cultivadas com agrotóxicos e hortaliças orgânicas, e nem entre os

métodos de intoxicação (p>0,05); porém, foram encontradas diferenças

estatisticamente significativas na quantidade de micronúcleos das

amostras orgânicas em relação ao controle positivo e entre as amostras

com pesticida em relação ao controle branco. Embora Trad-MCN seja

um excelente indicador de genotoxicidade, possivelmente não foi eficaz

neste estudo pelo fato de os agrotóxicos serem planejados para causar

danos às pragas agrícolas e não aos vegetais.

Abstract: Brazil is one of the largest pesticide consumer in the world

and one third of the food consumed by Brazilians is contaminated by

pesticides. Excessive use of pesticides can cause various environmental

problems, and pesticides may be related to health problems on

producers and consumers of these products. The objective of the

present study was to evaluate genotoxicity and mutagenicity in

vegetables cultivated with pesticides and organics using the Trad-MCN

technique, which consists of the use of the plant Tradescantia pallida

purpurea to quantify micronuclei in order to obtain the mutagenesis rate.

Influorescence stems were collected from T. pallida purpurea, which

were taken to the Laboratory of Clinical Analysis of UNIP, where they

went through the stages of adaptation, intoxication and recovery. Four

experimental groups were evaluated using chicory originating from

organic cultivation and from traditional cultivation with water or slightly

chopped in water, besides the positive, negative and white controls.

Microscopic reading of 300 tetrad was performed for each sample on

slides prepared with inflorescence buds macerated with dye. There were

no statistically significant differences between the samples of vegetables

cultivated with pesticides and organic vegetables, nor between the

intoxication methods (p> 0.05); however, statistically significant

differences were found in the amount of micronuclei of the organic

samples in relation to the positive control and among the samples with

pesticide in relation to the white control. Although Trad-MCN is an

excellent indicator of genotoxicity, it was possibly not effective in this

study because pesticides are designed to cause damage to agricultural

pests rather than plant.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ... 6

MÉTODOS ... 9

1. Coleta Trandescantia pallida ... 9

2. Intoxicação das hastes ... 9

3. Preparação das lâminas ... 11

4. Leitura e contagem de micronúcleos ... 11

5. Análise estatística. ... 12

RESULTADOS ... 12

DISCUSSÃO ... 13

CONCLUSÃO ... 14

INTRODUÇÃO

O uso de agrotóxicos na agricultura brasileira aumentou muito nos últimos anos: o Brasil encontrava-se entre os oito maiores consumidores de agrotóxicos do mundo, e em 2008 passou a liderar o 1° lugar do ranking (ALMEIDA et al. 2009).

Os agrotóxicos são divididos conforme sua função e seu mecanismo de ação em herbicidas (48%), inseticidas (25%) e fungicidas (22%), sendo os herbicidas os mais utilizados no manejo de ervas daninhas, visando diminuir as perdas por competição biológica e obter maiores rendimentos (TAVELLA, et al. 2011; CASSAL

et al. 2014).

O uso de agrotóxicos em hortaliças, especialmente os fungicidas, expõe de forma recorrente e perigosa a saúde do consumidor, o ambiente e os trabalhadores à contaminação química por uso de agrotóxicos (ALMEIDA et al. 2009). No atual sistema agrícola, é comum a ocorrência da desestruturação ecológica do meio ambiente por meio da remoção química de plantas competidoras, controle de pragas, seleção de linhagens, monocultura, adubação química, irrigação, entre outros processos (CASSAL et al. 2014).

Um terço dos alimentos consumidos cotidianamente pelos brasileiros está contaminado por agrotóxicos, segundo alerta feito pela Associação Brasileira de Saúde Coletiva (ABRASCO), segundo dossiê lançado durante o primeiro congresso mundial de nutrição, o World Nutrition Rio 2012 (CARNEIRO et al. 2012; ORTIZ, 2012).

Vários insumos agrícolas apresentam efeitos nocivos ao meio ambiente. Dentre esses efeitos, pode ser citada a presença de resíduos no solo, na água, no ar, nas plantas e nos animais, podendo esses resíduos chegarem ao homem através da cadeia alimentar (VIEIRA, 2010; SOUZA et al. 2012). As intoxicações agudas por agrotóxicos atingem três milhões de pessoas anualmente, sendo 2,1 milhões de casos só nos países em desenvolvimento, segundo dados disponibilizados pela

Organização Pan-Americana Da Saúde/Organização Mundial Da Saúde –

OPAS/OMS (BRASIL, 1996). O número de mortes atinge cerca de 20.000 pessoas em todo o mundo, sendo 14 mil nas nações do terceiro mundo. Morrem por ano cerca de 5.000 trabalhadores vítimas de agrotóxicos no Brasil. A maior parte dessas mortes poderia ser evitada se houvesse o uso efetivo de EPIs por parte dos agricultores que manuseiam o produto (REBELO, 2006; VEIGA et al. 2007).

A exposição ocupacional aos agrotóxicos tem um forte impacto na saúde pública. Os efeitos mais bem documentados sobre a exposição ocupacional de trabalhadores rurais envolvem o sistema nervoso. Keifer & Mahurin (1997) observaram que as consequências neurotóxicas de uma exposição aguda de alto nível estão associadas a uma série de sintomas e defeitos na conduta neurológica e anormalidades na função nervosa. Os sintomas neurológicos menos nocivos incluem cefaleia, tontura, náusea, vômito e suor excessivo. Já os mais perigosos incluem o desenvolvimento de fraqueza muscular e bronquiespasmos, podendo progredir para convulsões e coma, e em alguns casos progredindo ao óbito. A exposição a pesticidas pode ainda estar associada ao aumento de doenças e alterações como a Doença de Parkinson, alterações do humor e distúrbios do comportamento como surtos psicóticos, tonturas, bem como diminuição das defesas imunológicas, anemia, impotência sexual masculina, cefaleia, insônia e alterações da pressão arterial (LONDON et al. 1997; BHAT et al. 1999;) Um grande número de agrotóxicos apresenta ainda atividades capazes de desregular o equilíbrio hormonal (homeostase corporal), desencadear cânceres, causar modificação na razão entre sexos ao nascimento, infertilidade, más-formações congênitas no trato genital masculino, modificações na qualidade do sêmen e intoxicações, em diferentes graus, de agricultores e de consumidores (PIRES et al. 2005).

Segundo a OPAS/OMS, os casos de intoxicação por defensivos agrícolas no Brasil apresentam grandes índices de subnotificação e descentralização de informações decorrentes de fatores diversos, tais como: dificuldade de acesso dos agricultores às unidades de saúde, inexistência de centros de saúde em regiões produtoras importantes, dificuldade de diagnóstico e de relacionar os problemas de saúde com a exposição a agrotóxicos, escassez de laboratórios de monitoramento biológico e inexistência de biomarcadores precoces e/ou confiáveis. Está previsto que o número de mortes deve crescer 15% até 2020 em decorrência dessas doenças (BRASIL, 1996).

Os alimentos orgânicos são definidos como alimentos in natura ou oriundos de um sistema orgânico de produção agropecuária e industrial, baseado em técnicas que dispensam o uso de defensivos agrícolas (e.g. pesticidas sintéticos, fertilizantes químicos, medicamentos de uso veterinários, organismos geneticamente modificados, conservantes, aditivos e irradiação) (DE SOUSA et al. 2012).

A produção de orgânicos leva em conta o correto manuseio do solo e o uso de práticas de gestão de acordo com as condições regionais e adaptando localmente os sistemas de produção. As principais vantagens do consumo de orgânicos frente aos convencionais referem-se ao menor índice de toxicidade e à manutenção do equilíbrio ambiental (VILELA, 2006).

As vantagens desse sistema para o produtor estariam relacionadas a não utilização dos produtos químicos, já que boa parte dos agricultores não faz uso de equipamentos de proteção individual (EPIs), e geralmente os produtos são utilizados de forma indiscriminada e desordenada pelos mesmos. Além disso, os agricultores se sentem pessoalmente satisfeitos em oferecer aos consumidores produtos de melhor qualidade, que também promovem melhorias para a população próxima aos locais de produção, diminuindo consideravelmente a contaminação ambiental (PANZENHAGEN et al. 2008).

É importante salientar que, mesmo que a produção dos alimentos orgânicos não utilize de artifícios como os agrotóxicos, não é possível garantir a ausência total de resíduos de contaminantes químicos, devido à contaminação ambiental com produtos persistentes e a mecanismos como derivação e proximidade de propriedades convencionais (DE SOUSA et al. 2012).

A metodologia de contagem de micronúcleos (Trad-MCN) representa um índice a partir da determinação da taxa de aberrações cromossômicas detectadas através da identificação e contagem de micronúcleos em uma determinada população celular. Sua utilização tem sido proposta como teste de curta duração para avaliação do potencial genotóxico de agentes químicos e físicos (SCHIMID, 1975). Este teste permite a detecção da exposição a compostos genotóxicos, mas não possibilita a determinação do tempo exato da exposição, por isso é considerado como um marcador de exposição de largo espectro ao longo da vida do indivíduo (NEVES, 2011).

O bioensaio Trad-MCN vem se mostrando adequado para uma rápida averiguação de riscos impostos por substâncias mutagênicas aos sistemas biológicos. Além disso, esta técnica permite investigar o agente quando diluído em meio líquido, como no caso dos agrotóxicos (MA et al. 1984).

O uso da técnica de contagem de micronúcleos (Trad-MCN), mais especificamente com a planta Tradescantia pallida, pode colaborar muito nos estudos de genotoxidade, entretanto, a maior parte desses estudos esses estão

voltados à poluição atmosférica e da água, não sendo comumente estudados a genotoxidade de agrotóxicos (MIELLI et al. 2009). Dessa forma, o estudo propôs uma inovação no uso dessa técnica tão difundida em análises de toxicidade ambiental.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a genotoxicidade e mutagenicidade em hortaliças cultivadas com agrotóxicos e orgânicas através da técnica Trad-MCN. Os objetivos específicos foram (1) analisar a genotoxicidade de hortaliças cultivadas com agrotóxicos através da detecção de mutagênese com a técnica Trad-MCN e (2) comparar a taxa de mutagênese de hortaliças orgânicas com a de hortaliças cultivadas com agrotóxicos.

MÉTODOS

1. Coleta Trandescantia pallida

No dia 04 de setembro de 2017, foram coletadas 104 hastes de aproximadamente 10 cm da região apical de Tradescantia pallida, contendo inflorescências. A coleta foi realizada no Jardim Botânico de Jundiaí, com a devida

autorização dos responsáveis do local. As hastes, também denominadas “cuttings”,

foram levadas ao Laboratório de Análises Clínicas da UNIP, onde foram separadas e transferidas para sete béqueres contendo água de torneira por 24 horas, na fase de adaptação.

2. Intoxicação das hastes

Após a fase de adaptação das hastes, dezesseis hastes foram imersas em um béquer contendo uma solução de cinco folhas de chicória orgânica trituradas em um mixer com 200 mL de água, e dezenove hastes foram imersas em outro béquer contendo uma solução de cinco folhas de chicória comprada em supermercado, oriunda de cultivo tradicional, também trituradas em um mixer com 200 mL de água. Estas amostras experimentais foram denominadas SO (solução orgânica) e SP (solução pesticida). A fim de minimizar a possibilidade de metabólitos das hortaliças atuarem como substâncias genotóxicas nas soluções processadas com mixer, outros dois grupos experimentais foram testados: dezessete hastes foram imersas em um béquer contendo cinco folhas levemente picadas de chicória orgânica em

200 ml de água, e dezoito hastes foram imersas em um béquer contendo cinco folhas levemente picadas de chicória comprada em supermercado, oriunda de cultivo tradicional. Estas amostras experimentais foram denominadas IO (imersão orgânica) e IP (imersão pesticida) (Figura 1).

Figura 1 – Intoxicação das hastes nas soluções experimentais processadas e não processadas.

Fonte: Própria (2017).

Também foram realizados os controles positivo, negativo e branco. Onze hastes foram imersas em um béquer contendo 200 mL de água deionizada (controle branco), onze hastes foram imersas em um béquer contendo 200 ml de água de torneira (controle negativo), e doze hastes foram imersas em um béquer contendo 200 ml de uma solução de formol 1:1000ml (controle positivo).

A fase de intoxicação durou 8 horas, e foi sucedida pela fase de recuperação, em que foi realizado o mesmo processo da fase de adaptação (as hastes foram imersas em água de torneira durante 24h). Após a recuperação, todas as inflorescências foram colocadas sem as folhas no fixador (1 parte de ácido acético para 3 partes de álcool etílico 98°INPM), no qual as inflorescências permaneceram por no mínimo 48 horas antes do início das análises.

3. Preparação das lâminas

Foram retirados os botões médios da inflorescência e, com o estile histológico de ponta fina, estes foram macerados sobre lâminas e corados com Carmim e Orceína acética. Os “debris” (restos de sépalas que podem interferir na visualização) foram descartados e a lamínula foi apoiada sobre o líquido obtido. A lâmina foi levemente aquecida sobre a chama de uma espiriteira, e foi então analisada ao microscópio para a busca por tétrades. Após a identificação destas, foi realizada a leitura dos micronúcleos em 300 tétrades para cada um dos sete grupos.

4. Leitura e contagem de micronúcleos

Foi realizada a contagem de micronúcleo em 300 tétrades para cada um dos sete grupos. Três quesitos foram considerados para a identificação dos micronúcleos: 1) estar nitidamente separado do núcleo e dentro do citoplasma da tétrade; 2) não estar sobreposto ao núcleo; e 3) não apresentar formato irregular. (Figura 2).

Figura 2 – Tétrades com micronúcleo (aumento de 100x)

5. Análise estatística.

Os valores obtidos foram analisados estatisticamente através do teste qui-quadrado (X2_{), cujo princípio básico é comparar proporções, isto é, as possíveis}

divergências entre as frequências observadas e esperadas para certo evento (PIANA; MACHADO; SELAU, 2009). Além disso, é um teste de probabilidade que se destina a identificar um valor de dispersão para duas variantes nominais, verificando a associação existente entre variantes qualitativas, levando-se em conta diferenças superiores a 95% entre as amostras, ou seja, com nível de significância (P<0,05). As análises foram realizadas utilizando-se o software Excel, da Microsoft Corporation®.

RESULTADOS

Na análise microscópica das 300 tétrades para cada grupo analisado (ao todo, 2.100 tétrades), todas as amostras apresentaram micronúcleos. Na tabela I encontram-se expressos os resultados absolutos e percentuais obtidos.

Tabela I - Resultados amostrais absolutos e em percentual

Amostra Valor absoluto % de micronúcleos

SO 2 0,66% SP 8 2,66% IO 5 1,66% IP 11 3,66% Controle Positivo 12 4% Controle Negativo 2 0,66% Controle Branco 0 0

Nas tabelas II e III encontram-se expressos os resultados das análises estatísticas realizadas.

Tabela II – Valores de P e significância do teste X2

AMOSTRA SO SP IO IP

Positivo 0,006 (P<0,05)* 0,36 (P>0,05) 0,02 (P<0,05)* 0,83 (P>0,05) Negativo 0,15 (P>0,05) 0,055(P>0,05) 0,25 (P>0,05) 0,01 (P<0,05)* Branco 0,15 (P>0,05) 0,004(P<0,05)* 0,02 (P<0,05)* 8,15-4 _(P<0,05)*

Tabela III – Valores de P e significância do teste X2

AMOSTRA SP IO

SO 0,056 (P>0,05) 0,254 (P>0,05)

IP 0,484 (P>0,05) 0,128(P>0,05)

DISCUSSÃO

Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na quantidade de micronúcleos das amostras orgânicas em relação ao controle positivo, o que demonstra que ambas as soluções experimentais que não possuem pesticidas são significativamente menos tóxicas do que a solução de formol 1:1000, comprovadamente mutagênica e genotóxica.

Também foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as amostras com pesticida em relação ao controle branco, o que demonstra que as amostras são significativamente mais tóxicas do que o veículo utilizado no experimento, que é inócuo (água deionizada). A amostra IP também apresentou diferenças estatisticamente significativas em relação ao controle negativo, o que reforça os resultados obtidos.

Os resultados...

Porém, não foram identificadas diferenças estatisticamente significativas entre nenhuma das amostras de hortaliças cultivadas com agrotóxicos em relação às hortaliças orgânicas, resultado que poderia reforçar as diferenças estatísticas encontradas entre as amostras e os controles.

Surpreendentemente, a amostra IO apresentou diferenças estatisticamente significativas com o controle branco, o que poderia ser interpretado como uma maior genotoxicidade da amostra em relação ao veículo utilizado nas diluições.

Também não foram identificadas diferenças estatisticamente significativas entre os dois métodos de intoxicação experimentados a fim de evitar que os metabólitos presentes nas hortaliças não interferissem no resultado final do estudo, de maneira que qualquer um dos métodos pode ser utilizado por estudos posteriores para avaliar a genotoxicidade de agrotóxicos residuais, se utilizadas as mesmas hortaliças.

O presente estudo apresentou, em sua maioria, resultados significativos na comparação entre as amostras experimentais em relação aos controles, mas não

demonstrou diferenças entre os grupos experimentais. Dessa forma, interpretamos que o bioensaio Trad-MCN talvez não seja uma metodologia eficaz para identificar o grau de toxicidade e de mutagênese em agrotóxicos, possivelmente pelo fato de os agrotóxicos serem planejados para causar danos às pragas agrícolas e não aos vegetais.

Portanto, a partir dos resultados obtidos, sugere-se que estudos com metodologias distintas de Trad-MCN comparem hortaliças de cultivo tradicional com hortaliças orgânicas para que seus resultados possam evidenciar de forma mais conclusiva os danos que os agrotóxicos residuais em alimentos podem causar.

CONCLUSÃO

O uso indiscriminado de agrotóxicos e pesticidas têm sido um problema recorrente no país. O uso de agrotóxicos comprovadamente traz inúmeros riscos para a saúde humana e para o ambiente.

Embora Trad-MCN seja um excelente indicador de genotoxicidade e os resultados do presente estudo tenham indicado parcialmente uma maior toxicidade das amostras de cultivo tradicional quando estas foram comparadas aos controles, os resultados não foram conclusivos. Possivelmente este não é o método mais eficaz para estudos envolvendo genotoxicidade de agrotóxicos.

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